CN1291106A - 新型免疫疾病预防剂/治疗剂 - Google Patents

Abstract

一种用于免疫疾病的预防剂/治疗剂,它包含作为活性成分的葡萄球菌肠毒素B(SEB)的修饰物或其衍生物,所述修饰是在天然型SEB的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基被取代,其中所述SEB修饰物或其衍生物对T细胞的活化具有抑制活性,它们与T细胞受体(TCR)的特异性Vβ成分相互作用但它们对SEB的免疫反应性降低了,同时没有导致具有特异性Vβ成分的T细胞被消除,这种消除通常由天然型SEB或重组野生型SEB引起。

Description

新型免疫疾病预防剂／治疗剂

发明领域本发明涉及新型的免疫疾病预防剂／治疗剂。更具体地说，本发明涉及诸如类风湿性关节炎、变应性疾病等免疫疾病的新型预防剂／治疗剂，它包含作为活性成分的天然葡萄球菌肠毒素B(下文中也称之为“SEB”)(被认为是一种超级抗原)的修饰物，或其衍生物。

发明背景

自身免疫疾病分为两种类型：器官非特异型自身免疫疾病，诸如类风湿性关节炎(下文中也称作“RA”)，和器官特异型自身免疫疾病，诸如溃疡性结肠炎。它们是由T细胞对自身抗原的反应引起的，通常在免疫耐受之下的所述T细胞在自身组织中因某些原因而激活，对自身抗原产生反应，导致连续的炎症反应，由此损害了组织。在这类情况下，自身抗原分别是构成自身关节的II型胶原或肠粘膜的主要成分。

患有这些疾病的人数每年都有稍许增加，但仍未发现有效的治疗剂或预防剂(“因药物导致的免疫缺陷”，Men-eki Kagaku(免疫科学)，第9卷，285-289页(1984年)，Yuichi Yamamura，Chuzo Kishimoto，RobertA．Good编辑)。目前，为了治疗这些疾病，已采用了药物疗法，包括给药柳氮磺吡啶，5-氨基水杨酸，硫唑嘌呤，6-MP，曲尼司特，甲氨蝶呤，环孢菌素A，或甲硝唑，和给药过量的7S-免疫球蛋白；还采用了手术疗法，诸如胸腺切除术或更换人工关节；或症状疗法，诸如营养疗法〔YoichiIchikawa等，“长期给药甲氨蝶呤和柳氮磺胺吡啶对类风湿性关节炎的功效的研究”，《风湿病》第35卷，663-670页(1995年)；SadaoKashiwazaki，“金诺芬和甲氨蝶呤联合用药对类风湿性关节炎功效的研究”，《风湿病》第36卷，528-544页(1996年)；Takefumi Furutani等，“用低剂量甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎中的有害事件”，《风湿病》第36卷，746-752页(1996年)；Nobuo Watanabe，“对幼年型类风湿性关节炎的药物治疗”，《风湿病》第36卷，670-675页(1996年)；TakayasuYakura，“免疫抑制疗法：自身免疫疾病的治疗”，《Sogo Rinsho》第30卷，3358页，(1981年)；Shin Totokawa等，“有关甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎的研究：寻找更有效的给药策略”，《风湿病》第37卷，681-687页(1997年)〕。然而，这些疗法都没有根除疾病，并且存在会由于长期服药而引起严重的副作用的缺点。因此，需要开发更有效的预防剂／治疗剂和疗法。

众所周知，SEB是一种细菌超级抗原(White J．等，《细胞》第56卷，27-35页，1989年)。与II类主要组织相容性复合体(下文中也称作“MHC”)复合的正常抗原被T细胞抗原受体(下文中也称作“TCR”)识别。这种识别受到II类MHC的单元型的限制，叫做“MHC限制”。相反，超级抗原则不论单元型如何都与II类MHC分子结合，并且进一步与TCR的特异性β链可变区(Vβ链)结合。当这样一种连结形成时，与超级抗原结合的T细胞被瞬间激活，从而促进其分裂和繁殖，并产生炎性细胞因子(Micusan V．V．＆ Thibodean J．，《免疫学研讨》第5卷，3-11页，1993年)。

SEB是一种导致食物中毒的毒素。当对动物静脉给药SEB时可以看到食物中毒的症状，这提示毒性通过上面所提到的SEB的生物学活性产生(Micusan V．V．＆ Thibodean J．，《免疫学研讨》第5卷，3-11页，1993年)。

但是，当对新出生的小鼠静脉或腹膜内给药超级抗原时，具有对该超级抗原敏感的Vβ链的T细胞亚群被清除，使得所述小鼠变得对所述抗原不敏感，即，免疫耐受(White J．等，《细胞》第56卷，27-35页，1989年)。另一方面，当对成年小鼠给药SEB时，如上所述瞬间激活后，具有反应性Vβ7，Vβ8 TCR的T细胞亚群变得对另一种SEB的刺激不敏感，即，变成无反应性的，由此导致免疫耐受。由于SEB具有这种活性，暗示其可能是顽固性自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎或溃疡性结肠炎或免疫疾病的潜在预防剂／治疗剂(日本专利公开第9-110704号)。由于SEB是引起葡萄球菌食物中毒的肠毒素，当其给药到活体中时，其致病性就成为一个问题。按照日本专利公开第9-110704号，通过连续给药高纯度的SEB可避免这种毒性，给药剂量应不会使SEB通过口服途径长时间给药时成为致病的，由此有效地诱导免疫耐受而没有SEB的致病性。

