CN102203244A

CN102203244A - 制备光学活性胺衍生物的方法

Info

Publication number: CN102203244A
Application number: CN2009801431929A
Authority: CN
Inventors: 长泽透; 吉田丰和; 石田浩一; 山本浩明; 木本训弘
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 2008-09-01
Filing date: 2009-09-01
Publication date: 2011-09-28
Also published as: KR20110049906A; JPWO2010024444A1; US20110287494A1; EP2330190A1; WO2010024444A1

Abstract

本发明分离和纯化立体选择地还原亚胺衍生物的新酶，并克隆编码该酶的多核苷酸。利用可立体选择地还原所述化合物的微生物的培养物、菌体或其处理物和/或其亚胺还原酶作用于亚胺衍生物，来制备光学活性胺衍生物，然后回收所产生的光学活性胺衍生物。本发明能够制备例如式(IV)代表的光学活性化合物(式中，R基团代表具有1～3个碳原子的烷基；n代表1至4的整数)。

Description

制备光学活性胺衍生物的方法

技术领域

本发明涉及通过立体选择地还原亚胺衍生物来制备光学活性胺衍生物的方法，该光学活性胺衍生物用作合成药物等的原料或中间体。

背景技术

本领域技术人员已经了解参与氨基酸(例如1-吡咯啉-2-羧酸或1-吡咯啉-5-羧酸)代谢的酶，和具有特定结构与功能的、可还原亚胺衍生物的酶，例如二氢叶酸还原酶。然而，除了下述报道之外，对可通过立体选择地还原简单的亚胺化合物(例如2-甲基-1-吡咯啉)来制备光学活性胺衍生物的酶或微生物知之甚少。

非专利文献1：Tetrahedron，60，753-758，2004

Reduction of N-benzylidenebenzylamine by Acetobacterium woodi

非专利文献2：Tetrahedron Asymmetry，19，93-96(2008)

Reduction of N-((E)-N-(1-phenylethylidene)aniline derivatives by Candida parapsilosis

然而，由于N-亚苄基苯甲胺(N-benzylidenebenzylamine)的还原产物没有手性，所以还不清楚该反应的立体选择性。此外，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)还原N-((E)-N-(1-苯基亚乙基)苯胺衍生物的效率非常低，因此并不适于工业应用。另外，还没有鉴别出负责所述亚胺还原的酶。

另一方面，已知下面的方法可用于制备2-甲基吡咯烷：

非专利文献3：Acta.Pharm.Suec.，15，255-263，1978

使用酒石酸，通过光学拆分外消旋2-甲基吡咯烷来制备手性2-甲基吡咯烷的方法，其中，外消旋2-甲基吡咯烷是使用硼氢化钠还原2-甲基-1-吡咯啉来制备的。

非专利文献4：J.Org.Chem.，54，209-216，1989

制备2-甲基吡咯烷的方法，其中，使用亚硫酰氯将L-脯氨酸衍生的L-脯氨醇(L-prolinol)的羟基转变为氯基团；用苄氧基羰基保护氮原子；然后使用三正丁基氢锡(tributyltin hydride)，通过基于自由基(radical)的还原来制备(R)-1-苄氧基羰基-2-甲基吡咯烷，然后进行脱保护。

专利文献1：WO2005/073388

制备(R)-2-甲基吡咯烷的方法，其中，光学活性(S)-1，4-戊二醇转变为二磺酸酯，以及与苯甲胺的反应来进行环化，从而合成(R)-1-苄基-2-甲基-1-吡咯烷，然后进行脱苄基。

然而，所有这些方法均具有下面的问题：

-过程长；

-使用危险的氢化物试剂；

-使用昂贵的光学活性二醇作为原料；以及

-由于通过光学拆分方法制备产物，因此产率不超过50％

[现有技术文献]

[非专利文献]

[非专利文献1]Tetrahedron，60，753-758(2004)

[非专利文献2]Tetrahedron Asymmetry，19，93-96(2008)

[非专利文献3]Acta.Pharm.Suec.，15，255-263(1978)

[非专利文献4]J.Org.Chem.，54，209-216(1989)

[专利文献1]WO2005/073388

发明内容

[本发明要解决的问题]

本发明的目的是提供由亚胺衍生物来制备光学活性胺衍生物的方法。本发明的另一个目的是提供微生物和酶，这些微生物和酶能够使用亚胺衍生物作为底物来制备光学活性胺衍生物。本发明的另一个目的是通过分离编码具有目标性质的酶的DNA来获得重组体。本发明的又一个目的是提供使用重组体来制备光学活性胺衍生物的方法。

[解决问题的方法]

本发明人等探索了能够使用亚胺衍生物作为底物来制备光学活性胺衍生物的微生物，成功地发现了具有目标活性的微生物。本发明人等鉴定了所得到微生物，并确定下述微生物均属于链霉菌属(Streptomyces)。本发明人鉴定的微生物可以通过2-甲基-1-吡咯啉的不对称还原来制备例如(R)-2-甲基吡咯烷。

链霉菌(Streptomyces sp.)GF3587；

链霉菌(Streptomyces sp.)GF3501；

链霉菌(Streptomyces sp.)GF3585；和

链霉菌(Streptomyces sp.)GF4415。

这些微生物当中，显示出最强活性的链霉菌GF3587用于分析可通过2-甲基-1-吡咯啉的不对称还原来制备(R)-2-甲基吡咯烷的酶的性质。该酶显示是NADPH-依赖亚胺还原酶。本发明人还通过大量GF3587培养物来制备无细胞提取物、然后进行下述步骤成功地纯化了亚胺还原酶：

-硫酸铵分级；

-使用DEAE-葡聚糖纤维素(Sephacel)的离子交换色谱；

-使用苯基琼脂糖凝胶(Phenylsepharose)的疏水色谱；和

-使用2′，5′-ADP琼脂糖凝胶4B的亲和色谱。

此外，本发明人分离了编码该酶的DNA，并且构建了高水平表达该酶的重组细菌。

同时，使用BLAST程序，进行SEQ ID NO：6的氨基酸序列的同一性检索(相对于SWISS-PROT)，发现与本发明的亚胺还原酶同样的蛋白质。具体来说，它是一个被命名为Q1EQE0的推定蛋白，其通过卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的基因组分析来鉴定。该蛋白质的功能是未知的。制备高水平表达Q1EQE0的重组细菌，并评价Q1EQE0的性质。结果表明Q1EQE0具有亚胺还原活性。

如上所述，已知涉及立体选择地还原亚胺衍生物的生物合成的酶。然而，所有已知的酶与氨基酸或叶酸代谢有关。

因此，当酶用于制备药物的中间体或诸如此类物质时，不能预期工业应用需要的底物特异性和活性。尤其是，没有利用还原环状烷基亚胺衍生物(例如2-甲基-1-吡咯啉)来制备光学活性环状烷基胺衍生物的合适方法。

因此，令人非常惊讶的是发现了具有底物特异性和催化活性的微生物，其适于制备药物等的中间体。更意外的是，微生物的立体选择地还原亚胺的能力十分地高，并且满足工业应用的需要。此外，本发明人分离了编码亚胺还原酶的DNA，然后制备了高水平表达该酶的重组细菌，由此完成了本发明。

具体来说，本发明提供了制备光学活性胺的方法，如下所述。本发明还涉及可用于该方法的微生物和亚胺还原酶，包含编码这种酶的DNA的多核苷酸，制备该酶的方法和其用途。

[1]一种亚胺还原酶，其具有下面物理化学性质(1)～(5)：

(1)活性：以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(在下文简写为NADPH)-依赖方式还原2-甲基-1-吡咯啉从而产生(R)-2-甲基吡咯烷；

(2)辅酶依赖性：使用NADPH作为辅酶；

(3)最适pH值：6.0～7.0；

(4)最适温度：40～55℃；以及

(5)分子量：利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(在下文简写为SDS-PAGE)约为32000，以及利用凝胶过滤法约为65000～70000。

[2][1]项所述的亚胺还原酶，其来源于属于链霉菌属的微生物。

[3][2]项所述的亚胺还原酶，其中，属于链霉菌属的微生物选自下述中的任意微生物：

链霉菌NITE BP-594；

链霉菌NITE BP-595；

链霉菌NITE BP-596；以及

链霉菌NITE BP-597。

[4][2]项所述的亚胺还原酶，其中属于链霉菌属的微生物选自下述中的任意微生物：

灰锈赤链霉菌(Streptomyces griseorubiginosus)；

细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)；以及

白绿链霉菌(Streptomyces alboviridis)。

[5][4]项所述的亚胺还原酶，其中灰锈赤链霉菌、细黄链霉菌和白绿链霉菌分别是下面的微生物菌株：

灰锈赤链霉菌(Streptomyces griseorubiginosus)NBRC 13047；

细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)NBRC 13062；以及

白绿链霉菌(Streptomyces alboviridis)NBRC 13013。

[6]一种亚胺还原酶，其具有[1]项的物理化学性质(1)和(2)，并且其是由下面(a)～(e)中的任意多核苷酸编码的：

(a)包括SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列的多核苷酸；

(b)编码蛋白质的多核苷酸，其中该蛋白质包括SEQ ID NO：6所述的氨基酸序列；

(c)编码蛋白质的多核苷酸，其中该蛋白质包括在SEQ ID NO：6所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列；

(d)在严格条件下与DNA杂交的多核苷酸，其中该DNA包括SEQ IDNO：5所述的核苷酸序列；以及

(e)编码氨基酸序列的多核苷酸，其中该氨基酸序列与SEQ ID NO：6所述的氨基酸序列具有80％或更高的序列同一性。

[7]一种亚胺还原酶，其包括具有[1]项的物理化学性质(1)和(2)，且具有产生至少80％ee或更高光学纯度的(R)-2-甲基吡咯烷的功能的蛋白质，并且该蛋白质通过下面(a)～(e)中的任意多核苷酸进行编码：

(a)包括SEQ ID NO：16所述的核苷酸序列的多核苷酸；

(b)编码蛋白质的多核苷酸，其中该蛋白质包括SEQ ID NO：17所述的氨基酸序列；

(c)编码蛋白质的多核苷酸，其中该蛋白质包括在SEQ ID NO：17所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列；

(d)在严格条件下与DNA杂交的多核苷酸，其中该DNA包括SEQ IDNO：16所述的核苷酸序列；以及

(e)编码氨基酸序列的多核苷酸，其中该氨基酸序列与SEQ ID NO：17所述的氨基酸序列具有80％或更高的序列同一性。

[8]制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，该方法包括下述步骤：

使式(I)代表的亚胺衍生物与至少一种选自下述的酶活性物质接触，

所述酶活性物质为：具有立体选择地还原所述化合物能力的微生物的培养物；菌体；和其处理物；以及

回收式(II)代表的光学活性R-异构体胺衍生物：

式(I)：

式(II)：

(其中，R1和R2基团各自代表具有1～3个碳原子的烷基；R3基团代表氢或具有1～3个碳原子的烷基；以及R1和R3任选一起形成环)。

[9][8]项所述的方法，其中式(I)的化合物是下式(III)代表的亚胺衍生物，以及式(II)的化合物是式(IV)代表的胺衍生物：

式(III)：

式(IV)：

(其中R基团代表具有1～3个碳原子的烷基；n代表1至4的整数)。

[10][9]项所述的制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，其中式(III)代表的化合物是2-甲基-1-吡咯啉，式(IV)代表的化合物是2-甲基吡咯烷。

[11][8]～[10]项中任一项所述的制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，其中，所述微生物属于链霉菌属。

[12][11]项所述的制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，其中，所述属于链霉菌属的微生物是选自下述中的任意微生物：

链霉菌NITE BP-594；

链霉菌NITE BP-595；

链霉菌NITE BP-596；以及

链霉菌NITE BP-597。

[13][11]项所述的制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，其中，所述属于链霉菌属的微生物选自下述中的任一种：

灰锈赤链霉菌；

细黄链霉菌；以及

白绿链霉菌。

[14][13]项所述的制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，其中，灰锈赤链霉菌、细黄链霉菌和白绿链霉菌分别是下面的微生物菌株：

