CN1665926A - 同源补体介导下裂解活化淋巴细胞的人IgM抗体 - Google Patents

Abstract

一种应对HIV感染细胞的人IgM单克隆抗体，所述抗体在同源人补体介导下裂解活化人淋巴细胞。使用上述单克隆抗体，可提供一种免疫反应控制剂，该控制剂包括人IgM单克隆抗体，该抗体特别作用于活化淋巴细胞，并在同源补体介导下诱导细胞裂解。使用应对活化人淋巴细胞的人IgM单克隆抗体，还可提供一种HIV药物等，该药物裂解并消除活化淋巴细胞，从而治疗T淋巴细胞过度应答造成的移植排斥反应和自身免疫疾病，以及治疗HIV感染。

Description

同源补体介导下裂解活化淋巴细胞的人IgM抗体

技术领域

本发明涉及与HIV感染细胞反应的人IgM单克隆抗体，此抗体通过与活化淋巴细胞的分化抗原反应，在同源人补体的介导下，裂解活化淋巴细胞，本发明还涉及含有该单克隆抗体的治疗自身免疫疾病药物。

背景技术

现已开发出各种免疫抑制剂如环孢菌素和FK506，用于控制胶原蛋白疾病、自身免疫疾病和器官移植中的生物免疫反应。但是，由于这些免疫抑制剂与免疫活性细胞以外的细胞反应，应考虑到这些药物的副反应。

现已研究了各种使用特别作用于目标细胞的抗体的方法。例如，与目标细胞反应的抗体被期望通过与补体反应而被裂解。但是由于人细胞膜上存在种族特异性补体调控膜因子(如DAF，衰变加速因子；MCP，膜辅助因子蛋白；以及HRF20，20kDa同源限制因子)，它们通过补体反应使不能诱导细胞裂解反应，以阻止同源人补体中的反应。

另一方面，人血清中与HIV感染细胞反应的IgM抗体被发现可通过人补体越过补体调控膜因子，使HIV感染细胞产生细胞裂解反应。IgM抗体被发现可对神经节苷脂如GM2和Gg4表现出类似上述的反应，而神经节苷脂的表达被HIV感染增强(Japanese Patent Application Laid-OpenNo.9-227409)。

L55被报道为人抗GM2神经节苷脂IgM单克隆抗体，其中L55由EB病毒转形的无限增殖人B原淋巴细胞产生。用此人IgM单克隆抗体处理后的HIV感染细胞被发现通过人补体反应产生裂解。

发明内容

本方面的一个目的是提供控制免疫应答的药物，该药物包含特别作用于活化淋巴细胞的人IgM单克隆抗体，以在同源补体介导下诱导细胞裂解。

作为解决上述问题而进行的透彻研究的结果，本发明提供与HIV感染细胞反应的人IgM单克隆抗体，该抗体在同源人补体介导下，裂解人活化淋巴细胞。

本发明为解决上述问题提供了一种HIV药物，该药物治疗T淋巴细胞过度应答造成的移植排斥反应和自身免疫疾病，以及通过使用与HIV感染细胞和活化淋巴细胞反应的人IgM单克隆抗体，细胞裂解清除活化淋巴细胞以治疗HIV感染疾病。

更具体的说，本发明为解决上述问题提供了第一方面到第二个方面任一项的人IgM单克隆抗体，其中该与活化淋巴细胞和HIV感染细胞反应的人IgM单克隆抗体为9F11抗体，具有序列编号1表示的H链可变区碱基序列。

更具体的说，本发明为解决上述问题提供了第一方面到第三个方面任一项的人IgM单克隆抗体，其中该与活化淋巴细胞和HIV感染细胞反应的人IgM单克隆抗体为9F11抗体，具有序列编号2表示的L链可变区碱基序列。

附图说明

图1示出了9F11抗体特异性。

流式细胞仪分析的结果示出HIV感染细胞被9F11抗体染色，而非感染细胞则没有。

图2示出了9F11抗体对外周血淋巴细胞的特异性。

此图示出9F11抗体与受PHA刺激的活化淋巴细胞反应，但它不与正常外周血淋巴细胞反应(PBMC：外周血淋巴细胞)。

图3示出了9F11抗体在补体介导下的细胞损伤反应。

(A)向HIV-1感染细胞MOLT-4/IIIB中加入2μg/ml的9F11抗体和新鲜人血清(包括补体成分)后，几乎所有的细胞在4小时内被摧毁。在未加入血清时或未感染细胞MOLT-4中没有观察到任何效果。

