WO2004087915A1

WO2004087915A1 - Ｓｅｂ改変体およびそれを含有する免疫異常性疾患の予防・治療用剤

Info

Publication number: WO2004087915A1
Application number: PCT/JP2004/004184
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Nakashima; Takumi Sasaki; Kazuhiko Kimachi; Shigeki Kuwata; Tsukasa Nishihara; Atsuko Sakata; Masao Ohkuchi; Tomoyuki Koshi; Toshiyuki Edano
Original assignee: Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute; Kowa Company, Ltd.
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-25
Publication date: 2004-10-14
Also published as: ATE461277T1; US8226958B2; US20070166331A1; DE602004026039D1; EP1609860A1; EP1609860A4; JPWO2004087915A1; EP1609860B1; JP4516914B2

Abstract

　スーパー抗原の一つとして知られる黄色ブドウ球菌腸管内毒素Ｂ（ＳＥＢ）の中和抗体によって中和されることなく、スーパー抗原として有効に作用しうる新規な免疫異常性疾患の予防・治療用剤を提供する。ＳＥＢに対する中和抗体（抗ＳＥＢ抗体）との反応性を低減させたＳＥＢ改変体および該改変体を有効成分として含有する免疫異常性疾患の予防・治療用剤。本願発明のＳＥＢ改変体は、ＳＥＢのアミノ酸配列、とりわけ抗ＳＥＢ抗体によって認識されるエピトープ部位のアミノ酸配列でアミノ酸置換を行うことにより、進化分子工学的手法により得ることができる。

Description

明細書

S E B改変体およびそれを含有する免疫異常性疾患の予防■治療用剤技術分野

本願発明は、新規な免疫異常性疾患の予防■治療用剤に関する。更に詳細には、細菌性スーパー抗原の一つとして知られる黄色ブドウ球菌腸管内毒素 B

(Staphylococcal enterotoxin B；以下、「SEB」と呼称する）の改変体おょぴ該改変体を有効成分として含有する関節リゥマチ、アレルギー性疾患等の免疫異常性疾患の予防 ·治療用剤に関する。

背景技術

自己免疫疾患は、関節リウマチ（Rheumatoid arthritis ；以下、「RA」と呼称することがある）等の非特異的自己免疫疾患と潰瘍性大腸炎等の臓器特異的自己免疫疾患とに大きく分けられる力通常は免疫学的寛容の状態にある自己の抗原に対して応答する Τ細胞が、何らかの原因で自己の組織内で活性化され自己抗原と応答するようになり、これが持続的な炎症反応となって組織に障害を与えることに起因するものである。その場合の自己抗原とは、それぞれ自己の関節の成分である II型コラーゲンや消化管粘膜の主成分である。

これらの疾患の患者数は毎年、僅かながら増加しているにもかかわらず、今なお有効な治療薬や予防方法は見出されていない（山村雄一、岸本忠三、ロバ一ト · A ·グッド編、「薬剤による免疫不全」、免疫科学、 1984年、 9卷、 p. 285-289) 。現在これらの疾患の治療には、サラゾピリン、 5—アミノサリチル酸、ァザチォプリン、 6— MP、トラニラスト、メトトレキセ一ト、シクロスポリン A、メタ口ダニゾールの投与および 7 S—免疫グ口プリンの大量投与等の薬物療法や胸腺摘出術、人工関節への置換術等の外科的療法、更には栄養療法等の対症療法が行われている（市川陽一ら、「慢性関節リウマチにおけるメトトレキサートおよびサラゾスルフアビリジン長期投与例の検討」、リウマチ、 1 995年、 35卷、 p.663— 670 ;柏崎禎夫、「慢性関節リゥマチに対するオーラノフィンとメトトレキサートによる併用療法の検討」、リウマチ、 19 96年、 36巻、 p. 528— 544 ;古谷武文ら、「慢性関節リゥマチにおける低用量メトトレキセ一ト療法の有害事象」、リゥマチ、 1996年、 36巻、 p. 746-752 ;渡辺言夫、「若年性関節リゥマチの薬物療法」、リゥマチ、 1996年、 36卷、 p.670— 675 ;八倉隆保、「免疫抑制療法 · 自己免疫疾患の治療」、総合臨床、 1981年、 30卷、 p. 3358 ；および都外川新ら、「慢性関節リゥマチにおけるメトトレキサ一ト療法の検討一有効性のより高い投与法を求めて一」、リウマチ、 1997年、 37卷、 p.681—68

