JP4516914B2 - Ｓｅｂ改変体およびそれを含有する免疫異常性疾患の予防・治療用剤 - Google Patents

Description

本願発明は、新規な免疫異常性疾患の予防・治療用剤に関する。更に詳細には、細菌性スーパー抗原の一つとして知られる黄色ブドウ球菌腸管内毒素Ｂ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ；以下、「ＳＥＢ」と呼称する）の改変体および該改変体を有効成分として含有する関節リウマチ、アレルギー性疾患等の免疫異常性疾患の予防・治療用剤に関する。

自己免疫疾患は、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；以下、「ＲＡ」と呼称することがある）等の臓器非特異的自己免疫疾患と潰瘍性大腸炎等の臓器特異的自己免疫疾患とに大きく分けられるが、通常は免疫学的寛容の状態にある自己の抗原に対して応答するＴ細胞が、何らかの原因で自己の組織内で活性化され自己抗原と応答するようになり、これが持続的な炎症反応となって組織に障害を与えることに起因するものである。その場合の自己抗原とは、それぞれ自己の関節の成分であるＩＩ型コラーゲンや消化管粘膜の主成分である。
これらの疾患の患者数は毎年、僅かながら増加しているにもかかわらず、今なお有効な治療薬や予防方法は見出されていない（山村雄一、岸本忠三、ロバート・Ａ・グッド編、「薬剤による免疫不全」、免疫科学、１９８４年、９巻、ｐ．２８５−２８９）。現在これらの疾患の治療には、サラゾピリン、５−アミノサリチル酸、アザチオプリン、６−ＭＰ、トラニラスト、メトトレキセート、シクロスポリンＡ、メタロダニゾールの投与および７Ｓ−免疫グロブリンの大量投与等の薬物療法や胸腺摘出術、人工関節への置換術等の外科的療法、更には栄養療法等の対症療法が行われている（市川陽一ら、「慢性関節リウマチにおけるメトトレキサートおよびサラゾスルファピリジン長期投与例の検討」、リウマチ、１９９５年、３５巻、ｐ．６６３−６７０；柏崎禎夫、「慢性関節リウマチに対するオーラノフィンとメトトレキサートによる併用療法の検討」、リウマチ、１９９６年、３６巻、ｐ．５２８−５４４；古谷武文ら、「慢性関節リウマチにおける低用量メトトレキセート療法の有害事象」、リウマチ、１９９６年、３６巻、ｐ．７４６−７５２；渡辺言夫、「若年性関節リウマチの薬物療法」、リウマチ、１９９６年、３６巻、ｐ．６７０−６７５；八倉隆保、「免疫抑制療法・自己免疫疾患の治療」、総合臨床、１９８１年、３０巻、ｐ．３３５８；および都外川新ら、「慢性関節リウマチにおけるメトトレキサート療法の検討−有効性のより高い投与法を求めて−」、リウマチ、１９９７年、３７巻、ｐ．６８１−６８７）。しかしながら、これらは根治的な療法とはいえず、むしろ長期服用によるため重篤な副作用の原因ともなり、より有効な予防・治療薬、治療法の開発が望まれいる。
ＳＥＢは黄色ブドウ球菌によって産生されるエンテロトキシン（腸管毒；毒素型食中毒の原因毒素）の１種である。ＳＥＢは２３９個のアミノ酸残基よりなり、そのアミノ酸配列も知られている。ＳＥＢ分子は２つのドメインから構成され、最初のドメインは残基１〜１２０よりなり、２番目のドメインは残基１２７〜２３９よりなる。また、ＳＥＢのＮ末端部分にはクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ；以下、「ＭＨＣ」と呼称する）分子結合および／またはＴ細胞抗原受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、「ＴＣＲ」と呼称する）結合に影響を与える３つの領域（領域１（残基９〜２３）、領域２（残基４１〜５３）および領域３（残基６０〜６１））が同定されている。
ＳＥＢは周知のように細菌性スーパー抗原の１種である（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ Ｊ．）ら、Ｃｅｌｌ，１９８９，ｖｏｌ．５６，ｐ．２７−３５）。通常の抗原はＭＨＣと複合体を形成した状態でＴ細胞上のＴＣＲに認識され、しかもその認識はクラスＩＩ ＭＨＣ分子のハプロタイプに限定される（これを「ＭＨＣ拘束性」という）。これに対してスーパー抗原は、クラスＩＩ ＭＨＣ分子のハプロタイプに非拘束性に結合し、さらに特定のＴＣＲのβ鎖領域（Ｖβ鎖）に結合する。その結果、スーパー抗原が結合したＴ細胞は一時的に活性化され分裂増殖を引き起こし、炎症性のサイトカインを産生する（ミクサン（Ｍｉｃｕｓａｎ Ｖ．Ｖ．）およびチボディーン（Ｔｈｉｂｏｄｅａｎ Ｊ．），Ｓｅｍｉｎｏｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，ｖｏｌ．５，ｐ．３−１１）。