(B)通过使用PHA活化外周血活化淋巴细胞诱导9F11抗原，细胞被9F11抗体和补体损伤，如同在HIV-1感染细胞中(FHS：新鲜人血清(作为补体来源)，PHA：人活化淋巴细胞活化剂，％51Cr release＝细胞死亡率，PBMC：外周血淋巴细胞)。

图4简要例示9F11μ链表达质粒结构。

具体实施方式

虽然本发明通过实施例被详细说明，本发明的技术范围不被这些实施例所限制。

为解决上述问题，本发明的发明人使小鼠(TC鼠：转染色体小鼠；Kirin Brewery Co.，Ltd.制备)的HIV感染细胞免疫，该小鼠中被转入含有人免疫球蛋白基因的染色体，从而获得产生特别作用于HIV感染细胞的人抗体的小鼠。通过此传统的方法，融合免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株，制备杂交瘤。从杂交瘤中选出产生单克隆抗体的克隆，其中所述单克隆抗体作用于HIV感染细胞，并在人补体存在下导致感染细胞裂解。将所选杂交瘤命名为9F11细胞株。9F11细胞株产生的9F11单克隆抗体为人IgM单克隆抗体，包含人μ链和人κ链。虽然9F11抗体可在人补体介导下与HIV感染细胞反应，产生细胞裂解，该抗体也可导致未感染的淋巴细胞的活化淋巴细胞裂解。相应地，对HIV感染细胞的应答可理解为HIV感染使淋巴细胞达到某活化状态，HIV感染细胞表达作为分化抗原的抗的9F11抗原(9F11抗原)，在人补体介导下被裂解。换句话说，9F11抗原为由淋巴细胞活化表达的分化抗原，在补体介导下通过与抗原反应诱导细胞裂解的9F11抗体，在补体介导下特别导致活化淋巴细胞裂解。因此可以解释包含9F11抗体的药物可用在抑制活化淋巴细胞的治疗中。本发明完全基于上述发现。产生本发明9F11抗体的9F11细胞株于2003年5月8号由国际先进工业科学协会—国际专利组织保藏处(NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，International PatentOrganism Depository，Chuo-6，Higashi 1-1-1，Tsukuba City，Ibaraki Pref.)保藏，保藏号(accession number)FERM BP-8379。

表1示出κ链和μ链可变区中分别编码9F11抗体基因的碱基序列分析结果。恒定区的碱基序列与报道基因的碱基序列大致相同。

表1

μ链可变区碱基序列

GCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAGTCACCAGAGCTCCAGACAATGTCTGTC

TCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCAC

AGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCGCGCAGACCC

TCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTAC

TTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATTGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAG

GACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGT

CGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGA

ACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGAGAATTA

CTATGGTTCGGGGAGGTACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCT

GGTCACCGTCTCCTCA

κ链可变区碱基序列

TGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCC

TGCTGCTCTGGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCC

ATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCG

AGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAA

GCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCAT

CAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAG

CCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTC

CCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

用于免疫反应调节剂的本发明组合物包含人IgM单克隆抗体，该抗体特别与活化淋巴细胞反应，并在同源补体介导下诱导细胞裂解，所述组合物可通过与生理学可接受的载体结合获得。生理学可接受的载体是本领域已知的，包括生理盐水缓冲液或其他具有缓冲性能的水溶液，或者是溶剂如乙二醇、甘油、油(例如橄榄油)或可注射的有机酯。生理学可接受的载体可包含能稳定人IgM抗体或增加其吸收的化合物。生理学可接受化合物的实例包括糖如葡萄糖、蔗糖和葡聚糖；抗氧化剂如抗坏血酸和谷胱甘肽；鳌合剂；诸如白蛋白的蛋白质；以及其它稳定剂和赋形剂。各种诸如环孢菌素的免疫抑制剂和FK506以及其它免疫抑制剂可加入到组合物中。可根据给药途径和对象的疾病选择任何生理学可接受载体的组合。