7) 。しかしながら、これらは根治的な療法とはいえず、むしろ長期服用によるため重篤な副作用の原因ともなり、より有効な予防 ·治療薬、治療法の開発が望まれいる。

SEBは黄色ブドウ球菌によって産生されるェンテロトキシン（腸管毒；毒素型食中毒の原因毒素）の 1種である。 SEBは 239個のアミノ酸残基よりなり、そのアミノ酸配列も知られている。 S EB分子は 2つのドメィンから構成され、最初のドメインは残基 1〜120よりなり、 2番目のドメインは残基 127~2 39よりなる。また、 S E Bの N末端部分にはクラス I I主要糸且織適合遺伝子複合体（Major Histocompatibility Complex；以下、「MHC」と呼称する）分子結合および/または T細胞抗原受容体（T cell antigen receptor；以下、「TCR」と呼称する）結合に影響を与える 3つの領域（領域 1 (残基 9〜2 3) 、領域 2 (残基 41〜53) および領域 3 (残基 60〜61) ) が同定されている。

SEBは周知のように細菌性スーパー抗原の 1種である（ホワイト（White J.) ら、 Cell, 1989, vol. 56, p.27 - 35) 。通常の抗原は MH Cと複合体を形成した状態で T細胞上の T C Rに認識され、しかもその認識はクラス I I MHC 分子のハプロタイプに限定される (これを「MHC拘束性」という）。これに対してスーパー抗原は、クラス I I MHC分子のハプロタイプに非拘束性に結合し、さらに特定の TCRの鎖領域（Vi3鎖）に結合する。その結果、スーパー抗原が結合した T細胞は一時的に活性化され分裂増殖を引き起こし、炎症性のサイト力インを産生する（ミクサン（Micusan V. V. ) およびチボディーン

(Thibodean J. ) ， Semi nor s in Immunology, 1993， vol. 5, p.3-11) ₀

スーパー抗原を新生マウスに静脈内あるいは腹腔内投与すると、これに応答する V]3TCRをもった T細胞亜集団が除去され、同じス一パー抗原に対して応答しなくなるトレランスの状態になる。一方、成体のマウスに投与した場合、そのスーパー抗原に結合する V ]3 T C Rを持つ T細胞がスーパー抗原の再刺激に対して応答しなくなる状態、すなわち、ァナジ一が誘導されトレランスの状態になる。このようなスーパー抗原の特徴は通常の抗原認識とは異なっている。特定の V β TCRを持つ Τ細胞にトレランスを誘導するという性質は、ある種の免疫異常性疾患、特に I型ァレルギ一性疾患や自己免疫疾患の予防もしくは治療に応用できる可能性を示唆している。事実、疾患モデルマウスの系を用いて SEBを投与することで発症抑制が可能となったという報告がなされている。

キム（Kim C. ) らは全身性エリテマトーデス（Systemic lupus

erythematosus；以下、「S LE」と称する) のモデルマウスである MR L/ 1 p rマウスのループス腎炎が、 SEBをあらかじめ投与しておくことにより発症を抑制できることを報告した (キム（Kim C.) ら、 Journal of Experimental Medicine, 1991， vol. 174, p.1131) 。またロット（Rott 0. ) らは実験的ァレノレギ一十生月脊髓膜炎 (Experimental Allergic Encepharomyelitis；以下、「E AE」と称する）の系で前もって S EBを投与し、 SEB応答性の VjS 8 TCR を持つ T細胞をトレランス状態にしておくことで発症が抑制できたことを報告し † {,ΐ¹ y (Rott 0. j ら、 International and National immunology, 1991, vol. 4, p.347) 。これらの結果は、 S EBをワクチン的に用いることで特定の自己免疫疾患の発症を予防できる可能性を示唆するものである。

し力しながらこれらの実験では S E Bの投与方法は静脈内もしくは腹腔内であり、投与量も 1匹当たり 1 0 Ο μ g前後とかなり多い。このような投与量ではマゥスに対して無視できない程度の病原性をもたらすことは必至であり、また抗原性や免疫原性も問題となる。特にスーパー抗原の大量投与は、前述のごとく T細胞亜集団や抗原提示細胞の一時的な活性化を引き起こし、炎症性サイトカインの産生亢進を招き、体内に急激な炎症状態を惹起するという問題がある。また桑畑らはヒトの場合、就学年齢以上の児童では血中にほぼ 1 00%抗 SEB抗体を保有し、更に、唾液等での解析から約 5 0%に抗 I g A抗体が検出されることを報告している（桑畑（M. Kuwahata) ら、 Acta Pediatrics Japonica, 1996, 38， p.1-7) 。また折口らはリゥマチ患者血清中の I gM型抗 S E B抗体が有意に高値を示すことを明らかにしている（折口（Origuchi) ら、 Annals of the