灰锈赤链霉菌NBRC 13047；

细黄链霉菌NBRC 13062；以及

白绿链霉菌NBRC 13013。

[15]制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，该方法包括下述步骤：

使式(I)代表的亚胺衍生物与至少一种选自下述的酶活性物质接触，所述酶活性物质为：[1]～[7]中任一项的亚胺还原酶；产生该亚胺还原酶的微生物；和其处理物；以及

回收式(II)代表的光学活性R-异构体胺衍生物：

式(I)：

式(II)：

[16][15]项所述的方法，其中式(I)代表的化合物是下式(III)代表的亚胺衍生物，以及式(II)的化合物是式(IV)代表的胺衍生物：

式(III)：

式(IV)：

(其中，R基团代表具有1～3个碳原子的烷基；n代表1至4的整数)。

[17]一种多核苷酸，其编码具有[1]项的物理化学性质(1)和(2)的亚胺还原酶，且其是下面多核苷酸中的任意多核苷酸：

(a)包括SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列的多核苷酸；

[18]一种多核苷酸，其编码亚胺还原酶，该亚胺还原酶具有[1]项的物理化学性质(1)和(2)和具有产生至少80％ee或更高光学纯度的(R)-2-甲基吡咯烷的功能，并且其是下面多核苷酸中的任意多核苷酸：

(a)包括SEQ ID NO：16所述的核苷酸序列的多核苷酸；

[19]一种重组载体，其插入有[17]项或[18]项所述的多核苷酸。

[20][19]项所述的重组载体，其另外插入有编码脱氢酶的多核苷酸，所述脱氢酶能够催化以β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为辅酶的氧化还原反应。

[21][20]项所述的载体，其中脱氢酶是葡糖脱氢酶。

[22][21]项所述的重组载体，其中葡糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

[23]一种转化体，其以能表达的方式保持[17]项或[18]项所述的多核苷酸或[19]项的载体。

[24]制备由[17]项或[18]项所述的多核苷酸所编码的蛋白质的方法，该方法包括培养[23]项的转化体并回收表达产物的步骤。

[发明的效果]

本发明提供了有效制备光学活性胺(R)异构体的方法，该方法使用微生物的还原能力、通过立体选择地还原亚胺来进行。本发明还提供了催化该反应的亚胺还原酶。另外，通过分离编码上述亚胺还原酶的DNA，本发明提供了高水平表达该酶的重组细菌。使用微生物或酶的高立体选择性的本发明方法在工业上是有利的，这是因为作为底物来合成光学活性胺的亚胺衍生物能够以较低的成本合成。本发明对于制备(R)-2-甲基吡咯烷特别有用。(R)-2-甲基吡咯烷是在药物合成中用作中间体的有用化合物。通过使用微生物或酶的活性，本发明能够简单、有效地制备所述化合物。

附图说明

图1是示出分子系统树的图，该分子系统树基于链霉菌GF3587的16SrDNA(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列构建。

图2是示出分子系统树的图，该分子系统树基于链霉菌GF3501的16SrDNA(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列构建。

图3是示出分子系统树的图，该分子系统树基于链霉菌GF3585的16SrDNA(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列构建。

图4是示出分子系统树的图，该分子系统树基于链霉菌GF4415的16SrDNA(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列构建。

图5是示出链霉菌GF3587还原2-甲基-1-吡咯啉(2-MPN)的结果的图。纵轴表示所产生的(R)-2-甲基吡咯烷(2-MP)的量(mM)，而横轴表示反应时间(小时)。

图6是示出链霉菌GF3587还原2-甲基-1-吡咯啉(2-MPN)的结果的图。纵轴表示所产生的(R)-2-甲基吡咯烷(2-MP)的量(mM)，而横轴表示反应时间(小时)。

图7是示出评价链霉菌GF3587来源的亚胺还原酶的最适温度的结果的图。纵轴表示将50℃的最大活性(12.3U/ml)视为100时的相对活性(％)，而横轴表示酶反应混合物的温度(℃)。

图8是示出评价链霉菌GF3587来源的亚胺还原酶的热稳定性的结果的图。纵轴表示将于20～25℃的最大剩余活性(6.65U/ml)视为100时的相对活性(％)，而横轴表示酶处理温度(℃)。

图9是示出评价链霉菌GF3587来源的亚胺还原酶的最适pH值的结果的图。纵轴表示将pH7.0时的最大活性(6.82U/ml)视为100时的相对活性(％)，而横轴表示酶反应混合物的pH值。

图10是示出评价链霉菌GF3587来源的亚胺还原酶的pH稳定性的结果的图。纵轴表示将pH7.5时的最大剩余活性(3.67U/ml)视为100时的相对活性(％)，而横轴表示酶处理pH值。

图11是示出插入有链霉菌GF3587来源的亚胺还原酶基因的质粒(pSUSRIR1)的构建过程的图。

图12是示出插入有链霉菌GF3587来源的亚胺还原酶基因和芽孢杆菌属来源的葡糖脱氢酶基因的质粒(pSGSRIR1)的构建过程的图。

图13是示出插入有Q1EQE0和芽孢杆菌属来源的葡糖脱氢酶基因的质粒(pSG-SK11)的构建过程的图。

具体实施方式

本发明涉及制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，该方法包括下述步骤：

使式(I)代表的亚胺衍生物与至少一种选自下述的酶活性物质接触：具有立体选择地还原所述化合物能力的微生物的培养物、菌体、和其处理物；以及

回收式(II)代表的光学活性R-异构体胺衍生物。

式(I)：

式(II)：

(其中R1和R2基团各自代表具有1～3个碳原子的烷基；R3基团代表氢或具有1～3个碳原子的烷基；以及R1和R3任选形成环)。

在本发明中，环状亚胺化合物优选为式(I)化合物。在本发明中，环状亚胺化合物包括，例如下式(III)代表的亚胺衍生物。

式(III)：

(其中R基团代表具有1～3个碳原子的烷基；以及n代表1至4的整数)。

作为光学活性胺衍生物，式(IV)代表的化合物可以通过使用上式(III)所代表的化合物作为底物来制备。优选，所述化合物是可以按照本发明制备的光学活性胺衍生物。

式(IV)：

在本发明优选的化合物中，例如，在上式(III)中，R是甲基、乙基或丙基，以及n是2或3。更具体来说，本发明优选的亚胺衍生物包括：

2-甲基-1-吡咯啉；

2-甲基-1-四氢吡啶(piperideine)；

2-乙基-1-吡咯啉；和

2-乙基-1-四氢吡啶。

2-甲基-1-吡咯啉 2-甲基-1-四氢吡啶

2-乙基-1-吡咯啉 2-乙基-1-四氢吡啶

如下所示的光学活性胺衍生物可以使用上述化合物作为底物来制备。

2-甲基-1-吡咯啉 →(R)-2-甲基吡咯烷

2-甲基-1-四氢吡啶→(R)-2-甲基哌啶

2-乙基-1-吡咯啉 →(R)-2-乙基吡咯烷

2-乙基-1-四氢吡啶→(R)-2-乙基哌啶

(R)-2-甲基吡咯烷 (R)-2-甲基哌啶

(R)-2-乙基吡咯烷 (R)-2-乙基哌啶

在本文中，“光学活性胺衍生物”是指胺衍生物，其中，某一类的光学活性异构体比其它光学活性异构体的量更丰富。在本发明中，优选的光学活性胺衍生物具有例如60％光学纯度，通常是70％或更高，优选80％或更高，更加优选90％或更高的光学纯度(对映异构体过量(enantiomeric excess)(ee))。通常，本发明的“光学活性异构体”有时还称为“对映异构体”。

在本文中，立体选择地还原亚胺衍生物的能力是指：使用上式(I)或优选式(III)所代表的亚胺衍生物作为底物来生产式(II)或(IV)所代表的R-异构体胺衍生物的能力。本发明的微生物可以是任何微生物，只要它可以产生R-异构体胺衍生物即可。通过测试微生物是否具有当与亚胺衍生物作用时可生成R-异构体胺衍生物的能力，可以获得这种本发明的微生物。

例如，在含化合物(I)(优选化合物(III))所代表的亚胺衍生物的培养基中培养测试微生物，然后对培养物进行分析，以测定所产生的胺衍生物的光学纯度。结果，如果能够证明形成了光学活性(R)-胺衍生物，则该微生物可以在本发明中使用。

或者，预先让测试微生物在合适的培养基中生长，收集微生物，并悬浮在合适的缓冲液中。然后，使其与化合物(I)(优选化合物(III))所代表的亚胺衍生物接触并反应。测定在反应缓冲液中所产生的胺衍生物的光学纯度。当证明生成光学活性(R)-胺衍生物时，则该微生物可以在本发明中使用。在这种情况下，在培养测试微生物期间，当将化合物(I)(优选化合物(III))加入到培养基中时，可以预期诱导出用于还原该化合物的酶。此外，当在反应期间加入还原能量源时，可以预期产物会更为有效的积累。用于还原的这种能量源通常包括葡萄糖、蔗糖、醇和有机酸。

例如，利用下面的方法，可以评价微生物还原2-甲基-1-吡咯啉的能力。在合适的培养基(如果需要包含2-甲基-1-吡咯啉)中培养微生物。将得到的菌体悬浮在反应混合物中，反应混合物可以含25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、10mM 2-甲基-1-吡咯啉，以及根据需要含葡萄糖。将该悬浮液在25℃振荡24小时，然后通过TLC或HPLC分析产物。

TLC条件包括，例如如下方法：使用硅胶60F254平板，并且使用展开剂1-丁醇/乙酸/水＝2/1/1进行展开，然后使用茚三酮进行显色反应。

例如利用下面的方法，可以测定所产生的胺衍生物的光学纯度。

将下述组份加入到50μl测试样品中并在40℃温育该混合物1小时，以用GITC衍生所产生的胺，然后通过HPLC分离并定量。

50μl的2mg/ml三乙胺和100μl的8mg/ml 2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基异硫氰酸酯(GITC)

例如，可以在下述条件下进行HPLC。

-HPLC柱：Wakosil II 5C18(4.6mm x 150mm)，来自Wako Pure Chemical Industries

-洗脱缓冲液：10mM磷酸盐缓冲液(pH2.5)∶甲醇＝55∶45

-流速：1ml/min

-检测：254nm处的UV吸光度

在上述条件下，在26.3分钟时洗脱出(R)-2-甲基吡咯烷衍生物，而在24.9分钟时洗脱出(S)-2-甲基吡咯烷衍生物。

当然，使用具有高立体选择性的微生物来获得高光学纯度的产物是有利的。具体来说，可以使用能够合成光学纯度例如为60％，通常是70％或更高，优选80％或更高，且更优选90％或更高的光学活性R-异构体胺衍生物的微生物。

能够产生R-异构体胺衍生物的微生物包括，例如，属于链霉菌属并且具有由2-甲基-1-吡咯啉产生(R)-2-甲基吡咯烷的能力的那些微生物。例如，下述微生物可用于产生R-异构体胺衍生物。

链霉菌GF3587；

链霉菌GF3501；

链霉菌GF3585；和

链霉菌GF4415。

这些微生物保藏在下述保藏机构。

(1)保藏机构的名称：独立行政法人制品评价技术基础机构

(2)地址：邮政编码：292-0818日本千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8

(3)识别显示和保藏号：

链霉菌GF3587；

保藏号：NITE P-594(保藏日期：2008年6月24日)

链霉菌GF3585；

保藏号：NITE P-596(保藏日期：2008年6月24日)

链霉菌GF3501；

保藏号：NITE P-595(保藏日期：2008年6月24日)

链霉菌GF4415

保藏号：NITE P-597(保藏日期：2008年6月24日)

此外，基于布达佩斯条约，这些微生物已经转入下述国际保藏机构。

(1)国际保藏机构：独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD)

(2)地址：邮政编码：292-0818日本千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8

(3)识别显示和保藏号：

链霉菌GF3587；

保藏号：NITE BP-594(转交日期：2009年6月29日)