另一种避免SEB毒性的方法是Kappler J．和Marrack P．等在日本专利公开第8-500328号中公开的“突变超级抗原的保护作用”。他们的发明可概述如下：制备SEB突变体并将其纯化，挑选出可与人II类MHC分子和TCR结合的那些SEB突变体。然后，动物在接触SEB之前，将与II类阳性细胞结合到几乎不能与天然型SEB的突变体区别开来但却不会刺激T细胞增殖的SEB突变体注射到动物体内。结果，注射后的动物显示出了对SEB毒性的完全保护。

日本专利公开第8-500328号的最重要的教导是有关可以用于消除SEB毒性的SEB结构的研究。Swaminathan S．等报道了SEB的三维结构(《自然》第359卷，801页，1992年)。SEB分子由两个结构域组成，即，由残基1-120组成的第一结构域和由残基127-239组成的第二结构域。在SEB的N末端，已确定了可影响II类MHC细胞结合和／或TCR结合的三个区域，即，区域1(残基9-23)，区域2(残基41-53)和区域3(残基60-61)。

本发明的公开

基于上述发现，本发明人完成了本发明，本发明提供了用于免疫疾病的新型预防剂／治疗剂，它包含作为活性成分的、能有效地用于预防和治疗免疫疾病同时毒性降低的SEB修饰物或其衍生物。

也就是，本发明提供了用于免疫疾病的预防剂／治疗剂，它包含作为活性成分的葡萄球菌肠毒素B(SEB)的修饰物，所述修饰是在天然型SEB的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基被取代，或其衍生物，其中所述SEB修饰物或其衍生物对于T细胞的活化具有抑制活性，它们与T细胞受体(TCR)的特异性Vβ成分相互作用，但它们对SEB的免疫反应性降低了，同时没有导致具有特异性Vβ成分的T细胞被消除，这种消除通常由天然型SEB或重组野生型SEB引起。

在本发明的第一个方面，SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在9位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是通过位点特异性诱变被除了天冬氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，优选天冬酰胺。

在本发明的第二个方面，SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在23位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是通过位点特异性诱变被除了天冬酰胺以外的蛋白质构成氨基酸取代，优选酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸或赖氨酸。

在本发明的第三个方面，SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在41位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是通过位点特异性诱变被除了异亮氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，优选被精氨酸或苏氨酸取代；外加或者在44位被除了苯丙氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，优选缬氨酸；或者在45位被除了亮氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，优选缬氨酸。

在本发明的第四个方面，SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在44位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是通过位点特异性诱变被除了苯丙氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，优选被丝氨酸取代。

附图的简要说明

图1显示了制备本发明的各种SEB修饰物时用于氨基酸取代的各种PCR引物的核苷酸序列。

图2显示了制备本发明的各种SEB修饰物时用于氨基酸取代的各种PCR引物的核苷酸序列。

图3显示了人外周血单核细胞(PBMC)用野生型SEB和SEB修饰物刺激而产生的TNF-α的量。

图4显示了SEB修饰物的T细胞抑制活性。

图5显示了有效病例中，口服给药SEB修饰物对胶原诱导的关节炎的治疗作用，其中纵坐标轴指示试验小鼠的疾病严重程度。纵坐标轴指示试验小鼠的疾病严重程度，横坐标轴指示SEB修饰物开始给药后的天数。

图6显示了无效病例中，口服给药SEB修饰物对胶原诱导的关节炎的治疗作用。纵坐标轴指示试验小鼠的疾病严重程度，横坐标轴指示SEB修饰物开始给药后的天数。

图7显示了口服给药SEB修饰物对胶原诱导的关节炎的预防作用。纵坐标轴指示试验小鼠的疾病严重程度，横坐标轴指示SEB修饰物开始给药后的天数。

本发明的最佳实施方式

按照本发明，为了制备SEB修饰物，对于影响与II类MHC分子结合的那些修饰物进行了全面研究，但在涉及与TCR结合的部位没有引入修饰。既然超级抗原与II类MHC分子间的键对于超级抗原激活T细胞来说是不可缺少的，因此可预期抑制SEB与II类MHC分子的结合将降低T细胞对SEB的反应性，即，未对TCR结合位点修饰而诱导了无变应性。

对于定义为氨基酸残基9-23的区域1来说，特别研究了可阻断与II类MHC分子结合的、23位为天冬酰胺的修饰物，包括N23D、N23K、N23Y和N23I。还研究了9位为天冬氨酸的修饰物诸如D9N和17位为苯丙氨酸的修饰物诸如F17S。本文中所用的对于修饰物的指示是这样的，即，修饰之前和之后的氨基酸分别显示在发生了修饰的氨基酸残基位置序号的前面和后面。例如，“N23D”的意思是从N末端开始第23位上的“N”(Asn：天冬酰胺)被“D”(Asp：天冬氨酸)取代。