Rheumatic Disease 1995， 54, p. 713- 720)。更に西らは、ヒト血清中の抗 S E B 抗体の主要ェピトープが C端側に存在し、この領域に対する抗体は S E Bの中和抗体であることを明らかにしている（西（Jun- Ichiro Nishi) ら、 The journal of Immunology, 1997, 158， p. 247-254) 。このことは S E Bをヒトに投与した場合、抗体によって S E Bの生物活性が中和され、体内から排除されることを意味する。そこで西らは遺伝子工学的手法を用いて C端の主要ェピトープを欠如した欠損変異体を構築した。しかしながら、このようにして調製した S E B改変体は不溶性にしか発現せず、充分な評価'解析ができなかった。また、薬剤としての安定供給にも対応できなかつた。

本発明者らは、スーパー抗原の大量投与に関連する問題について、高度に精製した S E Bを病原性を与えない投与量で連続的に長期間経口投与することにより、有効にトレランスを誘導する方策 (特開平 9— 1 1 0 7 0 4 ) 、ならびに S E B の分子改変を行って本来の S E Bの有する毒性を軽減しつつも、免疫異常性疾患の予防■治療に効果を棻揮する S E B改変体およびそれらの誘導体を構築し、その有用性を証明してきた（W0 9 9 / 4 0 9 3 5 ) 。

¾明 Φ闘示

(発明が解決しようとする技術的課題）

上記のように S E Bを天然のままでヒトに投与した場合、生体に存在する抗 S E B抗体によって S E Bの生物活性が中和され、最終的には体内から排除されて

S E Bによる所望の効果を期待できないという問題がある。そのため、遺伝子ェ学的手法を用いて S E Bの C端の主要ェピトープを欠如した欠損変異体も構築されているが、このようにして調製した S E B改変体は不溶性にしか発現せず、それゆえ充分な評価 ·解析ができておらず、薬剤としての安定供給にも対応できな力つた。

(その解決方法）

本発明らは、上記の S E Bの抗原' I"生に関連する問題を回避するため、進化分子工学的手法（試験管内生物進化）を用いて鋭意研究したところ、天然型の S E B あるいは既知の S E B 3女変体にァミノ酸置換を導入し、これら改変体の中からスクリーニングすることによって、抗 SEB中和抗体との結合性が減弱し、かつ大腸菌で可溶性に発現可能で水溶液中における安定性を保持し、さらに天然の S E Bと同等の免疫異常性疾患の改善作用を保持した S E B改変体を調製することができた。

本願発明は、黄色プドウ球菌腸管内毒素 B (SEB) に対する中和抗体（抗 S

E B抗体〉との反応性を低減させた S E B改変体を提供する。

(従来技術より有効な効果）

本願発明の S E Bェピトープ改変体は、 S E Bに対する中和抗体との反応性が低減し、且つ N23Y [SEBの 23位のァスパラギン残基をチロシン残基に置き換えた変異体； WO 99/40935 (PCT/J P 99/00638) ] と同等の C I A (コラーゲン誘導性関節炎) 症状改善効果があることが示された。更にこれらのェピトープ改変体は可溶性に分泌発現が可能であり、関節リゥマチ、了レルギ一性疾患等の免疫異常疾患の有効な予防 ·治療用剤としての使用が期待される。

図面の鐘単な説明

図 1は、抗 SEB中和モノクローナル抗体 S A 58— 2を用いて、 SEBによるヒト PBMC (末梢血単核球）活性化の抑制試験の結果を示す。

図 2は、本願発明の S E Bェピトープ改変体の、抗 SEB中和モノクローナノレ抗体 SA58-2 (A) 、あるいはヒト抗 SEB抗体 (B) との反応性を示す。図 3は、本願発明の S E Bェピトープ改変体でヒト PBMCを 3日間刺激して、細胞の増殖応答をトリチウム一チミジンのカウントで測定した結果を示す。

図 4は、本願発明の S E Bェピトープ改変体でヒト PBMCを 6日間刺激して、細胞の幼若化反応をフ口一サイトメトリ一で測定後、幼若化の割合をパーセントで示す。

図 5は、本願発明の S E Bェピトープ改変体でヒト PBMCを 2日間刺激し、培養上清中に分泌される各種サイトカインを EL I SA法で測定して得られた結果（B) 、および該測定値を野生型 SEBに対する相対値で表したもの（A) を示す。

図 6は、本願発明の S E Bェピトープ改変体についてマウスのコラーゲン誘導性関節炎（C I A) モデルで四肢の腫脹の抑制を評価した結果を示す。

図 7は、本願発明の S E Bェピトープ改変体についてマウスのコラ一ゲン誘導性関節炎モデルで骨破壊の抑制を評価した結果を示す。

図 8は、本願発明の SEBェピトープ改変体を経口投与したマウスの血中の抗 SEB抗体価 (A) およぴ抗 47— C 7抗体価（B) の測定値（450 nmの吸光度の値）を示す。

