CN102834524A

CN102834524A - 5-（氨甲基）-2-氯噻唑的制造方法

Info

Publication number: CN102834524A
Application number: CN2011800151167A
Authority: CN
Inventors: 朝子弘之
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2011-03-22
Publication date: 2012-12-19
Also published as: JP2011200182A; WO2011118831A1; TW201137125A

Abstract

本发明提供5-(氨甲基)-2-氯噻唑的制造方法等，其包括使将多核苷酸导入微生物细胞内而得到的转化体的培养物或者其处理物作用于N-氨基甲酰氨基化合物的反应工序，其中，所述多核苷酸具有编码酶的氨基酸序列的碱基序列，所述酶具有将该N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力。

Description

5-(氨甲基)-2-氯噻唑的制造方法

技术领域

本发明涉及5-(氨甲基)-2-氯噻唑的制造方法等。

背景技术

5-(氨甲基)-2-氯噻唑已知为医药品、农药品等的合成中间体(例如，参照US5180833A)。

作为该化合物的制造方法，US5180833A中记载了使氯化剂与异硫氰酸烯丙酯衍生物反应后再与液氨或六亚甲基四胺反应的方法。

N-氨基甲酰氨基化合物可以成为5-(氨甲基)-2-氯噻唑的前体。

发明内容

本发明的目的在于，提供作为合成中间体有用的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的制造方法等。

本发明提供以下方案等等。即

1.一种5-(氨甲基)-2-氯噻唑的制造方法(以下，有时也记作本发明制造方法。)，其包括使将多核苷酸(以下，有时也记作本多核苷酸。)导入微生物细胞内而得到的转化体(以下，有时也记作本转化体。)的培养物或者其处理物作用于式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物(以下，有时也记作化合物(2)。)的反应工序，其中，所述多核苷酸具有编码酶(以下，有时也记作本酶。)的氨基酸序列的碱基序列，所述酶具有将该N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力；

2.根据前项1所述的制造方法，其中，上述酶为具有下述的氨基酸序列的任一项的酶：

a)序列号1所示的氨基酸序列；

b)与由序列号2所示的碱基序列构成的DNA在严格条件下进行杂交的DNA的碱基序列所编码的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列为具有将上述N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力的酶的氨基酸序列；或者

c)序列号1所示的氨基酸序列中缺失、置换或增加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列为具有将上述N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力的酶的氨基酸序列；

3.一种转化体的培养物或者其处理物作为用于将式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的催化剂的用途(以下，有时也记作本发明用途。)，所述转化体是将多核苷酸导入微生物细胞内而得到的转化体，所述多核苷酸为具有编码酶的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸，所述酶具有将该N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力；

4.根据前项3所述的用途，其中，上述酶为具有编码序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列的酶；

5.一种5-(氨甲基)-2-氯噻唑的制造方法，其包括以下工序：

前工序：使具有酶或产生该酶的能力的微生物的培养物或者其处理物作用于式(1)所示的异脲化合物，得到式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物，所述酶具有将该异脲化合物转化为对应的N-氨基甲酰氨基化合物的能力，

式(1)中，R表示直链状或环状的烷基，该烷基可以具有取代基，该烷基的碳原子数为1～6，

以；以及

反应工序：使将多核苷酸导入微生物细胞内而得到的转化体的培养物或者其处理物作用于由前工序得到的N-氨基甲酰氨基化合物，所述多核苷酸具有编码酶的氨基酸序列的碱基序列，所述酶具有将该N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力；以及

6.根据前项5所述的制造方法，其中，上述具有将N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力的酶为具有编码序列号1所示的氨基酸序列的酶。

根据本发明，能够提供5-(氨甲基)-2-氯噻唑的新型制造方法等。

具体实施方式

本说明书所记载的方案并不受所记载的特定的方法论、协议(protocol)及试剂的限定，其是可变的。此外，本说明书中使用的术语仅用于记载特定的实施方式，其并非用于对本发明的范围进行任何限定。

在无特别说明的情况下，本说明书中使用的全部技术术语以及化学术语具有与被熟悉本发明所属技术领域的技术人员所共同理解之义相同的含义。在对本发明加以实施或进行试验的基础上，均可以使用与本说明书所记载的方法相同或同等的方法、以及材料，以下，记载优选的方法、装置及材料。

以下，更详细地说明本发明。

本发明制造方法，包括使将多核苷酸导入微生物细胞内而得到的转化体(即，本转化体)的培养物或者其处理物作用于式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物(即，化合物(2))的反应工序，所述多核苷酸具有编码酶(即，本酶)的氨基酸序列的碱基序列，所述酶具有将该N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力。

本发明制造方法中使用的作为催化剂的本转化体的培养物或者其处理物可以通过使用通常的基因工程学的方法将多核苷酸(即，本多核苷酸)导入微生物细胞内来制备，所述多核苷酸具有编码酶(即，本酶)的氨基酸序列的碱基序列，所述酶具有将化合物(2)转化为5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力。

下面，对有关本转化体的外来基因导入的制备方法进行说明。

作为本酶，例如可列举出具有下述的氨基酸序列的任意之一的酶。

a)序列号1所示的氨基酸序列；

c)序列号1所示的氨基酸序列中缺失、置换或增加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列为具有将上述N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力的酶的氨基酸序列。

本多核苷酸，例如可以为天然的多核苷酸，或者为通过在天然的多核苷酸中导入变异(部位特异性变异导入法、突变处理等)而制作出的多核苷酸。在对天然的多核苷酸进行检索的情况下，可以以具有酶的产生能力的微生物作为对象，所述酶为具有将化合物(2)转化为5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力的酶或者所述酶为具有编码序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列的酶。

在寻求这样的微生物的情况下，具体而言，例如，向试管中加入灭菌后的培养基5ml，向其中接种通过从各菌株保藏机构购买而取得的菌体或者通过从土壤中纯化分离而制备的菌体。将其在30℃需氧条件下进行振荡培养。培养结束后，通过离心分离回收菌体，从而得到活菌体。向所得的活菌体中添加0.2M磷酸钾缓冲溶液(pH值为7)1.5ml，使其悬浮后，添加溶解于二甲基亚砜15μl的N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-脲1.5mg，然后，使所得的混合物在30℃下振荡2～3天。

反应结束后，对反应液进行取样，利用液相色谱法等对反应液中生成的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的量进行分析。

如此地，对具有酶的产生能力的微生物进行挑选，所述酶具有将N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力。

作为本发明制造方法中使用的作为催化剂的酶或具有该酶的产生能力的转化体的培养物或者其处理物，例如可列举出来自从下述的微生物群A中选择的1种以上的微生物的培养物或者其处理物。

<微生物群A>

乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)、密西根棒状杆菌(Corynebacteriummichiganense)、荚膜黄杆菌(Flavobacterium capsulatum)、法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniaspora valbyensis)、泡状枝动菌(Mycoplana bullata)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、华根霉(Rhizopus chinensis)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)、微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)、韩国假单胞菌(Stenotrophomonas koreensis)、Stenotrophomonas nitritireducens、Stenotrophomonas rhizophila、寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)、及嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonasmaltophilia)。

进而，作为本发明制造方法中使用的作为优选的催化剂的酶或具有该酶的产生能力的转化体的培养物或者其处理物，例如可列举出来自从下述的微生物群B中选择的1种以上的微生物的培养物或者其处理物。

<微生物群B>

乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)JCM 2594t、密西根棒状杆菌(Corynebacterium michiganense)ATCC 10202、荚膜黄杆菌(Flavobacterium capsulatum)JCM 7452t、法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniaspora valbyensis)IFO 1758、泡状枝动菌(Mycoplana bullata)IFO 13290t、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Biotype F ATCC17513、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)IFO 3903、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)JCM 5968t、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)IFO 12320、华根霉(Rhizopus chinensis)IFO4768、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)IFO 15164、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)JCM 7514、微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)JCM 13310、韩国假单胞菌(Stenotrophomonas koreensis)JCM13256、Stenotrophomonas nitritireducens JCM13311、Stenotrophomonasrhizophila JCM13333、寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)SC-1(FERM-BP10785)、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)IFO 15149t、及嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)JCM 1975t。

这些菌株可以从天然中分离，例如可以通过从下述的菌株保藏机构购买而容易地取得。

1.IFO(Institute of Fermentation Osaka：财团法人发酵研究所)菌种保藏(culture collection)

现在移交给独立行政法人制品评价技术基础机构生物遗传资源部门(NBRC)。在取得时，只要向NBRC申请购买即可，例如可以访问NBRC的主页(http://www.nbrc.nite.gojp/NBRC2/NBRCDispSearchServlet？lang＝jp)。

2.ATCC(American Type Culture Collection美国模式培养物集存库)