链霉菌GF3585；

保藏号：NITE BP-596(转交日期：2009年6月29日)

链霉菌GF3501；

保藏号：NITE BP-595(转交日期：2009年6月29日)

链霉菌GF4415

保藏号：NITE BP-597(转交日期：2009年6月29日)

在本发明中，具有立体选择地还原上述式(I)或(III)所代表的亚胺衍生物能力的微生物不局限于上述保藏的菌株。这种微生物可以由各种微生物学来源获得。微生物学来源包括从自然环境中分离的那些以及保藏在微生物保藏机构中的那些。例如，下述链霉菌属的微生物是优选的具有立体选择地还原上述式(I)或(III)所代表亚胺衍生物能力的微生物。

灰锈赤链霉菌

细黄链霉菌

白绿链霉菌

因此，例如，上述选择方法可用于从保藏在微生物保藏机构的链霉菌属中选择具有目标活性的微生物。保藏的这种微生物可以从例如下述保藏机构获得。

生物遗传资源中心(NBRC)

理化学研究所(JCM)

NODAI(东京农业大学)菌株保藏中心(IAM)

美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)

德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)(DSM)

或者，可以基于核糖体DNA(rDNA)的核苷酸序列信息来选择本发明的微生物。众所周知，有关rDNA的核苷酸序列信息通常在生物体之间用作表征遗传距离的标志。特别是，编码16S rRNA的DNA(在下文简写为16S rDNA)已经被用作测定微生物之间的遗传同一性或同源性的工具。16S rRNA存在于所有的生物体中。虽然生物体之间的结构不同，但序列特征可以保守到一定程度从而能够实现序列比对。16S rRNA在生物体之间的水平传递的频率较低，因此通常利用16S rRNA来对生物体进行分类。

具体来说，小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)是构成蛋白质合成位点的核糖体的核酸分子。虽然核苷酸序列的长度稍有不同，但认为从细菌到人的核苷酸序列的起源是相同的。因此，在进化过程中，rRNA的核苷酸序列是高度保守的，并且在生物体的系统发生分析中是最常被使用的(Microbiol.Rev.，58，1-9(1994))。原核生物的SSU rRNA具有约1500个核苷酸。基于16S rRNA的核苷酸序列的系统分类学通常用于原核生物的鉴定和分类(ASM News，65，752-757(1999)；Seibutsu Kogaku Jikkensho(Experimental manual of bioengineering)p.113，Ed.The Society of Biotechonogy，Japan，Baifukan)。

现行的放线菌的分类系统是基于16S rDNA的核苷酸序列的同源性形成的(Stackebrandt等人(1997)Int.J.Syst.Bacteriol.，47，479-491)。在主要的细菌系统分类中，基于16S rDNA的核苷酸序列的同一性，不但以属的水平、而且以种的水平来鉴定菌株(“Housenkin no Bunrui to Doutei(Identification and classification of actinomycetes)”(The Society of Actinomycetes Japan)p.19)。

发现本发明人鉴定的菌株的16S rDNA包括SEQ ID NO：1～4的核苷酸序列。可以用这种核苷酸序列信息来检索核苷酸序列信息数据库，以从已经测定16S rDNA的微生物中发现在16S rDNA方面具有高度同源的核苷酸序列的菌株。公共数据库服务提供者，例如，DNA Data Bank of Japan(DDBJ)，提供面向16S rRNA(原核生物)的核苷酸序列信息的数据检索服务。在用这种方法展现的微生物当中，通过特别选择属于链霉菌属的微生物，并且可以在本发明中使用。如果需要的话，可以预先评价用上述方法选择的微生物对亚胺衍生物的活性。

实际上，本发明人用实验方法证明了用上述方法选择的微生物具有目标催化活性。具体来说，证明下述链霉菌属的微生物(它的16S rDNA序列与GF3587菌株具有99.9％的同一性)通过以光学特异性方式还原2-甲基-1-吡咯啉，可以产生高光学纯度的(R)-2-甲基吡咯烷。

灰锈赤链霉菌NBRC 13047

细黄链霉菌NBRC 13062

白绿链霉菌NBRC 13013

这些微生物可以按照发酵学领域已知的方法来培养。培养基可以是合成或天然培养基，只要它包含合适量的碳源、氮源、无机物质及其它营养素即可。培养基可以是液体或固体培养基。

具体来说，考虑所使用的微生物的同化作用，从下述通常使用的碳源中适当地选择一种、两种或多种碳源。

糖：葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖等；

淀粉；

淀粉水解产物；

糖蜜；

醇：甘油，甲醇，乙醇等；

糖醇；

有机酸：乙酸，葡糖酸，丙酮酸，α-酮戊二酸，柠檬酸等；

脂质：棕榈油，大豆油，橄榄油等；和

烃：正链烷(normal paraffin)等。

考虑所使用的微生物的同化作用，从下述通常使用的氮源中适当地选择一种、两种或多种氮源。

有机氮化合物：例如，肉膏，蛋白胨，酵母抽提物，麦芽汁，大豆水解产物，乳酪蛋白，酪蛋白氨基酸，糖蜜，氨基酸例如天冬酰胺、谷酰胺和谷氨酸，玉米浆，NZ胺等。

无机氮化合物：氨，硝酸铵，硫酸铵等。

脲，硝酸盐等。

此外，可以无机盐形式加入少量的镁盐、锰盐、钾盐、钙盐、钠盐、铜盐、锌盐或诸如此类的盐，并且可以加入痕量营养素，例如各种维生素。

另外，如果需要的话，可以将消泡剂例如植物油、表面活性剂和硅加入到培养基中。此外，可以使用诱导物质来提高微生物立体选择地还原亚胺衍生物的能力。根据所使用的微生物，亚胺衍生物可以用作诱导物质。

或者，优选的培养条件可用来诱导目标酶的产生，而不用使用诱导物质。例如，通过使用下述培养基(该培养基被优化用来诱导亚胺还原酶)，本发明人成功地诱导了链霉菌属中的亚胺还原酶。具体来说，本发明提供了制备亚胺还原酶的方法，该方法包括下述步骤：在含有下述组成的培养基中培养链霉菌属微生物，并从培养物中回收亚胺还原酶。

4g NZ胺

20g麦芽汁

8g葡萄糖

5mg FeSO₄·7H₂O

将上述组份溶解在自来水中，达到1L，并将pH值调节至7.3。

例如，通过在含有上述组分的培养基中培养下述微生物，不用加入任何诱导试剂(例如亚胺衍生物)，可以诱导本发明的亚胺还原酶的产生。

灰锈赤链霉菌

细黄链霉菌

白绿链霉菌

这些细菌可以用常规培养方法、利用含有上述组份的液体培养基来进行培养。例如，可以使用下述培养方法。

振荡培养

通风搅拌培养

连续培养

流加培养，补料分批培养

可以根据微生物的类型、培养类型和培养方法来选择合适的培养条件。对条件没有特别限制，只要细菌可以利用该培养基生长、并且能够立体选择地还原亚胺衍生物即可。常规培养条件如下所述。

将培养的起始pH值调节至4～10，优选6～8。

培养温度是15～70℃，优选20～40℃。

对培养期没有特别限制，只要它能够使具有还原亚胺衍生物能力的菌体得到增殖即可。常规的培养期是1～14天，优选1～7天。

本文中，“微生物菌体的处理物”是指在使菌体保持目标酶活性的条件下处理菌体所得到的物质。酶活性的保持是指：与活菌体的酶活性相比较，一般20％，通常30％或更高，优选50％或更高，且更优选70％或更高的酶活性得到保持。通过检验活菌体的活性和由相同量的活菌体制备的处理物的活性，可以在活菌体与其处理物之间对酶活性进行定量地比较。在某些情况下，本发明的处理物的酶活性可以比活菌体的酶活性高。

制备这种处理物的方法包括冷冻干燥、用有机溶剂脱水干燥、菌体的自溶作用、酶活性馏份的提取和超声处理。这种处理方法可以获得例如冷冻干燥的菌体、丙酮干燥的菌体、菌体的自溶产物、菌体的提取物、菌体的破碎产物和菌体的超声处理产物。

可以单独使用或组合使用这些处理方法。例如，在合适的培养基中培养微生物之后，可以将菌体破碎，然后离心，制备无细胞提取物。可以将菌体机械破碎或进行超声处理、高压处理、酶消化、自溶作用或类似的方法。无细胞提取物包括在本发明的菌体的处理物中。

此外，在本发明中，可以通过部分或完全纯化菌体来获得催化反应的酶。更具体来说，本发明涉及亚胺还原酶，其可以从本发明所提供的、具有亚胺还原酶活性的微生物的菌体中纯化。本发明的亚胺还原酶具有下述物理化学性质：

(1)活性：以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-依赖方式还原2-甲基-1-吡咯啉产生(R)-2-甲基吡咯烷；和

(2)辅酶依赖性：使用NADPH作为辅酶。

在优选实施方案中，本发明人发现的亚胺还原酶除了具有上述性质(1)和(2)之外，还具有如下所述的物理化学性质。这种亚胺还原酶可以例如由链霉菌GF3587制备。

(3)分子量：利用凝胶过滤法为65000～70000；利用SDS-PAGE约为32000。

(4)最适pH值：pH6.5(pH6.0～7.5时为最大活性的80％或更大)

(5)最适温度：50℃(40～55℃时为最大活性的80％或更大)

(6)pH稳定性：稳定性在pH6.5～8.5时是80％或更高(在30℃处理30分钟之后的剩余活性)

(7)热稳定性：在高达35℃时，稳定性是80％或更高(在每个温度下处理30分钟之后的剩余活性)

(8)底物特异性：当将还原2-甲基-1-吡咯啉的活性视为100时，下面表示了还原每个化合物的活性水平。

2-甲基-1-吡咯啉：100％

N-亚苄基苯甲胺：30％

N-(E)-N-(1-苯基亚乙基)苯胺：29％

二氢叶酸：7.6％

本发明的亚胺还原酶可以从上述微生物、其无细胞提取物或诸如此类的物质中纯化出来。更具体来说，可以通过使用下述纯化步骤的合适组合，从无细胞提取物中获得基本上纯的亚胺还原酶：

分级，基于溶解性，使用硫酸铵、丙酮或诸如此类的物质；

离子交换色谱；

疏水色谱；

亲和色谱，使用2′，5′-ADP琼脂糖凝胶、蓝色或红色琼脂糖凝胶或诸如此类的物质；和

凝胶过滤。

收集微生物菌体之后，可以将本发明的亚胺还原酶分离为基本上纯的酶，例如，利用下述纯化步骤：

通过超声处理将菌体破碎，然后制备无细胞提取物；

利用硫酸铵分级分离蛋白质馏份；

使用DEAE-葡聚糖纤维素的离子交换色谱；

使用苯基琼脂糖凝胶的疏水色谱；和

利用2′，5′-ADP琼脂糖凝胶亲和色谱分离具有亚胺还原酶活性的馏份。

本文中，“基本上纯”是指除了酶本身之外基本上不包含生物大分子化合物或化学物质。除了酶以外，这种生物大分子化合物包括，例如，蛋白质，糖，脂质和核苷酸，它们来源于菌体和培养基。

本发明的基本上纯的酶的纯度至少为75％或更高，通常是80％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，更加优选95％或更高，或99％或更高。测定酶纯度的方法是已知的。测定蛋白质纯度的已知方法包括，例如，各种色谱法和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

本发明还提供了分离的、具有上述物理化学性质(1)和(2)的亚胺还原酶。本文中，分离的亚胺还原酶是指从其最初存在的自然环境分离的还原酶。因此，从菌体分离的亚胺还原酶包括在本发明的分离的亚胺还原酶的范围内。

在纯化或分离之后，可以将本发明的基本上纯的亚胺还原酶或本发明的分离的亚胺还原酶配制成酶组合物。例如，通过与合适载体一起配制纯化或分离的亚胺还原酶，可以制备包含本发明的亚胺还原酶的酶组合物。这种载体包括非活性的蛋白质，例如白蛋白；糖，例如蔗糖，和糖醇。酶组合物可以是液体或冷冻干燥形式。通过将包含酶和载体的水溶液冷冻干燥而制备的酶组合物是本发明的优选组合物。

