JPH089986A - マンノースまたはマンノース・フラクトース混合物の 製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 マンノースまたはマンノース・フラクトース
混合物を安価に工業的に製造する。 【構成】 アシネトバクター属に属しマンノースを生産
する能力を有する微生物をフラクトースを主要原料とす
る培地で培養し、培養液中にマンノースを生成蓄積さ
せ、この生成物からマンノースまたはマンノース・フラ
クトース混合物を採取することを特徴とするマンノース
またはマンノース・フラクトース混合物の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はフラクトースをマンノー
スへと変換する微生物の菌体または菌体処理物を利用し
たマンノースまたはマンノースとフラクトースの混合物
の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】マンノースは天然には遊離ではほとんど
存在せず、マンナンと呼ばれる多糖類として植物、微生
物に存在している。マンノースはこれらマンナンの分解
や化学合成によって製造されているため非常に高価であ
る。マンノースは医薬品合成原料などの他に家禽の腸内
サルモネラ菌の抑制効果を期待する用途も考えられるよ
うになってきた。しかし、製造コストが高いためこれら
への利用はほとんどなされていない。

【０００３】低コストでマンノースを製造する方法とし
ては微生物によってフラクトースとマンノースを可逆的
に変換する製造法が考えられる。シェードモナス・サッ
カロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒ
ｏｐｈｉｌａ） ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８，
ｐ５３５，１９５６］、ストレプトミセス・アエロコロ
リゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｅｒｏｃｌｏ
ｒｉｇｅｎｅｓ） ［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．３１，ｐ４３５，１９６７］、ミコバクテリウム・
スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅ
ｇｍａｔｉｓ）［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０１，ｐ
７７７，１９７０］などの微生物はフラクトースとマン
ノースを相互変換することができる。しかしこれらの微
生物のフラクトースからのマンノース生産能は収率が低
く工業的利用に適さない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】現在、マンノースはマ
ンナンの分解や化学合成によって製造されているため非
常に高価である。また微生物による製造法も収率が低く
工業的生産はほとんど行われていない。

【０００５】

【課題を解決するための手段および作用】本発明者らは
フラクトースからマンノースを生産する微生物の検索を
行ったところ、アシネトバクター属に属する微生物がマ
ンノースを効率良く生産することを見い出し、本発明を
完成した。

【０００６】本発明はフラクトースにアシネトバクター
属に属する微生物の菌体、菌体処理物を作用させるマン
ノースまたはマンノース・フラクトース混合物の製造法
である。その一例としてアシネトバクター（Ａｃｉｎｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒ）属ｓｐｐ．Ｍ−１３−１−２株は上
記の特性を有している。

【０００７】本発明に使用するアシネトバクター（Ａｃ
ｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属ｓｐｐ．Ｍ−１３−１−２
株は本発明者らによって土壌中より発見された菌種であ
り工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−
１４３６７として寄託されている。

【０００８】アシネトバクター（Ａｅｉｎｅｔｏｂａｅ
ｔｅｒ）属ｓｐｐ．Ｍ−１３−１−２株は以下の菌学的
諸性質を有する。なお、菌学的諸性質は、長谷川武治
著：「微生物の分類と同定」（１９７５）に準拠し、分
類方法は、「Ｂｅｒｇｅｙ′ｓＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｅｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（１
９８４）に準拠して行った。 （１）形態 細胞の形及び大きさ：０．８〜１．２×１．２〜１．８
μｍの桿菌 運動性 ：なし グラム染色性 ：陰性 （２）生理学的性質 硝酸塩の還元 ：− 脱窒反応 ：− ＭＲテスト ：− ＶＰテスト ：− インドールの生成 ：− 硫化水素の生成 ：− クエン酸の利用 ：− ウレアーゼ ：− オキシダーゼ ：− カタラーゼ ：＋ 至適温度 ：３０℃ 至適ｐＨ ：６．０〜７．０ Ｏ−Ｆテスト ：酸化型 炭素源からの酸生成 Ｌ−アラビノース ：＋ Ｄ−グルコース ：＋ Ｄ−キシロース ：− マルトース ：− シュークロース ：− Ｄ−ソルビトール ：− Ｄ−マンニトール ：− イノシット ：− ゼラチンの分解 ：＋ 以上の菌学的性質によりＭ−１３−１−２株はアシネト
バクター（Ａｅｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属ｓｐｐ．と
同定した。このアシネトバクター属ｓｐｐ．Ｍ−１３−
１−２株は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４３６７として寄託している。アシネトバク
ター属の微生物がフラクトースからマンノースを生産す
ることについては未だ知られていない。

【０００９】本菌はマンノースやフラクトース、または
グルコース等の糖類を炭素源とし、それに微生物の増殖
に必要な窒素化合物（ペプトン、アミノ酸、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム等）やミネラルを加えた培地
で２０℃〜４０℃、好ましくは３０℃の温度で好気条件
下において１〜５日間、好ましくは２〜３日間振盪培養
することにより生育する。