通过住商制药国际株式会社ATCC事业组织即可取得，在购买时，例如可以访问该组织的主页(http://www.summitpharma.cojp/japanese/service/s_ATCC.html)。此外，也可以从ATCC直接购买。

3.IAM菌种保藏(culture collection)

现在，IAM菌种保藏的保存菌株中，细菌、酵母、丝状菌移交给独立行政法人理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(JCM)，且微细藻类移交给独立行政法人国立环境研究所微生物系统保存设施(NIES)。在取得时，只要向这些机构申请购买即可，例如可以访问这些机构的主页的有关菌种保藏的链接(http://wwwjcm.riken.gojp/JCM/aboutJCM_J.shtml或http://mcc.nies.go jp/aboutOnlineOrder.do)。

4.JCM(理化学研究所微生物系统保存设施(Japan Collection ofMicroorganisms，JCM)

现在移交给独立行政法人理化学研究所生物资源中心(RIKEN BRC)微生物材料开发室。在取得时，只要向该机构申请购买即可，例如可以访问该机构的主页的有关菌种保藏的链接(http://wwwjcm.riken.gojp/JCM/aboutJCM_J.shtml)。

本发明制造方法中使用的作为更优选的催化剂的酶或具有该酶的产生能力的转化体的培养物或者其处理物，例如可列举出来自从假单胞菌(Pseudomonas)属及寡养单胞菌(Stenotrophomonas)属所组成的组中选择的1种以上的微生物的材料。另外，作为寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)，进一步优选以保藏号FERM-BP 10785登记于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的菌株。例如可进一步优选列举出来自Rhodococcus R312(短杆菌R 312(CBS 717-73))等属于红球菌属的微生物的材料。作为能够购买Rhodococcus R312的菌株保藏机构，例如可列举出Centraalbureau voor Schimmelcultures。Rhodococcus R312(短杆菌R312(CBS 717-73))现在以“Rhodococcus sp.Zopf 1891AL”这一菌株名进行保存，在取得时，只要向上述机构申请购买即可，例如可以访问该机构的主页(http://www.cbs.knaw.nl/databases/nccb/search_bac_plas.aspx)等。

本多核苷酸具有编码酶的氨基酸序列的碱基序列，所述酶具有将化合物(2)转化为5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力。

本多核苷酸中“与由序列号2所示的碱基序列构成的DNA在严格条件下进行杂交的DNA」是指例如如下的DNA，例如在“克隆和测序”(渡边格监修，杉浦昌弘编集，1989年，农村文化社发行)，“Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nd ed.”(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，“Current Protocols in Molecular Biology”(John Wiley & Sons(1987-1997))等中记载的Southern杂交(Southern hybridization)法中，(1)在高离子浓度[例如可列举出6XSSC(900mM的氯化钠、90mM的柠檬酸钠)。]、使其在65℃下进行杂交，由此与由编码序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA或者由序列号2所示的碱基序列构成的DNA形成DNA-DNA杂交体，并且(2)在低离子浓度下[例如可列举出0.1X SSC(15mM的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠)。]，即使在65℃保温30分钟后该杂交体也可维持的DNA。

具体而言，例如可列举：在由编码序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成DNA中；或者，在由序列号2所示的碱基序列构成的DNA中，由其一部分的碱基被缺失、置换或者增加后的碱基序列构成的DNA；与由编码序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA的序列同源性为80％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的DNA等。上述DNA可以是从自然界中存在的DNA之中克隆得到的DNA，也可以是在该克隆得到的DNA的碱基序列中人为地导入其一部分碱基的缺失、置换或增加而成的DNA，还可以是人为地合成的DNA。

作为在序列号2所示的碱基序列中缺失、置换或增加1个或多个碱基的碱基序列，例如可列举：(i)序列号2所示的碱基序列中缺失1～10个(例如1～5个，优选1～3个，进一步优选1～2个)碱基的碱基序列，(ii)序列号2所示的碱基序列中的1～10个(例如1～5个，优选1～3个，进一步优选1～2个)的碱基被以其他的碱基置换后的碱基序列，(iii)在序列号2所示的碱基序列中增加1～10个(例如1～5个，优选1～3个，进一步优选1～2个)碱基的碱基序列，或者(iv)组合上述(i)至(iii)的碱基序列。

具有在序列号2所示的碱基序列中1个或多个核酸产生缺失、置换或者增加等变异的碱基序列的多核苷酸可以按照“Molecular Cloning，ALaboratory Manual 2nd ed.”(Cold Spring Harbor Press(1989))，“CurrentProtocols in Molecular Biology”(John Wiley & Sons(1987-1997))，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92，Kunkel(1988)Method.Enzymol.85：2763-6等记载的部位特异性变异诱发法等方法来制备。

此外，为了向多核苷酸中导入变异，可以通过利用Kunkel法、Gappedduplex法等公知方法，使用利用了部位特异性突变诱发法的变异导入用试剂盒，例如QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制)、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K，Mutan-Super ExpressKm等：Takara Bio公司)等来进行。

本多核苷酸，例如可以按照以下方式来制备。

依照通常的基因工程学的方法(例如，“新细胞工学实验协议”(东京大学医科学研究所制癌研究部编，秀润社，1993年)记载的方法)从Rhodococcus R312(短杆菌R 312(CBS 717-73))等属于红球菌属的微生物等制备DNA文库，以所制备的DNA文库为模板，且使用适当的引物进行PCR，由此可扩增由编码序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA、由编码在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、置换或增加1个或多个氨基酸的氨基酸序列的碱基序列构成的DNA和/或具有序列号2所示的碱基序列的DNA等，制备本多核苷酸的DNA。

此外，以上述DNA文库为模板，并且使用具有序列号3所示的碱基序列的寡核苷酸和具有序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸作为引物，进行PCR，由此可扩增由序列号2所示的碱基序列构成的DNA，制备本多核苷酸的DNA。

作为该PCR的条件，例如可列举出以下条件，即将混合有4种dNTP各20μM、2种寡核苷酸引物各15pmol、Taqpolymerase 1.3U及作为模板的cDNA文库的反应液加热到97℃(2分钟)后，将97℃(0.25分钟)-50℃(0.5分钟)-72℃(1.5分钟)的循环进行10次，接着将97℃(0.25分钟)-55℃(0.5分钟)-72℃(2.5分钟)的循环进行20次，再在72℃保持7分钟。

在该PCR中使用的引物的5’末端侧可以附加限制酶识别序列等。

具有编码如序列号1所示那样的氨基酸序列的碱基序列的寡核苷酸也可以通过以下的方法(AssemblyPCR法)来合成，即，将与如序列号1所示那样的氨基酸序列对应的正向引物和反向引物以切分成各约40bp的长度的形式进行合成，并将这些引物群连在一起。

使用上述DNA文库作为模板，具有选自编码序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列的部分碱基序列的寡核苷酸等(例如，由编码序列号1所示的氨基酸序列的5’末端侧的约14个碱基左右以上的碱基序列组成的寡核苷酸)和由与DNA文库构建中使用的载体的DNA插入部位附近的碱基序列互补的碱基序列组成的约14个碱基左右以上的寡核苷酸作为引物进行PCR，由此也可扩展具有编码序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列的DNA、或者具有编码序列号1所示的氨基酸序列中缺失、置换或增加1个或多个氨基酸的氨基酸序列的碱基序列的DNA等，制备本多核苷酸的DNA。

将如上述那样扩增的DNA依据“Molecular Cloning：A LaboratoryManual 2nd edition”(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，“CurrentProtocols in Molecular Biology”(1987)，John Wiley & Sons，Inc.ISBNO-471-50338-X等中记载的方法克隆到载体上，可以得到重组载体。作为所使用的载体，具体而言，例如可列举出pUC119(宝酒造公司制)、pTV118N(宝酒造公司制)、pBluescriptII(东洋纺公司制)、pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司制)、pTrc99A(Pharmacia公司制)、pKK223-3(Pharmacia公司制)等。

此外，本多核苷酸的DNA也可以通过以下方式来取得，例如，以由具有从编码序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列中选择的部分碱基序列的约15个碱基左右以上的碱基序列组成的DNA作为探针，使其与插入至来自微生物或噬菌体的载体的DNA文库在后述的条件下进行杂交，并对该探针特异性结合的DNA进行检测。

作为使探针与染色体DNA或DNA文库进行杂交的方法，例如可列举出菌落杂交、噬菌斑杂交，可以根据文库的制作中使用的载体的种类来选择方法。

在使用质粒载体制作所使用的文库的情况下，可以利用菌落杂交。具体而言，通过将文库的DNA导入宿主微生物而取得转化体，将所得的转化体稀释后，将该稀释物散播在琼脂培养基上，培养至出现菌落为止。