实施例1.9F11抗体的特异性

受试细胞以1×10⁶细胞/ml的浓度悬浮于培养液中，等体积10μg/ml浓度的9F11抗体溶液加入悬浮物中，随后反应30分钟。洗涤受试细胞，连接的9F11用荧光标记的抗人IgM抗体染色，细胞用流式细胞仪分析。结果表明HIV感染表达9F11抗原，虽然作为人细胞株的MOLT-4细胞和CEM细胞没有被染色，被HIV-1病毒IIIB株和MN株感染的细胞被强烈染色(图1)。由于HIV感染导致淋巴细胞活化，向正常人外周血细胞淋巴细胞中加入植物血凝素(PHA)后，培养3天，可发现活化淋巴细胞染色。显然9F11抗原为活化T淋巴细胞中表达的分化抗原(图2)，虽然外周血细胞和外周血淋巴细胞中没有被观察到染色，经PHA刺激的活化T淋巴细胞被强烈染色。

实施例2.9F11抗体在补体介导下的细胞损伤反应

受试细胞用⁵¹Cr放射性同位素预先标记，40μl不同浓度的9F11溶液和20μl人新鲜血清(补体血清)加入到标记的受试细胞中(以5×10⁵/ml的浓度悬浮于培养液中)，使混合物在微量滴定板上反应4小时。反应后，离心板沉淀细胞，测定由于细胞裂解而释放到上清液中的⁵¹Cr的放射性，用作细胞裂解反应的指标。表达9F11抗原的细胞如MOLT-4/IIIB(被HIV-1感染的MOLT-4细胞)和PHA活化的外周血衍生出的淋巴细胞在2μg/ml的9F11存在下经补体介导被裂解。相反，使用56℃加热或缺乏C9的失活人血清，没有观察到细胞裂解。由于向缺乏C9的人新鲜血清中加入纯化的C9，可使细胞裂解发生，可以得出结论：人补体反应是细胞裂解反应必须的(图3)。

实施例3.基因工程重建抗体

重建9F11抗体的一个实施例的方法如下所述，该实施例基于表1所示的9F11抗体可变区碱基序列，其中产生9F11抗体的细胞株用基因工程如鸟枪连接法(shot-gun ligation method)构建(Grundstrom，T.et al.，Nucleic Acid Res.13，3305-3316，1985)。

9F11抗体可变区的氨基酸序列通过翻译表中的碱基序列获得。如表2中所示，9F11抗体可变区中有许多编码氨基酸序列的碱基序列，如原始9F11抗体可变区的碱基序列以及通过变换密码子活动的序列。从这些序列中选出具有特定限制性内切酶识别片断的碱基序列，使每段达到能作为寡核苷酸化学合成的长度(表2)。