【００１０】本菌は炭素源としてフラクトースを用いた
培地で培養すると培養液中にマンノースが蓄積する。ま
た、培養によって得られた菌体または菌体処理物もマン
ノースの生産に使用できる。ここでいう菌体処理物と
は、培養によって生育した菌体を得た後に通常の方法で
菌体を固定化したもの、または菌体を種々の方法により
破砕したものをいう。また菌体を破砕し、破砕残渣を除
いた上澄液またはその上澄液を固形化したもの、いわゆ
る粗酵素も菌体処理物に含まれる。例えば得られた菌体
をポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、カラギ
ーナン等通常の固定化法により固定化した担体を用いて
も良い。また粗酵素もポリアクリルアミド、イオン交換
担体、キトサンビーズ等を用いて固定化して使用しても
良い。

【００１１】本菌体または本菌体処理物は１〜５０％の
フラクトース濃度下でｐＨ６〜９、２０℃〜６０℃の環
境条件でフラクトースからマンノースをマンノース対フ
ラクトースの割合が２５対７５で生産する。かかるマン
ノースの生産は平衡反応であるところから、マンノース
の生成過程ではマンノースとフラクトースの混合状態と
なる。本発明はこのマンノースとフラクトースの混合物
を培養液から採取して有効利用することもできる。

【００１２】マンノースとフラクトースの混合物からの
マンノースの分画は、適当な分離方法、例えば陽イオン
交換樹脂によるカラムクロマトグラフィーによって分離
できる。

【００１３】このようにして取得したマンノースは市販
のＤ−マンノース（和光純薬工業（株）製）と理化学的
性質を比較したところ一致したことからＤ−マンノース
（以下マンノースと略す。）と断定した。ここで、培養
液からのマンノース・フラクトース混合物の採取につい
ては、遠心分離、濾過等により培養液から菌体、菌体処
理物を取り除き、その後、脱塩操作により行うことがで
きる。

【００１４】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されない。

【００１５】（実施例１）下記組成からなるｐＨ７．０
の培地を作成した。百分率はＷ／Ｖ％である。 フラクトース ２．０％ 硫酸アンモニウム ０．２％ 酵母エキス ０．０２％ ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．２％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ０．８％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０５％ 上記組成の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量三角フラス
コにとり、別に前培養しておいたアシネトバクター属ｓ
ｐｐ．Ｍ−１３−１−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４３６７）
の培養液１ｍｌを接種し、３０℃で２日間ロータリー
シェーカーにより１６０ｒｐｍの回転数で振盪培養を行
った後、培養液を遠心分離機にて１２０００ｒｐｍの回
転数で遠心分離し、菌体と上澄液とに分けた。高速液体
クロマトグラフィーにより上澄液中のマンノースを定量
したところ０．２２ｇであった。フラクトースよりの変
換率は１１．０％であった。高速液体クロマトグラフィ
ーの分折条件は以下のとおりである。 ポンプ：（株）島津製作所製 ＬＣ−９Ａ カラム：Ｃｉｃａ−ＭＥＲＣＫ社製 リクロゾルブＮＨ_２（５μｍ） 検出器：昭和電工（株）製 ＳＥ−６１型 示差屈折計 溶離液：アセトニトリル：水＝８５：１５ 流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ

【００１６】（実施例２）下記組成（Ｗ／Ｖ％）からな
るｐＨ７．０の培地を作成した。 マンノース ２．０％ 硫酸アンモニウム ０．２％ 酵母エキス ０．０２％ ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．２％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ０．８％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０５％ 上記組成の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量三角フラス
コにとり、別に前培養しておいたアシネトバクター属ｓ
ｐｐ．Ｍ−１３−１−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４３６７）
の培養液１ｍｌを接種し、３０℃で２日間ロータリーシ
ェーカーにより１６０ｒｐｍの回転数で振盪培養を行っ
た後、培養液を遠心分離機にて１２０００ｒｐｍの回転
数で遠心分離し、菌体を得た。得られた菌体を１００ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５ｍｌに懸濁し、さ
らに２５ｍｌの２０％フラクトース溶液を加え３０℃で
２０時間反応させて、実施例１と同様の高速液体クロマ
トグラフィーによりマンノースを定量したところ０．９
２ｇであった。フラクトースよりの変換率は１８．４％
であった。

【００１７】（実施例３）実施例２と同様にして得られ
たアシネトバクター属ｓｐｐ．Ｍ−１３−１−２（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４３６７）の菌体を１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）２５ｍｌに懸濁し、超音波破砕を行
い、その後回転数１２０００ｒｐｍの遠心分離によって
沈殿と粗酵素液とに分けた。この粗酵素液１０ｍｌに１
０ｍｌの２０％フラクトース溶液を加え３０℃、２０時
間反応を行った。反応液中のマンノースを定量したとこ
ろ０．４６ｇであった。フラクトースからの変換率は２
３％であった。

