CN1709909A

CN1709909A - 一种蛇毒去整合素及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1709909A
Application number: CN 200510076906
Authority: CN
Inventors: 张艳宇; 姜升阳; 许金波; 周锡鹏; 马平; 吕丽萍
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2005-06-09
Filing date: 2005-06-09
Publication date: 2005-12-21
Anticipated expiration: 2025-06-09
Also published as: CN100357322C

Abstract

本发明公开了一种去整合素及其编码基因与应用。其目的是提供一种去整合素及其编码基因与其在制备抑制血小板聚集药物中的应用。它是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制血小板聚集作用的蛋白质。本发明所提供的能够抑制血小板聚集的去整合素及其编码基因，有望成为临床血小板聚集抑制剂或蛋白类药物，并可作为临床上使用的血小板抑制剂(血小板膜受体的拮抗剂)在药物设计时的理想底物，将对研发具有自主知识产权的血小板聚集抑制剂具有重要意义。

Description

一种蛇毒去整合素及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及动物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种蛇毒去整合素及其编码基因与其在制备抑制血小板聚集药物中的应用。

背景技术

心脑血管疾病导致的死亡率位于我国各类疾病之首。目前，治疗心脑血管的药物有防栓药物、溶栓药物和抗血小板聚集药物。在蛇毒中就存在上述三种药物成分，如防栓的类凝血酶，溶栓的纤维蛋白溶解酶和抗血小板聚集的去整合素等，其中去整合素是在蛇毒中所分离的一种蛋白质分子，因其可强力拮抗整合素而得名，蛇毒去整合素的典型特征是含有亲水性的氨基酸序列Arg-Gly-Asp(RGD)、富含半胱氨酸残基(cysteine)、分子量在5-9kDa的小分子蛋白，蛇毒去整合素抑制血小板聚集的机理在于其RGD序列和血小板上的纤维蛋白原受体(GPIIb/IIIa)有极高的结合亲和力，可阻断血小板和纤维蛋白原的结合，从而达到抑制血小板凝集的作用。目前临床上用于阻断血小板和纤维蛋白原结合产生聚集的药物有抗GPIIb/IIIa的人鼠嵌合抗体-阿昔单抗(abciximab)、含RGD序列的合成环状肽类，如埃替非巴肽(Eptifibatide)、合成非肽类衍生物，如替罗非班(tirofiban)、拉米非班(lamifiban)等；国内应用上述三类药物目前主要依赖进口，因此迫切需要具有自主知识产权的抗血小板聚集药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抑制血小板聚集作用的去整合素及其编码基因。

本发明所提供的去整合素，名称为Kistin，来源于蝰科蝮亚科腹蛇属尖吻腹蛇(Deinagkistrodon acutus)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制血小板聚集作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由81个氨基酸残基组成。

编码本发明去整合素的基因(Kistin)，也属于本发明的保护范围。它是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由243个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-第243位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增Kistin中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述去整合素的方法。

本发明所提供的表达上述去整合素的方法，是将含有编码上述去整合素基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到去整合素。

所述宿主为任一可表达外源基因的原核或真核细胞。

所述原核细胞可为大肠肝菌，如E.coli TB1或E.coli DE3等。

所述真核细胞可为哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞等。包括COS-7、CHO、BHK-21或Pichia pastoris等。

用于构建含有去整合素编码基因的重组表达载体的出发载体可为pMAL-P2X、pET32或pQE-30等。

以pMAL-P2X为出发载体，构建的含有所述去整合素基因的重组表达载体为pMAL-P2X/Kistin。

当所述宿主为大肠肝菌时，需加入IPTG进行诱导表达，所加入IPTG的浓度为0.1-0.5mM，优选为0.3mM。

培养含有本发明的去整合素编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

本发明还提供了一种抑制血小板聚集的药物。

本发明所提供的抑制血小板聚集的药物，活性成分均为上述去整合素。

需要的时候，在上述抑制血小板聚集的药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为0.5-2mg去整合素Kistin/kg体重/day，疗程为10-20天。

本发明所提供的能够抑制血小板聚集的去整合素Kistin及其编码基因，有望成为临床血小板聚集抑制剂或蛋白类药物，并可作为临床上使用的血小板抑制剂(血小板膜受体的拮抗剂)在药物设计时的理想底物，将对研发具有自主知识产权的血小板聚集抑制剂具有重要意义。

附图说明

图1为RT-PCR扩增的去整合素基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为转化有去整合素基因克隆载体的阳性克隆的PCR和酶切鉴定结果