表2：9F11抗体氨基酸序列中编码同样氨基酸的cDNA实例

  1

 M   S   V   S   F   L   I   F   L   P   V   L   G   L   P   W   G   V   L   S

ATA TCT GTT TCT TTT TTA ATT TTT TTA CCT GTT TTA GGT TTA CCT TGA GGT GTT TTA TCT

ATG TCC GTC TCC TTC TTG ATC TTC TTG CCC GTC TTG GGC TTG CCC TGG GGC GTC TTG TCC

    TCA GTA TCA     CTT         CTT CCA GTA CTT GGA CTT CCA     GGA GTA CTT TCA

    TCG GTG TCG     CTC         CTC CCG GTG CTC GGG CTC CCG     GGG GTG CTC TCG

    AGT     AGT     CTA         CTA         CTA     CTA                  CTA AGT

    AGC     AGC     CTG         CTG         CTG     CTG                  CTG AGC

 21

 Q   V   Q   L   Q   Q   S   G   P   G   L   V   K   P   A   Q   T   L   S   L

CAA GTT CAA TTA CAA CAA TCT GGT CCT GGT TTA GTT AAA CCT GCT CAA ACT TTA TCT TTA

CAG GTC CAG TTG CAG CAG TCC GGC CCC GGC TTG GTC AAG CCC GCC CAG ACC TTG TCC TTG

    GTA     CTT         TCA GGA CCA GGA CTT GTA     CCA GCA     ACA CTT TCA CTT

    GTG     CTC         TCG GGG CCG GGG CTC GTG     CCG GCG      ACG CTC TCG CTC

            CTA         AGT    CTA                                    CTA AGT CTA

            CTG         AGC    CTG                                    CTG AGC CTG

 41

 T   C   A   I   S   G   D   S   V   S   S   N   S   A   T   W   N   W   I   R

ACT TGT GCT ATT TCT GGT GAT TCT GTT TCT TCT AAT TCT GCT ACT TGA AAT TGA ATT CGT

ACC TGC GCC ATC TCC GGC GAC TCC GTC TCC TCC AAC TCC GCC ACC TGG AAC TGG ATC CGC

ACA     GCA     TCA GGA     TCA GTA TCA TCA     TCA GCA ACA                  CGA

ACG     GCG     TCG GGG     TCG GTG TCG TCG     TCG GCG ACG                  CGG

                AGT         AGT     AGT AGT     AGT

                AGC         AGC     AGC AGC     AGC

 61

 Q   S   P   L   R   G   L   E   W   L   G   R   T   Y   Y   R   S   K   W   Y

CAA TCT CCT TTA CGT GGT TTA GAA TGA TTA GGT CGT ACT TAT TAT CGT TCT AAA TGA TAT

CAG TCC CCC TTG CGC GGC TTG GAG TGG TTG GGC CGC ACC TAC TAC CGC TCC AAG TGG TAC

    TCA CCA CTT CGA GGA CTT         CTT GGA CGA ACA          CGA TCA

    TCG CCG CTC CGG GGG CTC         CTC GGG CGG ACG          CGG TCG

    AGT     CTA         CTA         CTA                           AGT

    AGC     CTG         CTG         CTG                           AGC

 81

 N   D   Y   A   V   S   V   K   S   R   I   T   I   N   P   D   T   S   K   N

AAT GAT TAT GCT GTT TCT GTT AAA TCT CGT ATT ACT ATT AAT CCT GAT ACT TCT AAA AAT

AAC GAC TAC GCC GTC TCC GTC AAG TCC CGC ATC ACC ATC AAC CCC GAC ACC TCC AAG AAC

            GCA GTA TCA GTA     TCA CGA      ACA         CCA     ACA TCA

            GCG GTG TCG GTG     TCG CGG      ACG         CCG     ACG TCG

                    AGT         AGT                                   AGT

                    AGC         AGC                                   AGC

101

 Q   F   S   L   Q   L   N   S   V   T   P   E   D   T   A   V   Y   Y   C   A

CAA TTT TCT TTA CAA TTA AAT TCT GTT ACT CCT GAA GAT ACT GCT GTT TAT TAT TGT GCT

CAG TTC TCC TTG CAG TTG AAC TCC GTC ACC CCC GAG GAC ACC GCC GTC TAC TAC TGC GCC

        TCA CTT     CTT     TCA GTA ACA CCA          ACA GCA GTA             GCA

        TCG CTC     CTC     TCG GTG ACG CCG          ACG GCG GTG             GCG

        AGT CTA     CTA     AGT

        AGC CTG     CTG     AGC

121

 R   E   N   Y   Y   G   S   G   R   Y   N   W   F   D   P   W   G   Q   G   T

CGT GAA AAT TAT TAT GGT TCT GGT CGT TAT AAT TGA TTT GAT CCT TGA GGT CAA GGT ACT

CGC GAG AAC TAC TAC GGC TCC GGC CGC TAC AAC TGG TTC GAC CCC TGG GGC CAG GGC ACC

CGA                 GGA TCA GGA CGA                      CCA     GGA     GGA ACA

CGG                 GGG TCG GGG CGG                      CCG     GGG     GGG ACG

                        AGT

                        AGC

141

 L   V   T   V   S   S

TTA GTT ACT GTT TCT TCT

TTG GTC ACC GTC TCC TCC

CTT GTA ACA GTA TCA TCA

CTC GTG ACG GTG TCG TCG

CTA AGT             AGT

CTG AGC             AGC

基于为每个限制性内切酶识别片断分开的碱基序列，化学合成寡核苷酸。在用相应限制性内切酶依次消化合成的寡核苷酸后，将其连接获得编码9F11抗体可变区氨基酸序列的全长碱基序列。通过同样的方法获得9F11抗体H链和L链可变区的cDNA片断，每个片断(分别命名为rVμ9F11和rVκ9F11)整合到含有用同样方法获得的人IgM抗体H链和L链恒定区基因序列(分别为Cμ和Cκ)的载体中，形成嵌合体抗体，获得重组9F11μ链和κ链的表达质粒(分别为rVμ9F11-Cμ和rVκ9F11-Cκ；图4)。