スーパー抗原を新生マウスに静脈内あるいは腹腔内投与すると、これに応答するＶβＴＣＲをもったＴ細胞亜集団が除去され、同じスーパー抗原に対して応答しなくなるトレランスの状態になる。一方、成体のマウスに投与した場合、そのスーパー抗原に結合するＶβＴＣＲを持つＴ細胞がスーパー抗原の再刺激に対して応答しなくなる状態、すなわち、アナジーが誘導されトレランスの状態になる。このようなスーパー抗原の特徴は通常の抗原認識とは異なっている。特定のＶβＴＣＲを持つＴ細胞にトレランスを誘導するという性質は、ある種の免疫異常性疾患、特にＩ型アレルギー性疾患や自己免疫疾患の予防もしくは治療に応用できる可能性を示唆している。事実、疾患モデルマウスの系を用いてＳＥＢを投与することで発症抑制が可能となったという報告がなされている。
キム（Ｋｉｍ Ｃ．）らは全身性エリテマトーデス（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ；以下、「ＳＬＥ」と称する）のモデルマウスであるＭＲＬ／ｌｐｒマウスのループス腎炎が、ＳＥＢをあらかじめ投与しておくことにより発症を抑制できることを報告した（キム（Ｋｉｍ Ｃ．）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９１，ｖｏｌ．１７４，ｐ．１１３１）。またロット（Ｒｏｔｔ Ｏ．）らは実験的アレルギー性脳脊髄膜炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｉｃ Ｅｎｃｅｐｈａｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ；以下、「ＥＡＥ」と称する）の系で前もってＳＥＢを投与し、ＳＥＢ応答性のＶβ８ＴＣＲを持つＴ細胞をトレランス状態にしておくことで発症が抑制できたことを報告した（ロット（Ｒｏｔｔ Ｏ．）ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１，ｖｏｌ．４，ｐ．３４７）。これらの結果は、ＳＥＢをワクチン的に用いることで特定の自己免疫疾患の発症を予防できる可能性を示唆するものである。
しかしながらこれらの実験ではＳＥＢの投与方法は静脈内もしくは腹腔内であり、投与量も１匹当たり１００μｇ前後とかなり多い。このような投与量ではマウスに対して無視できない程度の病原性をもたらすことは必至であり、また抗原性や免疫原性も問題となる。特にスーパー抗原の大量投与は、前述のごとくＴ細胞亜集団や抗原提示細胞の一時的な活性化を引き起こし、炎症性サイトカインの産生亢進を招き、体内に急激な炎症状態を惹起するという問題がある。また桑畑らはヒトの場合、就学年齢以上の児童では血中にほぼ１００％抗ＳＥＢ抗体を保有し、更に、唾液等での解析から約５０％に抗ＩｇＡ抗体が検出されることを報告している（桑畑（Ｍ．Ｋｕｗａｈａｔａ）ら、Ａｃｔａ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃａ Ｊａｐｏｎｉｃａ，１９９６，３８，ｐ．１−７）。また折口らはリウマチ患者血清中のＩｇＭ型抗ＳＥＢ抗体が有意に高値を示すことを明らかにしている（折口（Ｏｒｉｇｕｃｈｉ）ら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ １９９５，５４，ｐ．７１３−７２０）。更に西らは、ヒト血清中の抗ＳＥＢ抗体の主要エピトープがＣ端側に存在し、この領域に対する抗体はＳＥＢの中和抗体であることを明らかにしている（西（Ｊｕｎ−Ｉｃｈｉｒｏ Ｎｉｓｈｉ）ら、Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５８，ｐ．２４７−２５４）。このことはＳＥＢをヒトに投与した場合、抗体によってＳＥＢの生物活性が中和され、体内から排除されることを意味する。そこで西らは遺伝子工学的手法を用いてＣ端の主要エピトープを欠如した欠損変異体を構築した。しかしながら、このようにして調製したＳＥＢ改変体は不溶性にしか発現せず、充分な評価・解析ができなかった。また、薬剤としての安定供給にも対応できなかった。