图3为含有突变碱基的去整合素基因的PCR扩增检测结果

图4为整合素原核表达载体pMAL-P2X的PCR和酶切鉴定结果

图5为含有突变碱基的去整合素基因与原去整合素基因Kistin的序列比对结果

图6为原核表达的去整合素的SDS-PAGE检测结果

图7为经纯化的原核表达的去整合素的SDS-PAGE检测结果

图8为加入经纯化的原核表达的去整合素后再以ADP诱导剂诱导的血小板5min聚集率的曲线图

图9为加入对照蛋白MBP后再以ADP诱导剂诱导的血小板5min聚集率的曲线图

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物均由上海生工合成。

实施例1、去整合素基因(Kistin)的获得

1、RT-PCR扩增

根据蛇毒去整合素的核苷酸序列(Eur J Biochem.2000 Mar；267(5)：1359-67，Tsai IH，Wang YM，Chiang TY，Chen YL，Huang RJ，Purification，cloning andsequence analyses for pro-metalloprotease-disintegrin variants fromDeinagkistrodon acutus venom and subclassification of the small venommetalloproteases)，选取去整合素5′和3′端的保守性核苷酸序列设计引物，以腹蛇属尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)的蛇毒腺总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，引物序列如下：

引物1(上游引物)：5′-CCAGTTTCTGGAAATGAA-3′

引物2(下游引物)：5′-GGCATGGGAGTGATATCT-3′

提取尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)(广西南宁地区)的蛇毒腺总RNA并以此为模板，在引物1和引物2的引导下，进行RT-PCR扩增，具体方法如下：

第一轮反应体系及反应条件为：模板RNA 2μg、Oligo(dT)引物3μL，加DEPC水至10μL，在65℃下保温5min后，迅速置于冰上冷却，然后加入5×PCR缓冲液(TAKARA公司产品)4μL、dNTPs混合物(10mM each)1μL、RNase抑制剂(TAKARA公司产品)20U、反转录酶M-MLV(TAKARA公司产品)200U，最后用DEPC水补足至20μL，42℃保温1h。

第二轮反应体系为：第一轮RT-PCR产物1μL，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)4μL，dNTPs(2.5mmol/L each)4μL，LA-Taq酶(TAKARA公司产品)(5U/μL)0.2μL，引物1和引物2(上、下游引物)(25μmol/L)各1μL，加去离子水补充反应体系至50μL。PCR反应条件为：先94℃5min；再94℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，共30个循环；最后72℃10min。

反应结束后，对RT-PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道1为Marker，泳道2为RT-PCR产物)，扩增出长度约250bp的DNA片段，与预期结果相符。

2、基因克隆载体的构建

1)连接

回收并纯化步骤1获得的长度约250bp的目的片段，将其与载体pMD18-T(TaKaRa公司)相连，得到含有目的片段的克隆载体，连接体系为：T₄ DNA连接酶10×缓冲液1μL，pMD18-T 1μL，经纯化的扩增产物3μL，T₄ DNA连接酶(TaKaRa公司)(3U/μL)1μL，加去离子水补充反应体系至10μL，16℃连接12h。

2)转化及阳性克隆的筛选

将步骤1)的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京天为时代公司)，具体方法为：取5μL连接产物，加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴1h后，42℃热休克90sec，立即于冰浴中放置3min，加入900μL LB液体培养基，在37℃、150rpm下，匀速摇动1h。取200μL均匀涂布于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB抗性平板上，37℃培养12-24h。

3)阳性克隆的挑选及阳性质粒的提取

随机挑选在LB抗性平板长出的单菌落，将其接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基中，在37℃、225rpm匀速摇动下，扩增培养12-16h。培养结束后，用北京鼎国生物技术公司的质粒快速提取试剂盒并参照试剂盒说明书提取质粒，具体方法为：取上述培养菌液3mL，15,000rpm离心30sec后，弃上清，加入200μL悬浮液和10μL RNase A(10mg/mL)彻底悬浮，再用300μL裂解液和450μL变性剂处理，12000rpm离心5min后，移上清至吸附柱中，静置2min，8000rpm离心30sec，再用洗涤液洗涤吸附柱后，12000rpm离心1min甩干剩余液体，将吸附柱置于新的离心管中，加入40μL 50℃预热的去离子水，静置1min，12,000rpm离心1min，沉淀即为质粒DNA，-20℃保存备用。