【００１８】（実施例４）実施例３の酵素フラクトース
混合液を２０℃〜６０℃の温度範囲で反応を６時間行っ
た。その結果、図１に示すように４５℃が最もマンノー
ス生産量が多く３０℃に比較して６０％以上も向上して
いた。５０℃でも１５％向上しており３０℃から５５℃
の広範囲で高い活性を示していることがわかった。

【００１９】（実施例５）実施例３で得た粗酵素液５ｍ
ｌにフラクトースが最終濃度として１０％、２０％、３
０％、４０％となるように加え、水で全量を１０ｍｌと
し、ｐＨ７．０、３０℃で反応を行った。経時的に一定
量をサンプリングし生成したマンノース量を測定した。
得られた結果を図２に示す。図２から明らかなように本
粗酵素は高濃度のフラクトース（１０％〜４０％）下で
効率良くマンノースを生産することがわかった。最終的
な収率は２２％〜２５％であった。

【００２０】（実施例６）実施例２と同様の方法によっ
て得られた菌体１００ｇを水２００ｍｌに懸濁し、同重
量の２．４％アルギン酸ナトリウム溶液と混和して、２
％塩化カルシウム溶液中に滴下しアルギン酸カルシウム
ビーズ２１０ｇを調製した。この固定化菌体５ｇを１０
０ｍｌ容量の三角フラスコにとりｐＨ７．０に調整した
１０％フラクトース溶液２０ｍｌを加え３０℃で２０時
間反応させ、生成したマンノースを高速液体クロマトグ
ラフィーによってマンノースを定量したところ０．４１
ｇであった。次に、固定化菌体だけを取り出して、上述
したフラクトース溶液を加える反応を１０回繰り返した
ところ活性の低下は１０％以下であった。

【００２１】（実施例７）実施例３で得られた粗酵素液
１０ｍｌにキトサンビーズ（富士紡績（株）製、商品名
「キトパールＢＣＷ−３５０５」）４ｍｌを加え３０℃
で３時間振盪させて固定化を行った。得られたビーズと
上澄液のマンノース生産活性を調べたところ上澄液には
活性は見られず酵素は完全にキトサンビーズに吸着され
たことがわかった。このビーズ２ｍｌを５ｍｌの１０％
フラクトース溶液（ｐＨ７．０）に加え３０℃、２０時
間反応を行った。生成したマンノースを高速液体クロマ
トグラフィーによってマンノースを定量したところ０．
１２４ｇであった。また、このビーズだけを取り出して
上述したフラクトース溶液を加える反応を１０回繰り返
したところ活性の低下は１２％であった。

【００２２】

【発明の効果】本発明はアシネトバクター属ｓｐｐ．Ｍ
−１３−１−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４３６７）の菌体ま
たは菌体処理物を用いることにより、３０℃〜５５℃の
広範囲の温度下で１０％〜４０％の高濃度のフラクトー
スを効率的にマンノースへ変換するため、マンノースま
たはマンノース・フラクトース混合物を高収率で製造で
きる。また本発明に用いる菌体および酵素は固定化菌
体、固定化酵素とすることによってより安価な工業的生
産に利用できる。

【００２３】

【図面の簡単な説明】

【図１】粗酵素液での反応におけるマンノース生産に及
ぼす温度の影響を示す特性図である。

【図２】粗酵素液での反応におけるマンノース生産に及
ぼす基質フラクトース濃度の影響を調べ、生成したマン
ノース量（重量％）を示す特性図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山内 謙三 東京都江東区豊洲４丁目９番11号 日新製 糖株式会社研究部内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アシネトバクター属に属しマンノースを
   生産する能力を有する微生物をフラクトースを主要原料
   とする培地で培養し、培養液中にマンノースを生成蓄積
   させ、この生成物からマンノースを採取することを特徴
   とするマンノースの製造方法。
2. 【請求項２】 アシネトバクター属に属しマンノースを
   生産する能力を有する微生物を培養し、その菌体または
   その菌体処理物をフラクトースを含む液に反応させてマ
   ンノースを生成し、この生成物からマンノースを採取す
   ることを特徴とするマンノースの製造方法。
3. 【請求項３】 アシネトバクター属に属しマンノースを
   生産する能力を有する微生物をフラクトースを主要原料
   とする培地で培養し、培養液中にマンノースを生成蓄積
   させ、この生成物からマンノースとフラクトースの混合
   物を採取することを特徴とするマンノース・フラクトー
   ス混合物の製造方法。
4. 【請求項４】 アシネトバクター属に属しマンノースを
   生産する能力を有する微生物を培養し、その菌体または
   その菌体処理物をフラクトースを含む液に反応させてマ
   ンノースを生成し、この生成物からマンノースとフラク
   トースの混合物を採取することを特徴とするマンノース
   ・フラクトース混合物の製造方法。
5. 【請求項５】 アシネトバクター属に属する微生物がア
   シネトバクター属ｓｐｐ．Ｍ−１３−１−２株であるこ
   とを特徴とする請求項１〜４いずれかに記載の製造方
   法。