可以利用下述方法，定量测定本发明的亚胺还原酶的活性。更具体来说，使还原酶在含有下述组合物的反应溶液(1mL)中、于30℃温育。检测该反应混合物，以测定由于NADPH的降低而造成的吸光度的降低(在340nm处)。

10mM 2-甲基-1-吡咯啉；

100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)；

0.1mM NADPH；和

酶。

定义在上述条件下每分钟能够催化减少1μmol的NADPH的酶的量为1U。

本发明涉及包含SEQ ID NO：6或17的氨基酸序列的蛋白质。本发明还包括包含SEQ ID NO：6或17的氨基酸序列的蛋白质的同系物。本发明的亚胺还原酶的同系物是指蛋白质，该蛋白质包含在SEQ ID NO：6或17的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且其与包含SEQ ID NO：6或17的氨基酸序列的蛋白质是功能等效的。在SEQ ID NO：6或17的氨基酸序列中可以接收的突变是，例如，100个氨基酸残基或更少，通常50个或更少，优选30个或更少，更优选15个或更少，更加优选10个或更少，或5个或更少。

本发明涉及编码亚胺还原酶和其同系物的多核苷酸。本发明的多核苷酸包括天然多核苷酸，例如DNA和RNA，和包含人工核苷酸衍生物的人工分子。本发明的多核苷酸还包括嵌合DNA-RNA分子。编码本发明的亚胺还原酶的多核苷酸包括例如SEQ ID NO：5的核苷酸序列。SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质。在一个优选实施方案中，本发明的亚胺还原酶是包含该氨基酸序列的蛋白质。

编码本发明的亚胺还原酶的多核苷酸的同系物是指：编码包含在SEQ ID NO：6的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且具有上述物理化学性质(1)和(2)的蛋白质的多核苷酸。利用定点突变(Nucleic Acid Res.10，pp.6487(1982)；Methods in Enzymol.100，pp.448(1983)；Molecular Cloning 2nd Edt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991))或其它方法，将取代的、缺失的、插入的和/或添加的突变适当地导入到SEQ ID NO：5的多核苷酸中，由此本领域技术人员可以获得多核苷酸的同系物。

本发明的多核苷酸的同系物还包括能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，并且其编码具有上述物理化学性质(1)和(2)的蛋白质。术语“能够在严格条件下杂交的多核苷酸”是指：使用ECL直接核酸标记和检测系统(ECL direct nucleic acid labeling and detection system)(GE Healthcare)，在说明书所描述的条件下(在42℃，在包含0.5x SSC的原始洗涤缓冲液中洗涤)，与一个或多个DNA探针杂交的多核苷酸，其中该DNA探针具有至少20个，优选至少30个，例如，40、60或100个SEQ ID NO：5的组成的核苷酸的任意序列。

本发明的多核苷酸的同系物包括编码蛋白质的多核苷酸，其中该蛋白质与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少70％的同一性，优选至少80％，更加优选90％或更高。可以按照下述方法来进行蛋白质同一性检索：例如，使用程序(例如BLAST和FASTA)，针对蛋白质氨基酸序列数据库(例如SWISS-PROT、PIR和DAD)；DNA序列数据库(例如DDBJ EMBL和GenBank)；和基于DNA序列预测的氨基酸序列的数据库，通过互连网来进行。

使用BLAST程序、在DAD中进行SEQ ID NO：6的氨基酸序列的同一性检索。结果表明，已知的蛋白质中显示出高同一性的蛋白质分别是由卡那霉素链霉菌和产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)产生的Q1EQE0(51％)和A3KHV9(42％)。本文中，70％或更高的同一性是指例如使用基于Lipman-Pearson方法(Science，227，1435-1441(1985))的程序所计算的数值。

为了证明预测的蛋白质是否具有本发明的亚胺还原酶活性，基于在DDBJ中登记的DNA序列来合成引物，并且利用PCR、从卡那霉素链霉菌和产二素链霉菌的基因组DNA中克隆推定的ORF部分。将每个ORF插入表达载体中，并用得到的载体转化大肠杆菌。培养所获得的每个转化体，以表达蛋白质。结果，Q1EQE0显示出亚胺还原活性。另外，利用亚胺还原反应，通过还原2-甲基-1-吡咯啉，Q1EQE0制备高光学纯度的(R)-2-甲基吡咯烷。具体来说，包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的蛋白质是本发明的亚胺还原酶同系物的优选实施方案。

本发明还涉及包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质。本发明还包括包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质的同系物。

“本发明的亚胺还原酶同系物”是指蛋白质，该蛋白质与包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质是功能等效的，以及该蛋白质包含在SEQ ID NO：6的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列。本文中，短语“与包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质功能等效”是指蛋白质具有上述物理化学性质(1)和(2)。利用定点突变(Nucleic Acid Res.10，pp.6487(1982)；Methods in Enzymol.100，pp.448(1983)；Molecular Cloning 2nd Edt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991))等，将取代的、缺失的、插入的和/或添加的突变适当地导入到SEQ ID NO：5的DNA中，由此本领域技术人员可以获得编码亚胺还原酶的同系物的多核苷酸。SEQ ID NO：6的亚胺还原酶的同系物可以如下获得：将编码亚胺还原酶的同系物的多核苷酸导入到宿主中，并在其中表达。

此外，本发明的亚胺还原酶的同系物是指与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少70％同一性的蛋白质，优选至少80％，更优选90％，更加优选90％或更高。可以按照下述方法来进行蛋白质同一性检索：例如，使用程序(例如BLAST和FASTA)，针对蛋白质氨基酸序列数据库(例如SWISS-PROT、PIR和DAD)；DNA序列数据库(例如DDBJ EMBL和GenBank)；和基于DNA序列预测的氨基酸序列的数据库，通过互连网来进行。

可以利用例如下述方法来分离编码本发明的亚胺还原酶的多核苷酸。

可以进行PCR，以获得本发明的DNA，使用基于SEQ ID NO：5的核苷酸序列设计的PCR引物，以及以来自于生产酶的菌株的染色体DNA或cDNA库作为模板。

另外，本发明的多核苷酸可以如下获得：用限制性内切酶消化染色体DNA(来自于生产酶的菌株)，然后将这些片段插入到噬菌体、质粒等中；用构建的DNA转化大肠杆菌。可以使用上述获得的DNA片段作为探针，利用菌落杂交、噬菌斑杂交或类似的方法来筛选上述所得到的库或cDNA库。

或者，本发明的多核苷酸可以如下获得：分析通过PCR得到的DNA片段的核苷酸序列，然后基于所获得的序列设计用于序列延长的PCR引物。接下来，用合适的限制性内切酶消化酶生产菌株的染色体DNA，然后进行自环化(self-circle)，作为反向PCR的模板(Genetics 120，621-623(1988))，或者利用RACE(Rapid Amplification of cDNA End；“Experimental manual for PCR”p.25-33，HBJ Press)等。

除了利用上述方法克隆的基因组DNA和cDNA之外，本发明的多核苷酸还包括合成的DNA。

本发明还提供了亚胺还原酶的表达载体，其是通过将编码利用上述方法分离的本发明亚胺还原酶的多核苷酸插入到常规表达载体中而构建的。

通过培养用所述表达载体转化的重组体，本发明的亚胺还原酶可以由重组体获得。

对于待进行转化用来表达本发明的亚胺还原酶的微生物的类型没有限制，只要它能够用包含编码具有亚胺还原酶的多肽的多核苷酸的重组载体转化、并且能够表达亚胺还原酶活性即可。合适的微生物包括下述微生物：

宿主-载体系统可利用的细菌，例如，属于下述的那些：

埃希氏杆菌属(Escherichia)，

芽孢杆菌属，

假单胞菌属(Pseudomonas)，

沙雷氏菌属(Serratia)，

短杆菌属(Brevibacterium)，

棒状杆菌属(Corynebacterium)，

链球菌属(Streptococcus)，和

乳酸杆菌属(Lactobacillus)；

宿主-载体系统可利用的放线菌，例如，属于下述的那些：

红球菌属(Rhodococcus)，和

链霉菌属(Streptomyces)；

宿主-载体系统可利用的酵母，例如，属于下述的那些：

酵母菌属(Saccharomyces)，

克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，

裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，

接合酵母属(Zygosaccharomyces)，

耶氏酵母属(Yarrowia)，

毛孢子菌属(Trichosporon)，

红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，

毕赤氏酵母属(Pichia)，和

假丝酵母属(Candida)；和

宿主-载体系统可利用的霉菌，例如，属于下述的那些：

脉孢菌属(Neurospora)，

曲霉属(Aspergillus)，

头孢霉菌属(Cephalosporium)，和

木霉属(Trichoderma)。

转化体的制备和对每个宿主相容的重组载体的构建可以使用分子生物学、生物工程学和遗传工程学的传统方法来实现(例如，Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratories)。为了在微生物中表达本发明的用NADPH作为电子供体的亚胺还原酶，DNA应该首先被插入到在微生物中稳定的质粒或噬菌体载体中，并且允许遗传信息的转录和翻译。

为了实现这个目的，在本发明的DNA链的5′-端(上游)插入启动子(其是转录和翻译的调节单元)，且更优选在DNA的3′-端(下游)还插入终止子。这种启动子和终止子在宿主微生物中应该是功能性的。可以在多种微生物中使用的这样的载体、启动子、终止子等(在“Fundamental Microbiology(Biseibutsugaku Kiso-kouza)8：Genetic Engineering，KYORITSU SHUPPAN CO.，LTD.”)中有详细描述，尤其是和酵母一起使用的那些在Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)；Yeast 8，423-488(1992)等中有详细描述。

例如，对于属于埃希氏杆菌属的细菌菌种来说，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)，pBR和pUC质粒作为质粒载体是合适的，并且合适的启动子包括那些lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac和trp的融合物)和λ噬菌体PL与PR来源的启动子。合适的终止子包括trpA、噬菌体和rmB核糖体RNA来源的终止子。合适的载体包括pSE420D(描述在JP-A(Kokai)2000-189170中)，其具有商购pSE420(Invitrogen)的多克隆位点来源的经修饰的克隆位点。

对于属于芽孢杆菌属的细菌菌种来说，合适的载体包括pUB110质粒和pC194质粒。可以将质粒整合到染色体中。启动子和终止子可以从包括apr(碱性蛋白酶)，npr(中性蛋白酶)，amy(α-淀粉酶)的基因中获得。

之前已经形成了针对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)及假单胞菌属来源的其它菌种的宿主-载体系统。宿主范围宽的载体(包含自主复制所需要的基因，来源于RSF1010等)，例如pKT240是合适的；这些载体由质粒TOL(其与甲苯和含甲苯的化合物的降解有关)构建。脂肪酶基因(JP-A(Kokai)H05-284973)可以提供启动子和终止子。

对于属于短杆菌属的细菌菌种来说，特别是乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，合适的质粒载体包括pAJ43(Gene 39，281(1985))。这种菌种可以使用适合用于大肠杆菌的启动子和终止子，不用进行修饰。

对于属于棒状杆菌属的细菌菌种来说，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，质粒载体例如pCS11(JP-A(Kokai)S57-183799)和pCB101(Mo1.Gen.Genet.196，175(1984))是合适的。

对于属于链球菌属的细菌菌种来说，质粒载体例如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26，239(1985))和pGK1(Appl.Environ.Microbiol.50，94(1985))是合适的。

对于属于乳酸杆菌属的细菌菌种来说，质粒载体pAM β1(J.Bacteriol.137，614(1979))是合适的；该质粒载体是针对属于链球菌属的细菌菌种而构建的，还可以使用适合于大肠杆菌的启动子。

对于属于红球菌属的细菌菌种来说，从紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)(J.Gen.Microbiol.138，1003(1992))中分离的质粒载体是合适的。

