JP4275529B2 - α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素およびシアル酸含有複合糖質の製造法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を用いたα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質の製造法、およびシアル酸含有複合糖質の製造法に関する。
背景技術
α２，３−シアル酸転移酵素およびその遺伝子に関しては、動物由来の遺伝子［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１０１１（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１６，３７７（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９４，３７５（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１３９４（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１００２８（１９９４）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，３１９（１９９５）］などが取得されており、動物由来のα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子を大腸菌などの細菌で発現させ、活性のある蛋白質を取得したという例はあるが（特開平１１−２５３１６３）、その活性は微弱である。また、α２，８−シアル酸転移酵素およびその遺伝子に関しては、動物由来の遺伝子［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，７９５２（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１０４５５（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１５９５０（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３６８４（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１４６２８（１９９５）］などが取得されているが、動物由来のα２，８−シアル酸転移酵素遺伝子を大腸菌などの細菌で発現させ、活性のある蛋白質を取得したという例は知られていない。
一方、微生物においては、ナイセリア属、キャンピロバクター属およびヘモフィラス属に属する微生物からα２，３−シアル酸転移酵素遺伝子が取得されており、該遺伝子を用いて大腸菌でα２，３−シアル酸転移酵素を発現させたとの報告はあるが［ＵＳＰ６，０９６，５２９、ＷＯ ９７／４７７４９、ＷＯ ９９／４９０５１、ＷＯ ００／４６３７９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２８２７１（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，３８９６（２０００）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３９，３４１（２００１）］、パスツレラ属に属する微生物から該遺伝子を取得したとの報告はない。
また、キャンピロバクター属に属する微生物由来のα２，３−シアル酸転移酵素はα２，８−シアル酸転移酵素活性を併せ持つとの報告はあるが［ＷＯ ００／４６３７９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，３８９６（２０００）］、パスツレラ属に属する微生物にα２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質が存在することは知られていない。
発明の開示
本発明の目的は、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を用いたα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質の製造法、および該形質転換体を用いたシアル酸含有複合糖質の製造法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ゲノムＤＮＡの配列が決定しているパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）ＰＭ７０株の配列情報を検索することにより、既知のα２，６−シアル酸転移酵素と相同性を示すｐｍ０１８８遺伝子産物、既知のα２，３−シアル酸転移酵素と相同性を示すｐｍ０５０８遺伝子産物およびｐｍ１１７４遺伝子産物を見出した。それぞれの遺伝子産物の活性を詳細に検討することにより、該遺伝子産物はいずれもα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有することを明らかにし、該ＤＮＡを取得することにより、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（２９）に関する。
（１）パスツレラ属に属する微生物由来のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を生産する形質転換体を培地に培養し、培養物中にα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造法。
（２）パスツレラ属に属する微生物が、パスツレラ・マルトシダである上記（１）の製造法。
（３）α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質が、配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質である上記（１）の製造法。
（４）α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質が、配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質である上記（１）の製造法。
（５）α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質が、配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質である上記（１）の製造法。
（６）形質転換体が、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体である上記（１）の製造法。
（７）形質転換体が、微生物を宿主として造成された形質転換体である上記（６）の製造法。
（８）微生物が、エッシェリヒア・コリである上記（７）の製造法。
（９）α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［ａ］〜［ｅ］のいずれか１つに記載のＤＮＡである上記（６）の製造法。
［ａ］配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［ｂ］配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［ｃ］配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と８０％以上の同一性を有し、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［ｄ］配列番号２、４および６から選ばれるいずれか１つの配列番号で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［ｅ］配列番号２、４および６から選ばれるいずれか１つの配列番号で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（１０）微生物由来のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、シチジン−５’−一リン酸シアル酸、および受容体複合糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でシアル酸含有複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体からシアル酸含有複合糖質を採取することを特徴とするシアル酸含有複合糖質の製造法。
（１１）培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする上記（１０）の製造法。
（１２）受容体複合糖質が、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖を含む複合糖質である上記（１０）の製造法。
（１３）受容体複合糖質が、非還元末端にシアル酸を有するオリゴ糖を含む複合糖質である上記（１０）の製造法。
（１４）非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖が、ラクトース、グロボトリオース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ルイスａおよびルイスＸからなる群より選ばれるオリゴ糖である上記（１２）の製造法。
（１５）非還元末端にシアル酸を有するオリゴ糖が、ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃおよびＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃからなる群より選ばれるオリゴ糖である上記（１３）の製造法。
（１６）微生物が、パスツレラ属に属する微生物である上記（１０）の製造法。
（１７）パスツレラ属に属する微生物が、パスツレラ・マルトシダである上記（１６）の製造法。