発明を実施するための最良の形態

本願発明の S E B改変体は、 S E Bのァミノ酸配列に任意のァミノ酸置換を導入することにより抗 SEB抗体との反応性を低減させたものである。かかるアミノ酸置換の導入は、とりわけ SEBのアミノ酸配列中の抗 SEB抗体ェピトープ認識部位で行うのが好ましい。

S EBのアミノ酸配列中のアミノ酸置換部位として本願発明において特に好ましいのは、 SEBのアミノ酸配列 (配列番号 1 ) 中の 226位の Ly sから 22 9位の Ly sまでの領域である。

本願発明に従って抗 S E B抗体との反応性を低減させた S EB改変体の具体例としては、 S E Bのァミノ酸配列中の 226位から 229位までのァミノ酸配列が以下のものが挙げられる：

(1) L e uP h eA l aA l a (配列番号 2) ；

(2) A l a Th r Th r G l n (配列番号 3 ) ；

(3) Ly s Ar g I 1 e I 1 e (配列番号 4) 。

本願発明による SEB改変体はまた、上記アミノ酸置換とともに SEBのアミノ酸配列中の 23位の A s nが Ty rで置換されているものをも包含する。本願発明はさらに、本願発明に従って得られる SEB改変体を主成分として含有し、 SEBに対する免疫学的応答性を低下させ、 T細胞活性化の抑制作用を有するものであることを特徴とする、免疫異常性疾患の予防■治療用剤をも提供する。免疫異常性疾患としては、たとえば、関節リウマチ、アレルギー性疾患、およびこれらに類似の疾患が挙げられる。

本願発明による S E B改変体を調製するに際して採用した「進化分子工学的手法」とは、自然界における生物進化（自然淘汰）の過程（あるタンパク質中の 1 つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換される確率は、およそ 1回 Zl 000万年であるといわれている）を試験管内で人為的に急加速させて有用なタンパク質等をデザインしょうとするものであり、自然界では何万年とかかる進化（新機能獲得、機能向上等）を数ケ月で行わせることが可能である。

本願発明では、抗 S E B中和抗体との結合性の低減した S E B改変体を調製するため、抗 S E B中和抗体によつて認識される SEB中のェピトープ部位においてァミノ酸置換をランダムに導入し、得られた改変体の中から抗 S E B中和抗体との結合性の低減した改変体をスタリーェングした。上記のように、 S E Bの主要ェピトープは C末端 (225〜234位) に存在することがわかっているので、本願発明ではこのうち 226〜 229位の 4ァミノ酸残基でのァミノ酸置換を試みた。すなわち、 SEBのアミノ酸配列中の 226〜229位の 4アミノ酸残基を天然の 20種のァミノ酸で任意に置換した改変体を作製して試験管内で淘汰をさせる母集団とし、その中から抗 S E B中和抗体との結合性の低減した S E B改変体をスクリ一ユングし、さらに大腸菌で可溶性に発現可能で水溶液中における安定性を保持していること、および天然の S E Bと同等の免疫異常性疾患の改善作用を保持していることも確認した。

具体的には、本願発明の S E B改変体の構築はファージディスプレイライブラリ一法を用いて以下のようにして行つた。

(1) 野生型 S E Bのファージディスプレイライブラリ一の構築と S E Bの抗原性の確認

まず、野生型 SEBを提示した Ml 3ファージを構築する。発現ベクター、たとえば p T r c 99 A (Araersham- Pharmacia社）に組み込まれた野生型 S E B発現プラスミドを錄型として、 5 ' 一プライマーには S f i I認識配列を 3 '—プライマーには No t I認、識配列を付力 [Iしたプライマーを用いて PC R (ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅する。増幅産物を制限酵素 S f i I -No t Iで消化し、プラスミドに組み込み、大腸菌を該プラスミドで形質転換後、ヘルパーファージを感染させ、野生型 SEBをファージ g 3蛋白との融合蛋白（SEB—g 3融合蛋白）として提示したファージ粒子を発現させる。発現の確認は抗 SEBゥサギポリクローナノレ抗体を用いてウェスタンブロットで確認、することができる。次に S E Bを提示するファージを段階希釈して抗 S E B中和モノクロ一ナル抗体、ヒト血漿由来抗 SEB抗体、および抗 E t a g抗体との反応性を EL I SA 法で測定し、 S E Bがファージ上で抗原性を保持して提示されているかを調べればよい。

(2) ランダム変異ファージディスプレイライプラリーの構築

SEBまたは既知の SEB改変体の C端の 226〜231位にランダムな変異を導入したランダム変異ファージディスプレイライプラリーを構築する。 SEB または既知の S E B改変体を発現ベクターに糸且み込んだプラスミドを铸型として PCR法により 226〜231位にランダムな変異を導入する。既知の SEB改変体としては、たとえば、 SEBの 23位のァスパラギン残基をチロシン残基に置き換えた変異体である N23 Y [WO 99/40935 (PCT/ J P 99/ 00638) ] を用いることができる。