对于属于链霉菌属的细菌菌种来说，可以利用Hopwood等人的方法构建的质粒，该方法描述在Genetic Manipulation of Streptomyces：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories(1985)中。特别是对于浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)来说，合适的质粒载体是pIJ486(Mol.Gen.Genet.203，468-478(1986))、pKC1064(Gene 103，97-99(1991))和pUWL-KS(Gene 165，149-150(1995))。此外，相同的质粒可以用于弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)(Actinomycetol.11，46-53(1997))。

对于属于酵母菌属的真菌菌种，特别是对于酿酒酵母(Saccharomyces cerevistae)，YRp质粒，YEp质粒，YCp质粒和YIp质粒是可以使用的。使用与染色体上的多拷贝核糖体DNA进行同源重组的整合载体(例如，EP537456)是非常有利的，这是由于可以使用载体将目标基因多拷贝地导入，并且整合的基因在宿主中是稳定的。合适的启动子和终止子来源于乙醇脱氢酶(ADH)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，酸性磷酸酶(PHO)，β-半乳糖苷酶(GAL)，磷酸甘油酸激酶(PGK)，烯醇化酶(ENO)等。

对于属于克鲁维酵母属的真菌菌种来说，特别是对于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，合适的质粒载体包括酿酒酵母来源的2μm质粒和pKD1质粒(J.Bacteriol.145，382-390(1981))；pGK11来源的质粒涉及放毒者活性(killer activity)；与属于克鲁维酵母属的真菌菌种的自主复制有关的基因来源的KARS质粒；以及能够与核糖体DNA进行同源重组而整合到染色体中的载体质粒(例如，EP 537456)。ADH、PGK及其它基因来源的启动子和终止子也是合适的。

对于属于裂殖酵母属的真菌菌种来说，合适的质粒载体是：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)来源的ARS(涉及自主复制的基因)和酿酒酵母来源的包含补足营养缺陷性的选择标记的质粒载体(Mol.Cell.Biol.6，80(1986))。另外，ADH启动子和其它粟酒裂殖酵母来源的启动子是合适的(EMBO J.6，729(1987))。特别是，可以容易地使用商购的pAUR224(Takara Bio Inc.)。

对于属于接合酵母属的真菌菌种来说，来源于鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)来源的质粒pSB3的质粒载体(Nucleic Acids Res.13，4267(1985))等是合适的，并且合适的启动子包括酿酒酵母来源的PHO5启动子和鲁氏酵母来源的GAP-Zr(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子(Agri.Biol.Chem.54，2521(1990))。

之前开发了针对属于毕赤氏酵母属的安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)(先前名称：汉逊酵母(Hansenula polymorpha))的宿主-载体系统。涉及自主复制的安格斯毕赤酵母来源的基因(HARS1和HARS2)可以用作载体。然而，这些基因相对不稳定，因此，更优选使用多拷贝整合到染色体中(Yeast 7，431-443(1991))。对于这种真菌菌种来说，可以使用能够用甲醇等诱导的AOX(醇氧化酶)启动子或FDH(甲酸脱氢酶)启动子。另外，对于巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)等来说，已经开发了使用毕赤氏酵母来源的、涉及自主复制的基因(PARS1和PARS2)的宿主-载体系统等(Mol.Cell.Biol.5，3376(1985))。由此，可以使用高效率启动子，例如AOX，其可用高密度培养物和甲醇诱导(Nucleic Acids Res.15，3859(1987))。

已经开发了针对麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、白色假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、产朊假丝酵母(Candida utilis)及其它属于假丝酵母属的菌种的宿主-载体系统。之前已经克隆了麦芽糖假丝酵母来源的ARS(Agri.Biol.Chem.51，51，1587(1987))，并由此针对麦芽糖假丝酵母开发了使用这种ARS的载体。另外，已经开发了针对产朊假丝酵母的带有高效率启动子的染色体整合载体(JP-A(Kokai)H08-173170)。

已经广泛地研究了属于曲霉属的真菌菌种黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。质粒、染色体整合载体和胞外蛋白酶和淀粉酶来源的启动子对真菌菌种来说也是合适的(Trends in Biotechnology 7，283-287(1989))。

已经开发了针对属于木霉属的里氏木霉(Trichoderma reesei)的宿主-载体系统，并且胞外纤维素酶基因来源的启动子等是合适的(Biotechnology 7，596-603(1989))。

此外，除了微生物之外，已经开发了多种针对植物和动物物种的宿主-载体系统。已经开发了在昆虫(特别是蚕)(Nature 315，592-594(1985))和植物(例如菜籽，玉米和马铃薯)中用于表达外源蛋白质的大规模系统，并且适合于使用。

能够产生本发明的亚胺还原酶的微生物包括所有能够产生亚胺还原酶属于链霉菌属的菌株、及其突变体(mutant)和变体(variant)，以及通过遗传工程学技术能够获得生产本发明的酶的能力的经转化的菌株。

制备本发明的光学活性胺衍生物的方法包括下述步骤：使式(I)或(III)代表的底物化合物与具有亚胺还原酶活性的酶活性物质接触，亚胺还原酶活性是在通过该酶活性物质能够还原底物化合物的条件下，能够立体选择地还原底物化合物的活性。本文中，“酶活性物质”是指来源于具有立体选择地还原式(I)或(III)所代表的底物化合物的能力的微生物的物质，并且可以保持该能力的物质。具体来说，例如，只要保持亚胺还原酶活性，下述的组份就包括在本发明的酶活性物质中。

(i)能够立体选择地还原式(I)或(III)代表的底物化合物的微生物；和

(ii)(i)中所描述微生物菌体的处理物。

本发明的微生物可以是培养物或菌体。培养物涉及微生物与支持微生物的存活和生长的培养基一起存在的一种状态。例如，包含微生物的液体培养基是培养物。同时，本文使用的“菌体”是涉及微生物本身的术语。菌体是从培养物中回收的微生物的细胞。例如，可以通过离心从液体培养基中回收微生物的微生物的菌体。可以通过洗涤从培养物中回收的菌体，从菌体的表面除去培养基组份。

此外，在一个实施方案中，本发明的酶活性物质也包括可以从上述(i)的微生物中分离的亚胺还原酶。固定到载体上的亚胺还原酶也包括在酶活性物质中，只要它们保持亚胺还原酶活性即可。

不用任何修饰，或进行固定之后，本发明的酶活性物质可以与底物化合物接触。有多种已知的固定微生物菌体或其处理物的方法。这种已知的固定微生物菌体或其处理物的方法包括，例如：

聚丙烯酰胺方法；

含硫的多糖方法(κ-卡拉胶法等)；

海藻酸凝胶法；

琼脂凝胶方法；和

离子交换树脂方法。

或者，可以在使用超滤膜等的膜生物反应器中使微生物、其处理物或酶与底物化合物接触而进行反应。

可以通过下述步骤来利用本发明微生物对亚胺进行立体选择地来还原。在适于诱导酶的上述培养条件下培养微生物；将亚胺衍生物作为反应底物加入到制备的培养物液体、从培养物液体中回收的菌体、其处理物或酶中；并温育该混合物。或者，在上述微生物培养开始时，或在培养过程中，加入充当反应底物的亚胺衍生物。由此，在培养期间，发生立体选择性的亚胺还原。

这种反应条件包括，例如，如下所示的那些反应条件：

pH值：4.0～9.0，优选6.0～8.0；

温度：15～50℃，优选20～40℃；和

反应时间：接触4小时～7天。

通常，可以通过单独进行微生物的培养和反应，使反应系统的培养基中的杂质污染最小化。这在反应之后纯化产物时，可以是有利的。

此外，在存在糖、有机酸、氨基酸或醇作为还原能源的条件下进行反应，可以预期更有效的酶催化还原反应。可以按照作为反应底物的亚胺衍生物的量，加入作为还原能源而添加的化合物。更具体来说，下述物质可以用作还原能源。

糖：葡萄糖，葡糖-6-磷酸，蔗糖等。

有机酸：苹果酸，柠檬酸，甲酸等。

氨基酸：丙氨酸，谷氨酸，赖氨酸等。

醇：乙醇，异丙醇等。

另外，在某些情况下，无机化合物(例如亚磷酸)可以用作还原能源。

本发明的还原反应在氢供体的存在下进行。相应地，在本发明中，能够还原底物化合物的条件是在氢供体的存在下、通过温育酶活性物质与底物化合物而实现的。可以使用任何氢供体，只要它支持本发明的还原反应即可。本发明优选的氢供体包括NADPH和NADH。NADPH优选与本发明人成功分离的链霉菌GF3587来源的亚胺还原酶、其同系物或其酶活性物质组合使用。

使用微生物的NADP⁺还原能力(糖酵解系统，甲基营养菌C1化合物的同化途径等)，可以实现由NADP⁺(其是由伴随上述还原反应的NADPH产生的)再生为NADPH。通过向反应系统中加入葡萄糖、乙醇等可以提高NADP⁺还原能力。或者，通过向反应系统中加入能够由NADP⁺产生NADPH的微生物、其处理物或其酶，可以实现这种再生。例如，可以使用含有葡糖脱氢酶、乙醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等的微生物、其处理物或其纯化或部分纯化的酶，使NADPH再生。可以将构成NADPH再生所需要反应的这些组份加入到制备本发明的光学活性胺的反应系统中，固定之后加入，或通过NADPH-可交换的膜进行接触。

或者，在某些情况下，当在制备光学活性胺的上述方法中使用携带本发明DNA的重组载体转化的微生物的活菌体时，可以不需要用于NADPH再生的额外反应系统。更具体来说，通过使用具有强NADPH再生活性的转化微生物，不用加入NADPH再生酶，就可以实现有效的还原。此外，通过共表达下述NADPH再生酶和亚胺还原酶，可以实现更有效的亚胺还原反应。可以将编码本发明亚胺还原酶的DNA与适合NADPH再生的基因(例如，编码葡糖脱氢酶、乙醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶或有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)的基因)一起导入到宿主中。当将两种或多种这样的基因导入到宿主中时，为了避免不相容性，将各个基因独立地插入到不同的重组载体中，这些重组载体的复制起点彼此不同，并且用这些载体转化宿主。或者，将两种基因插入到单一载体中，以及将两种或一种基因整合到染色体中。

当将多基因插入到单一载体中时，表达的调节区，例如启动子和终止子，可以与每个基因连接。或者，基因可以包含多个顺反子的操纵子，例如乳糖操纵子的形式表达。

例如，来源于属于枯草芽孢杆菌或嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)的菌种的葡糖脱氢酶可以用作NADPH再生酶。具体来说，优选的重组载体包括pSGSRIR1，其包含编码亚胺还原酶和葡糖脱氢酶(来源于枯草芽孢杆菌)的基因作为插入片段。

当与胺衍生物的降解有关的反应溶液的pH值有变化时，通过使用合适的酸或碱将pH值调节在某一范围之内可以继续该反应并且保持良好的反应性。

当在本发明中使用活菌体时，在某些情况下，通过向反应混合物中加入表面活性剂，可以缩短反应周期。对用于这种目的的表面活性剂没有特别限制，只要它们提高活菌体的细胞壁的渗透性即可。这样的表面活性剂包括十六烷基溴化吡啶

十六烷基三甲基溴化铵，Triton X-100，对异辛基苯基醚，Tween80和Span 60。在反应混合物中，优选使用约0.0001～1％的表面活性剂。

或者，在某些情况下，通过向反应溶液中加入有机溶剂，可以得到相同的效果。对用于这种目的的表面活性剂没有特别限制，只要它们提高活菌体的细胞壁的渗透性即可。这种有机溶剂包括甲苯和二甲苯。在反应溶液中，优选使用约0.0001～1％的有机溶剂。