在所有的葡萄球菌肠毒素中，定义为氨基酸残基40-53的区域2对于介导与II类MHC分子的结合来说是最重要的。对于区域2，研究了在41、44、45和53位上的突变。这些氨基酸残基对于与II类MHC分子的结合是特异性的。修饰物通过在残基的41、44、45和53位以及另外的59位的位点特异性诱变通过引入点突变而制备。制得的修饰物是：I41T L45V，I41R F44V，F44S，F44L I53N，和F44L I53N G59W。

对上述SEB修饰物的安全性和有效性进行评估。结果，我们发现，下列具体的SEB修饰物可以用作新型的免疫疾病诸如类风湿性关节炎的预防剂／治疗剂，它们是安全且具优良活性的：

(1)在天然型SEB的基础上在9位有氨基酸取代的SEB修饰物或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了天冬氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，特别是被天冬酰胺取代；

(2)在天然型SEB的基础上在23位有氨基酸取代的SEB修饰物或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了天冬酰胺以外的蛋白质构成氨基酸取代，特别是被酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸或赖氨酸取代；

(3)在天然型SEB的基础上在41位有氨基酸取代的SEB修饰物或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了异亮氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，特别是被精氨酸或苏氨酸取代，外加或者在44位被除了苯丙氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，特别是缬氨酸，或者在45位被除了亮氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，特别是被缬氨酸取代；和

(4)在天然型SEB的基础上在44位有氨基酸取代的SEB修饰物或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了苯丙氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，特别是被丝氨酸取代。

我们还发现，当这些SEB修饰物通过口服途径给药时，可以令人惊奇地产生优良效果。

首先，用诱导的重量损失作为指数来研究SEB修饰物的降低的毒性。重量损失用BALB／c小鼠评估。对小鼠腹膜内给药300μg SEB的PBS(磷酸缓冲盐溶液)溶液，其中除去内毒素直到不会对该实验造成影响的浓度。第二天开始对每只小鼠称重。结果，野生型SEB和D9N显示到给药后的三天重量损失了7-9％，而所有其他SEB修饰物没有显示出任何重量损失。

另外，本发明人研究了这些SEB修饰物的由D-半乳糖胺诱导的致死毒性。据报道，给药D-半乳糖胺可导致小鼠对SEB的敏感度显著增加，例如，当对雌性BALB／c小鼠给药D-半乳糖胺时，SEB的LD50下降到2μg／小鼠，给药20μg／小鼠SEB时，观察到100％死亡(Miethke T．等，《实验医学杂志》第175卷，91-98页，1992年)。

利用该实验系统，本发明人研究了SEB修饰物的致死毒性。结果，48小时后，野生型SEB和D9N显示出致死率分别为9／10和8／10，而I41TL45V显示为3／10，I41R F44V为1／10，F44S为0／10，F44L I53N为0／10，F44L I53N为1／10，F44L I53N G59W为0／10。因此，我们发现，这些SEB修饰物大大降低了致死毒性。这清楚地表明，按照本发明的修饰物不仅可如日本专利公开第8-500328中所述降低毒性，而且可消除致死毒性。

如上所述，预期SEB将是潜在的免疫疾病预防剂／治疗剂。但是，也有报道说，SEB本身与免疫疾病的发作有关(Omata S．等，《细胞免疫学》第179卷，138-145页，1997年)。因此，我们利用一种人类风湿性关节炎的模型-胶原诱导的关节炎(下文中也称之为“CIA”)研究了SEB本身以及本发明的SEB修饰物与免疫疾病的发作之间的关系。通过给药胶原诱导小鼠发生关节炎，对这些小鼠给药天然型SEB和本发明提供的SEB修饰物。在小鼠给药天然型SEB的情况下，关节炎的发病率相当高，且疾病的严重程度也非常高，这提示了SEB与疾病的发作之间的关系。相反，当给药SEB修饰物时，没有观察到严重的关节炎发作。

SEB的某些毒性看来是由于单核因子，尤其是SEB刺激的白细胞产生的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。事实上，人外周血淋巴细胞与SEB反应时产生大量TNF-α。然而，由SEB修饰物产生的TNF-α的浓度非常低，对N23Y的刺激活性是最低的。

如上所述，SEB显示出对增殖、细胞因子的产生等的降低的刺激活性。据估计，这种降低的刺激活性与小鼠的致死毒性的降低密切相关，或者与诱导关节炎的能力的丧失密切相关。不过，令人感兴趣的是，SEB修饰物显示出对T淋巴细胞活化的抑制活性，尽管它们大大降低了对T淋巴细胞的刺激活性。当在抗原呈递细胞存在下用抗原刺激T细胞时，它导致T细胞增殖或T细胞产生细胞因子诸如γ-干扰素(γ-IFN)。但是，向该系统中加入SEB修饰物抑制了这些反应。也就是说，我们发现SEB修饰物与天然型SEB相比不仅显示出降低的毒性，而且获得了天然型SEB未显示出的抑制T细胞活化的附加活性。

在体内也观察到了对T细胞活化的这种抑制作用。在上述实验系统中，当本发明的SEB修饰物在给予与关节炎的发作密切相关的天然型SEB之前给药时，严重关节炎的发作可受到保护，证实了SEB修饰物给药的优良效果。