在使用噬菌体载体制作所使用的文库的情况下，可以利用噬菌斑杂交。具体而言，使宿主微生物和文库的噬菌体在能够感染的条件下混合，再与软琼脂培养基混合，然后将该混合物散播在琼脂培养基上，培养至出现噬菌斑为止。

接着，在任一杂交的情况下，在进行了上述培养的琼脂培养基上放置膜，使转化体或噬菌体吸附或转印至该膜。对该膜进行碱处理后，进行中和处理，接着进行将DNA固定在该膜上的处理。更具体而言，例如，在噬菌斑杂交的情况下，在上述琼脂培养基上放置硝基纤维素膜或尼龙膜(例如，Hybond-N+(Amersham公司注册商标))，静置约1分钟，使噬菌体粒子吸附、转印到膜上。接着，将该膜在碱溶液(例如1.5M氯化钠，0.5M氢酸化钠)中浸渍约3分钟，使噬菌体粒子溶解而在膜上溶出噬菌体DNA，然后，在中和溶液(例如，1.5M氯化钠，0.5M TRIS盐酸缓冲溶液pH值7.5)中浸渍约5分钟。接着将该膜用洗涤液(例如，0.3M氯化钠，30mM柠檬酸，0.2M TRIS盐酸缓冲液pH值7.5)清洗约5分钟后，例如在约80℃加热约90分钟，从而将噬菌体DNA固定在膜上。

使用这样制备的膜，以上述DNA为探针进行杂交。杂交，例如可以根据J.Sambrook，E.F.Frisch，T.Maniatis著“Molecular Cloning：ALaboratory Manual 2nd edition(1989)”Cold Spring Harbor Laboratory Press等的记载来进行。

探针所使用的DNA可以是被放射性同位元素标记的DNA或被荧光色素标记的DNA。

作为利用放射性同位元素对探针所使用的DNA进行标记的方法，例如可列举出以下方法：利用Random Primer Labeling Kit(宝酒造公司制)等，使PCR反应液中的dCTP替换为(α-32P)dCTP，以探针所使用的DNA为模板，进行PCR。

此外，在用荧光色素对探针所使用的DNA进行标记的情况下，例如可以使用Amersham制的ECL Direct Nucleic Acid Labeling and DetectionSystem等。

杂交，例如可以按以下方式来进行。

以上述方式制作的膜每1cm²为50～200μl的比例的方式，准备含有450～900mM的氯化钠及45～90mM的柠檬酸钠，含有0.1～1.0重量％的浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，含有0～200μl/ml的浓度的改性后的非特异性DNA，根据情况还可以分别含有0～0.2重量％的浓度的白蛋白、聚蔗糖(Ficoll)、聚乙烯吡咯烷酮等的预杂交液(优选为含有900mM的氯化钠、90mM的柠檬酸钠、1.0重量％的SDS及100μl/ml的改性Calf-thymusDNA的预杂交液)，在该预杂交液中浸渍上述膜，在42～65℃保温1～4小时。

接着，例如，将含有450～900mM的氯化钠及45～90mM的柠檬酸钠、含有0.1～1.0重量％的浓度的SDS、含有0～200μg/ml的浓度的改性后的非特异性DNA、根据情况还可以分别含有0～0.2重量％的浓度的白蛋白、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等的杂交溶液(优选为含有900mM的氯化钠、90mM的柠檬酸钠、1.0重量％的SDS及100μg/ml的改性Calf-thymusDNA的杂交溶液)与由上述的方法制备得到的探针(每1cm²膜相当1.0×10⁴～2.0×10⁶cpm的量)混合，对每1cm²膜以50～200μl的比例准备所得的混合溶液，在该杂交溶液中浸渍，在42～65℃保温12～20小时。

该杂交后，取出膜，使用含有15～300mM的氯化钠、1.5～30mM柠檬酸钠及0.1～1.0重量％的SDS等的42～65℃的洗涤液(优选为含有15mM的氯化钠、1.5mM的柠檬酸钠及1.0重量％的SDS的65℃的洗涤液)等进行洗涤。对洗涤后的膜用2×SSC(300mM氯化钠、30mM柠檬酸钠)轻轻地冲洗后，进行干燥。将该膜供于例如放射自显影术等，检测膜上的探针的位置，在原来的琼脂培养基上确定与所用探针进行杂交的DNA的膜上的位置上所对应的克隆，对其钓取菌落，由此分离具有该DNA的克隆。

可以从对这样得到的克隆培养得到的培养菌体来制备本多核苷酸。

为了在宿主细胞中表达本多核苷酸，例如，将能够在宿主细胞内发挥作用的启动子与本多核苷酸以能够发挥作用的形态连接而成的DNA导入宿主细胞中。

在此，“能够发挥作用的形态”是指：在将该DNA导入宿主细胞而使宿主细胞进行转化时，本多核苷酸以能够在启动子的控制下表达的方式，与启动子结合后的状态。作为启动子，可列举出大肠杆菌的乳糖操纵子的lac启动子、大肠杆菌的色氨酸操纵子的trp启动子、或者tac启动子、trc启动子之类的被独自改变和设计的能够在大肠杆菌内发挥作用的合成启动子等。此外，还可列举出来自λ噬菌体的PL启动子及PR启动子、来自枯草菌的葡糖酸合成酶启动子(gnt)、碱蛋白酶启动子(apr)、中性蛋白酶启动子(npr)、α-淀粉酶启动子(amy)等。此外，在红球菌(Rhodococcus)R312等中可以利用控制本多核苷酸的表达的启动子。

一般而言，与可在宿主细胞中发挥作用的启动子以能够发挥作用的形式连接而成的DNA可依据“Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2ndedition”(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，“Current Protocols inMolecular Biology”(1987)，John Wiley & Sons，Inc.ISBNO-471-50338-X等中记载的方法克隆至载体，从而可以得到重组载体。

作为所使用的载体，只要能够保持本多核苷酸且能够进行复制(例如，包括宿主细胞中用于增殖质粒所需的DNA序列、启动子、核糖体结合序列、转录终止剂(转录终结序列)、选择性标记基因。)，则不受特别的限制，可以使用适于各自的宿主的载体。例如，可列举出质粒DNA、细菌噬菌体等。

作为质粒DNA，例如可列举出来自大肠杆菌的质粒(pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119(宝酒造公司制)、pTV118N(宝酒造公司制)、pBluescriptII(东洋纺公司制)、pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司制)、pTrc99A(Pharmacia公司制)、pKK223-3(Pharmacia公司制)等的ColE系质粒等)、来自放线菌的质粒(pIJ486等)、来自酵母的质粒(YEp13、YEp 24、Ycp50等)。作为噬菌体DNA，可列举出λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11等)、反转座子DNA、人工染色体DNA等。

作为载体，在使用含有选择性标记基因(例如，二氢叶酸还原酶基因、卡那霉素耐性基因、氨苄西林耐性基因、新霉素耐性基因、杀稻瘟菌素耐性基因等抗生物质耐性赋予基因等)的载体时，可以以该选择性标记基因的表现型等为指标对导入有该载体的转化体进行选择。此外，作为核糖体结合序列，已知SD序列、Kozak序列，可以将这些序列插入至变异基因的上游。在宿主使用原核生物时可以通过PCR法等附加SD序列，在宿主使用真核细胞时可以通过PCR法等增加Kozak序列。作为SD序列，可列举出来自大肠杆菌的序列、来自红球菌属细菌或枯草菌的序列等，只要是在所期望的宿主内发挥作用的序列，则没有特别的限定。例如，利用DNA合成制作与16S核糖体RNA的3’末端区域互补的序列的4个碱基以上连续的一致性序列(consensue sequence)，将其利用即可。转录终结序列未必是必需的，可以利用ρ因子非依赖存性的序列，例如脂蛋白终止子、trp操纵子终止子等。

为了将本多核苷酸植入这些载体中，可以通过以下方式来进行，即，用适当的限制酶切断含有本多核苷酸的DNA，在需要时附加适当的连接子后，与用适当的限制酶切断后的载体结合。此外，也可以通过以下方式来进行，即，使用含有适当的限制酶标记序列的引物对含有本多核苷酸的DNA进行PCR扩增，用限制酶对扩增产物进行处理后，使其与用适当的限制酶切断后的载体结合。

将与可在宿主细胞中发挥作用的启动子以能够发挥作用的形式连接而成的本多核苷酸或者保有其的重组载体等导入到宿主细胞的方法，只要是对应所使用的宿主细胞而通常使用的导入方法即可，例如可列举出“Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd edition”(1989)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，“Current Protocols in Molecular Biology”(1987)，John Wiley & Sons，Inc.ISBNO-471-50338-X等中记载的氯化钙法、“Methods in Electroporation：Gene Pulser/E.coli Pulser System”Bio-Rad Laboratories，(1993)等中记载的电穿孔法等。