或者，为了提高细胞壁的渗透性，可以在菌体收集之后，使用包含表面活性剂或有机溶剂的水或缓冲液预先处理的菌体，来代替向反应溶液中加入表面活性剂或有机溶剂。

用作本发明反应底物的亚胺衍生物可以使用的浓度应该足以有效制备目标产物。在某些情况下，亚胺衍生物对菌体或催化反应的酶是有毒性的。由此，值得注意的是，利用高浓度亚胺衍生物的反应可能不必然导致有效的制备。在反应混合物中，亚胺衍生物的浓度在例如0.05～50％w/v的范围，优选0.1～10％w/v。可以利用任何方法加入亚胺衍生物，例如，分批法，补料-分批法和补料法。或者，加入酮和胺(它们是亚胺的原料)来代替加入底物亚胺，从而在反应溶液中产生亚胺。产生的亚胺可以充当底物。

可以通过在不活性气体氛围中处理加入的亚胺衍生物来防止染色，从而改善产物质量。对于这种预期的效果，还可以在不活性气体氛围中将原料加入到反应混合物中。此外，通过在不活性气体氛围中进行酶反应，可以防止染色。本文使用的这种不活性气体包括，例如，氮气、氩气和氦气。特别是，氮气是便于获得的不活性气体。或者，氩气不容易扩散出来，这是因为它的比重高于空气的比重。由此，氩气在操作上是有利的，这是由于甚至在开放式操作中都可以保持不活性气体氛围。

本发明包括回收光学活性胺衍生物的步骤，这种光学活性胺衍生物是通过底物化合物与酶活性物质接触所获得的。具体来说，利用各种色谱、结晶等的组合使用，可以从反应溶液中分离通过亚胺衍生物的立体选择地还原所获得的光学活性胺衍生物。可以使用下述溶剂提取反应溶液中积累的光学活性胺衍生物，例如：

乙酸乙酯；

乙酸丁酯；

甲苯；

二甲苯；

己烷；

庚烷；

甲基异丁基酮；

甲基叔丁基醚；和

有机溶剂，例如卤素系溶剂。

可以利用下述的色谱对经提取的胺衍生物进行进一步纯化。在纯化之前例如，可以用酸或碱洗涤，以及用脱水剂脱水来进行处理，如果需要的话，可以组合使用。

离子交换色谱

吸附色谱

例如，通过离心或膜过滤法从反应混合物中除去不能溶解的物质(例如菌体)，然后在碱性条件下，使用有机溶剂(例如乙酸乙酯)进行提取。通过减压浓缩提取物，可以回收光学活性胺衍生物。

或者，从溶液中除去不可溶的物质，例如菌体，并将该溶液吸附到可以吸附胺衍生物的离子交换树脂等上。通过用碱(例如氨水，氢氧化钠水溶液，氢氧化钠的甲醇溶液或氢氧化钠的乙醇溶液)洗脱胺衍生物，可以容易地获得高浓度溶液。

或者，在溶剂提取之后，通过用盐酸对提取物进行处理，将其转变为盐酸盐，以便回收晶体形式的光学活性胺衍生物。为了提高产率，可以减压浓缩溶剂，或用适于结晶的溶剂替换。

或者，在某些情况下，以与酸形成的结晶盐形式制备光学活性胺衍生物，可以提高其光学纯度。纯化盐的这种酸包括无机酸，例如盐酸和硫酸，和有机酸，例如扁桃酸，柠檬酸和酒石酸。将利用上述方法获得的胺衍生物的盐溶解在强酸或强碱中，然后用合适碱或酸中和，以获得中和结晶。这种方法可以容易地使胺衍生物与其它杂质分离。例如，无机酸(例如盐酸和硫酸)可以用作溶解胺衍生物盐的强酸溶液。同时，NaOH水溶液和氨水可以用作强碱溶液。

另外，通过加热水溶液，然后冷却重结晶，可以容易地将胺衍生物与其它杂质分离。在将所获得的晶体溶解之后，通过使用合适的展开剂、进行硅胶色谱，可以将胺衍生物进一步纯化至高纯度。用于硅胶色谱的这种展开剂包括，例如，丁醇，乙酸，其与水的混合溶剂。

将在本文中引用的所有现有技术文献并入本文作为参考。

实施例

在下文中，参考实施例对本发明进行具体地描述，但不能将实施例理解为限制性的。在表中，菌株名称中的“GF”表示该菌株由国立大学法人岐阜大学保藏。

[实施例1]筛选

制备包含4g/l酵母抽提物，10g/l麦芽汁，4g/l葡萄糖，5mg/l硫酸铁七水合物和1g/l 2-甲基-1-吡咯啉的液体培养基(pH值调节至7.3)，并等分(4ml)到18mm直径的试管中。在高压灭菌器中，将上述试管在121℃加热15分钟，进行灭菌。用铂接种环(platinum loop)将各种微生物各自接种到试管中。将试管在28℃振荡培养2～6天。

将得到的培养物离心，回收微生物菌体。将含10mM 2-甲基-1-吡咯啉的25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)加入到菌体中。使菌体在25℃振荡反应24小时。反应之后，离心除去菌体。然后，使用硅胶(展开剂：1-丁醇/乙酸/水＝2/1/1)进行TLC分析，然后使用茚三酮喷雾剂进行检测。用GITC对表1所示成功地产生2-甲基-1-吡咯啉的四个微生物的反应混合物进行衍生，并用液相色谱测定2-甲基-1-吡咯啉的光学纯度。分析结果示于表1中。结果证明产生了(R)-2-甲基吡咯烷。

[表1]

[实施例2]GF3587的鉴定

表2总结了GF3587的微生物学特征。

[表2]

SIID5767-02

+：阳性，-：阴性

然后，用16S rDNA分析来鉴定GF3587。使用MicroSeq全基因16S rDNAPCR/测序试剂盒(ABI)，测定16S rDNA的核苷酸序列。按照试剂盒的说明书所描述的方法进行分析。测定的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1中。针对APOLLON DB(产品名称，TechnoSuruga Laboratory)，用BLAST检索SEQ ID NO：1的核苷酸序列。结果表明，序列显示出与下述菌株的16S rDNA序列具有99.9％的同一性：

Streptomyces luridiseabiei S63；

灰锈赤链霉菌(S.griseorubiginosus)NBRC 13047；

白绿链霉菌(S.alboviridis)NBRC 13013；

暗黄褐棕链霉菌(S.fulvorobeus)NBRC 15898；和

细黄链霉菌(S.microflavus)NBRC 13062。

基于该结果构建分子系统树，并示于图1中。簇分析(cluster analysis)的结果可认为GF3587属于下述菌种中的任一种。由此，鉴定GF3587细菌属于链霉菌。

灰锈赤链霉菌；

白绿链霉菌；

暗黄褐棕链霉菌；或

细黄链霉菌。

[实施例3]GF3501的鉴定

使用MicroSeq 500 16S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒(ABI)，分析GF3501的16S rDNA的核苷酸序列。按照试剂盒的说明书所描述的方法进行分析。结果示于SEQ ID NO：2中。针对APOLLON DB，用BLAST检索SEQ ID NO：2的核苷酸序列。结果表明，显示出最高同一性(99.4％)的标准菌株是利尻链霉菌(Streptomyces rishiriensis)NBRC 13407。基于同一性检索的结果构建分子系统树，并示于图2中。从上述结果可知，鉴定GF3501属于链霉菌。

[实施例4]GF3585的鉴定

使用MicroSeq 500 16S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒(ABI)，分析GF3585的16S rDNA的核苷酸序列。按照试剂盒的说明书所描述的方法进行分析。结果示于SEQ ID NO：3中。针对APOLLON DB，用BLAST检索SEQ ID NO：3的核苷酸序列。结果表明，显示出最高同一性(99.8％)的标准菌株是下述菌株。

Streptomyces luridiscabiei S63，

细黄链霉菌(S.microflavus)NBRC 13062，

早期链霉菌(S.praecox)NBRC 13073，

赫氏链霉菌(S.halstedii)NBRC 12783，

灰锈赤链霉菌(S.griseorubiginosus)NBRC 13047，

浅灰链霉菌(S.griseolus)NBRC 3415，

环图链霉菌(S.anulatus)NBRC 13369，

白绿链霉菌(S.alboviridis)NBRC 13013，

暗黄褐棕链霉菌(S.fulvorobeus)NBRC 15897，

灰色链霉菌灰色亚种(S.griseus subsp.griseus)NBRC 15744

基于同一性检索的结果构建分子系统树，并示于图3中。从上述结果可知，鉴定GF3585为链霉菌，其近似于卡伍尔链霉菌华盛顿亚种(Streptomyces cavourensis subsp.washintonesis)。

[实施例5]GF4415的鉴定

使用MicroSeq 500 16S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒(ABI)，分析GF4415的16S rDNA的核苷酸序列。按照试剂盒的说明书所描述的方法进行分析。结果示于SEQ ID NO：4中。针对APOLLON DB，用BLAST检索SEQ ID NO：4的核苷酸序列。结果表明，显示出最高同一性的标准菌株是大宫链霉菌(Streptomyces omiyaensis)NBRC 13449。它的同一性是95.6％，低于97％，97％用作不同菌种的指标。基于同一性检索的结果构建分子系统树，并示于图4中。从上述结果可知，鉴定GF4415属于链霉菌。

[实施例6]酶反应

按照实施例1培养链霉菌GF3587的菌体，然后用玻璃珠破碎。离心除去完整的菌体和菌体碎片，制备粗酶溶液。将100μl粗酶溶液加入到含10mM 2-甲基-1-吡咯啉和10mM NADH或NADPH的100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。在30℃温育混合物期间，在340nm处测定吸光度，以监控NAD(P)H的减少。用该试验测定酶活性。结果表明，当将使用NADPH作为辅酶所测定的活性视为100％时，使用NADH测定的活性是7％。该发现表明，亚胺还原酶负责主要使用NADPH作为辅酶的2-甲基-1-吡咯啉的还原。

[实施例7]菌体反应1

将含4g/l NZ胺、10g/l麦芽汁、8g/l葡萄糖和5mg/l硫酸铁七水合物的液体培养基(pH值调节至7.3)等分(40ml)到振荡烧瓶中。在高压灭菌器中，将烧瓶在121℃加热15分钟，进行灭菌。用铂接种环将链霉菌GF3587接种到烧瓶中。将烧瓶在28℃振荡培养24小时。

将得到的培养物离心，回收菌体。将75mM 2-甲基-1-吡咯啉和100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)加入到菌体中。使菌体在25℃振荡反应。反应24小时之后，将2％葡萄糖加入到一个反应混合物中，而另一个反应混合物不用加入葡萄糖并连续地温育。反应结果示于图5中。通过添加葡萄糖明显地改善了2-甲基-1-吡咯啉还原反应的效率。培养72小时之后，产生的(R)-2-甲基吡咯烷的浓度达到54mM。

[实施例8]菌体反应2

培养链霉菌GF3587，并按照实施例7收集微生物菌体。将回收的微生物菌体悬浮在含50mM 2-甲基-1-吡咯啉和4％葡萄糖的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。将该悬浮液在25℃振荡温育。温育24、48和72小时之后，分别加入20mM、20mM和10mM的2-甲基-1-吡咯啉，并观察(R)-2-甲基吡咯烷反应产物的积累。反应结果示于图6中。温育84小时之后，积累的(R)-2-甲基吡咯烷的浓度达到91mM。产生的(R)-2-甲基吡咯烷的光学纯度是95％ee或更高。用下述方法测定光学纯度。

将下述组份加入到50μl反应溶液中，并将得到的混合物在40℃温育1小时。用GITC衍生产生的胺，然后用HPLC分离并定量。

50μl的2mg/ml三乙胺；和

100μl的8mg/ml 2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖基异硫氰酸酯(GITC)。

HPLC的条件如下：

-HPLC柱：Wakosil II 5C18(4.6mm x 150mm)，来自于Wako Pure Chemical Industries

-洗脱缓冲液：10mM磷酸盐缓冲液(pH2.5)/甲醇＝55/45

-流速：1ml/min

-检测：254nm处的UV吸光度

在上述条件下，在26.3分钟时洗脱出(R)-2-甲基吡咯烷，而在24.9分钟时洗脱出(S)-2-甲基吡咯烷。基于254nm的UV吸光度，测定每个洗脱的馏份的光学纯度。