本発明者らは、スーパー抗原の大量投与に関連する問題について、高度に精製したＳＥＢを病原性を与えない投与量で連続的に長期間経口投与することにより、有効にトレランスを誘導する方策（特開平９−１１０７０４）、ならびにＳＥＢの分子改変を行って本来のＳＥＢの有する毒性を軽減しつつも、免疫異常性疾患の予防・治療に効果を発揮するＳＥＢ改変体およびそれらの誘導体を構築し、その有用性を証明してきた（ＷＯ９９／４０９３５）。

（発明が解決しようとする技術的課題）
上記のようにＳＥＢを天然のままでヒトに投与した場合、生体に存在する抗ＳＥＢ抗体によってＳＥＢの生物活性が中和され、最終的には体内から排除されてＳＥＢによる所望の効果を期待できないという問題がある。そのため、遺伝子工学的手法を用いてＳＥＢのＣ端の主要エピトープを欠如した欠損変異体も構築されているが、このようにして調製したＳＥＢ改変体は不溶性にしか発現せず、それゆえ充分な評価・解析ができておらず、薬剤としての安定供給にも対応できなかった。
（その解決方法）
本発明らは、上記のＳＥＢの抗原性に関連する問題を回避するため、進化分子工学的手法（試験管内生物進化）を用いて鋭意研究したところ、天然型のＳＥＢあるいは既知のＳＥＢ改変体にアミノ酸置換を導入し、これら改変体の中からスクリーニングすることによって、抗ＳＥＢ中和抗体との結合性が減弱し、かつ大腸菌で可溶性に発現可能で水溶液中における安定性を保持し、さらに天然のＳＥＢと同等の免疫異常性疾患の改善作用を保持したＳＥＢ改変体を調製することができた。
本願発明は、黄色ブドウ球菌腸管内毒素Ｂ（ＳＥＢ）に対する中和抗体（抗ＳＥＢ抗体）との反応性を低減させたＳＥＢ改変体を提供する。
（従来技術より有効な効果）
本願発明のＳＥＢエピトープ改変体は、ＳＥＢに対する中和抗体との反応性が低減し、且つＮ２３Ｙ［ＳＥＢの２３位のアスパラギン残基をチロシン残基に置き換えた変異体；ＷＯ９９／４０９３５（ＰＣＴ／ＪＰ９９／００６３８）］と同等のＣＩＡ（コラーゲン誘導性関節炎）症状改善効果があることが示された。更にこれらのエピトープ改変体は可溶性に分泌発現が可能であり、関節リウマチ、アレルギー性疾患等の免疫異常疾患の有効な予防・治療用剤としての使用が期待される。

図１は、抗ＳＥＢ中和モノクローナル抗体ＳＡ５８−２を用いて、ＳＥＢによるヒトＰＢＭＣ（末梢血単核球）活性化の抑制試験の結果を示す。
図２は、本願発明のＳＥＢエピトープ改変体の、抗ＳＥＢ中和モノクローナル抗体ＳＡ５８−２（Ａ）、あるいはヒト抗ＳＥＢ抗体（Ｂ）との反応性を示す。
図３は、本願発明のＳＥＢエピトープ改変体でヒトＰＢＭＣを３日間刺激して、細胞の増殖応答をトリチウム−チミジンのカウントで測定した結果を示す。
図４は、本願発明のＳＥＢエピトープ改変体でヒトＰＢＭＣを６日間刺激して、細胞の幼若化反応をフローサイトメトリーで測定後、幼若化の割合をパーセントで示す。
図５は、本願発明のＳＥＢエピトープ改変体でヒトＰＢＭＣを２日間刺激し、培養上清中に分泌される各種サイトカインをＥＬＩＳＡ法で測定して得られた結果（Ｂ）、および該測定値を野生型ＳＥＢに対する相対値で表したもの（Ａ）を示す。
図６は、本願発明のＳＥＢエピトープ改変体についてマウスのコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルで四肢の腫脹の抑制を評価した結果を示す。
図７は、本願発明のＳＥＢエピトープ改変体についてマウスのコラーゲン誘導性関節炎モデルで骨破壊の抑制を評価した結果を示す。
図８は、本願発明のＳＥＢエピトープ改変体を経口投与したマウスの血中の抗ＳＥＢ抗体価（Ａ）および抗４７−Ｃ７抗体価（Ｂ）の測定値（４５０ｎｍの吸光度の値）を示す。

本願発明のＳＥＢ改変体は、ＳＥＢのアミノ酸配列に任意のアミノ酸置換を導入することにより抗ＳＥＢ抗体との反応性を低減させたものである。かかるアミノ酸置換の導入は、とりわけＳＥＢのアミノ酸配列中の抗ＳＥＢ抗体エピトープ認識部位で行うのが好ましい。
ＳＥＢのアミノ酸配列中のアミノ酸置換部位として本願発明において特に好ましいのは、ＳＥＢのアミノ酸配列（配列番号１）中の２２６位のＬｙｓから２２９位のＬｙｓまでの領域である。