変異導入は、たとえば以下のようにして行う。 5 '一プライマーには S f i I 認識配列 (完全長の S E Bの N末端に相当する領域に対応) を付加し、 3 '—プライマーには N o t I認識配列を付加するとともに、 226〜 229位に相当する領域の各アミノ酸に対応したコドンに NNK (Nは A、 C、 G、 Tのいずれか、 Κは Gまたは Τの塩基を表す) を 4回繰り返して組み込んだプラィマーを用いて 226〜229位に 20種のァミノ酸が任意に発現するようにした S Ε Βランダム遗伝子を作製する。 S Ε Βランダム遺伝子を S f i I /N o t Iで処理後、プラスミドに且み込み、大腸菌を該プラスミドで形質転換して変異体のライブラリ一を構築する。

この形質転換体ライブラリーにヘルパーファージを感染させ、 SEBランダムをファージ g 3蛋白との融合蛋白として提示したファージ粒子を発現させる。

(3) SEB中和抗体低反応性 S E B改変体のスクリ一ユング

抗 SEB中和モノクローナル抗体に対する反応性、および E t a g発現効率を指標にして、上記ライブラリーを用いてスクリーニングする。抗 SEB中和モノクローナル抗体としては、中和活性を有することが確認されているものとして、たとえば SA58— 2 (化学及血清療法研究所により作製）を用いることができる。具体的には、第一ステップとして、抗 E t a g抗体を固相化したプレートにランダム変異ファージディスプレイライブラリ一を反応させて、 S E B改変体融合蛋白（g 3— E t a g— SEB改変体）を可溶性に発現しているファージを選択する。第二ステップとして、抗 SEB中和モノクローナノレ抗体を固相化したプレートに対して、第一ステップで選択したファージを反応させ、抗体と反応できないファージを回収する。得られたクローンを分離し、変異を導入したェピトープ部位の配列解析、 g 3融合蛋白の発現、発現部所、ヒト抗 SEB抗体との反応性を解析する。

(4) 抗 S E B中和抗体低反応性 SEB改変体の選択■評価

上記（3) で得られたクローンをさらに可溶性発現、発現量、抗 SEB抗体との反応性を指標に解析を続け、幾つかのクローンまで絞り込みを行い、これらのクローンについて、抗 S EBモノクローナル抗体、ァフィ二ティー精製ヒト抗 S EB抗体との反応性をサンドィツチ E L I S Aで評価する。

最後に、反応性の低下したクローンについて改変したェピトープ部位のァミノ酸配列の決定を行う。

以下に、実施例に従って本願発-明を詳説するが、本願明はこれら実施例に何等限定されるものではない。

実施例 1

抗 S EB抗体を用いた S E Bによる T細胞活性化の抑制

SEBに対して特異性を有する中和モノクローナル抗体 S A 58-2 (化学及血清療法研究所により作製）、および日本脳炎ウィルスに対して特異性を有する J F 2抗体 (化学及血清療法研究所により作製) を用いて、 SA58-2抗体の SEB中和能の評価を行った。

健常人の末梢血単核球を 1 X 10⁵Zゥェルとなるように 96ゥエルプレートに播種し、 S E B (トキシンテクノロジ一社製）を 1 n g /m Lの濃度で添加し、同時に SA58— 2抗体および J F 2抗体を 0. 05、 0. 5、 5、 50 n g/

L加えて 3日間刺激し、ハーべスト 1 6時間前にトリチウム一チミジン（0. 5 μθ i) を取り込ませて増殖誘導活性を調べた。

その結果、 S E Bによる増殖刺激活性は J F 2抗体を 50 n g /m L添加しても抑制は認められなかったが、 S A 58— 2抗体を添加した系では、 5 n g/m L以上添加した場合、 80%以上の抑制効果が認められた（図 1) 。従って、 S A 58— 2抗体は S E Bのリンパ球活性化能を充分に抑制できる中和抗体であることが確認できた。

実施例 2

SEB改変体の抗 S E B抗体との反応性

( 1 ) 野生型 S E Bのファージディスプレイライブラリ一の構築と S E Bの抗原性の確認

進化分子工学的アプローチを用いて抗 S E B抗体との結合性を減弱させた S E B改変体の構築は以下のように進めた。まず、野生型 SEBを提示した M 13ファージを構築した。発現ベクター p T r c 99 A (Amer sham- Pharmacia社）に組み込まれた野生型 SEB発現プラスミド (pT r c 99A/SEB) を鎵型として、 5 '一プライマーには S f i I認識配列を 3 '—プライマーには No t I認識配列を付加したプライマーを用いて PGR (ポリメラーゼ連鎖反応) で増幅した。増幅産物を制限酵素 S f i I -N o t Iで消化し、 pCANTAB 5E (Pharmacia社）に組み込んだ。このプラスミドを「pCANZSEB」と命名した。大腸菌 T G 1を p CAN/ SEBで形質転換後、ヘルパーファージを感染させ、野生型 SEBをファージ g 3蛋白との融合蛋白（SEB— g 3融合蛋白）として提示したファージ粒子を発現させた。発現の確認は抗 SE Bゥサギポリクローナル抗体を用いてウェスタンプロットで確認、した。