我们利用胶原诱导的关节炎(CIA)系统研究了本发明的SEB修饰物是否可以通过口服给药用作自身免疫疾病的治疗剂。结果，我们发现，野生型SEB和I41T L45V、I41R F44V、F44L I53N G59W、F44S、N23Y、N23I和N23D修饰物抑制了关节炎的恶化，从而证实了这些SEB修饰物的有效性。在这些修饰物中，N23Y是最强的CIA抑制剂。

因此，按照本发明的包含SEB修饰物的药物可以用作类风湿性关节炎的预防剂／治疗剂，特别是用于口服给药，基于与常规药物相比的对T细胞活化的抑制活性，它们具有降低的毒性和更强的有效性。还预期本发明的SEB修饰物显示出像天然型SEB一样的对炎性肠疾病的预防作用，天然型SEB的作用在日本专利公开第9-110704中公开。

本发明的口服给药的免疫疾病预防剂／治疗剂的特征在于：与用于另外的给药途径的药物相比，它含有极低量的SEB修饰物。这些SEB修饰物，与SEB一样，特异性诱导对带有SEB结合VβTCR的T细胞亚群的弱耐受。另一方面，当它们口服给药时抑制T细胞的炎性活性。

为了制备用于本发明的SEB修饰物，可以不受限制地使用任何方法。例如，可以用下述方法制备SEB修饰物：用基因工程技术生产产生SEB的细胞，并从其分离出所产生的SEB修饰物。

例如，按照下面的简单描述制备野生型SEB(即，用基因工程技术制备的、具有与来自金黄色葡萄球菌的SEB相同的氨基酸序列的SEB)，从该野生型SEB可以推出用于本发明药物的SEB修饰物。

由于SEB的染色体DNA是已知的(Ranelli D．M．等，《美国国家科学院院报》第82卷，5850-页，1985年)，可以用DNA合成仪等制备5’-有义和3’-反义引物。用这些引物与商业上可获得的SEB DNA文库中存在的染色体DNA进行噬斑杂交而得到噬斑。然后用有义引物进行PCR并从所形成的条带提取出DNA。再将提取出的DNA插入到适宜的克隆载体中用于克隆。

克隆化SEB编码基因用限制酶切割，所述限制酶是诸如SacI，HindIII，EcoRI，BamHI，XbaI，SalI和PstI，所得片段加入到用限制酶诸如XmnI，HindIII，EcoRI，BamHI，XbalI和PstI切割的载体中，从而得到重组DNA(Sambrook等，《分子克隆》第二版，第9章，1989年，纽约，Cold spring Harbor Laboratory Press出版)。至于载体，可以适当地使用pTrc99A等的分泌表达载体。

所得重组DNA可以引入到适宜的宿主诸如大肠杆菌中而得到转化体。所述转化体以常规方式培养，培养完成后分离细胞。然后将分离出的细胞以常规方式破裂，从悬浮液中可以得到所需的野生型SEB。在合适的条件下，将野生型SEB方便地分泌到培养物上清液中。在这种情况下，培养物上清液可以用作起始物质。起始物质用纯化方法进行纯化，诸如象带有吸收剂的免疫亲和层析法，抗SEB单克隆抗体结合到该吸收剂上。在不同实验中用于最终制剂的缓冲液优选包括Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液等。

本发明的SEB修饰物可以用上述制备野生型SEB的类似方法制备，但条件是与II类MHC分子结合的位点基于SEB的X射线结构分析数据来进行分析，确定要进行修饰的氨基酸序列的特异性位点，制备适宜的引物，并经PCR引入点突变。

为了保持所制得的野生型SEB或SEB修饰物的活性，使用新鲜制备的产品，或者如果在4℃下储存的话，优选在储存后的大约5天内使用。作为选择，本发明的SEB修饰物可以在合适的明胶、盐、糖、糖醇或氨基酸等环境下储存。

按照本发明，SEB修饰物或其衍生物可以与已知的适宜赋形剂结合并用已知方法配制成本发明的免疫疾病预防剂／治疗剂。本发明药物的剂型可以是适于口服给药的任何剂型，诸如粉末(固体)、溶液或糖浆的形式。例如，在一个优选的实施方案中，SEB修饰物或其衍生物与适宜的赋形剂一起冷冻干燥制成固体制剂，其中赋形剂是例如碳水化合物、糖、糖醇或氨基酸等。在另一个优选的实施方案中，SEB修饰物或其衍生物溶解于生理盐水或具有可接受的紧张性离子强度的适宜缓冲液中制成液体制剂。也可以想到将SEB修饰物或其衍生物溶解于商业上可获得的饮用水中并口服摄取该溶液。至于药物中的内含物，SEB修饰物或其衍生物优选以每次给药0．05μg-50mg(0．001-1，000μg／kg体重)的量存在，优选0．5μg-0．5mg(0．01-10μg／kg体重)。

一剂有效的、包含作为活性成分的SEB修饰物或其衍生物的免疫疾病预防剂／治疗剂可以根据例如受治疗者的年龄、症状或病情严重程度等而改变，并最终可由医师考虑后确定。例如，以SEB修饰物计算，对于成人的有效剂量一般是0．05-50，000μg／天，优选每天口服给药一次或两次总共0．5-500μg。本发明的SEB修饰物可以可选地与其他药物诸如象硫唑嘌呤、环磷酰胺等结合，或者与高分子量抗炎剂诸如抗TNFα抗体结合。