本願発明に従って抗ＳＥＢ抗体との反応性を低減させたＳＥＢ改変体の具体例としては、ＳＥＢのアミノ酸配列中の２２６位から２２９位までのアミノ酸配列が以下のものが挙げられる：

本願発明によるＳＥＢ改変体はまた、上記アミノ酸置換とともにＳＥＢのアミノ酸配列中の２３位のＡｓｎがＴｙｒで置換されているものをも包含する。
本願発明はさらに、本願発明に従って得られるＳＥＢ改変体を主成分として含有し、ＳＥＢに対する免疫学的応答性を低下させ、Ｔ細胞活性化の抑制作用を有するものであることを特徴とする、免疫異常性疾患の予防・治療用剤をも提供する。免疫異常性疾患としては、たとえば、関節リウマチ、アレルギー性疾患、およびこれらに類似の疾患が挙げられる。
本願発明によるＳＥＢ改変体を調製するに際して採用した「進化分子工学的手法」とは、自然界における生物進化（自然淘汰）の過程（あるタンパク質中の１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換される確率は、およそ１回／１０００万年であるといわれている）を試験管内で人為的に急加速させて有用なタンパク質等をデザインしようとするものであり、自然界では何万年とかかる進化（新機能獲得、機能向上等）を数ヶ月で行わせることが可能である。
本願発明では、抗ＳＥＢ中和抗体との結合性の低減したＳＥＢ改変体を調製するため、抗ＳＥＢ中和抗体によって認識されるＳＥＢ中のエピトープ部位においてアミノ酸置換をランダムに導入し、得られた改変体の中から抗ＳＥＢ中和抗体との結合性の低減した改変体をスクリーニングした。上記のように、ＳＥＢの主要エピトープはＣ末端（２２５〜２３４位）に存在することがわかっているので、本願発明ではこのうち２２６〜２２９位の４アミノ酸残基でのアミノ酸置換を試みた。すなわち、ＳＥＢのアミノ酸配列中の２２６〜２２９位の４アミノ酸残基を天然の２０種のアミノ酸で任意に置換した改変体を作製して試験管内で淘汰をさせる母集団とし、その中から抗ＳＥＢ中和抗体との結合性の低減したＳＥＢ改変体をスクリーニングし、さらに大腸菌で可溶性に発現可能で水溶液中における安定性を保持していること、および天然のＳＥＢと同等の免疫異常性疾患の改善作用を保持していることも確認した。
具体的には、本願発明のＳＥＢ改変体の構築はファージディスプレイライブラリー法を用いて以下のようにして行った。
（１）野生型ＳＥＢのファージディスプレイライブラリーの構築とＳＥＢの抗原性の確認
まず、野生型ＳＥＢを提示したＭ１３ファージを構築する。発現ベクター、たとえばｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に組み込まれた野生型ＳＥＢ発現プラスミドを鋳型として、５’−プライマーにはＳｆｉＩ認識配列を３’−プライマーにはＮｏｔＩ認識配列を付加したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅する。増幅産物を制限酵素ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩで消化し、プラスミドに組み込み、大腸菌を該プラスミドで形質転換後、ヘルパーファージを感染させ、野生型ＳＥＢをファージｇ３蛋白との融合蛋白（ＳＥＢ−ｇ３融合蛋白）として提示したファージ粒子を発現させる。発現の確認は抗ＳＥＢウサギポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロットで確認することができる。
次にＳＥＢを提示するファージを段階希釈して抗ＳＥＢ中和モノクローナル抗体、ヒト血漿由来抗ＳＥＢ抗体、および抗Ｅｔａｇ抗体との反応性をＥＬＩＳＡ法で測定し、ＳＥＢがファージ上で抗原性を保持して提示されているかを調べればよい。
（２）ランダム変異ファージディスプレイライブラリーの構築
ＳＥＢまたは既知のＳＥＢ改変体のＣ端の２２６〜２３１位にランダムな変異を導入したランダム変異ファージディスプレイライブラリーを構築する。ＳＥＢまたは既知のＳＥＢ改変体を発現ベクターに組み込んだプラスミドを鋳型としてＰＣＲ法により２２６〜２３１位にランダムな変異を導入する。既知のＳＥＢ改変体としては、たとえば、ＳＥＢの２３位のアスパラギン残基をチロシン残基に置き換えた変異体であるＮ２３Ｙ［ＷＯ９９／４０９３５（ＰＣＴ／ＪＰ９９／００６３８）］を用いることができる。