4)阳性克隆的PCR鉴定

取400μL步骤1)经扩增的菌液，离心后取其沉淀，每管加TE液80μL，于沸水中孵育10min后，15,000rpm离心10min，取上清。分别以步骤3)提取的质粒和用上述方法获得的菌液上清为模板，在引物1和引物2的引导下，用常规PCR法进行鉴定，PCR扩增扩增条件为：94℃30sec，57℃30sec，72℃，30sec，共30个循环。PCR反应结束后，取5μL扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(泳道2为提取的质粒，泳道3为菌体PCR鉴定结果，泳道4为质粒PCR鉴定结果，泳道5为DL2000 DNA Marker)，扩增出了长度约250bp的DNA片段，与预期结果相符，将其命名为pMD18-T/Kistin。

5)阳性克隆质粒的测序

对步骤4)获得的阳性克隆质粒进行测序，测序结果表明所克隆的基因具有序列表中SEQ ID №：2的DNA序列，序列表中的SEQ ID №：2由243个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-第243位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质，经该基因命名为Kistin，将其所编码的蛋白命名为Kistin。对该基因的核苷酸序列进行Blast比对分析，结果表明本发明的基因与Gloydiussaxatilis metalloproteinase/disintegrin saxin precursor(gi|31322300)、T.mucrosquamatus mRNA for metalloprotease and disintegrin(gi|467703)、Gloydius halys brevicaudus platelet aggregation inhibitor(gi|3003024)、Gloydius saxatilis disintegrin mRNA，partial cds(gi|31322308)、Trimeresurusflavoviridis hemorrhagic metalloprotease HR2a(gi|14595994)和Gloydiusussuriensis metalloproteinase/disintegrin ussurin precursor(gi|31322302)所限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。对该基因所编码的蛋白的氨基酸残基序列进行Blast比对分析，结果表明本发明基因所编码的蛋白与metalloproteinase/disintegrin saxin precursor(gi|31322301)、Hemorrhagic protein-rhodostomin precursor(RHO，gi|461932)、Hemorrhagicmetalloproteinase HR2a precursor(Trimerelysin II，gi|50403719)、Zincmetalloproteinase jerdonin precursor(gi|48428041)、Disintegrin acostatinalpha precursor(gi|48428043)和platelet aggregation disintegrin(basilicin)，venom-Mexican West-Coast rattlesnake(gi|281138)所限定的氨基酸序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。

实施例2、去整合素原核表达载体pMAL-P2X/Kistin的构建及目的蛋白的表达

一、去整合素原核表达载体pMAL-P2X/Kistin的构建

1、去整合素基因的扩增

重新设计引物PCR扩增去整合素基因片断，将引物1(上游引物)中自5’端第三位G和第九位A分别人为无义突变为A与C，成为大肠杆菌所偏爱的密码子，但是其编码氨基酸不变，在引物2(下游引物)中引入限制性内切酶Hind III识别位点及两个连续的终止密码子，得到的引物序列为：

引物3(上游引物)：5′-GAAGCAGGCGAAGAGTGT-3′

引物4(下游引物)：5′-GCTAAAGCTTCTATTAGGCATGGGAGTG-3′

以实施例1获得的阳性克隆质粒pMD18-T/Kistin为模板，在引物3和引物4的引导下，PCR扩增去整合素基因Kistin，PCR反应体系为：克隆质粒2μL，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)20μL，dNTPs(2.5mmol/L each)16μL，LA-Taq酶(5U/μL)0.8μl，引物3(25μmol/L)4μL，引物4(25μmol/L)4μL，加去离子水补充反应体系至200μL。PCR反应条件为：先94℃5min；再94℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，结果如3所示(泳道1为DL-2000 DNA Marker，泳道2和泳道3为PCR扩增产物)，用DNA纯化/回收试剂盒(北京鼎国生物技术公司)回收并纯化250bp的目的片断，将纯化产物溶于40μL TE中，-20℃冻存备用。

2、回收产物的末端平端化处理

对步骤1的回收产物进行末端平端化处理，反应体系及反应条件为：经纯化的回收产物26.5μL，10×缓冲液(TAKARA公司)3.6μL，0.1％ BSA 3.6μL，10mM dNTPs 1μL(加样顺序为：10×缓冲液→0.1％ BSA→DNA)。先置70℃保温5min，然后置于37℃保温后添加1.3μL的T₄ DNA聚合酶(TAKARA公司)反应5min，在震荡器上剧烈震荡，使酶失活，再置于冰上，加入等体积酚/氯仿后，混匀，12,000rpm、4℃离心10min，小心吸取最上层，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)，混匀后加入2.5倍体积的100％乙醇，于4℃沉淀12-24h，12,500rpm离心20min，用70％乙醇洗涤沉淀，干燥后加入20μL的去离子水。