次に SEBを提示するファージを段階希釈して抗 SEB中和モノクロ一ナル抗体 S A 58— 2 (化学及血清療法研究所により作製）、ヒ 1、血漿由来抗 S E B抗体、抗 E t a g抗体（Amersham- Pharmacia社）との反応性を EL I S A法で測定し、 SEBがファージ上で抗原性を保持して提示されている力調べた。 SEB発現ファージを 1 X 10¹⁰から 10倍段階希釈して 96ゥエルプレートに添カロし、抗 S E B抗体、あるいは抗 E t a g抗体と反応させ、 H R P標識二次抗体で発色させて吸光度を測定した。その結果、 S E Bはファージ上で天然な状態と同様の抗原性を保持して発現、提示されていることが確認された。

( 2 ) ランダム変異ファージディスプレイライブラリ一の構築

S EB改変体の一つである N23 Y [SEBの 23位のァスパラギン残基をチ口シン残基に置き換えた変異体： WO 99/40935 (PCT/J P 99/0 0638) ] を pTr c 99 Aに組み込んだプラスミド pT r c 99A/N23 Yを鏺型にして、？〇1法にて〇端の226〜229位にランダムな変異を導入した。変異導入は以下のようにして行った。

5 '—プライマーには S f i I認識配列（完全長の SEBの N末端に相当する領域に対応）を付加し、 3 '—プライマーには No t I認識配列を付加するとともに、 226〜229位に相当する領域の各アミノ酸に対応したコドンに NNK (Nは A、 C、 Gまたは Tのいずれか、 Κは Gまたは Τの塩基を表す）を 4回繰り返して組み込んだプライマーを用いて 226〜229位に 20種のアミノ酸が任意に発現するようにした Ν 23 Υランダム遺伝子を作製した。 Ν 23 Υランダム遺伝子を S f i I /No t Iで処理後、 p CANTAB 5 Eに組み込んだ。このプラスミドを「p CAN/N23 Yランダム」と命名した。大腸菌 TG1を p C A N/N 23 Yランダムで形質転換した結果、 1.88 X 10⁵種の変異体からなるライブラリ一を構築できた。

この形質転換体ライブラリ一にへ Λ ^パーブァージを感染させ、 Ν 23 Υランダムをファージ g 3蛋白との融合蛋白として提示したファージ粒子を発現させた。 E t a g抗体および S A 58— 2抗体、ァフィ二ティー精製ヒト抗 SEB抗体との反応を EL I S Aで解析した結果、 N 23 Yランダムのファージ上への呈示率は野生型の 1 Z 20にすぎないが、 SA58— 2抗体、ァフイエティー精製ヒト抗 S E B抗体との反応性は 1/200以下に低下していることを確認した。従つて、ライブラリ一を構成する N 23ランダムの各抗体への反応性は野生型に比べ平均約 1 10に低下していると考えられた。このことはこのライブラリ一中にこれらの S EB抗体との反応性が低下した配列が充分に含まれていることを示していると考えられた。

(3) SEB中和抗体低反応性 SEB改変体のスクリ一ユング

中和活性を有することが確認されている抗 S E B中和モノクローナル抗体 S A 58— 2に対する反応性、および E t a g発現効率を指標にして、上述のライブラリーを用いてスクリーニングを 3回実施した。すなわち、第一ステップとして、抗 E t a g抗体を固相化したプレートにランダム変異ファージディスプレイライブラリーを反応させて、 SEB改変体融合蛋白（g 3— E t a g— SEB改変体）を可溶性に発現しているファージを選択した。第二ステップとして、抗 SE B中和モノクローナノレ抗体 S A 58— 2を固相化したプレートに対して、第一ステツプで選択したファージを反応させ、抗体と反応できないファージを回収した。この中から任意に 48クローンを分離し、変異を導入したェピトープ部位の配列解析、 g 3融合蛋白の発現、発現部所、ヒト抗 SEB抗体との反応性を解析した。その結果、 48クローン中 30クローンが g 3との融合蛋白として発現しており、その中で 21クローンが培養上清中に発現可能であった。更に 21クローン中 1 0クローンはヒト抗 SEB抗体と明らかに反応したが、残る 1 1クローンの反応性は顕著に低下していた。