[实施例9]GF3587来源的亚胺还原酶的纯化

按照实施例7所描述方法培养GF3587并收集微生物菌体。将制备的微生物菌体悬浮在含100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)和1mM二硫苏糖醇(DTT)的标准缓冲液中，并超声破碎。

用40～70％硫酸铵分馏菌体的溶胞产物。将制备的酶用缓冲液(含10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)和1mM DTT)透析，然后上样到用相同缓冲液平衡的DEAE-葡聚糖纤维素柱(2.0 x 14cm)上。用氯化钾逐步洗脱该柱。用含100mM氯化钾的100mM磷酸钾缓冲液洗脱亚胺还原酶。

回收并浓缩活性馏份。然后，将浓缩样品上样到用30％硫酸饱和的苯基琼脂糖凝胶柱(1.0 x 14cm)上。用相同的缓冲液洗涤柱之后，逐渐降低硫酸铵的浓度来洗脱酶。亚胺还原酶存在于用不包含硫酸铵的缓冲液洗脱的馏份中。表3对纯化进行了总结。

[表3]

GF3587来源的亚胺还原酶的纯化

接下来，评价由GF3587纯化的亚胺还原酶的物理化学性质。

(1)最适温度：

测试由GF3587纯化的亚胺还原酶的最适温度。在10～70℃，温育含有下述组成的1ml反应溶液，以测定由于形成(R)-2-甲基吡咯烷而伴随的NADPH的吸光度(340nm)的降低。在每个温度下预先温育反应溶液五分钟，然后向其中加入亚胺还原酶溶液(12.3U/ml)，以引发反应。2分钟之后，在340nm测定反应溶液的吸光度。当在30℃、在含有下述组成的反应溶液中温育时，将每分钟催化减少(氧化)1μmol NADPH的亚胺还原酶的量定义为1U。反应结果示于图7中。该结果表明，由GF3587纯化的亚胺还原酶的最适温度是50℃。此外，发现在40～55℃保持最大活性的80％或更大。

反应混合物的组成：

10mM 2-甲基-1-吡咯啉

100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)

0.1mM NADPH

1μl亚胺还原酶溶液

---------------------------------------------------------

总量 1ml

(2)热稳定性：

然后，评价由GF3587纯化的亚胺还原酶的热稳定性。首先，将6.85U/ml亚胺还原酶溶液在0～50℃预先温育30分钟，然后在冰上冷却10分钟。然后，将在每个温度下处理的亚胺还原酶加入到含有与(1)相同的组成的反应溶液中，以引发反应。在30℃温育2分钟之后，检测分析反应混合物，以测定由于形成(R)-2-甲基吡咯烷而伴随的NADPH的吸光度(340nm)的降低。结果示于图8中。该结果表明，直至35℃，由GF3587纯化的亚胺还原酶保持约80％的活性，但在40℃或更高温度下，其快速地失去活性。

(3)最适pH值：

此外，测试由GF3587纯化的亚胺还原酶的最适pH值。除了加入多种类型的缓冲剂之外，通过向含有与(1)所示组成相同组成的反应混合物中加入亚胺还原酶(6.82U/ml)溶液来引发反应。将混合物在30℃温育2分钟。在该实验中使用的缓冲液和它们的pH值如下所示。

100mM柠檬酸盐缓冲液：pH 3～6

100mM乙酸钠缓冲液：pH 4～5.5

100mM磷酸钾缓冲液：pH 6～8

100mM Tris-HCl缓冲液：pH 7.5～9

100mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液：pH 9～11

检验反应溶液，以测定由于形成(R)-2-甲基吡咯烷而伴随的NADPH的吸光度(340nm)的降低。结果示于图9中。结果表明，由GF3587纯化的亚胺还原酶的最适pH值是6.5。此外，在pH6.0～7.5时保持最大活性的80％或更大。

(4)pH稳定性：

接下来，评价pH值对由GF3587纯化的亚胺还原酶的稳定性的影响。将亚胺还原酶(3.67U/ml)溶解与(3)中所描述的相同的缓冲液中。将溶液在30℃预温育30分钟。将在每个pH值下处理的亚胺还原酶加入到含有与(1)相同的组成的反应溶液中，以便起始反应。将混合物在30℃温育2分钟。分析反应混合物，以测定由于形成(R)-2-甲基吡咯烷而伴随的NADPH的吸光度(340nm)的降低。结果示于图10中。该结果表明，在30℃和pH6.5～8.5条件下处理30分钟之后，由GF3587纯化的亚胺还原酶保持活性的80％或更大。

(5)底物特异性：

为了评价由GF3587纯化的亚胺还原酶的底物特异性，对针对表4所列化合物的酶活性进行了比较。

(6)分子量的测定：

利用SDS-PAGE，测定由GF3587纯化的亚胺还原酶亚基的分子量约为32000。或者，当使用Sephacryl^TM S-200的凝胶过滤柱测定时，分子量是65000～70000。

将含有下述组成的1ml反应混合物在30～65℃温育。分析反应混合物，以测定由于形成(R)-2-甲基吡咯烷而伴随的NADPH的吸光度(340nm)的降低。将亚胺还原酶溶液(2.04U/ml)加入到含有表4所示的每个底物化合物的反应溶液中，以引发反应。温育2分钟之后，在340nm测定每个反应溶液的吸光度。

反应混合物的组成：

0.05～25mM底物化合物

100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)

0.1mM NADPH

1μl亚胺还原酶溶液

-----------------------------------------------------------

总量 1ml

结果显示：在表4所示的化合物中，下述化合物被由GF3587所纯化的亚胺还原酶还原。表中所示的相对活性定义为：将对于2-甲基-1-吡咯啉(2-MPN)的酶活性视为100时的相对活性。

2-甲基-1-吡咯啉：100％

N-亚苄基苯甲胺：30％

N-(E)-N-(1-苯基亚乙基)苯胺：29％

二氢叶酸：7.6％

[表4]

[实施例10]GF3587链霉菌相关菌株的酶活性

在含有下述组成的培养基中，在28℃，振荡培养与GF3587的16S rDNA序列具有99.9％序列同一性的链霉菌属的模式菌株48～72小时。以静止菌体(resting cell)形式收集微生物菌体。

培养基组成：

4g/l NZ胺

20g/l麦芽汁

8g/l葡萄糖

5mg/l硫酸铁(II)七水合物

-----------------------------------------

用自来水(pH7.3)填充至1L体积

培养的链霉菌属的模式菌种是下述三株菌株。这些菌株的16S rDNA核苷酸序列均与链霉菌GF3587(实施例4)具有99.8％的序列同一性。

灰锈赤链霉菌NBRC 13047

细黄链霉菌NBRC 13062

白绿链霉菌NBRC 13013

在25℃，在含100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、50mM 2-甲基-1-吡咯啉和2％葡萄糖的4ml反应溶液中，使从8ml培养物中收集的菌体反应48小时。对产生的(R)-2-甲基吡咯烷进行定量。如表5所示，结果表明，与GF3587的16S rDNA序列具有99.9％序列同一性的四个模式菌株当中，三个菌株生成了98％ee或更高光学纯度的(R)-2-甲基吡咯烷(2-MP)。

[表5]

在该实验中使用的微生物的三个菌株都得自于制品评价技术基础机构的生物遗传资源部门(NITE Biological Resource Center(NBRC)，National Institute of Technology and Evaluation)(http://www.nbrc.nite.go.jp)。该机构的联系信息如下：

邮政编码：292-0818日本千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8

独立行政法人制品评价技术基础机构

生物技术本部生物遗传资源部门(NBRC)遗传资源保存科

[实施例11]亚胺还原酶的部分氨基酸序列

使用蛋白质测序仪(Procise 494 HT Protein Sequencer System)，对实施例9所述制备的酶的N端氨基酸序列进行了分析。氨基酸序列示于SEQ ID NO：7中。此外，从SDS-PAGE凝胶上切除包含亚胺还原酶的凝胶片段。洗涤两次之后，使用赖氨酰内肽酶(lysyl endopeptidase)，在35℃进行过夜凝胶内消化。用反相HPLC(Tosho；TSK凝胶ODS-80-Ts，2.0mm x 250mm)分馏消化的肽。使用0.1％三氟乙酸(含有乙腈梯度)洗脱并回收肽。

将所回收肽中的一个的峰命名为lep 38。用蛋白质测序仪(Procise 494 HT Protein Sequencer System)分析肽的氨基酸序列。lep 38的氨基酸序列示于SEQ ID NO：8中。

[实施例12]链霉菌GF3587来源的染色体DNA的纯化

按照实施例7所述方法培养GF3587并收集菌体。按照J.Dairy Sci.，75，1186-1191(1992)的参考文献中所描述的方法，从菌体中纯化染色体DNA。

[实施例13]亚胺还原酶基因核心区域的克隆

基于N端氨基酸序列和lep 38的氨基酸序列，合成有义和反义引物。核苷酸序列示于SEQ ID NO：9(SsRIR-Nmix)和SEQ ID NO：10(SsRIR-IAmix)中。

使用50μl反应混合物(含每种引物50pmol，10nmol dNTP，50ng链霉菌GF3587来源的染色体DNA，Ex-Taq缓冲液(Takara Bio)，5％DMSO和1U Ex-Taq(Takara Bio))，在GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)中进行PCR，该PCR具有30个循环的变性(94℃，30秒钟)、退火(45℃，30秒钟)和延伸(70℃，1分零5秒钟)。

用琼脂糖凝胶电泳分析部分PCR反应混合物。在约800bp处检测到可能的特异条带。然后，对该DNA片段的核苷酸序列进行测序。测定的核心区域的核苷酸序列示于SEQ ID NO：11中。

[实施例14]围绕亚胺还原酶基因的核心区域的核苷酸序列分析

用限制性内切酶BamHI、ApaI和SacI消化链霉菌GF3587来源的染色体DNA。在16℃，使用T4连接酶，通过进行过夜自身连接使每个片段环化。然后，在GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)中，使用50μl的反应混合物(含每种引物SsRIR-UP(SEQ ID NO：12)和SsRIR-DW(SEQ ID NO：13)100pmol，25ng环化DNA，Ex-Taq缓冲液(Takara Bio)，5％DMSO和1U的Ex-Taq(Takara Bio))进行PCR，该PCR具有30个循环的变性(95℃，30秒钟)、退火(55℃，30秒钟)和延伸(72℃，7分钟)。用琼脂糖凝胶电泳分析每个PCR混合物的一部分。在BamHI、ApaI和SacI消化模板DNA中，分别检测到约6000bp、4000bp和1400bp的DNA片段。分析DNA片段的核苷酸序列，以测定亚胺还原酶基因的ORF序列。测定的DNA序列示于SEQ ID NO：5中，推测的氨基酸序列示于SEQ ID NO：6中。

[实施例15]亚胺还原酶基因的克隆

基于亚胺还原酶的结构基因，合成引物SsRIR-ATG1(SEQ ID NO：14)和SsRIR-TAA1(SEQ ID NO：15)，以仅克隆ORF。在GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)中，使用50μl反应混合物(含每个引物50pmol，10nmol dNTP，50ng链霉菌GF3587来源的染色体DNA，Pfu Turbo-DNA聚合酶缓冲液(STRATAGENE)，5％DMSO和1.9U的Pfu Turbo-DNA聚合酶(STRATAGENE))进行PCR，该PCR具有30个循环的变性(98℃，30秒钟)、退火(60℃，1分钟)和延伸(72℃，1分零10秒钟)。

使用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare)，纯化并回收得到的DNA片段。用限制性内切酶NcoI和XbaI对DNA片段进行双重消化。琼脂糖凝胶电泳之后，切除含目标条带的部分，并使用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare)来纯化DNA片段。

使用Takara连接试剂盒，将制备的DNA片段连接至用NcoI和XbaI双重消化的pSE420D(通过修饰质粒载体pSE420(来自于Invitrogen)的多克隆位点而构建的质粒；日本专利申请Kokai出版物No.(JP-A)2000-189170(未审查、已公开的日本专利申请))。用得到的载体转化大肠杆菌JM109菌株。