（１８）α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質が、配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質である上記（１０）の製造法。
（１９）α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質が、配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質である上記（１０）の製造法。
（２０）α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質が、配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質である上記（１０）の製造法。
（２１）形質転換体が、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体である上記（１０）の製造法。
（２２）形質転換体が、微生物を宿主として造成された形質転換体である上記（２１）の製造法。
（２３）微生物が、エッシェリヒア・コリである上記（２２）の製造法。
（２４）α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが、以下の［ａ］〜［ｅ］のいずれか１つに記載のＤＮＡである上記（２１）の製造法。
［ａ］配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［ｂ］配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［ｃ］配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と８０％以上の同一性を有し、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［ｄ］配列番号２、４および６から選ばれるいずれか１つの配列番号で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［ｅ］配列番号２、４および６から選ばれるいずれか１つの配列番号で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（２５）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質。
（２６）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質。
（２７）配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質。
（２８）配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質。
（２９）配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質。
本発明のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質としては、パスツレラ属に属する微生物由来の該蛋白質、好ましくはパスツレラ・マルトシダ由来の該蛋白質をあげることができる。また本発明の複合糖質製造法に用いられるα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質は、微生物由来であれば特にその由来は限定されないが、好ましくはパスツレラ属に属する微生物由来の該蛋白質、さらに好ましくはパスツレラ・マルトシダ由来の該蛋白質をあげることができる。具体的には、配列番号１、３および５から選ばれる配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質、および配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と８０％以上の同一性を有し、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をあげることができる。
１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１、３または５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、上記の配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加があることを意味し、欠失、置換若しくは付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、上記の１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質がα２，３／２，８シアル酸転移酵素活性を有するためには、配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の同一性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
本発明のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質の製造に用いられる形質転換体としては、パスツレラ属に属する微生物由来のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を生産する形質転換体であれば、特に限定されないが、好ましくはパスツレラ属に属する微生物由来の該蛋白質をコードするＤＮＡ、より好ましくはパスツレラ・マルトシダ由来の該蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体をあげることができる。具体的には、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（２）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（４）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（５）配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（６）配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（７）配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（８）配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と８０％以上の同一性を有し、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（９）配列番号２、４および６から選ばれるいずれか１つの配列番号で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記配列番号２、４および６から選ばれるいずれか１つの配列番号で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等による同一性値の計算において、配列番号２、４および６から選ばれるいずれか１つの配列番号で表される塩基配列と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性値を示すＤＮＡをあげることができる。
［１］本発明のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質の製造法に用いられるＤＮＡの調製
（１）データベースを利用したα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの選択
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＰＭ７０株においては、そのゲノムＤＮＡの全塩基配列が決定されており［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９８，３４６０（２００１）］、該ゲノムＤＮＡ配列データベース［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｃ．ｕｍｎ．ｅｄｕ／ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｊｅｃｔｓ／Ｐｍ／ｐｍｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／］に対して、公知のシアル酸転移酵素遺伝子をクエリーとして遺伝子検索及び相同性検索等を行うことによりα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを選択することができる。
（２）α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、パスツレラ属する微生物より調製することができる。パスツレラに属する微生物としては、例えばＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａをあげることができ、具体的にはＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＰＭ７０株（ミネソタ大学より分譲可能）等をあげることができる。
パスツレラ・マルトシダに属する微生物を公知の方法［例えば、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６６，２８９（１９９８）］により培養する。
培養後、公知の方法（例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
本発明の製造法に用いるＤＮＡを含むＤＮＡ断片の取得は、上記（１）で選択されたゲノムの塩基配列に基づいたプライマーを調製し、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により行うことができる。