可用本发明的包含SEB修饰物的免疫疾病预防剂／药物治愈的免疫疾病主要是自身免疫疾病，诸如类风湿性关节炎或溃疡性结肠炎。不过，除了自身免疫疾病以外，本发明的免疫疾病预防剂／药物也可用于骨髓移植后的移植物抗宿主疾病，或I型、II型或III型变应性疾病。

本文中所用的本发明的SEB修饰物的“衍生物”是指被进一步修饰的如上所述至少有一个氨基酸残基取代的SEB修饰物。本发明包括在天然型SEB的氨基酸序列内在除了上述SEB修饰物中的特定氨基酸残基以外的任何氨基酸残基上有取代、缺失或插入并且仍然具有与SEB修饰物同等活性的那些SEB衍生物。

工业实用性

按照本发明，可以提供新型的免疫疾病预防剂／治疗剂，所述免疫疾病包括自身免疫疾病如类风湿性关节炎，该预防剂／治疗剂一直是被长期热切需求的。

实施例

本发明利用下列制备和实施例作了更详细的说明，但不应理解为将其限制于此。

制备1(重组SEB修饰物的制备和表达)

1-1 SEB基因的克隆

从CLONOTECH购得金黄色葡萄球菌肠毒素A+B+D的DNA文库并进行噬斑杂交。使用合成反义DNA或PCR片段作为探针。在引物的两端加上SalI切割位点，用于促进随后的克隆过程。

收集引物与之结合的那些噬斑。用有义引物进行PCR，从所得条带中提取出DNA并将其克隆到PCR-II载体(Invitrogen)中。表1中描述了上述杂交中使用的引物。表1反义：5’-AAG TCG ACA ATA TTA GAA AAG GCA GGT ACT-3’(SEQ ID NO：1)      SalI有义：5’-ATG TCG ACT TAA TTG AAT ATT TAA GAT TAT-3’(SEQ ID NO：2)      SalI

随后，用自动测序仪确定DNA的核苷酸序列。所得SEB基因含有启动子区(SEB-Pro)。为了得到没有启动子区的SEB基因，进一步用表2中所列的引物进行PCR，并将所得DNA片段克隆到PCR-II载体中。表2有义：5’-AAG TCG ACA AAA AAT GTA TAA GAG ATT ATT-3’(SEQ ID NO：3)      SalI反义：5’-AAG TCG ACT TTC ACT TTT TCT TTG TCG TAA-3’(SEQ ID NO：4)      SalI

用自动测序仪确定所得SEB基因的DNA的核苷酸序列。我们发现，由此所得的SEB基因不含任何突变。该没有启动子区的SEB基因用SalI切割并克隆到具有相同切割位点的分泌表达载体pTrc99A(PharmaciaBiotech)中。使用该基因以正确方向插入的载体，用IPTG诱导表达，从而确认SEB的表达和分泌。

1-2聚合酶链式反应(PCR)

如Saiki等在《科学》1988年第239卷，第487页中所述，用Taq聚合酶和Perkin Elmer Cetus(Norwalk，CT，USA)的DNA热循环仪进行PCR。每个循环由用于变性和释放复制模板DNA的变性过程(94℃下1分钟)、用于将引物和模板退火的退火过程、以及用于合成的延伸过程(72℃下2分钟)组成。总共重复30-35次循环。模板以1-10M的浓度存在，寡核苷酸引物以1mM的浓度存在。dNTP的浓度为200mM，但当引入突变时，一个dNTP的浓度降低至20mM。

1-3重组SEB修饰物的制备和表达

利用基因重组技术制备并表达仅带有氨基酸残基取代的SEB修饰物。按照Marrack P．等(《实验医学杂志》第171卷，第445页，1990年)的教导，对SEB的与II类MHC分子结合有关的区域进行修饰。表3显示了引入氨基酸残基取代的位点。表3

要修饰的位点        改变                标识

    D9   　　         Asn→Asp         　　     D9N

   F17       　　     Phe→Ser      　　   　     F17S

   N23       　　     Asn→Asp    　　   　      N23D

   N23      　　      Asn→Tyr        　　 　    N23Y

   N23       　　     Asn→Ile        　　   　  N23I

   N23       　　     Asn→Lys          　　    N23K

 D9，N23     　　     Asp→Asn      　　      D9N N23D

              　 　　   Asn→Asp

   F44          　　  Phe→Ser    　　          F44S

 F44，I53        　　 Phe→Leu    　　        F44L I53N

           　　       Ile→AsnF44，I53，G59     　　  Phe→Leu        　　   F44L I53N G59W

         　　         Ile→Asn

      　　            Gly→Trp

 I41，F44      　　   Ile→Arg         　　   I41R F44V

            　　      Phe→Val

 I41，L45     　　    Ile→Thr      　　      I41T L45V

          　　        Leu→Val

1-4氨基酸取代的引入

将插入到PCRII载体中的SEB-Pro基因用作模板DNA，利用PCR分别在5’和3’末端引入SfiI和NotI位点。将所得DNA片段插入pTrc99ApelB载体中，通过测序确定核苷酸序列。制备用于PCR的在有义和反义位点上的每种引物，在核苷酸序列中产生突变，以使所需位点上的天然氨基酸残基转变为每种SEB修饰物所需的氨基酸残基。首先将反义位点上的引物(D9N，N23I，N23Y，N23D，N23K，F17S，F17S N23D)-SEB用于制备。然后，利用引入SfiI位点的引物作为有义引物进行PCR。