在此，作为“宿主细胞”，例如可列举出大肠杆菌(具体而言，例如K12株、B株、JM109株、XL1-Blue株、C600株、W3110株)、枯草菌、酵母、霉菌、红球菌属细菌等微生物。优选可列举出属于Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属(具体而言，例如Saccharomyces cerevisiae)、Schizosaccharomyces属(具体而言，例如Schizosaccharomyces pombe)、Pichia属(具体而言，例如Pichia pastoris)、Kluyveromyces属、Aspergillus属及Rhodococcus属(具体而言，例如Rhodococcus rhodochrousATCC12674株、Rhodococcus rhodochrous J-1株(FERM BP-1478))的微生物等。

接着，使本转化体的培养物作用于化合物(2)。对反应生成物中的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的量进行分析，从而可以确认所得的DNA编码具有上述能力的酶的氨基酸序列。

此外，也可以通过利用惯用的方法进行序列确定，从而确认DNA的碱基序列。例如，可以利用双脱氧核苷酸链终止法(例如，参照F.Sanger，S.Nicklen，A.R.Coulson著，Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977)74：5463-5467页)等来解析。碱基序列分析用的试样制备，例如可以使用PerkinElmer公司的ABI PRISM Dye Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit等市售的试剂。此外，也可以利用适当的DNA测序仪对碱基序进行解析。

作为如上述那样的表达载体导入到宿主细胞的方法，只要是导入DNA的方法，则没有特别的限定。例如可列举出使用钙离子的方法、电穿孔法等。

作为表达质粒导入大肠杆菌的方法，例如可列举出利用热冲击的方法，此时，可以使用预先制作的感受态细胞。作为表达质粒导入酵母的方法，只要是向酵母中导入DNA的方法，则没有特别的限定，例如可列举出电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法等。

为了对导入有与可在宿主细胞中发挥作用的启动子以能够发挥作用的形式连接而成的本多核苷酸或保有其的重组载体等的转化体进行挑选，例如可以以上述那样的载体所含的选择性标记基因的表现型为指标进行挑选。

该转化体保有本多核苷酸的情况例如可以通过依据“MolecularCloning：A Laboratory Manual 2nd edition”(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press等中记载的通常的方法进行限制酶部位的确认、碱基序列的解析、Southern杂交、Western杂交等来确认。

在将这样制作的表达载体导入宿主细胞时，可以得到高度表达本酶的转化体。通过培养该转化体，能够表达本酶。

下面，对本转化体的培养所涉及的制备方法进行说明。

本转化体只要使用用于培养各种微生物的适当含有碳源、氮源、有机盐、无机盐等的培养基进行培养即可。

作为碳源，例如可列举出葡萄糖、糊精、蔗糖等糖类，甘油等糖醇，富马酸、柠檬酸、丙酮酸等有机酸，动物油，植物油及糖蜜。这些碳源在培养基中的添加量通常为培养液的0.1％(w/v)～30％(w/v)左右。

作为氮源，例如可列举出肉提取物、胨、酵母提取物、麦芽提取物、大豆粉、玉米浆(Corn Steep Liquor)、棉籽粉、干燥酵母、酪蛋白氨基酸等天然有机氮源，氨基酸类、硝酸钠等无机酸的铵盐，氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等无机酸的铵盐，富马酸铵、柠檬酸铵等有机酸的铵盐及脲。在这些当中的有机酸的铵盐、天然有机氮源、氨基酸类等在多数情况下，也可以用作碳源。这些氮源在培养基中的添加量通常为培养液的0.1％(w/v)～30％(w/v)左右。

作为有机盐或无机盐，例如可列举出钾、钠、镁、铁、锰、钴、锌等的氯化物、硫酸盐、醋酸盐、碳酸盐及磷酸盐。具体而言，例如可列举出氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、醋酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钾及磷酸氢二钾。这些有机盐和/或无机盐在培养基中的添加量通常为培养液的0.0001％(w/v)～5％(w/v)左右。

在培养导入有作为启动子的诱导性的启动子和本多核苷以能够发挥作用的形态连接而成的DNA而成的转化体的情况下，可以根据需要在培养基中添加诱导物。例如，在导入由tac启动子，trc启动子及lac启动子等以异乳糖诱导的类型的启动子和本多核苷酸以能够发挥作用的形态连接而成的DNA而成的转化体的情况下，作为用于诱导产生本酶的诱导剂，例如也可以在培养基中添加少量的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)。此外，在培养导入由trp启动子等以吲哚乙酸(IAA)诱导的类型的启动子和本多核苷酸以能够发挥作用的形态连接而成的DNA而成的转化体的情况下，作为用于诱导产生本酶的诱导剂，例如也可以在培养基中添加少量的IAA。

作为培养方法，例如可列举出固体培养、液体培养(试管培养、烧瓶培养、发酵缸(jar fermenter)培养等)。

培养温度及培养液的pH值只要为本转化体生长繁殖的范围，则没有特别的限定，例如可列举：培养温度为约15℃～约45℃，优选为10℃～37℃的范围，培养液的pH值为约4～约8的范围。培养时间可以根据培养条件进行适当选择，通常为约1天～约7天。另外，对属于红球菌属的微生物的优选的培养只要在4℃～36℃优选20℃～30℃进行18小时～96小时即可。

本转化体的培养物可以直接用作本发明制造方法的催化剂。在使用本转化体的培养物的方法的中，作为直接使用本转化体的菌体的方法，例如可列举出(1)直接使用培养液的方法，(2)使用通过对培养液进行离心分离等而回收的菌体(根据需要，用缓冲液或水进行清洗后的湿菌体)的方法等。

作为本发明制造方法的催化剂，也可以使用本转化体的培养物的处理物。作为该处理物，例如可列举：对培养而得到的菌体用有机溶剂(丙酮、乙醇等)进行处理而得到的处理物、进行冷冻干燥处理而得到的处理物或进行碱处理而得到的处理物，或者对菌体进行物理性破碎或借助酶进行破碎而得到的处理物，或者从这些处理物分离和提取得到的粗酶等。进而，上述处理物也包括实施上述处理后利用公知的方法进行固定化处理而得到的处理物。

作为从本转化体的培养物对本酶进行精制的方法，只要应用通常的蛋白的精制中使用的方法即可。例如可列举出如下所述的方法。

首先，通过离心分离等从本转化体的培养物收集菌体，然后，然后利用超声波处理、卧式砂磨机(Dynomill)处理、弗氏压碎器(French press)处理等物理破碎法或者使用表面活性剂或lysozyme等溶菌酶的化学破碎法等对其进行破碎。利用离心分离、滤膜过滤等从所得的破碎液除去杂质，从而制备无细胞提取液，适当使用阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤色谱法、或者金属螯合物色谱法等分离精制方法对其进行分级，从而可以对本酶进行精制。

作为在色谱法中使用的载体，例如可列举出导入了羧甲(CM)基、二乙基氨基乙(DEAE)基、苯基或者丁基的纤维素、糊精或琼脂糖等不溶性高分子载体。也可以使用市售的填充有载体的色谱柱，作为上述市售的填充有载体的色谱柱，例如可列举出Q-Sepharose FF，Phenyl-SepharoseHP(商品名，均为Amersham Pharmacia Biotech公司制)，TSK-gelG3000SW(商品名，东曹公司制)等。

另外，为了挑选含有本酶的级分，例如只要根据本发明的“将式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力”的存在有无或其程度进行挑选即可。

作为具体的形态，例如可列举出本转化体的培养物、该培养物的处理物(例如，无细胞提取液、粗精制蛋白、精制蛋白及它们的固定化物等)。在此，作为培养物的处理物，例如可列举出冷冻干燥微生物、有机溶剂处理微生物、干燥微生物、微生物磨碎物、微生物的自消化物、微生物的超声波处理物、微生物提取物或者微生物的碱处理物。此外，作为得到固定化物的方法，例如可列举出载体结合法(使本酶等吸附于二氧化硅凝胶、陶瓷等无机载体、纤维素、离子交换树脂等的方法)及包埋法(将本酶等限制于聚丙烯酰胺、含硫多糖凝胶(例如卡拉胶)、海藻酸凝胶、琼脂凝胶等高分子的网状结构之中的方法)。

若考虑使用本转化体的工业性生产，则从制造设备的限制等方面出发，与使用未处理状态的微生物的方法相比，有时更优选使用将该微生物灭活后的处理物的方法。作为用于此的死菌化处理方法，例如可列举出物理性杀菌法(加热、干燥、冷冻、光线、超声波、过滤、通电)、使用化学药品的杀菌法(碱、酸、卤素、氧化剂、硫、硼、砷、金属、醇、苯酚、胺、硫醚、醚、醛、酮、氰、抗生物质)。一般而言，在这些杀菌法中优选选择尽可能地不使本酶的上述“将式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力”失活且对反应体系的残留、污染等影响少的处理方法。