3、平端化PCR产物的Hind III酶切处理

对步骤2经平端化处理的PCR产物用限制性内切酶Hind III进行酶切处理，酶切反应体系为：平端化PCR产物20μL，10×缓冲液3μL，Hind III酶(TaKaRa公司)2μL，去离子H₂O 5μL。37℃反应2.5h后，65℃10min灭活酶，加入等体积酚/氯仿后，混匀，12,000rpm、4℃离心10min，吸取最上层，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)，混匀后加入2.5倍体积的100％乙醇，于4℃沉淀12-24h，12,500rpm离心20min，用70％乙醇洗涤沉淀，干燥后加入15μL的去离子水。

4、pMAL-P2X质粒载体的扩增及酶切处理

1)pMAL-P2X质粒载体的扩增

将载体pMAL-P2X(购自New Englang Biolabs公司)用CaCl₂法转化大肠杆菌JM109菌株。挑取阳性克隆，接种于5mL LB液体培养基中，37℃、225rpm培养12h后，提取质粒。

2)pMAL-P2X质粒载体的Xmn I(购自New Englang Biolabs公司)和Hind III(购自New Englang Biolabs公司)酶切处理

对步骤1)扩增的pMAL-P2X质粒载体用限制性内切酶Xmn I进行酶切处理，酶切体系为：pMAL-P2X质粒25μL，10×缓冲液5μL，0.1％BSA 0.5μL，Xmn I酶(TaKaRa公司)2.5μL，去离子H₂O 17μL。37℃反应2.5h，再65℃10min灭活酶。对酶切产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，回收6700bp目的条带。再对其用限制性内切酶Hind III进行酶切，酶切体系为：经Xmn I酶切处理后的载体pMAL-P2X 25μL，10×缓冲液5μL，Hind III酶2.5μL，去离子H₂O 17.5μL。37℃反应2.5h，再65℃10分钟灭活酶，加入等体积酚/氯仿后，混匀，12,000rpm、4℃离心10min，吸取最上层，加入1/10体积的3M乙酸钠，混匀后加入2.5倍体积的100％乙醇，于4℃沉淀12-24h，12,500rpm离心20min，用70％乙醇洗涤沉淀，干燥后加入15μL去离子水。

5、去整合素原核表达载体pMAL-P2X/Kistin的获得

1)连接

将步骤3获得的经Hind III酶切处理目的片断与经Xmn I和Hind III酶切处理的质粒载体pMAL-P2X进行连接，连接体系及反应条件为：经酶切的载体pMAL-P2X1μL，目的片段5μL，去离子H₂O 11μL，45℃保温5min，在冰上冷却后加入以下成分：10×T₄ DNA连接酶缓冲液(TAKARA公司)2μL，T₄ DNA连接酶1μL，16℃反应12h后，于-20℃保存备用。

2)连接产物的转化、阳性克隆的筛选与鉴定

取5μL步骤1)的连接产物，将其用CaCl₂法转化200μL大肠杆菌JM109感受态细胞后，接种于含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB抗性琼脂平板，37℃培养12-24h，随机挑选单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃培养12-24h。培养结束后，提质粒，对其用限制性内切酶Xmn I和Hind III进行酶切鉴定，结果如图4所示(泳道1为DL-2000 DNA Marker，泳道2为Xmn I和Hind III酶切产物，泳道3为PCR鉴定结果)，经酶切获得6700bp和250bp DNA片段为阳性克隆；用PCR法作进一步的鉴定，PCR鉴定的方法为：取1μL菌液作为PCR反应模板，在引物3和引物4的引导下，进行PCR扩增。反应结束后，取5μL扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4所示(泳道1为DL-2000 DNA Marker，泳道2为Xmn I和Hind III酶切产物，泳道3为PCR产物)，PCR扩增到250bp的DNA片段，与预期结果相符；最后对所获得阳性克隆质粒进行测序，结果如图5所示，阳性克隆质粒中的目的基因与去整合素基因除自5’端第3位碱基的G和第9位碱基A无义突变为A与C后，其余碱基序列均相同，表明所构建的去整合素的原核表达载体正确，将含有去整合素基因的原核表达载体命名为pMAL-P2X/Kistin。

二、去整合素的表达及其检测

1、去整合素的表达

将步骤一构建的去整合素原核表达载体pMAL-P2X/Kistin转化大肠杆菌TB1感受态细胞，16℃培养12h后，随机挑选一个单菌落，接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，以37℃，225rpm振荡过夜培养；用含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基作1∶50稀释后增菌3h，当OD600达到0.4时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.3mmol/L，诱导表达6h。