また、ゲノムの塩基配列に基づいて設計された合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション法などにより目的とするＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号２、４または６で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
上記で取得されたＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
配列番号２、４または６で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡであるｐＰＭ０１８８ＳＫ、ｐＰＭ０５０８ＳＫおよびｐＰＭ１１７４ＳＫは、それぞれ平成１３年９月１３日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５―８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７７３０、ＦＥＲＭ ＢＰ−７７３１およびＦＥＲＭ ＢＰ−７７３３として寄託されている。
配列番号２、４または６で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物としては、エシェリヒア・コリ等をあげることができる。
エシェリヒア・コリとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＥ８４１５等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
上記の組換え体ＤＮＡを導入して得られるα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素を生産する形質転換体としては、上記組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体、相同組換えによりα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素をコードするＤＮＡが宿主細胞の染色体ＤＮＡに挿入された形質転換体等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体として具体的には、配列番号２、４または６で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有するエシェリヒア・コリであるＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７６、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７９、およびＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７８をあげることができる。
［２］α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質の調製
α２，３／δ２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記［１］に記載の方法により取得したＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
上記ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産性を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、α２，３／α２，８シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の製造法に用いられる蛋白質をコードするＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐ ｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐ ｌａｃ）、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター、Ｐ_ＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰ ｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐ ｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
組換え体ＤＮＡには、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を発現させるための転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ、ｐＲＥＰ４（いずれもインビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等、ヒト白血病細胞としては、ＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を製造することができる。
本発明のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質の製造法に用いられる形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５），７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを含有する微生物、動物細胞、昆虫細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を生産させる形態としては、該蛋白質をそのままの構造で生産させる以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、シグナル配列を配した分泌タンパク質として、あるいは融合蛋白質として生産することができる。
融合させる蛋白質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる［山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）］。
さらにα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質の生産方法としては、宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いてα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いてα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法［Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に該蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該蛋白質を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いてα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質の製造法により製造された該蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１、３または５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
上記で取得された蛋白質のアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
［３］シアル酸含有複合糖質の調製
本発明のシアル酸含有複合糖質の製造法は、微生物由来のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、シチジン−５’−一リン酸シアル酸、および受容体複合糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でシアル酸含有複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体からシアル酸含有複合糖質を採取することを特徴とする製造法である。
上記本発明のシアル酸含有複合糖質の製造法に用いられる形質転換体としては、微生物由来のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を生産する形質転換体であれば特に限定されないが、好ましくはパスツレラ属に属する微生物由来のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体、より好ましくパスツレラ・マルトシダ由来の該蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体あげることができる。
パスツレラ・マルトシダ由来の該蛋白質をコードするＤＮＡの具体的な例としては、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（２）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（４）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（５）配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（６）配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（７）配列番号１、３および５から選ばれるいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（８）配列番号２、４および６から選ばれるいずれか１つの配列番号で表される塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
上記ＤＮＡは、上記［１］の方法により取得することができ、該ＤＮＡを含有する形質転換体、および該形質転換体の培養物は、上記［２］の方法によって取得することができる。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