以下，进行更具体地说明。

1.培养物的处理物(其1)

为了从本转化体的培养物回收菌体，可以使用离心分离法、膜过滤法。离心分离并不受限定，例如可以在3,000～4,500×g、5～20分钟、4℃的条件下进行。可以根据需要用磷酸钠缓冲液、磷酸缓冲液等对所回收的本转化体进行洗涤，并使其悬浮。由此得到菌体悬浮液。

作为菌体的破碎方法，可以利用超声波处理、弗氏压碎器、利用均化器的高压处理、利用玻璃珠等的磨碎处理、使用lysozyme、纤维素酶、果胶酶等的酶处理、冷冻溶解处理、低渗液处理、利用噬菌体的溶菌诱导处理等。破碎处理根据需要在冰冷却下进行。例如，使用超声波破碎机VP-15S(TAITEC，日本)将菌体悬浮液在输出控制4、DUTY CYCLE 40％、PULS、IMER＝B模式10s的条件下冰冷却下破碎1～5分钟、优选3分钟即可。此外，例如，也可以使用NiroSoavi公司制均化器PANDA2K型将菌体悬浮液在100MPa加压条件进行破碎。

破碎后，可以根据需要从本转化体的破碎物除去菌体的破碎残渣。作为除去残渣的方法，例如可列举出离心分离、过滤等。也可以根据需要使用凝集剂、过滤助剂等来提高残渣除去效率。离心分离并不受限定，例如可以在4,000～25,000×g、3～45分钟、4℃的条件下进行。由此从破碎物除去残渣即可。

2.培养物的处理物(其2)

通过对上述的本转化体的破碎物、无细胞提取液进行加热处理，从而可以使本酶以外的多种蛋白改性。因此，通过对本转化体的破碎物或无细胞提取液进行加热处理，从而可以作为可溶性级分取得本酶液。本酶中含有如上述那样取得的本酶液。

在此，“加热处理”是指用于使来自本转化体的本酶以外的蛋白改性而进行的热失活操作，该加热处理的温度优选为50℃以上且75℃以下，进一步优选为60℃以上且70℃以下。加热处理的时间没有特别的限定，从使本转化体的破碎物、无细胞提取液成为设定温度来看，优选10分钟以上。进一步优选为1小时以上且5小时以下。

例如，将本转化体的破碎物等放入试管中，在设定为规定的温度的水浴中孵育规定的时间，由此可以进行加热处理。此外，也可以在带有温度计的三口烧瓶中加入本转化体的破碎物等，加热至规定的温度，进行规定时间的加热处理。

此外，本发明中，对本转化体的破碎物进行加热处理(前加热)后，除去破碎残渣，之后可以再次进行加热处理。再次加热时，可以存在锌盐。

作为除去由加热处理生成的不溶性物质的方法，例如可列举出离心分离、过滤等，也可以列举出根据需要使用凝集剂、过滤助剂等来提高除去效率的方法。需要时，也可以使用各种色谱法等(凝胶过滤、离子交换色谱法、亲和色谱法等)进行进一步精制。

本发明制造方法通常在水的存在下进行。此时的水可以是缓冲液的形态。作为该缓冲液中使用的缓冲剂，例如可列举出磷酸钠、磷酸钾等磷酸的碱金属盐，醋酸钠、醋酸钾等醋酸的碱金属盐等。

此外，本发明制造方法也可以进一步使用疏水性有机溶剂，在水和疏水性有机溶剂的存在下进行。作为此时使用的疏水性有机溶剂，例如可列举出甲酸乙酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯类，正丁醇、正戊醇、正辛醇等醇类，苯、甲苯、二甲苯等芳香族烃类，二乙基醚、二异丙基醚、甲基叔丁基醚等醚类，氯仿、1，2-二氯乙烷等卤代烃类及它们的混合物。

本发明制造方法也可以进一步使用亲水性有机溶剂，在水和水性介质的存在下进行。作为此时使用的亲水性有机溶剂，例如可列举出甲醇、乙醇等醇类，丙酮等酮，二甲氧基乙烷、四氢呋喃、二噁烷等醚类，二甲基亚砜及它们的混合物。

本发明制造方法通常在水层的pH值为3～10的范围内进行，可以使其在反应进行的范围内适当变化。

本发明制造方法通常在约0℃～约60℃的范围内进行，可以使其在反应进行的范围内适当变化。

本发明制造方法通常在约0.5小时～约10天的范围内进行。反应的终点可以通过以下方式进行确认，即在添加完作为原料化合物的式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物(即，化合物(2))后，例如利用液相色谱法、气相色谱法等对反应液中的该式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物的量进行测定。

本发明制造方法中的作为原料化合物的式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物(即，化合物(2))的浓度通常为50％(w/v)以下，为了使反应体系中的该式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物的浓度大体保持一定，可以向反应体系中连续或逐次加入该式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物(即，化合物(2))。

本发明制造方法中，也可以根据需要在反应体系中加入例如葡萄糖、蔗糖、果糖等糖类，或者TritonX-100或Tween60等表面活性剂等。

从反应液的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的回收只要以通常已知的任意方法进行即可。

例如，可列举出以下方法：根据需要组合色谱法、蒸馏等来进行反应液的有机溶剂提取操作、浓缩操作等后处理，由此进行精制。

具体而言，可优选列举出例如在反应液中添加盐酸等无机酸而以5-(氨甲基)-2-氯噻唑的无机酸盐的形式进行结晶精制的方法。

本发明制造方法还可以进一步含有作为原料化合物的式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物(即，化合物(2))的制造工序作为前工序。

这样的前工序包括以下工序：

使酶(以下，有时也记为前工序酶。)或该酶的产生能力的微生物(以下，有时也记为前工序微生物。)的培养物或者其处理物作用于式(1)所示的异脲化合物(以下，有时也记为化合物(1)。)，得到式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物，所述酶具有将该异脲化合物转化为对应的N-氨基甲酰氨基化合物的能力，

在此，作为化合物(1)中的“直链状或环状的烷基”，可列举：例如甲基、乙基、正丙基或正丁基等直链状的烷基，或者例如环戊基或环己基等环状烷基等。该烷基可以具有取代基，作为该取代基，例如可列举出碳原子数为1～4左右的直链状烷基、卤素原子或碳原子数为1～4左右的直链状烷氧基等，作为具有取代基的(直链状或环状的)烷基，可列举：例如异丙基或叔丁基等支链状烷基，例如氟甲基、氯甲基、三氟甲基或三氯甲基等卤代烷基，或者例如甲氧基甲基等烷氧基烷基等。

作为优选的R，例如可列举出甲基或乙基等。

上述的前工序中使用的作为催化剂的酶或具有该酶的产生能力的微生物的培养物或者其处理物具有将化合物(1)转化为化合物(2)的能力。作为具有这样的能力的微生物(即，前工序微生物)，可列举出从假单胞菌(Pseudomonas)属及寡养单胞菌(Stenotrophomonas)属所组成的组中选择的1种以上的微生物。

此外，作为具有这样的能力的微生物(即，前工序微生物)，可列举出从下述的微生物群C中选择的1种以上的微生物。

<微生物群C>

犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)、液化气单胞菌(Aeromonasliquefaciens)、节杆菌(Arthrobacter sp.)、出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、森田芽孢杆菌(Bacillus moritai)、土生隐球酵母(Cryptococcus humicolus)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、迪氏分枝杆菌(Mycobacterium diernhoferi)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea)、自养假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)、红球菌(Rhodococcus sp.)、Stenotrophomonas nitritireducens、Stenotrophomonas rhizophila、寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)、肉质链霉菌(Streptomyces carnosus)、及水栖丝孢酵母(Trichosporon aquatile)。

进而，作为具有这样的能力的优选的微生物，例如可列举出从下述的微生物群D中选择的1种以上的微生物。

<微生物群D>

犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)IFO 13244t、液化气单胞菌(Aeromonas liquefaciens)IFO 12978、节杆菌(Arthrobacter sp.)ATCC27778、出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)IF06353、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)IFO 3331、森田芽孢杆菌(Bacillus moritai)ATCC 21282、土生隐球酵母(Cryptococcus humicolus)IFO 1527、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)IFO 0541、迪氏分枝杆菌(Mycobacteriumdiernhoferi)IFO 3707、异常毕赤酵母(Pichia anomala)IFO 0963、异常毕赤酵母(Pichia anomala)IFO 1181、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)IAM 1002、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)IFO 14671、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)IFO 14796、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)JCM 6156、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)JCM 6157、稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea)JCM 2783t、自养假诺卡氏菌(Pseudonocardiaautotrophica)IFO 12743T、红球菌(Rhodococcus sp.)ATCC 19148、Stenotrophomonas nitritireducens JCM 13311、Stenotrophomonas rhizophilaJCM13333、寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)SC-1(FERM-BP 10785)、肉质链霉菌(Streptomyces carnosus)IFO 13025t、及水栖丝孢酵母(Trichosporon aquatile)ATCC 22310。