图1和图2显示了用于制备SEB修饰物的PCR引物的核苷酸序列(SEQID NO：5-19)。

随后，利用先前用有义引物制得的引入NotI位点的引物作为反义引物进行PCR。然后利用所得到的两种DNA片段进行PCR。将所得DNA片段克隆到pTrc99A中。然后该载体用SfiI和NotI处理，以研究该载体是否被切割成所需大小的DNA片段。测定具有所需大小的那些DNA片段的核苷酸序列，以确认正确地引入了突变。

1-5 SEB修饰物的表达和所述修饰物的制备

用插入到pTrc99A载体中的修饰基因表达SEB修饰物。带有掺入基因的大肠杆菌细胞在培养基中在37℃下培养18小时，其中培养基中溶解有4％CORCLEGROW(BIO IOI公司，Vista，CA，USA)和氨苄青霉素(50mg／ml)。收集细胞并将它们悬浮于相同的培养基中至550nm下光密度为0．3-1．0。向其中加入2mM异丙基-B-D(-)-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，该混合物在37℃下振摇过夜而诱导表达。诱导完成后，通过离心除去宿主大肠杆菌细胞，上清液通过0．45μm滤膜过滤。

由此制得的上清液通过Sepharose 4B柱，抗SEB单克隆抗体SA58-2-6IgG固定在该层析柱上，所以上清液中的SEB修饰物被吸附。该柱用0．1M Tris HCl(pH8．0)洗涤，然后用4M MgCl₂洗脱。洗脱的级分用20倍体积的生理盐水透析三次，然后用20倍体积的PBS透析两次。本文中制得的所有SEB修饰物都可用上述单克隆抗体柱纯化。

实施例1(小鼠致死毒性试验)

天然型SEB不提供小鼠致死毒性。但是，如Miethke T．等报道(《实验医学杂志》第175卷，91-98页，1992年)，已知当事先给药D-半乳糖胺时，静脉或腹膜内给药20μg／小鼠SEB可导致小鼠死亡。因此，为了研究SEB修饰物是否能降低死亡率，对事先接受了D-半乳糖胺的小鼠给药SEB或SEB修饰物。

首先研究对内毒素的敏感度。对BALB／c小鼠给药20mg／小鼠D-半乳糖胺后，对该小鼠静脉给药来自大肠杆菌B4菌株的LPS(脂多糖)，24小时后测定死亡率。结果，在不超过1ng／小鼠LPS的剂量下未观察到死亡(表4)。

表4

    剂量       死亡数／总数

  1μg／只        7／9

  100ng／只       8／9

  10g／只         5／9

  1ng／只         0／9

  0．1ng／只      0／9

降低SEB修饰物样品中的内毒素含量，使最终剂量成为不超过10ng／小鼠，将雄性小鼠用于实验。在雄性小鼠的情况下，给药D-半乳糖胺后SEB的致死毒性不少于100μg／小鼠。因此，SEB修饰物以100μg／小鼠的剂量给药。如表5中所示，天然型SEB、野生型SEB和D9N-SEB显示出较高的死亡率，指示此剂量有致死毒性。然而，在其他SEB修饰物中，致死毒性大大降低。本文中所用的“天然型SEB”是指来自金黄色葡萄球菌的肠毒素。本文中所用的“野生型SEB”是指与天然型SEB具有相同氨基酸序列并利用基因工程技术制备的SEB。

表5

  SEB修饰物               死亡率

 (100μg／只)         (死亡总数／总数)

                    24小时后       48小时后天然型       8／10    　　　    8／10野生型       7／10          　　　　9／10D9N          　　  6／10        　　　  7／10I41T L45V              3／10        　 　　 3／10I41R F44V              0／10          　　　0／10F44L I53N              0／9           　　　0／9F44L I53N G59W       0／10         　 　0／10F44S                  　　 0／10     　 　  0／10N23I                   　　0／10       　 　  0／10N23D                   0／10          0／10N23Y                   0／10          0／10N23K                   0／10          0／10PBS                    0／10          0／10

用雌性BALB／c小鼠进行相同实验。在雌性小鼠的情况下，当给药40mg／小鼠D-半乳糖胺时，用20μg／小鼠SEB观察到了高致死毒性。在天然型SEB、野生型SEB和D9N-SEB的情况下产生了较高死亡率。然而，其他SEB修饰物显示出较低的死亡率，证明致死毒性降低了。

实施例2(人外周血单核细胞(PBMC)用SEB或SEB修饰物刺激后TNF-α产生情况的比较)

利用淋巴细胞分离试剂(Pharmacia)从健康成人采集外周血单核细胞(PBMC)，并将其悬浮于含有10％FCS的RPMI1640培养基中，使浓度为1×10⁶细胞／ml。将该细胞悬浮液(100ml)加入到96孔微量滴定板(Falcon)中，然后加入SEB或SEB修饰物溶液(100ml)，该滴定板在37℃下温育24小时。24小时后，收集培养物上清液，用人TNF-α的酶免疫测定试剂盒(Biosource)定量分析上清液中的TNF-α。结果显示在图3中。当PBMC用SEB刺激时，产生了大量TNF-α。相反，当PBMC用SEB修饰物刺激时，TNF-α的产生显著降低。其中，N23Y显示是最低的，即，与SEB相比的特异性活性为千分之一或更小。