シアル酸含有複合糖質の生成において用いられる酵素源は、３７℃で１分間に１μｍｏｌのシアル酸含有複合糖質を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜５００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
シアル酸含有複合糖質の生成において用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
シアル酸含有複合糖質の生成において用いられる受容体複合糖質としては、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖を含む複合糖質、または非還元末端にシアル酸を有するオリゴ糖を含む複合糖質をあげることができ、好ましくは非還元末端にラクトース、グロボトリオース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ルイスａおよびルイスＸからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖を含む複合糖質、または非還元末端にＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃおよびＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖を含む複合糖質をあげることができる。
シアル酸含有複合糖質の生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、シアル酸含有複合糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
シアル酸含有複合糖質の生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２等の無機塩等を添加することができる。
水性媒体中に生成したシアル酸含有複合糖質の定量はＤｉｏｎｅｘ社製の糖分析装置などを用いて行うことができる［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９，１５１（１９９０）］。
反応液中に生成したシアル酸含有複合糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１ パスツレラ・マルトシダ由来のα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素遺伝子発現株の造成
（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７６株の造成
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＰＭ７０株の染色体ＤＮＡは、ミネソタ大学より分譲されたものを用いた。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した、配列番号７および８で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いて、パスツレラ・マルトシダＰＭ７０株の全ゲノム配列中で、α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子と推定されているｐｍ０１８８を含むＤＮＡ断片を下記方法で増幅した。
上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＰＭ７０株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／ｌ ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。
該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ社より購入）により１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．２ｋｂおよび２．９ｋｂの断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、アガロース１５ｇ／ｌ］に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出して、該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認し、該プラスミドをｐＰＭ０１８８ＳＫと命名した。ｐＰＭ０１８８ＳＫは、平成１３年９月１３日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５―８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７７３０として寄託されている。
次に、ｐＰＭ０１８８ＳＫを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。ｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．２ｋｂおよび５．４ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＰＴ７６を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第１図）。
（２）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７９株の造成
上記（１）と同様、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＰＨ７０株の染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲにより目的とするＤＮＡを以下のようにして取得した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した、配列番号９および１０で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いて、パスツレラ・マルトシダＰＭ７０株の全ゲノム配列中で、α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子と推定されているｐｍ５０８を含むＤＮＡ断片を下記方法で増幅した。
上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＰＭ７０株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／ｌ ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。
該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび２．９ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出して、該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認し、該プラスミドをｐＰＭ０５０８ＳＫと命名した。ｐＰＭ０５０８ＳＫは、平成１３年９月１３日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５―８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７７３１として寄託されている。
次に、ｐＰＭ０５０８ＳＫを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。ｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび５．４ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＰＴ７９を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第２図）。
（３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７８株の造成
上記（１）と同様、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＰＭ７０株の染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲにより目的とするＤＮＡを取得した。
パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した、配列番号１１および１２で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いて、パスツレラ・マルトシダＰＭ７０株の全ゲノム配列中で、α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子と推定されているｐｍ１１７４を含むＤＮＡ断片を下記方法で増幅した。
上記合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＰＭ７０株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μｍｏｌ／ｌ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液４μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μｍｏｌ／ｌを含む反応液４０μｌを用い、９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／ｌ ｖｏｌ）を添加し、混合した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。