这些菌株可以从天然中分离，也可以通过从各菌株保藏机构购买而容易地取得。进而，作为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)，更优选以保藏号FERM-BP 10785登记于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的菌株。

作为能够购买这样的菌株的菌株保藏机构，例如可列举出下述的菌株保藏机构。

1.IFO(Institute of Fermentation Osaka：财团法人发酵研究所)菌种保藏

2.ATCC(American Type Culture Collection，美国模式培养物集存库)

3.IAM菌种保藏

现在，IAM菌种保藏的保存菌株中，细菌、酵母、丝状菌移交给独立行政法人理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(JCM)，且微细藻类移交给独立行政法人国立环境研究所微生物系统保存设施(NIES)。在取得时，只要向这些机构申请购买即可，例如可以访问这些机构的主页的有关菌种保藏的链接(http://www.jcm.riken.gojp/JCM/aboutJCM_J.shtml或http ://mcc.nies.gojp/aboutOnlineOrder.do)。

现在移交给独立行政法人理化学研究所生物资源中心(RIKEN BRC)微生物材料开发室。在取得时，只要向该机构申请购买即可，例如可以访问该机构的主页的有关菌种保藏的链接(http://www.jcm.riken.go.jp/JCM/aboutJCM_J.shtml)。

前工序中使用的作为催化剂的酶或具有该酶的产生能力的微生物的培养物或者其处理物也可以通过寻求出具有将化合物(1)转化为化合物(2)的能力的酶或微生物而获得并制备。具体而言，例如，向试管中加入灭菌后的培养基5ml，向其中接种通过从各菌株保藏机构购买而取得的菌体或者通过从土壤中纯化分离而制备的菌体。将其在30℃需氧条件下进行振荡培养。培养结束后，通过离心分离回收菌体，从而得到活菌体。向所得的活菌体中添加0.2M磷酸钾缓冲溶液(pH值为7)1.5ml，使其悬浮后，添加溶解于二甲基亚砜15μl中的N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-O-甲基异脲1.5mg，然后，使所得的混合物在30℃下振荡2～3天。

反应结束后，对反应液进行取样，利用液相色谱法等对反应液中生成的N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-脲的量进行分析。

如此地，对具有酶的产生能力的微生物进行挑选，所述酶具有将异脲化合物转化为对应的N-氨基甲酰氨基化合物的能力。

下面，对前工序微生物的制备方法进行说明。

前工序微生物只要使用用于培养各种微生物的适当含有碳源、氮源、有机盐、无机盐等的培养基进行培养即可。

作为有机盐或无机盐，例如可列举出钾、钠、镁、铁、锰、钴、锌等氯化物、硫酸盐、醋酸盐、碳酸盐及磷酸盐。具体而言，例如可列举出氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、醋酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钾及磷酸氢二钾。这些有机盐和/或无机盐在培养基中的添加量通常为培养液的0.0001％(w/v)～5％(w/v)左右。

作为培养方法，例如可列举出固体培养、液体培养(试管培养，烧瓶培养，发酵缸培养等)。

培养温度及培养液的pH值只要为前工序微生物生长繁殖的范围，则没有特别的限定，例如可列举：培养温度为约15℃～约45℃的范围，培养液的pH值为约4～约8的范围。培养时间可根据培养条件进行适当选择，通常为约1天～约7天。

前工序微生物的培养物可以直接用作前工序的催化剂。在使用前工序微生物的培养物的方法中，作为直接使用前工序微生物的菌体的方法，例如可列举出(1)直接使用培养液的方法，(2)使用通过对培养液进行离心分离等而回收的菌体(根据需要，用缓冲液或水进行清洗后的湿菌体)的方法等。

作为前工序的催化剂，也可以使用前工序微生物的培养物的处理物。作为该处理物，例如可列举：对培养而得到的菌体用有机溶剂(丙酮、乙醇等)进行处理而得到的处理物、进行冷冻干燥处理而得到的处理物或进行碱处理而得到的处理物，或者对菌体进行物理性破碎或借助酶进行破碎而得到的处理物，或者从这些处理物分离和提取得到的粗酶等。进而，上述处理物也包括实施上述处理后利用公知的方法进行固定化处理而得到的处理物。

作为从前工序微生物的培养物对前工序酶进行精制的方法，只要应用通常的蛋白精制中使用的方法即可。例如可列举出如下所述的方法。

首先，通过离心分离等从前工序微生物的培养物收集菌体，然后利用超声波处理、卧式砂磨机处理、弗氏压碎器处理等物理破碎法或者使用表面活性剂或lysozyme等溶菌酶的化学破碎法等对其进行破碎。利用离心分离、滤膜过滤等从所得的破碎液除去杂质，从而制备无细胞提取液，适当使用阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤色谱法、金属螯合物色谱法等分离精制方法对其进行分级，从而可以对前工序酶进行精制。

作为在色谱法中使用的载体，例如可列举出导入了羧甲(CM)基、二乙基氨基乙(DEAE)基、苯基或者丁基的纤维素、糊精或琼脂糖等不溶性高分子载体。也可以使用市售的填充有载体的色谱柱，作为上述市售的填充有载体的色谱柱，例如可列举出Q-Sepharose FF、Phenyl-SepharoseHP(商品名，均为Amersham Pharmacia Biotech公司制)、TSK-gelG3000SW(商品名，东曹公司制)等。

含有前工序酶的级分，例如只要根据前工序中的“将异脲化合物转化为对应的N-氨基甲酰氨基化合物的能力”的存在有无或者其程度进行挑选即可。

作为具体的形态，例如可列举出前工序微生物的培养物、该培养物的处理物(例如，无细胞提取液、粗精制蛋白、精制蛋白及它们的固定化物等)。在此，作为培养物的处理物，例如可列举出冷冻干燥微生物、有机溶剂处理微生物、干燥微生物、微生物磨碎物、微生物的自消化物、微生物的超声波处理物、微生物提取物或者微生物的碱处理物。此外，作为得到固定化物的方法，例如可列举出载体结合法(使本酶等吸附于二氧化硅凝胶、陶瓷等无机载体、纤维素、离子交换树脂等的方法)及包埋法(将本酶等限制于聚丙烯酰胺、含硫多糖凝胶(例如卡拉胶)、海藻酸凝胶、琼脂凝胶等高分子的网状结构之中的方法)。

若考虑使用前工序微生物的工业性生产，则从制造设备的限制等方面出发，与使用未处理状态的微生物的方法相比，有时更优选使用将该微生物灭活后的处理物的方法。作为用于此的死菌化处理方法，例如可列举出物理性杀菌法(加热、干燥、冷冻、光线、超声波、过滤、通电)、使用化学药品的杀菌法(碱、酸、卤素、氧化剂、硫、硼、砷、金属、醇、苯酚、胺、硫醚、醚、醛、酮、氰、抗生物质)。一般而言，在这些杀菌法中，优选选择尽可能地不使前工序酶的上述“将异脲化合物转化为对应的N-氨基甲酰氨基化合物的能力”失活且对反应体系的残留、污染等影响少的处理方法。

前工序通常在水的存在下进行。此时的水可以是缓冲液的形态。作为该缓冲液中所使用的缓冲剂，例如可列举出磷酸钠、磷酸钾等磷酸的碱金属盐，醋酸钠、醋酸钾等醋酸的碱金属盐等。

前工序也可以进一步使用疏水性有机溶剂，在水和疏水性有机溶剂的存在下进行。作为此时使用的疏水性有机溶剂，例如可列举出甲酸乙酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯类，正丁醇、正戊醇、正辛醇等醇类，苯、甲苯、二甲苯等芳香族烃类，二乙基醚、二异丙基醚、甲基叔丁基醚等醚类，氯仿、1，2-二氯乙烷等卤代烃类及它们的混合物。

前工序也可以进一步使用亲水性有机溶剂，在水和水性介质的存在下进行。作为此时使用的亲水性有机溶剂，例如可列举出甲醇、乙醇等醇类，丙酮等酮，二甲氧基乙烷、四氢呋喃、二噁烷等醚类，二甲基亚砜及它们的混合物。

前工序通常在水层的pH值为3～10的范围内进行，可以使其在反应进行的范围内适当变化。

前工序通常在约0℃～约60℃的范围内进行，可以使其在反应进行的范围内适当变化。

前工序通常在约0.5小时～约10天的范围内进行。反应的终点可以通过以下方式进行确认，即在添加完作为原料化合物的式(1)所示的异脲化合物(即，化合物(1))后，例如利用液相色谱法、气相色谱法等对反应液中的该式(1)所示的异脲化合物的量进行测定。