实施例4.重组抗体的表达

使用COS7细胞(ATCC CRL 1651)中的临时表达体系考察抗体的活性，所述抗体使用表达重组9F11抗体基因的质粒获得，。采用GIBCO Co.的脂质转染试剂盒，使用两种质粒(rVμ9F11-Cμ和rVκ9F11-Cκ)的混合物以及人IgM抗体J链的表达质粒(Cj)导入基因。继续培养2天，其后采用常规培养条件，取回导入了基因的细胞培养物上清液。使用抗人μ-抗体和抗人κ-抗体，用夹层ELISA法检测系统检测培养物上清液，确认培养物上清液中分泌的重组9F11抗体。使用诸如通过用HIV-1的IIIB株感染U937细胞和MOLT-4细胞制备的U937/IIIB和MOLT-4/IIIB细胞，通过FACS分析培养物上清液，抗体被确认具有上述特异性。而且，使荧光标记原始的9F11抗原和培养物上清液同时与U937/IIIB或MOLT-4/IIIB反应，通过此竞争性抑制试验，确认了重组9F11抗体的活性。

随后，表1所列出的9F11抗体μ链和κ链可变区碱基序列被确认为是抗HIV感染活化淋巴细胞表达的分化抗原活性的重要区域。

从这些结果还可确认的是编码μ链可变区和κ链可变区碱基序列的基因对于制备重组抗HIV抗体和抗活化淋巴细胞是决定性的基因。

工业应用性

由于本发明抗活化淋巴细胞表达的分化抗原的人IgM单克隆抗体在补体介导下表现出对活化淋巴细胞的裂解功能，该抗体可用作控制体内异常活化淋巴细胞的药物。本发明还提供编码μ链可变区和κ链可变区碱基序列的基因，该基因对于重组抗活化淋巴细胞抗体有决定性作用。

                        序列表

<110>冈田  则子

     冈田  秀亲

<120>同源补体介导下的人IgM抗体裂解活化淋巴细胞

<130>T-070102-2

<150>2002-227952

<151>2002-07-01

<160>2

<170>专利版本3.1

<210>1

<211>481

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>人u链的可变区

<220>

<221>V区

<222>(1)..(481)

<223>

<400>1

 gctgaattct ggctgaccag ggcagtcacc agagctccag acaatgtctg tctccttcct  60

catcttcctg cccgtgctgg gcctcccatg gggtgtcctg tcacaggtac agctgcagca    120

gtcaggtcca ggactggtga agcccgcgca gaccctctca ctcacctgtg ccatctccgg    180

ggacagtgtc tctagcaaca gtgctacttg gaactggatc aggcagtccc cattgagagg    240

ccttgagtgg ctgggaagga catactacag gtccaagtgg tataatgatt atgcagtatc    300

tgtgaaaagt cgaataacca tcaacccaga cacatccaag aaccagttct ccctgcagct    360

gaactctgtg actcccgagg acacggctgt gtattactgt gcaagagaga attactatgg    420

ttcggggagg tacaactggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc    480

a                                                                    481

<210>2

<211>401

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>人k链的可变区

<220>

<221>V区

<222>(1)..(401)

<223>

<400>2

tgtcaggaca cagcatggac atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct   60

ggttcccagg ttccagatgc gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat   120

ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag   180

cctggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcatccagtt    240

tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca    300

ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt    360

tccctctcac tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa a                        401

Claims (6)

1、一种人IgM单克隆抗体，其特征在于，所述抗体与活化人淋巴细胞和HIV感染细胞反应，在同源人补体介导下裂解细胞。

2、一种抑制免疫的抗HIV药物，所述药物用于治疗移植排斥反应和T淋巴细胞过度活化导致的自身免疫疾病，其特征在于，其中异常的活化淋巴细胞被与活化人淋巴细胞反应的人IgM单克隆抗体裂解清除。

3、根据权利要求1或2的人IgM单克隆抗体，其特征在于，其中与活化的人淋巴细胞和HIV感染细胞反应的人IgM单克隆抗体为9F11抗体，所述抗体包含序列号1表示的H链可变区碱基序列。

4、根据权利要求1-3任一项的人IgM单克隆抗体，其特征在于，其中与活化的人淋巴细胞和HIV感染细胞反应的人IgM单克隆抗体为9F11抗体，所述抗体包含序列号2表示的L链可变区碱基序列。

5、保藏号为FERM PB-8379的细胞株，其特征在于，所述细胞株产生与活化的人淋巴细胞和HIV感染细胞反应的人IgM单克隆抗体，该抗体在同源人抗体介导下裂解细胞。

6、根据权利要求1-4任一项的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体由保藏号为FERM BP-8379的细胞株产生。

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