該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで部分消化し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ社より購入）により０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該０．９ｋｂおよび２．９ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出して、該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認し、該プラスミドをｐＰＭ１１７４ＳＫと命名した。ｐＰＭ１１７４ＳＫは、平成１３年９月１３日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５―８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７７３３として寄託されている。
次に、ｐＰＭ１１７４ＳＫを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。ｐＰＡＣ３１ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
該０．９ｋｂおよび５．４ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃で１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、発現プラスミドであるｐＰＴ７８を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（第３図）。
実施例２ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７６株を用いたシアル酸含有複合糖質の生産
（１）ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの生産
実施例１（１）で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７６株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し２８℃で２時間培養後、４０℃で３時間培養した。該培養物０．５ｍｌを遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
上記で取得したＮＭ５２２／ｐＰＴ７６株湿菌体、５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ_２、１０ｍｍｏｌ／ｌラクトース、５ｍｍｏｌ／ｌ ＣＭＰ−シアル酸、４ｇ／ｌナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液中で、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて以下の分析条件で分析し、反応液中に２．６９ｍｍｏｌ／ｌ（１７０４ｍｇ／ｌ）のＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃが生成蓄積していることを確認した。
分析条件：
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ ＰＡ１０（ダイオネックス社製）
溶離液：溶離液Ａ；５００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨ、溶離液Ｂ；１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨ＋５００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＯＡｃ
グラジエント：０分において溶離液Ａ２０％、溶離液Ｂ１０％からなる組成から、３０分かけて直線的に溶離液Ａ３０％、溶離液Ｂ２５％からなる組成とした。
検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
（２） ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ１ＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの生産
実施例１（１）で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７６株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し２８℃で２時間培養後、４０℃で３時間培養した。該培養物０．５ｍｌを遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
上記で取得したＮＭ５２２／ｐＰＴ７６株湿菌体、５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ_２、１０ｍｍｏｌ／ｌラクト−Ｎ−ネオテトラオース、５ｍｍｏｌ／ｌ ＣＭＰ−シアル酸、４ｇ／ｌナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液中で、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて実施例２（１）記載の分析条件で分析し、反応液中に１．６４ｍｍｏｌ／ｌ（１６３８ｍｇ／ｌ）のＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ１ＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃが生成蓄積していることを確認した。
（３）ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの生産
実施例１（１）で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７６株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し２８℃で２時間培養後、４０℃で３時間培養した。該培養物０．５ｍｌを遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
上記で取得したＮＭ５２２／ｐＰＴ７６株湿菌体、５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ_２、２ｍｍｏｌ／ｌ ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＣＭＰ−シアル酸、４ｇ／ｌナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液中で、３７℃で２時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて、以下に記載の分析条件で分析し、反応液中に０．４３ｍｍｏｌ／ｌ（３９７ｍｇ／ｌ）のＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃが生成蓄積していることを確認した。
分析条件：
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ ＰＡ１０
溶離液：溶離液Ａ；Ｈ_２Ｏ、溶離液Ｂ；５００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨ、溶離液Ｃ；１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨ＋５００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＯＡｃ
グラジエント：０分において溶離液Ａ１０％、溶離液Ｂ６０％および溶離液Ｃ３０％からなる組成から、１５分かけて直線的に溶離液Ａ０％、溶離液Ｂ６５％および溶離液Ｃ３５％からなる組成にした
検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
実施例３ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７９株を用いたシアル酸含有複合糖質の生産
（１）ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの生産
実施例１（２）で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７９株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し２８℃で２時間培養後、４０℃で３時間培養した。該培養物０．５ｍｌを遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
上記で取得したＮＭ５２２／ｐＰＴ７９株湿菌体、５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ_２、１０ｍｍｏｌ／ｌラクトース、５ｍｍｏｌ／ｌ ＣＭＰ−シアル酸、４ｇ／ｌナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液中で、３７℃で６時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて実施例２（１）に記載の分析条件で分析し、反応液中に０．２５ｍｍｏｌ／ｌ（１６４ｍｇ／ｌ）のＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃが生成蓄積していることを確認した。
（２）ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの生産
実施例１（２）で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７９株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し２８℃で２時間培養後、４０℃で３時間培養した。該培養物０．５ｍｌを遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