2、去整合素的检测

表达结束后，取菌体进行SDS-PAGE电泳进行检测，结果如图6所示(泳道1为pMAL-P2X诱导表达产物，泳道2为pMAL-P2X未诱导表达，泳道3为蛋白质Marker，泳道4为pMAL-P2X/Kistin未诱导产物，泳道5为pMAL-P2X/Kistin诱导表达产物)，表达获得了50KD的蛋白，与预期结果相符，用Amylose树脂亲和纯化系统(购自New Englang Biolabs公司)方法对其进行纯化，对纯化的蛋白再行SDS-PAGE电泳进行检测，结果如图7所示(泳道1为pMAL-P2X诱导表达产物纯化结果，泳道2为未纯化的pMAL-P2X诱导表达产物，泳道3为未纯化的pMAL-P2X/Kistin诱导表达产物，泳道4为蛋白质Marker，泳道5为纯化的pMAL-P2X/Kistin诱导表达产物，表明获得较高纯度的去整合素。

实施例3、体外抑制血小板聚集实验

健康人血小板(解放军307医院或北京血站)中加入终浓度为33μM/L的ADP溶液(Sigma公司)，5min内血小板最大聚集率接近100％，以其作为参照，再将浓度分别为25、37.5、50μg/mL的实施例2获得的去整合素加入血小板中，在37℃下孵育3分钟后，再加入浓度为33μM/L的ADP聚集诱导剂，随即检测血小板聚集率，结果如图8所示(纵坐标为血小板聚集率，横坐标为给药后时间)，添加ADP聚集诱导剂后，血小板5min最大聚集率随着去整合素浓度的增加明显下降，当去整合素终浓度为50μg/mL时，血小板聚集几乎完全被抑制；将去整合素替换为MBP蛋白(pMAL-P2X表达产物)作为对照(制备方法和该重组去整合素获得的方法相同)，其余与上述方法相同，结果如图9所示(纵坐标为血小板聚集率，横坐标为给药后时间)，在各个MBP蛋白浓度下，血小板5min最大聚集率均接近100％，对上述实验结果进行统计，统计结果如表1所示，表明MBP蛋白并不具有抑制血小板聚集活性的作用。

表1 加入不同剂量融合蛋白和对照蛋白后血小板的五分钟最大聚集率(X±S)

组别	血小板五分钟最大聚集率
	血小板五分钟最大聚集率			蛋白剂量(μg/mL)	25	37.5	50
	ADP+对照蛋白(MBP)ADP+表达的去整合素	1.00±00.65±0.04	0.97±0.040.37±0.04	蛋白剂量(μg/mL)	25	37.5	50	0.97±0.050.01±0.02

序列表

<160>2

<210>1

<211>81

<212>PRT

<213>蝰科蝮亚科尖吻腹蛇(Agkistrodon acutus)

<400>1

Pro Val Ser Gly Asn Glu Leu Leu Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys

1 5 10 15

Gly Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Lys

20 25 30

Gln Gly Ala Gln Cys Ala Lys Gly Leu Cys Cys Asp Gln Cys Thr Phe

35 40 45

Val Lys Ala Gly Lys Ile Cys Arg Arg Ala Arg Gly Asp Asn Pro Asp

50 55 60

Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Gly Asp Cys Pro Arg Tyr His Ser His

65 70 75 80

Ala

<210>2

<211>243

<212>DNA

<213>蝰科蝮亚科腹蛇属尖吻腹蛇(Deinagkistrodon acutus)

<400>2

ccagtttctg gaaatgaact tttggaggca ggagaagagt gtgactgtgg ctctcctgaa 60

aatccgtgct gcgatgctgc aacctgtaaa ctgaagcaag gagcacagtg tgcaaaagga 120

ctgtgttgtg accagtgcac atttgtaaaa gcaggaaaaa tatgccggag agcaaggggt 180

gataatccgg atgatcgctg cactggccaa tctggtgact gtcccagata tcactcccat 240

gcc 243

Claims

1、一种去整合素，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2、根据权利要求1所述的去整合素，其特征在于：所述去整合素具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列。

3、编码权利要求1所述去整合素的基因。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：它是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

5、根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述基因具有序列表中SEQ ID №：2的DNA序列。

6、含有权利要求3或4或5所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

7、一种表达权利要求1或2所述去整合素的方法，是将含有所述去整合素基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到去整合素。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述表达去整合素的重组表达载体为pMAL-P2X/Kistin。

9、根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠肝菌时，需加入IPTG进行诱导表达，所加入IPTG的浓度为0.1-0.5mM。

10、一种抑制血小板聚集的药物，它的活性成分为权利要求1或2所述去整合素。