(4) 抗 S E B中和抗体低反応性 SEB改変体の選択■評価

可溶性発現、発現量、抗 SEB抗体との反応性を指標に更に解析を続けた結果、 4— C l、 4一 C 3、 42— C 2、 42— C 3、 47— C 3、 47— C 7、 48 — C 1、 48 _C 4の 8クローンに絞り込まれた。これらのクローンについて、 SA58— 2抗体、ァフィ二ティ一精製ヒト抗 S E B抗体との反応性をサンドィツチ EL I S Aで評価した。

発現蛋白量を併せて、両抗体に対する反応性を評価した結果、全てのクローンで反応性が低下していた（図 2 ) 。特に中和抗体である SA58-2に対する反応性は、铸型に用いた N 23 Yと比べてクローン 42— C 2や 48— C 1、 48 一 C 4で約 1/30~1/50、 47-C 7で約 1/8、 4一 C 1で約 1 Z 2に低下していた (表 1) 。精製ヒト抗 SEB抗体に対する反応性では、同じく 42 — C 2や 48— C 1、 48— C4、また 47— C 7で約 1 / 8程度、 4一 C 1で ¾ 1/2- 1/4に低下していた (表 1) 。なお、これら抗 SEB抗体との反応性を調べたクローンについては、ェピトープ領域中のアミノ酸置換部位の配列も決定し、表 1に示した。

以上の反応性を総合的に解析評価して、以下の実験には 42— C 2、 47-C 7、および 4一 C 1を用いることとした。 N23 Yを錄型としたこれらの SEB 改変体を、以下、「ェピトープ改変体」と総称する。表 1 ：ェピトープ改変体の抗 S E B抗体との反応性低下

実施例 3

ェピトープ改変体の末梢血単核球に対する生物学的解析

(1) ェピトープ改変体の増殖ならびに幼若化誘導活性の評価

健'吊'人の末梢血単核球 (peripheral blood mononuclear cell；以下、「PB MCJ と称することがある）を 1 X 10⁵/ゥエルとなるように 96ゥエルプレートに播種し、 SEB N23Y SEBェピトープ改変体を 0.01 1 1 00 1000 n g/mLの濃度で 3日間刺激し、ハーべスト 16時間前にトリチウムーチミジン (0. 5μΟ i) を取り込ませて増殖誘導活性を調べた。また、上記 PBMCを各々同濃度の SEB改変体存在下で中期間（6日間）培養し、 T 細胞の幼若化の程度をフローサイトメトリー（以下、「FACS」と称することもある）の FSC/SSC解析により調べた。

その結果、 SEBは O. O l n g/mL以上で PBMCに対し濃度依存的に強い増殖誘導活性を示した。代表例を図 3に示す。 N23Yは SEBより増殖誘導活性はかなり弱く、 100 n g/mL以上でトリチウム一チミジンの取り込みが検出されはじめ、 1000 n g/mLでも SEBの 1/10程度のカウントであつた。ェピトープ改変体は更に増殖誘導能が低下していた（図 3) 。また、幼若ィ匕誘導活性では N 23 Yは 1 n gZm L以上で 10— 30 %の細胞に有意な幼若化を誘導したが、 42— 02ぉょび47—〇7の誘導活性は N 23 Yの約 1 Z 1 0程度であった。 4— C 1は N23 Yとほぼ同等であった（図 4) 。これらの成績から、ェピトープ改変体はェピトープに変異を導入しても、インビトロでヒト PBMCに対する増殖誘導能や幼若化誘導能において、 N23 Yとほぼ同等の生物活 1"生を有していることが明らかとなった。

(2) ェピトープ改変体のサイト力イン誘導活性の評価

健常人の PBMCを 1 X 1 0⁶/mLで 24ゥエルプレートに播種し、 SEB、

N23 Y、およびェピトープ改変体の 0. 0 1、 1、 100、 1000 n g/m Lで 2日間刺激後、上清を回収した。この培養上清の種々のサイト力イン（TN F— 、 I L一 1 ]3、 I L一 6、 I L_8、 I L— 1 2、 I FN— γ、 I L- 1 r a、 I L— 4、 I L_ 1 0、 GM—C S F) 産生を E L I S Aキット

(CytoSets, CytoFix、旭テクノグラス社) を用いて測定した。

その結果、ェピトープ改変体は N 23 Yと同様、 SEBに比べサイトカイン産生能は低く、サイトカイン誘導パターンは N 23 Yと同様の傾向を示した。すなわち、抑制性サイトカイン I L—l r a、 I L— 10、 I L一 4産生は相対的に有意に高く、炎症性サイト力イン I L— 1 i3、 I L— 6、 TNF— α、 I L— 1 2、 GM—CS F、 I FN— yの誘導は低かった。 S E B 1 00 n g/mL刺激時のサイトカイン誘導活性を 100 %としたときのェピトープ改変体（ 1 00 n g /m L ) の相対活 14を図 5に示す。ェピトープ改変体はィンビトロでヒト P B MCに対するサイトカイン誘導能において N 23 Yと同等の生物学的活性を有していた。