変異導入は、たとえば以下のようにして行う。５’−プライマーにはＳｆｉＩ認識配列（完全長のＳＥＢのＮ末端に相当する領域に対応）を付加し、３’−プライマーにはＮｏｔＩ認識配列を付加するとともに、２２６〜２２９位に相当する領域の各アミノ酸に対応したコドンにＮＮＫ（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれか、ＫはＧまたはＴの塩基を表す）を４回繰り返して組み込んだプライマーを用いて２２６〜２２９位に２０種のアミノ酸が任意に発現するようにしたＳＥＢランダム遺伝子を作製する。ＳＥＢランダム遺伝子をＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで処理後、プラスミドに組み込み、大腸菌を該プラスミドで形質転換して変異体のライブラリーを構築する。
この形質転換体ライブラリーにヘルパーファージを感染させ、ＳＥＢランダムをファージｇ３蛋白との融合蛋白として提示したファージ粒子を発現させる。
（３）ＳＥＢ中和抗体低反応性ＳＥＢ改変体のスクリーニング
抗ＳＥＢ中和モノクローナル抗体に対する反応性、およびＥｔａｇ発現効率を指標にして、上記ライブラリーを用いてスクリーニングする。抗ＳＥＢ中和モノクローナル抗体としては、中和活性を有することが確認されているものとして、たとえばＳＡ５８−２（化学及血清療法研究所により作製）を用いることができる。具体的には、第一ステップとして、抗Ｅｔａｇ抗体を固相化したプレートにランダム変異ファージディスプレイライブラリーを反応させて、ＳＥＢ改変体融合蛋白（ｇ３−Ｅｔａｇ−ＳＥＢ改変体）を可溶性に発現しているファージを選択する。第二ステップとして、抗ＳＥＢ中和モノクローナル抗体を固相化したプレートに対して、第一ステップで選択したファージを反応させ、抗体と反応できないファージを回収する。得られたクローンを分離し、変異を導入したエピトープ部位の配列解析、ｇ３融合蛋白の発現、発現部所、ヒト抗ＳＥＢ抗体との反応性を解析する。
（４）抗ＳＥＢ中和抗体低反応性ＳＥＢ改変体の選択・評価
上記（３）で得られたクローンをさらに可溶性発現、発現量、抗ＳＥＢ抗体との反応性を指標に解析を続け、幾つかのクローンまで絞り込みを行い、これらのクローンについて、抗ＳＥＢモノクローナル抗体、アフィニティー精製ヒト抗ＳＥＢ抗体との反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡで評価する。
最後に、反応性の低下したクローンについて改変したエピトープ部位のアミノ酸配列の決定を行う。
以下に、実施例に従って本願発明を詳説するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。

抗ＳＥＢ抗体を用いたＳＥＢによるＴ細胞活性化の抑制
ＳＥＢに対して特異性を有する中和モノクローナル抗体ＳＡ５８−２（化学及血清療法研究所により作製）、および日本脳炎ウイルスに対して特異性を有するＪＦ２抗体（化学及血清療法研究所により作製）を用いて、ＳＡ５８−２抗体のＳＥＢ中和能の評価を行った。
健常人の末梢血単核球を１×１０^５／ウエルとなるように９６ウェルプレートに播種し、ＳＥＢ（トキシンテクノロジー社製）を１ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、同時にＳＡ５８−２抗体およびＪＦ２抗体を０．０５、０．５、５、５０ｎｇ／ｍＬ加えて３日間刺激し、ハーベスト１６時間前にトリチウム−チミジン（０．５μＣｉ）を取り込ませて増殖誘導活性を調べた。
その結果、ＳＥＢによる増殖刺激活性はＪＦ２抗体を５０ｎｇ／ｍＬ添加しても抑制は認められなかったが、ＳＡ５８−２抗体を添加した系では、５ｎｇ／ｍＬ以上添加した場合、８０％以上の抑制効果が認められた（図１）。従って、ＳＡ５８−２抗体はＳＥＢのリンパ球活性化能を充分に抑制できる中和抗体であることが確認できた。

ＳＥＢ改変体の抗ＳＥＢ抗体との反応性
（１）野生型ＳＥＢのファージディスプレイライブラリーの構築とＳＥＢの抗原性の確認