前工序中的作为原料化合物的式(1)所示的异脲化合物(即，化合物(1))的浓度通常为50％(w/v)以下，为了使反应体系中的该式(1)所示的异脲化合物的浓度大体保持一定，可以向反应体系中连续或逐次加入该式(1)所示的异脲化合物(即，化合物(1))。

在前工序中，也可以根据需要在反应体系中加入例如葡萄糖、蔗糖、果糖等糖类，或者TritonX-100或Tween60等表面活性剂等。

从反应液的式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物的回收只要以通常已知的任意方法进行即可。

作为原料化合物即式(1)所示的异脲化合物(即，化合物(1))的制造方法，例如可以通过将5-(氨甲基)-2-氯噻唑与式(3)所示的化合物(以下，有时记作化合物(3))混合，并按照例如以下方式得到该异脲化合物，

式(3)中，R表示与上述相同的含义。

作为化合物(3)，例如可列举出O-甲基-N-硝基异脲、O-乙基-N-硝基异脲等。

根据依照日本特开平10-120666号公报的实施例1～16的方法，首先，使5-(氨甲基)-2-氯噻唑和化合物(3)在水中、室温下进行反应，主要制造式(4)所示的化合物(以下，有时记作化合物(4))，接着，对所得的化合物(4)进行脱硝基化，从而可以得到化合物(1)，

式(4)中，R表示与上述相同的含义。

上述方法中，在主要制造化合物(4)时，由于化合物(1)也作为副产物被直接地制造，因此可将其回收利用。

更具体而言，例如，作为使5-(氨甲基)-2-氯噻唑与化合物(3)反应而制造作为中间体有用的化合物(4)的方法，可列举出以下方法等，即根据需要使化合物(3)溶解于水，然后，在10℃～35℃左右的温度下混合5-(氨甲基)-2-氯噻唑，得到含有化合物(4)及化合物(1)的混合物，通过过滤、离心分离等对以结晶形式析出的化合物(4)进行固液分离，从而取得化合物(4)。而且，取出以结晶形式存在的化合物(4)后的滤液可以作为含有化合物(1)的水溶液而获得。

实施例

下面列举实施例对本发明进行更详细地说明。

实施例1(具有本多核苷酸的质粒的合成法(其1))

使用QIAGEN Genomic-tip(Qiagen公司制)由根据下述的参考例3记载的方法挑选后的、具有将N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力的微生物(Rhodococcus sp.)来制备染色体DNA(A)。

基于Rhodococcus R312(短杆菌R 312(CBS 717-73))的酰胺酶基因序列，合成具有序列号3所示的碱基序列的寡核苷酸引物及具有序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸引物。

将所合成的2种寡核苷酸引物作为1组引物对，且以由上述制备的染色体DNA(A)为模板，在下述的反应液组成、反应条件进行PCR。(使用roche-diagnostic公司制的Expand High Fidelity PCR System。)

[反应液的组成]

[反应条件]

将加入有上述组成的反应液的容器安装在PERKINELMER-GeneAmp PCR System2400上，加热到94℃(2分钟)后，将94℃(10秒钟)-60℃(0.5分钟)-72℃(1.5分钟)的循环进行30次，再在72℃保持7分钟。

之后，取PCR反应液的一部分，进行琼脂糖凝胶电泳，结果检测出约1.6kbp的DNA片段的条带(bend)。

直接使用各个检测出约1.6kbp的DNA片段的条带的PCR反应液，使上述的约1.6kbp的DNA片段在pCR2.1-TOPO载体的已有“PCR Product插入位点”进行连接反应(使用Invitrogen公司制TOPOTMTA cloning试剂盒)，在所得的连接反应液中转化大肠杆菌DH5α株。

在含有50μg/ml的氨苄西林的LB(1％Bacto胰蛋白胨、0.5％Bacto酵母提取物、1％氯化钠)琼脂培养基中涂布5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(以下，记为X-gal)4％水溶液30μl及0.1M IPTG30μl，向其中接种并培养所得的转化体。在所形成的菌落中各取1个白色的菌落，将该菌落接种到含有50μg/ml的氨苄西林的灭菌LB培养基(2ml)中，在试管中进行振荡培养(30℃，24小时)。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各个培养菌体中取出质粒。

以下，有时也将所得的来自DNA片段的质粒记为质粒pCRami。

对插入至质粒pCRami的DNA片段的碱基序列进行了解析，可知所插入的DNA片段的碱基序列具有序列号2所示的碱基序列。

使用Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit(perkinelmer制)，以各质粒为模板进行测序反应，将得到的DNA的碱基序列用DNA测序仪373A(perkinelmer制)进行解析，由此进行插入至质粒的DNA片段的碱基序列的解析。

利用2种限制酶(SacI及KpnI)对所得的质粒pCRami进行2重消化，接着，对如此进行2重消化的约1.6kbp的DNA片段进行精制。

另一方面，利用2种限制酶(SacI及KpnI)对质粒载体pTV118N(宝酒造公司制)进行2重消化，接着，对如此进行2重消化的DNA片段进行精制。

将所得的2种精制后的DNA片段混合，用T4DNA连接酶进行连接反应后，接着在所得的连接反应液中转化大肠杆菌DH5α株。

在含有50μg/ml的氨苄西林的LB琼脂培养基中培养所得的转化体，从生长繁殖出来的菌落的中任意挑选3个菌落。将该挑选的菌落分别接种在含有50μg/ml的氨苄西林的灭菌LB培养基(2ml)中，在试管中进行振荡培养(30℃，24小时)。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从各个培养菌体中取出质粒。

利用SacI和KpnI 2种限制酶对各个所取出的质粒的一部分进行2重消化，然后，对2重消化后的DNA片段进行凝胶电泳，从而确认在该取出的所有质粒中上插入有述约1.6kbp的DNA片段。(以下，有时也将该质粒记为质粒pTVami。)

使用这样得到的质粒pTVami来转化大肠杆菌DH5α株。将所得的转化体接种到含有50μg/ml的氨苄西林的灭菌LB培养基(100ml)中，进行振荡培养(30℃，26小时)。对所得的培养液进行离心分离，从而得到本转化体。

实施例2(使用产生本酶的大肠杆菌重组体的从N-氨基甲酰氨基化合物制造5-(氨甲基)-2-氯噻唑的例)

将实施例1中得到的本转化体(即，具有质粒pTVami的大肠杆菌DH5α株)接种到含有50μg/ml的氨苄西林的灭菌LB培养基(100ml)中，进行振荡培养(30℃，26小时)。对所得的培养液进行离心分离，得到湿菌体约0.6g。在所得的湿菌体中混合N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-脲5mg、二甲基亚砜50μl、0.2M磷酸缓冲液(pH值7.0)5ml，在37℃搅拌144小时。

反应结束后，对反应液取样0.6ml。从该取样液中除去菌体后，利用液相色谱法对所生成的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的量进行分析。其结果可知：相对于反应中使用的N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-脲的量，生成91.6％的5-(氨甲基)-2-氯噻唑。

<含量分析条件>

色谱柱：Cadenza CD-C18(4.6mmφ×15cm，3μm)(Imtakt公司制)

流动相：A液(5mmol/L辛磺酸钠+50mmol/L磷酸二氢钾水溶液，B液乙腈

流量：1ml/分钟

柱温：40℃

检测：254nm

实施例3(本酶的制备)

由根据参考例3记载的方法挑选的、具有将N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力的微生物(Rhodococcus sp.)制备湿菌体约2.2g，使其悬浮在20mM磷酸钾缓冲溶液(pH值7.0)20ml中，用多珠体破碎机(Multi Beads Shocker)(安井器械制，玻璃珠0.1mmΦ，2500rpm，20分钟)进行破碎。对所得的破碎液进行离心分离(10000rpm，10分钟)，在所得的上清中添加硫酸鱼精蛋白后，再次进行离心分离(10000rpm，10分钟)，从而得到离心上清。

用超滤膜(30kNMWL)使所得的离心上清约20ml浓缩至2ml。使所得的浓缩物在离子交换色谱法色谱柱[HiTrap Q FF(AmershamBio-Science公司制)][用磷酸钾缓冲溶液(20mM，pH值7)平衡后的色谱柱]展开，以溶解有氯化钠的磷酸钾缓冲溶液(氯化钠浓度0→1.0M的浓度梯度)为流动相进行溶出，由此以具有还原酶活性的级分的形式得到氯化钠浓度为0.14～0.65M的级分4ml。