实施例3(SEB修饰物对T细胞的抑制活性)

用对纯化肽衍生物(PPD)有反应的小鼠T细胞系PPD914来评价SEB修饰物对T细胞的抑制活性。该T细胞系是Vβ8 TCR阳性的，不仅对其抗原PPD有反应，而且对SEB有反应。1×10⁴PPD914和来自DBA／1J的5×10⁵丝裂霉素处理的脾细胞在96孔微量滴定板(Falcon)上培养并加入0．5mg／ml PPD刺激。向该系统中加入SEB修饰物(1mg／ml)并在37℃下继续培养48小时。48小时后，以0．5mCi／孔的浓度加入氚胸苷，再继续培养16小时，测定增殖情况。通过与不存在SEB修饰物时得到的结果进行对比来评估SEB修饰物的抑制活性。结果显示于图4中。SEB修饰物N23Y和F44S抑制了T细胞由其抗原PPD诱导的增殖。

实施例4(在胶原诱导的关节炎(CIA)中对SEB修饰物安全性的评价)

对DBA／1小鼠真皮内给药200μg／小鼠的牛II型胶原和弗氏完全佐剂，从而诱导小鼠产生胶原诱导的关节炎(CIA)。牛II型胶原给药21天后，对小鼠腹膜内给药各50μg／小鼠的SEB、F44S或N23D。一周后(最初给药胶原后28天)，比较关节炎的发病率。表6总结了关节炎的发病率和严重程度的结果。用SEB给药的8只小鼠中有5只观察到重度关节炎。相反，用F44S或N23D给药的小鼠未发现关节炎。

表6初次免疫接种     　增强       发病率        严重程度

  胶原           SEB       　　  5／8    　      6．2

  胶原           F44S     　　   0／8      　　     -

  胶原           N23D     　　   0／8         　　  -

实施例5(SEB修饰物对SEB诱导的关节炎的预防作用)

对如实施例4中所述用胶原诱导的小鼠给药牛II型胶原18天后，腹膜内给药各50μg／小鼠的F44S或N23D和作为对照的磷酸盐缓冲液。三天后，对小鼠腹膜内给药50μg／小鼠的SEB。如表7中所示，给药磷酸盐缓冲液的8只小鼠中有4只观察到了关节炎(发病率50％)。相反，事先给药F44S或N23D使发病率分别降低至13％和25％。

表7初次免疫      预处理      加强       发病率       严重程度胶原          PBS        　　 SEB    　    4／8       　  　　6．5胶原          F44S       　　 SEB    　 　  1／8       　　  5．0胶原          N23D        　　SEB      　  　2／8     　    　2．5

实施例6(SEB修饰物经口服给药后对胶原诱导的关节炎(CIA)的治疗作用)

如实施例4中所述对DBA／1小鼠进行CIA诱导，21天后腹膜内给药牛II型胶原进行加强。通过测量关节炎得分来观察CIA的发作。比较CIA的严重程度，而实验开始时疾病的严重程度是相同的。对于口服给药，测定每天每只小鼠摄取的水的量并计算其平均值。将小鼠分成数组，以使每组中小鼠摄取的水的平均量可以适当地分开。

分成几组后，实验开始，其中小鼠可以不受限制地饮水，由此摄取SEB修饰物并观察疾病的减少情况。一周对每只小鼠的疾病打分一次，记录疾病严重程度的变化。这些结果显示于图5和图6中。至于CIA症状的减少和对CIA恶化的抑制活性，I41R F44V、I41T L45V、D9N、N23K、F44S、N23I和野生型SEB显示是有效的。基于各实验组中的关节炎得分，利用给药PBS的各组(CIA发作的组)和给药SEB修饰物的各组之间的Wilcoxon检验进行显著性检验。结果发现，在疾病发作后的25-75天内，在小于0．05的置信度下，上述所有SEB修饰物都是显著的，因此可以减轻CIA的症状。因此，具有降低的毒性和对CIA保持功效的SEB修饰物的功效得到了证明，这提示这些SEB修饰物将是潜在的用于口服给药的人类风湿性关节炎的治疗药物，它们具有低得多的毒副作用。

另一方面，在Wilcoxon检验中，与PBS给药组对比，在置信度为0．05时，D9N N23D、F17S E22D和N23Y F208L不是显著的。

实施例7(SEB修饰物经口服给药对胶原诱导的关节炎(CIA)的预防作用)

如实施例4中所述，在DBA／I小鼠的尾部真皮内给药悬浮于CFA中的200μg牛II型胶原用于免疫接种。免疫接种20天后，每隔一天给这些小鼠口服溶解于生理盐水中的各0．5mg／小鼠的SEB修饰物。初次接种后的第30天，腹膜内给药100μg胶原(加强)。观察关节炎的消失时间和得分，以评价SEB修饰物的CIA抑制活性。如图7所示，即使在加强前10天给药SEB修饰物，它们也抑制了CIA，这证明了SEB修饰物对关节炎的预防作用。在这些SEB修饰物中，N23Y是最好的，它能显著减轻关节炎。