進化分子工学的アプローチを用いて抗ＳＥＢ抗体との結合性を減弱させたＳＥＢ改変体の構築は以下のように進めた。まず、野生型ＳＥＢを提示したＭ１３ファージを構築した。発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に組み込まれた野生型ＳＥＢ発現プラスミド（ｐＴｒｃ９９Ａ／ＳＥＢ）を鋳型として、５’−プライマーにはＳｆｉＩ認識配列を３’−プライマーにはＮｏｔＩ認識配列を付加したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅した。増幅産物を制限酵素ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩで消化し、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に組み込んだ。このプラスミドを「ｐＣＡＮ／ＳＥＢ」と命名した。大腸菌ＴＧ１をｐＣＡＮ／ＳＥＢで形質転換後、ヘルパーファージを感染させ、野生型ＳＥＢをファージｇ３蛋白との融合蛋白（ＳＥＢ−ｇ３融合蛋白）として提示したファージ粒子を発現させた。発現の確認は抗ＳＥＢウサギポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロットで確認した。
次にＳＥＢを提示するファージを段階希釈して抗ＳＥＢ中和モノクローナル抗体ＳＡ５８−２（化学及血清療法研究所により作製）、ヒト血漿由来抗ＳＥＢ抗体、抗Ｅｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）との反応性をＥＬＩＳＡ法で測定し、ＳＥＢがファージ上で抗原性を保持して提示されているか調べた。ＳＥＢ発現ファージを１×１０^１０から１０倍段階希釈して９６ウェルプレートに添加し、抗ＳＥＢ抗体、あるいは抗Ｅｔａｇ抗体と反応させ、ＨＲＰ標識二次抗体で発色させて吸光度を測定した。その結果、ＳＥＢはファージ上で天然な状態と同様の抗原性を保持して発現、提示されていることが確認された。
（２）ランダム変異ファージディスプレイライブラリーの構築
ＳＥＢ改変体の一つであるＮ２３Ｙ［ＳＥＢの２３位のアスパラギン残基をチロシン残基に置き換えた変異体：ＷＯ９９／４０９３５（ＰＣＴ／ＪＰ９９／００６３８）］をｐＴｒｃ９９Ａに組み込んだプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／Ｎ２３Ｙを鋳型にして、ＰＣＲ法にてＣ端の２２６〜２２９位にランダムな変異を導入した。変異導入は以下のようにして行った。
５’−プライマーにはＳｆｉＩ認識配列（完全長のＳＥＢのＮ末端に相当する領域に対応）を付加し、３’−プライマーにはＮｏｔＩ認識配列を付加するとともに、２２６〜２２９位に相当する領域の各アミノ酸に対応したコドンにＮＮＫ（ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれか、ＫはＧまたはＴの塩基を表す）を４回繰り返して組み込んだプライマーを用いて２２６〜２２９位に２０種のアミノ酸が任意に発現するようにしたＮ２３Ｙランダム遺伝子を作製した。Ｎ２３Ｙランダム遺伝子をＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで処理後、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅに組み込んだ。このプラスミドを「ｐＣＡＮ／Ｎ２３Ｙランダム」と命名した。大腸菌ＴＧ１をｐＣＡＮ／Ｎ２３Ｙランダムで形質転換した結果、１．８８×１０^５種の変異体からなるライブラリーを構築できた。
この形質転換体ライブラリーにヘルパーファージを感染させ、Ｎ２３Ｙランダムをファージｇ３蛋白との融合蛋白として提示したファージ粒子を発現させた。Ｅｔａｇ抗体およびＳＡ５８−２抗体、アフィニティー精製ヒト抗ＳＥＢ抗体との反応をＥＬＩＳＡで解析した結果、Ｎ２３Ｙランダムのファージ上への呈示率は野生型の１／２０にすぎないが、ＳＡ５８−２抗体、アフィニティー精製ヒト抗ＳＥＢ抗体との反応性は１／２００以下に低下していることを確認した。従って、ライブラリーを構成するＮ２３ランダムの各抗体への反応性は野生型に比べ平均約１／１０に低下していると考えられた。このことはこのライブラリー中にこれらのＳＥＢ抗体との反応性が低下した配列が充分に含まれていることを示していると考えられた。
（３）ＳＥＢ中和抗体低反応性ＳＥＢ改変体のスクリーニング