また、図 5に示す結果から明らかなように、 S EBと比較して N23 Yゃェピトープ改変体では I FN—γの誘導が顕著に抑制され、それに対して抑制性サイトカイン I L— 4、 I L— 10の産生は相対的に高いことから、 SEB改変体は T細胞ポピュレーションを Th 1から Th 2ヘシフ 1、させる活性を有していると考えられた。

実施例 4

(1) ェピトープ改変体のマウス関節炎モデルでの評価

マウスのコラ一ゲン誘導性関節炎（ C I A) モデルで N 2 3 Yおよびェピトープ改変体の薬効を評価した。 7週齢の DBA_ 1 J雄マウスの尾根部にフロイントのコンプリ一トアジュバント (FCA) を用いて、ゥシ I I型コラーゲンをマウス当たり 1 0 Ο μ _§で感作した。 3週後に再度同抗原で追加感作して関節炎を誘導した。追加感作 1週後に各マウスの四肢を観察し、関節炎の発症程度をスコァ化した。スコア化は以下のように行った。各四肢について、未発症： 0点、指が 1本腫脹： 1点、指が 2〜 4本腫脹あるいは肢の甲が腫脹： 2点、全ての指が腫脹あるいは激しい腫脹： 3点。四肢の合計点数を算出し（最高 1 2点）、当該マウスの関節炎スコアとした。関節炎のスコアが 1〜4点の軽度のマウスを選別して群を構成し、薬剤を経口投与した。薬剤は 1 Ο μ _§ /マウスでゾンデを使つて 4週間連日投与した。薬剤投与開始から 1週間に 2度スコアを付け、関節炎の程度を観察した。投与終了後に四肢の関節をソフト X線で撮影して、骨びらんの程度をスコア化して骨破壊に対する作用を評価した。

その結果、生理食塩水投与のコントロール群に比べて 4一 C 1および 4 7 - C 7の各ェピトープ改変体は関節炎症状を有意に抑制した。 4 2— C 2では抑制は認められなかつた (図 6 ) 。また、 4 7— C 7および 4 _ C 1では骨破壊の抑制効果も観察された（図 7 ) 。

( 2 ) ェピトープ改変体投与による抗 S Ε Β抗体の惹起

試験終了後に全採血し、血中の抗 S E B抗体価を E L I S Α法にて測定した。その結果、 4 7— C 7投与群は薬剤無投与群、コント口ールの生理食塩水投与群と同程度の値を示し、免疫原性が低減されていることが明らかとなった (図 8

(A) ) 。また、 4 7— C 7改変体は、この蛋白自身に対する抗体誘導も低く、ェピトープを改変した配列が新たな抗原ェピトープとなっている可能性は低いと思われた（図 8 (B) ) 。

Claims

請求の範囲

1. 黄色プドウ球菌腸管内毒素 B (SEB) に対する中和抗体（抗 SEB抗体）との反応性を低減させた S E B改変体。

2. SEBのァミノ酸配列に任意のァミノ酸置換を導入することにより抗 SEB 抗体との反応性を低減させた、請求項 1に記載の SEB改変体。

3. S E Bのァミノ酸配列中の抗 S E B抗体ェピトープ認識部位にァミノ酸置換を導入する、請求項 2に記載の SEB改変体。

4. SEBのアミノ酸配列中の 226位の Ly sから 229位の Ly sまでの領域でァミノ酸置換を導入した、請求項 2または 3に記載の S E B改変体。

5. S E Bのァミノ酸配列中の 226位から 229位までのァミノ酸配列が L e uPh eAl a A 1 aである、請求項 4に記載の S E B改変体。

6. SEBのアミノ酸配列中の 226位から 229位までのァミノ酸配列が A 1 aTh r Th rG l nである、請求項 4に記載の S EB改変体。

7. SEBのァミノ酸配列中の 226位から 229位までのァミノ酸配列が L y s Ar g I 1 e I 1 eである、請求項 4に記載の S E B改変体。

8. SEBのアミノ酸配列中の 23位の As nが Ty rで置換されている、請求項 1から 7のいずれかに記載の S E B改変体。

9. 請求項 1から 8のいずれかに記載の S EB改変体を主成分として含有し、 S E Bに対する免疫学的応答性を低下させ、 T細胞活性化の抑制作用を有するものであることを特徴とする、免疫異常性疾患の予防 ,治療用剤。

10. 免疫異常性疾患が関節リウマチである、請求項 9に記載の免疫異常性疾患の予防 ·治療用剤。

11. 経口投与剤である、請求項 9または 10に記載の免疫異常性疾患予防-治療用剤。