                                       序列表&#60110&#62Juridical Foundation the Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute&#60120&#62新型免疫疾病预防剂／治疗剂&#60130&#62661202&#60150&#62JP 10-50137&#60151&#621998-02-15&#60160&#6219&#60210&#621&#60211&#6230&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#621aagtcgacaa tattagaaaa ggcaggtact                                     30&#60210&#622&#60211&#6230&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的有义引物&#60400&#622atgtcgactt aattgaatat ttaagattat                                     30&#60210&#623&#60211&#6230&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的有义引物&#60400&#623aagtcgacaa aaaatgtata agagattatt                                     30&#60210&#624&#60211&#6230&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#624aagtcgactt tcactttttc tttgtcgtaa                                     30&#60210&#625&#60211&#6266&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#625ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaaa cgagttgcac    60aaatcg                                                               66&#60210&#626&#60211&#62104&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#626ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaga tgagttgcac    60aaatcgagta aattcactgg tttgatggaa attatgaaag tttt                     104&#60210&#627&#60211&#62104&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#627ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaga tgagttgcac    60aaatcgagta aattcactgg tttgatggaa aaaatgaaag tttt                     104&#60210&#628&#60211&#62104&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#628ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaga tgagttgcac    60aaatcgagta aattcactgg tttgatggaa tatatgaaag tttt                     104&#60210&#629&#60211&#62104&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#629ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaga tgagttgcac    60aaatcgagta aattcactgg tttgatggaa gatatgaaag tttt                     104&#60210&#6210&#60211&#62104&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#6210ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaaa cgagttgcac    60aaatcgagta aattcactgg tttgatggaa gatatgaaag tttt                     104&#60210&#6211&#60211&#6290&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#6211ctcgcggccc agccggccat ggccgagagt caaccagatc ctaaaccaga tgagttgcac    60aaatcgagta aatccactgg tttgatggaa                                     90&#60210&#6212&#60211&#6233&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的有义引物&#60400&#6212aaatctatag atcaatctct atactttgac tta                                33&#60210&#6213&#60211&#6233&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#6213taagtcaaag tatagagatt gatctataga ttt                                 33&#60210&#6214&#60211&#6233&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的有义引物&#60400&#6214tctatagatc aatttgtata ctttgactta ata                                 33&#60210&#6215&#60211&#6233&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#6215tattaagtca aagtatacaa attgatctat aga                                 33&#60210&#6216&#60211&#6242&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的有义引物&#60400&#6216ataaacgtta aatctcgtga tcaagttcta tactttgact ta                       42&#60210&#6217&#60211&#6242&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#6217taagtcaaag tatagaactt gatcacgaga tttaacgttt at                       42&#60210&#6218&#60211&#6260&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的有义引物&#60400&#6218aaatctatag atcaactgct atactttgac ttaatatatt ctaacaagga cactaagtta    60&#60210&#6219&#60211&#6260&#60212&#62DNA&#60220&#62&#60223&#62计划用于通过PCR扩增制备SEB变体的反义引物&#60400&#6219taacttagtg tccttgttag aatatattaa gtcaaagtat agcagttgat ctatagattt    60

Claims (13)

1、一种免疫疾病预防剂／治疗剂，它包含作为活性成分的葡萄球菌肠毒素B(SEB)的修饰物，所述修饰是在天然型SEB的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基被取代，或其衍生物，其中所述SEB修饰物或其衍生物对于T细胞的活化具有抑制活性，它们与T细胞受体(TCR)的特异性Vβ成分相互作用，但它们对SEB的免疫反应性降低了，同时没有导致具有特异性Vβ成分的T细胞被消除，这种消除通常由天然型SEB或重组野生型SEB引起。

2、如权利要求1所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，其中所述SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在9位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了天冬氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代。

3、如权利要求2所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，其中所述SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在9位有天冬酰胺取代的SEB。

4、如权利要求1所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，其中所述SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在23位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了天冬酰胺以外的蛋白质构成氨基酸取代。

5、如权利要求4所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，其中所述SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在23位有酪氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸或赖氨酸取代的SEB，或其衍生物。

6、如权利要求1所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，其中所述SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在41位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了异亮氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，外加或者在44位被除了苯丙氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代，或者在45位被除了亮氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代。

7、如权利要求6所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，其中所述SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在41位有精氨酸或苏氨酸取代、外加或者在44位有缬氨酸取代或者在45位有缬氨酸取代的SEB或其衍生物。

8、如权利要求1所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，其中所述SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在44位有氨基酸取代的SEB或其衍生物，所述氨基酸取代是被除了苯丙氨酸以外的蛋白质构成氨基酸取代。

9、如权利要求8所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，其中所述SEB修饰物或其衍生物是在天然型SEB的基础上在44位有丝氨酸取代的SEB或其衍生物。

10、如权利要求9所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，它用于口服给药。

11、如权利要求10所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，它是具有生理学上可接受的pH和离子强度的水溶液。

12、如权利要求11所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，其中有选自下列成员的物质存在：碳水化合物、糖、糖醇和氨基酸，它们的量足以使该溶液具有生理学上可接受的紧张性。

13、如权利要求1-12任一项所述的免疫疾病预防剂／治疗剂，它用于类风湿性关节炎的预防／治疗。

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