中和活性を有することが確認されている抗ＳＥＢ中和モノクローナル抗体ＳＡ５８−２に対する反応性、およびＥｔａｇ発現効率を指標にして、上述のライブラリーを用いてスクリーニングを３回実施した。すなわち、第一ステップとして、抗Ｅｔａｇ抗体を固相化したプレートにランダム変異ファージディスプレイライブラリーを反応させて、ＳＥＢ改変体融合蛋白（ｇ３−Ｅｔａｇ−ＳＥＢ改変体）を可溶性に発現しているファージを選択した。第二ステップとして、抗ＳＥＢ中和モノクローナル抗体ＳＡ５８−２を固相化したプレートに対して、第一ステップで選択したファージを反応させ、抗体と反応できないファージを回収した。この中から任意に４８クローンを分離し、変異を導入したエピトープ部位の配列解析、ｇ３融合蛋白の発現、発現部所、ヒト抗ＳＥＢ抗体との反応性を解析した。
その結果、４８クローン中３０クローンがｇ３との融合蛋白として発現しており、その中で２１クローンが培養上清中に発現可能であった。更に２１クローン中１０クローンはヒト抗ＳＥＢ抗体と明らかに反応したが、残る１１クローンの反応性は顕著に低下していた。
（４）抗ＳＥＢ中和抗体低反応性ＳＥＢ改変体の選択・評価
可溶性発現、発現量、抗ＳＥＢ抗体との反応性を指標に更に解析を続けた結果、４−Ｃ１、４−Ｃ３、４２−Ｃ２、４２−Ｃ３、４７−Ｃ３、４７−Ｃ７、４８−Ｃ１、４８−Ｃ４の８クローンに絞り込まれた。これらのクローンについて、ＳＡ５８−２抗体、アフィニティー精製ヒト抗ＳＥＢ抗体との反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡで評価した。
発現蛋白量を併せて、両抗体に対する反応性を評価した結果、全てのクローンで反応性が低下していた（図２）。特に中和抗体であるＳＡ５８−２に対する反応性は、鋳型に用いたＮ２３Ｙと比べてクローン４２−Ｃ２や４８−Ｃ１、４８−Ｃ４で約１／３０〜１／５０、４７−Ｃ７で約１／８、４−Ｃ１で約１／２に低下していた（表１）。精製ヒト抗ＳＥＢ抗体に対する反応性では、同じく４２−Ｃ２や４８−Ｃ１、４８−Ｃ４、また４７−Ｃ７で約１／８程度、４−Ｃ１で約１／２〜１／４に低下していた（表１）。なお、これら抗ＳＥＢ抗体との反応性を調べたクローンについては、エピトープ領域中のアミノ酸置換部位の配列も決定し、表１に示した。
以上の反応性を総合的に解析評価して、以下の実験には４２−Ｃ２、４７−Ｃ７、および４−Ｃ１を用いることとした。Ｎ２３Ｙを鋳型としたこれらのＳＥＢ改変体を、以下、「エピトープ改変体」と総称する。

エピトープ改変体の末梢血単核球に対する生物学的解析
（１）エピトープ改変体の増殖ならびに幼若化誘導活性の評価
健常人の末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；以下、「ＰＢＭＣ」と称することがある）を１×１０^５／ウエルとなるように９６ウェルプレートに播種し、ＳＥＢ、Ｎ２３Ｙ、ＳＥＢエピトープ改変体を０．０１、１、１００、１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で３日間刺激し、ハーベスト１６時間前にトリチウム−チミジン（０．５μＣｉ）を取り込ませて増殖誘導活性を調べた。また、上記ＰＢＭＣを各々同濃度のＳＥＢ改変体存在下で中期間（６日間）培養し、Ｔ細胞の幼若化の程度をフローサイトメトリー（以下、「ＦＡＣＳ」と称することもある）のＦＳＣ／ＳＳＣ解析により調べた。
その結果、ＳＥＢは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上でＰＢＭＣに対し濃度依存的に強い増殖誘導活性を示した。代表例を図３に示す。Ｎ２３ＹはＳＥＢより増殖誘導活性はかなり弱く、１００ｎｇ／ｍＬ以上でトリチウム−チミジンの取り込みが検出されはじめ、１０００ｎｇ／ｍＬでもＳＥＢの１／１０程度のカウントであった。エピトープ改変体は更に増殖誘導能が低下していた（図３）。また、幼若化誘導活性ではＮ２３Ｙは１ｎｇ／ｍＬ以上で１０−３０％の細胞に有意な幼若化を誘導したが、４２−Ｃ２および４７−Ｃ７の誘導活性はＮ２３Ｙの約１／１０程度であった。４−Ｃ１はＮ２３Ｙとほぼ同等であった（図４）。これらの成績から、エピトープ改変体はエピトープに変異を導入しても、インビトロでヒトＰＢＭＣに対する増殖誘導能や幼若化誘導能において、Ｎ２３Ｙとほぼ同等の生物活性を有していることが明らかとなった。
（２）エピトープ改変体のサイトカイン誘導活性の評価