在含氨苄青霉素的LB培养基上培养转化体。从生长的转化体中提取质粒。将质粒命名为pSUSRIR1，确定其具有亚胺还原酶基因作为插入片段。质粒构建的过程示于图11中。

[实施例16]评价重组体亚胺还原酶的活性

在30℃，在含氨苄青霉素的液体LB培养基中过夜培养已经用亚胺还原酶表达质粒pSUSRIR1转化的大肠杆菌JM109菌株。加入0.1mM IPTG之后，进一步培养菌体4个小时。

离心收集菌体，然后悬浮在含1mM DTT的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在密封型超声波菌体粉碎机UCD-200TM(Cosmo Bio)中破碎菌体。离心之后，回收上清液作为菌体的提取物。同时，在LB培养基中过夜培养不包含上述基因的大肠杆菌JM109。加入0.1mM IPTG之后，进一步培养菌体4个小时。使用相同的方法，将菌体破碎，以制备菌体的提取物。

检测每种菌体的提取物对于2-甲基-1-吡咯啉的亚胺还原活性。结果示于表6中。该检测活性的方法与实施例6所述方法相同。

[表6]

重组体亚胺还原酶活性的检测结果

[实施例17]共表达亚胺还原酶和芽孢杆菌来源的葡糖脱氢酶的质粒pSGSRIR1的构建

用限制性内切酶NcoI和XbaI双重消化质粒pSE-BSG1(JP-A(Kokai)2000-189170)(其表达芽孢杆菌属来源的葡糖脱氢酶基因)。利用相同酶的从pSUSRIR1中切除含亚胺还原酶基因的DNA片段。使用Takara连接试剂盒，将片段连接至经消化的pSE-BSG1，以构成质粒pSGSRIR1，其可用于共表达亚胺还原酶和葡糖脱氢酶。质粒构建的过程示于图12中。

[实施例18]亚胺还原酶和葡糖脱氢酶在大肠杆菌中的共表达

在30℃，在含氨苄青霉素的液体LB培养基中过夜培养已经用pSGSRIR1转化的大肠杆菌JM109菌株。加入0.1mM IPTG之后，进一步培养菌体4个小时。

离心收集菌体，然后悬浮在含1mM DTT的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在密封型超声波细胞粉碎机UCD-200TM(Cosmo Bio)中破碎菌体。将菌体溶胞产物离心，并回收上清液作为菌体的提取物。检测该提取物对于2-甲基-1-吡咯啉的亚胺还原活性和它的葡糖脱氢酶活性。结果示于表6中。在30℃，使用含100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)、2.5mM NADP⁺、100mM葡萄糖和菌体的提取物的反应溶液，检测葡糖脱氢酶活性。将在上述条件下每分钟能够催化形成1μmol NADPH的酶的量定义为1U。

[实施例19]卡那霉素链霉菌来源的染色体DNA的纯化

在链霉菌YEME培养基中培养卡那霉素链霉菌NBRC 13414。按照J.Dairy Sci.，75，1186-1191(1992)的参考文献中所描述的方法，从制备的菌体中纯化染色体DNA。

[实施例20]亚胺还原酶同系物Q1EQE0的克隆

推测的蛋白质Q1EQE0(登录在DDBJ中)的DNA序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：16和17中。基于SEQ ID NO：16合成PCR的引物(SEQ ID NO：18和19)。在GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)中，使用50μl反应混合物(含每个引物50pmol，10nmol dNTP，50ng卡那霉素链霉菌NBRC 13414来源的染色体DNA，Pfu Turbo-DNA聚合酶缓冲液(STRATAGENE)，5％DMSO和1.9U的Pfu Turbo-DNA聚合酶(STRATAGENE))，该PCR具有30个循环的变性(98℃，30秒钟)、退火(60℃，1分钟)和延伸(72℃，1分零10秒钟)。使用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare)，纯化并回收得到的DNA片段。

使用In-fusion系统，将回收的DNA片段连接至经消化的pSE-BSG1(JP-A(Kokai)2000-189170)(用NcoI和XbaI双重消化)，以构建质粒pSG-SKI1，其可用于共表达Q1EQE0和葡糖脱氢酶。质粒构建的过程示于图13中。

[实施例21]Q1EQE0和葡糖脱氢酶在大肠杆菌中的共表达

在30℃，在含氨苄青霉素的液体LB培养基中过夜培养已经用pSG-SKI1转化的大肠杆菌JM109菌株。加入0.1mM IPTG之后，进一步培养菌体4个小时。

离心收集菌体，然后悬浮在含1mM DTT的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在密封型超声波细胞粉碎机UCD-200TM(Cosmo Bio)中破碎菌体。将菌体的溶胞产物离心，并回收上清液作为菌体的提取物。检测该提取物对于2-甲基-1-吡咯啉的亚胺还原活性和它的葡糖脱氢酶活性。结果示于表6中。

[实施例22]利用重组体大肠杆菌制备(R)-2-甲基吡咯烷

在30℃，在含氨苄青霉素的10ml液体LB培养基中过夜培养已经用pSGSRIR1或pSG-SKI1转化的大肠杆菌JM109菌株。加入0.1mM IPTG之后，进一步培养菌体4个小时。

离心收集菌体，然后悬浮在含47.5mM 2-甲基-1-吡咯啉和100mM葡萄糖的10ml 100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。使该悬浮液在25℃振荡反应过夜。反应之后，分析反应混合物，利用与实施例8所述方法相同的方法，测定所产生的2-甲基吡咯烷的光学纯度和2-甲基-1-吡咯啉和2-甲基吡咯烷在反应混合物中的浓度。产生的(R)-2-甲基吡咯烷的光学纯度是99％ee或更高，反应产率是95％或更高。结果示于表7中。

[表7]

重组体大肠杆菌的反应结果

1)2MNP：2-甲基-1-吡咯啉

2)2MP：2-甲基吡咯烷

工业实用性

本发明提供了通过立体选择地还原亚胺来制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法。本发明制备的光学活性R-异构体胺衍生物作为药物或类似物质的原料是有用的。例如，(R)-2-甲基吡咯烷是作为药物原料的有用的化合物。

PCT

只用于受理局

只用于国际局

Claims

1.一种亚胺还原酶，其具有下述物理化学性质(1)～(5)：

(2)辅酶依赖性：使用NADPH作为辅酶；

(3)最适pH值：6.0～7.0；

(4)最适温度：40～55℃；以及

2.权利要求1所述的亚胺还原酶，其来源于属于链霉菌属(Streptomyces)的微生物。

3.权利要求2所述的亚胺还原酶，其中，属于链霉菌属的微生物选自下述中的任意微生物：

链霉菌(Streptomyces sp.)NITE BP-594；

链霉菌(Streptomyces sp.)NITE BP-595；

链霉菌(Streptomyces sp.)NITE BP-596；以及

链霉菌(Streptomyces sp.)NITE BP-597。

4.权利要求2所述的亚胺还原酶，其中，属于链霉菌属的微生物选自下述中的任意微生物：

灰锈赤链霉菌(Streptomyces griseorubiginosus)；

细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)；以及

白绿链霉菌(Streptomyces alboviridis)。

5.权利要求4所述的亚胺还原酶，其中，灰锈赤链霉菌、细黄链霉菌和白绿链霉菌分别是下面的微生物菌株：

灰锈赤链霉菌NBRC 13047；

细黄链霉菌NBRC 13062；以及

白绿链霉菌NBRC 13013。

6.一种亚胺还原酶，其具有权利要求1的物理化学性质(1)和(2)，并且其由下面(a)～(e)中的任意多核苷酸编码：

(a)包括SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列的多核苷酸；

7.一种亚胺还原酶，其包括具有权利要求1的物理化学性质(1)和(2)，且具有产生至少80％ee或更高光学纯度的(R)-2-甲基吡咯烷功能的蛋白质，并且该蛋白质由下面(a)～(e)中的任意多核苷酸编码：

(a)包括SEQ ID NO：16所述的核苷酸序列的多核苷酸；

8.制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，该方法包括下述步骤：

使式(I)代表的亚胺衍生物与至少一种选自下述的酶活性物质接触，所述酶活性物质为：具有立体选择地还原所述化合物能力的微生物的培养物、菌体、和其处理物；以及

回收式(II)代表的光学活性R-异构体胺衍生物；

式(I)：

式(II)：

上述式中，R1和R2基团各自代表具有1～3个碳原子的烷基；R3基团代表氢或具有1～3个碳原子的烷基；以及R1和R3任选一起形成环。

9.权利要求8所述的方法，其中式(I)的化合物是下式(III)代表的亚胺衍生物，以及式(II)的化合物是式(IV)代表的胺衍生物，

式(III)：

式(IV)：

上述式中，R基团代表具有1～3个碳原子的烷基；以及n代表1至4的整数。

10.权利要求9所述的制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，其中，式(III)代表的化合物是2-甲基-1-吡咯啉，以及式(IV)代表的化合物是2-甲基吡咯烷。

11.权利要求8～10中任一项所述的制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，其中，所述微生物属于链霉菌属。

12.权利要求11所述的制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，其中，所述属于链霉菌属的微生物是选自下述中的任意微生物：

链霉菌NITE BP-594；

链霉菌NITE BP-595；

链霉菌NITE BP-596；以及

链霉菌NITE BP-597。

13.权利要求11所述的制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，其中，所述属于链霉菌属的微生物选自下述中的任一种：

灰锈赤链霉菌；

细黄链霉菌；以及

白绿链霉菌。

14.权利要求13所述的制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，其中，所述灰锈赤链霉菌、细黄链霉菌和白绿链霉菌分别是下面的微生物菌株：

灰锈赤链霉菌NBRC 13047；

细黄链霉菌NBRC 13062；以及

白绿链霉菌NBRC 13013。

15.制备光学活性R-异构体胺衍生物的方法，该方法包括下述步骤：

使式(I)代表的亚胺衍生物与至少一种选自下述的酶活性物质接触，所述酶活性物质为：权利要求1～7中任一项所述的亚胺还原酶、产生该亚胺还原酶的微生物、和其处理物；以及

回收式(II)代表的光学活性R-异构体胺衍生物；

式(I)：

式(II)：

16.权利要求15所述的方法，其中式(I)代表的化合物是下式(III)代表的亚胺衍生物，以及式(II)的化合物是式(IV)代表的胺衍生物：

式(III)：

式(IV)：

上式中，R基团代表具有1～3个碳原子的烷基；以及n代表1至4的整数。

17.一种多核苷酸，其编码具有权利要求1的物理化学性质(1)和(2)的亚胺还原酶，且其是下面多核苷酸中的任意多核苷酸：

(a)包括SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列的多核苷酸；

(d)在严格条件下与DNA杂交的多核苷酸，其中该DNA包括SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列；以及

18.一种多核苷酸，其编码亚胺还原酶，该亚胺还原酶具有权利要求1的物理化学性质(1)和(2)和具有产生至少80％ee或更高光学纯度的(R)-2-甲基吡咯烷的功能，并且其是下面多核苷酸中的任意多核苷酸：

(a)包括SEQ ID NO：16所述的核苷酸序列的多核苷酸；

(d)在严格条件下与DNA杂交的多核苷酸，其中该DNA包括SEQ ID NO：16所述的核苷酸序列；以及

19.一种重组载体，其插入有权利要求17或18所述的多核苷酸。

20.权利要求19所述的重组载体，其还插入有编码脱氢酶的多核苷酸，所述脱氢酶能够催化以β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为辅酶的氧化还原反应。

21.权利要求20所述的载体，其中所述脱氢酶是葡糖脱氢酶。

22.权利要求21所述的重组载体，其中所述葡糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

23.一种转化体，其以能表达的方式保持权利要求17或18所述的多核苷酸或权利要求19所述的载体。

24.制备由权利要求17或18所述的多核苷酸所编码的蛋白质的方法，该方法包括培养权利要求23所述的转化体并回收表达产物的步骤。