上記で取得したＮＭ５２２／ｐＰＴ７９株湿菌体、５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ_２、２ｍｍｏｌ／ｌ ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＣＭＰ−シアル酸、４ｇ／ｌナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液中で、３７℃で２時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて実施例２（３）に記載の分析条件で分析し、反応液中に０．５４ｍｍｏｌ／ｌ（４９９ｍｇ／ｌ）のＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃが生成蓄積していることを確認した。
実施例４ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７８株を用いたシアル酸含有複合糖質の生産
（１）ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの生産
実施例１（３）で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７８株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し２８℃で２時間培養後、４０℃で３時間培養した。該培養物０．５ｍｌを遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
上記で取得したＮＭ５２２／ｐＰＴ７８株湿菌体、５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ_２、１０ｍｍｏｌ／ｌラクトース、５ｍｍｏｌ／ｌ ＣＭＰ−シアル酸、４ｇ／ｌナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液中で、３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて実施例２（１）記載の分析条件で分析し、反応液中に０．９８ｍｍｏｌ／ｌ（６２１ｍｇ／ｌ）のＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃが生成蓄積していることを確認した。
（２）ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの生産
実施例１（３）で得られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ７８株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養物をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し２８℃で２時間培養後、４０℃で３時間培養した。該培養物０．５ｍｌを遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
上記で取得したＮＭ５２２／ｐＰＴ７８株湿菌体、５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ_２、２ｍｍｏｌ／ｌ ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＣＭＰ−シアル酸、４ｇ／ｌナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液中で、３７℃で２時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて、実施例２（３）に記載の分析条件で分析し、反応液中に０．４３ｍｍｏｌ／ｌ（３９７ｍｇ／ｌ）のＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃが生成蓄積していることを確認した。
産業上の利用可能性
本発明により、α２，３／α２，８−シアル酸転移酵素を大量に生産することができる。また、該酵素を用いることにより効率的にシアル酸含有複合糖質を製造できる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図はα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素遺伝子発現プラスミドｐＰＴ７６の造成工程を示す図である。
第２図はα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素遺伝子発現プラスミドｐＰＴ７９の造成工程を示す図である。
第３図はα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素遺伝子発現プラスミドｐＰＴ７８の造成工程を示す図である。
なお、図中においてＡｍｐ^ｒはアンピシリン耐性遺伝子、Ｐ_ＬはＰ_Ｌプロモーター、ｃＩ８５７は温度感受性リプレッサー、ｐｍ０１８８はα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素遺伝子、ｐｍ０５０８はα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素遺伝子、ｐｍ１１７４はα２，３／α２，８−シアル酸転移酵素遺伝子をそれぞれ表す。

Claims (10)

1. 以下の [a] 〜 [c] のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するα2,3/α2,8-シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、シチジン-5' - 一リン酸シアル酸、および受容体複合糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でシアル酸がα 2,3 またはα 2,8 結合で結合したシアル酸含有複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体から該シアル酸含有複合糖質を採取することを特徴とする該シアル酸含有複合糖質の製造法。
   [a] 配列番号 1 で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
   [b] 配列番号 1 で表されるアミノ酸配列において、 1 個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα 2,3/ α 2,8- シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質
   [c] 配列番号 1 で表されるアミノ酸配列と９５ % 以上の同一性を有し、かつα 2,3/ α 2,8- シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質
2. 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする請求項１に記載の製造法。
3. 受容体複合糖質が、非還元末端にガラクト-スを有するオリゴ糖を含む複合糖質である請求項１に記載の製造法。
4. 受容体複合糖質が、非還元末端にシアル酸を有するオリゴ糖を含む複合糖質である請求項１に記載の製造法。
5. 非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖が、ラクトース、グロボトリオ-ス、 N-アセチルラクトサミン、ラクト-N-テトラオース、ラクト-N-ネオテトラオース、ルイスaおよびルイスXからなる群より選ばれるオリゴ糖である請求項３に記載の製造法。
6. 非違元末端にシアル酸を有するオリゴ糖が、 NeuAcα2-3Galβ1-4GlcおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcからなる群より選ばれるオリゴ糖である請求項４に記載の製造法。
7. 形質転換体が、 α2,3/α2,8-シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするDNAを含む組換え体DNAを含有する形質転換体である請求項１に記載の製造法。
8. 形質転換体が、微生物を宿主として造成された形質転換体である請求項７に記載の製造法。
9. 微生物が、エツシェリヒア・コリである請求項８に記載の製造法。
10. α2, 3/α2,8-シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするDNAが、以下の [a]〜[e]のいずれか1つに記載のDNAである請求項７に記載の製造法。
    [a]配列番号1 で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA
    [b]配列番号1 で表されるアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα2, 3/α2, 8-シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
    [c]配列番号1 で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と９５%以上の同一性を有し、かつα2,3/α2,8-シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
    [d]配列番号２で表される塩基配列を有するDNA
    [e]配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなる DNA ９５ % 以上の同一性を有し、かつα2,3/α2,8‐シアル酸転移酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA

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