健常人のＰＢＭＣを１×１０^６／ｍＬで２４ウエルプレートに播種し、ＳＥＢ、Ｎ２３Ｙ、およびエピトープ改変体の０．０１、１、１００、１０００ｎｇ／ｍＬで２日間刺激後、上清を回収した。この培養上清の種々のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ）産生をＥＬＩＳＡキット（ＣｙｔｏＳｅｔｓ、ＣｙｔｏＦｉｘ、旭テクノグラス社）を用いて測定した。
その結果、エピトープ改変体はＮ２３Ｙと同様、ＳＥＢに比べサイトカイン産生能は低く、サイトカイン誘導パターンはＮ２３Ｙと同様の傾向を示した。すなわち、抑制性サイトカインＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４産生は相対的に有意に高く、炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γの誘導は低かった。ＳＥＢ１００ｎｇ／ｍＬ刺激時のサイトカイン誘導活性を１００％としたときのエピトープ改変体（１００ｎｇ／ｍＬ）の相対活性を図５に示す。エピトープ改変体はインビトロでヒトＰＢＭＣに対するサイトカイン誘導能においてＮ２３Ｙと同等の生物学的活性を有していた。
また、図５に示す結果から明らかなように、ＳＥＢと比較してＮ２３Ｙやエピトープ改変体ではＩＦＮ−γの誘導が顕著に抑制され、それに対して抑制性サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１０の産生は相対的に高いことから、ＳＥＢ改変体はＴ細胞ポピュレーションをＴｈ１からＴｈ２へシフトさせる活性を有していると考えられた。

（１）エピトープ改変体のマウス関節炎モデルでの評価
マウスのコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルでＮ２３Ｙおよびエピトープ改変体の薬効を評価した。７週齢のＤＢＡ／１Ｊ雄マウスの尾根部にフロイントのコンプリートアジュバント（ＦＣＡ）を用いて、ウシＩＩ型コラーゲンをマウス当たり１００μｇで感作した。３週後に再度同抗原で追加感作して関節炎を誘導した。追加感作１週後に各マウスの四肢を観察し、関節炎の発症程度をスコア化した。スコア化は以下のように行った。各四肢について、未発症：０点、指が１本腫脹：１点、指が２〜４本腫脹あるいは肢の甲が腫脹：２点、全ての指が腫脹あるいは激しい腫脹：３点。四肢の合計点数を算出し（最高１２点）、当該マウスの関節炎スコアとした。関節炎のスコアが１〜４点の軽度のマウスを選別して群を構成し、薬剤を経口投与した。薬剤は１０μｇ／マウスでゾンデを使って４週間連日投与した。薬剤投与開始から１週間に２度スコアを付け、関節炎の程度を観察した。投与終了後に四肢の関節をソフトＸ線で撮影して、骨びらんの程度をスコア化して骨破壊に対する作用を評価した。
その結果、生理食塩水投与のコントロール群に比べて４−Ｃ１および４７−Ｃ７の各エピトープ改変体は関節炎症状を有意に抑制した。４２−Ｃ２では抑制は認められなかった（図６）。また、４７−Ｃ７および４−Ｃ１では骨破壊の抑制効果も観察された（図７）。
（２）エピトープ改変体投与による抗ＳＥＢ抗体の惹起
試験終了後に全採血し、血中の抗ＳＥＢ抗体価をＥＬＩＳＡ法にて測定した。その結果、４７−Ｃ７投与群は薬剤無投与群、コントロールの生理食塩水投与群と同程度の値を示し、免疫原性が低減されていることが明らかとなった（図８（Ａ））。また、４７−Ｃ７改変体は、この蛋白自身に対する抗体誘導も低く、エピトープを改変した配列が新たな抗原エピトープとなっている可能性は低いと思われた（図８（Ｂ））。

Claims (4)

1. 黄色ブドウ球菌腸管内毒素Ｂ（ＳＥＢ）の２２６位から２２９位までのアミノ酸配列がＡｌａＴｈｒＴｈｒＧｌｎまたはＬｙｓＡｒｇＩｌｅＩｌｅに置換されていることを特徴とする、ＳＥＢに対する中和抗体（抗ＳＥＢ抗体）との反応性を低減させたＳＥＢ改変体。
2. ＳＥＢのアミノ酸配列中の２３位のＡｓｎがＴｙｒで置換されている、請求項１ に記載のＳＥＢ改変体。
3. 請求項１または２に記載のＳＥＢ改変体を主成分として含有し、ＳＥＢに対する免疫学的応答性を低下させ、Ｔ細胞活性化の抑制作用を有するものであることを特徴とする、関節リウマチの予防・治療用剤。
4. 経口投与剤である、請求項３に記載の関節リウマチ予防・治療用剤。

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