用超滤膜(30kNMWL)使所得的活性级分4ml浓缩至2ml后，在所得的浓缩物中缓缓地加入硫酸铵直到其浓度为1.5M为止。使其在疏水性相互作用色谱法色谱柱[HiTrap Butyl FF(Amersham Bio-Science公司制)][用含有1.5M硫酸铵的磷酸钾缓冲溶液(20mM，pH值7)平衡后的色谱柱]中展开，以溶解有硫酸铵的磷酸钾缓冲溶液(硫酸铵浓度1.5M→0M的浓度梯度)为流动相进行溶出，由此以具有还原酶活性的级分的形式得到硫酸铵浓度为0.25～0.47M的溶出级分1ml。

利用超滤膜(30kNMWL)将所得的活性级分4ml用含有0.15M的NaCl的磷酸钠缓冲溶液(50mM，pH值7)进行脱盐，更换缓冲溶液，浓缩至约0.1ml。对所得的浓缩物进行凝胶过滤[色谱柱：SUPER DEX 200(10/300GL)(Amersham Bio-Science公司制)][流动相：含有0.15M的NaCl的磷酸钠缓冲溶液(50mM，pH值7)]，从而以具有使N-氨基甲酰氨基化合物水解至5-(氨甲基)-2-氯噻唑的活性的级分的形式得到分子量为约98000道尔顿的含有本酶的约1ml的活性级分。

另外，对由色谱法等得到的级分，通过以下的操作测定水解酶活性。添加溶解在二甲基亚砜15μl的N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-脲1.5mg后，加入利用色谱法等得到的溶出级分和0.2M磷酸钾缓冲溶液(pH值为7)，使其总量为1.5ml，将所得的混合物在30℃下振荡1～2天。

反应结束后，对反应液取样0.6ml，利用液相色谱法测定反应液中生成的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的量，从而求得级分的水解酶活性。

<含量分析条件>

色谱柱：Cadenza CD-C18(4.6mmφ×15cm，3μm)(Imtakt公司制)

流量：1ml/分钟

柱温：40℃

检测：254nm

实施例4(具有本多核苷酸的质粒的合成法(其2))

以将与序列号1所示的氨基酸序列对应的正向引物和反向引物切分成各约40bp的长度的形式，分别合成39条引物。在以下的条件下对这些引物进行Assembly PCR法。

[反应液组成]

将加入有上述组成的反应液的容器安装到PERKINELMER-GeneAmp PCR System 9700上，然后，将94℃(30秒钟)-52℃(30秒钟)-68℃(30秒钟)的循环进行55次。

反应结束后，以反应液为模板再次在以下的反应条件下进行PCR。加热到94℃(2分钟)后，将94℃(30秒钟)-53℃(30秒钟)-68℃(1.5分钟)的循环进行30次。此时，使用具有序列号3所示的碱基序列的寡核苷酸引物和具有序列号4所示的寡核苷酸引物。

[反应液组成]

之后，取PCR反应液的一部分，用琼脂糖凝胶进行精制，加入2种限制酶(SacI及KpnI)，使约1500bp的DNA片段进行2重消化，接着对酶消化后的DNA片段进行精制。

另一方面，利用2种限制酶(SacI及KpnI)使质粒载体pTV118N(TakaRa公司制)进行2重消化，对酶消化后的DNA片段进行精制。

将这2种酶消化后的DNA片段混合，用T4DNA连接酶进行连接反应，在所得的连接反应液中转化大肠杆菌DH5α株。

在含有50μg/ml的氨苄西林的LB琼脂培养基中培养所得的转化体，将生长繁殖出发的菌落分别接种到含有50μg/ml的氨苄西林的灭菌LB培养基(2ml)中，在试管中进行振荡培养(37℃，17小时)。由此可以得到具有质粒pTVami的大肠杆菌DH5α株(即，本转化体)。

使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)从上述的培养菌体中取出质粒，由此得到质粒pTVami。

参考例1(化合物(1)的制造方法)

一般在乙腈400mL中搅拌N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-O-甲基-N’-硝基异脲(化合物(4)的R为甲基的化合物)50g，一边在25～30℃向该混合物中滴加28％氨水58.6g。

将所得的混合物保温1小时后，在减压下蒸馏除去乙腈。用醋酸乙酯120mL稀释所得的残渣，用无水硫酸镁5g进行脱水，对不溶成分进行过滤后，进行了减压浓缩。

向如此得到的油状物质中加入甲苯50mL、正己烷30mL，使其溶解，在向所得的溶解物中缓缓加入正己烷时，析出结晶。将其滤取后，同样地用甲苯/正己烷进行重结晶，进行滤取，接着进行减压干燥，由此得到N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-O-甲基异脲的白色结晶18g。所得的白色结晶的物性如下所述。

<白色结晶的物性>

基于液相色谱法的面积百分率得到的纯度：98.3％

熔点：71～72℃

¹H-NMR：3.7(s，3H)，4.4(s，2H)，4.9(s，2H)，7.4(s，1H)

参考例2(化合物(2)的制造方法)

在水340mL中溶解氰酸钾24.3g，在50℃下向该溶解物中滴加5-(氨甲基)-2-氯噻唑盐酸盐水溶液(含量35wt％)135g。

在将所得的混合物保温1小时时，析出结晶。将其冷却至室温后，对其进行过滤，用温水洗涤，接着进行减压干燥，从而得到N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-脲的白色结晶45g。所得的白色结晶的物性如下所述。

<白色结晶的物性>

基于液相色谱法的面积百分率得到的纯度：98.6％

熔点：173℃

¹H-NMR：4.3(s，2H)，5.7(s，2H)，6.6(s，1H)，7.5(s，1H)

参考例3(寻求具有酶的产生能力的微生物，所述酶具有将N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力)

向试管中加入灭菌后的培养基(1L的水中含有葡萄糖20g、聚胨5g、酵母提取物3g、肉提取物3g、硫酸铵2g、磷酸二氢钾1g及硫酸镁7水合物0.5g后，将pH值调节为7.0的培养基)5ml，向其中接种通过从各菌株保藏机构购买而取得的菌体或者通过从土壤中纯化分离而制备的菌体。将其在30℃需氧条件下进行振荡培养。培养结束后，通过离心分离回收菌体，由此得到活菌体。向螺口试管中加入0.2M磷酸钾缓冲溶液(pH值为7)1.5ml，向其中加入上述活菌体后，使其悬浮。向所得的悬浮液中添加溶解于二甲基亚砜15μl的N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-脲1.5mg后，使所得的混合物在30℃下振荡2～3天。

反应结束后，对反应液取样0.6ml。从取样所得的反应液中除去菌体后，利用液相色谱法对反应液中生成的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的量进行分析。

如此地挑选具有酶的产生能力的微生物，所述酶具有将N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力。

<含量分析条件>

色谱柱：Cadenza CD-C18(4.6mmφ×15cm，3μm)(Imtakt公司制)

流量：1ml/分钟

柱温：40℃

检测：254nm

参考例4(从异脲化合物制造N-氨基甲酰氨基化合物的制造例)

向试管中加入灭菌后的培养基(1L的水中含有葡萄糖20g、聚胨5g、酵母提取物3g、肉提取物3g、硫酸铵2g、磷酸二氢钾1g及硫酸镁7水合物0.5g后，将pH值调节为7.0的培养基)5ml，向其中接种表1所示的各种菌体。将其在30℃需氧条件下进行振荡培养。培养结束后，通过离心分离回收菌体，由此得到活菌体。向螺口试管中加入0.2M磷酸钾缓冲溶液(pH值为7)1.5ml，向其中加入上述活菌体后，使其悬浮。向所得的悬浮液中添加溶解于二甲基亚砜15μl的N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-O-甲基异脲1.5mg后，使所得的混合物在30℃下振荡2～3天。

反应结束后，对反应液取样0.6ml。从取样所得的反应液中除去菌体后，利用液相色谱法对反应液中生成的N-(2-氯噻唑-5-基甲基)-脲的量进行分析。所得的结果如表2所示。

<含量分析条件>

色谱柱：Cadenza CD-C18(4.6mmφ×15cm，3μm)(Imtakt公司制)

流量：1ml/分钟

柱温：40℃

检测：254nm

表1

产业上的可利用性

序列表自由文本

序列号3：用于进行PCR的引物

序列号4：用于进行PCR的引物

Claims

1.一种5-(氨甲基)-2-氯噻唑的制造方法，其包括使将多核苷酸导入微生物细胞内而得到的转化体的培养物或者其处理物作用于式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物的反应工序，其中，所述多核苷酸具有编码酶的氨基酸序列的碱基序列，所述酶具有将该N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力

2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述酶为具有下述氨基酸序列的任一项的酶：

a)序列号1所示的氨基酸序列；

b)与由序列号2所示的碱基序列构成的DNA在严格条件下进行杂交的DNA的碱基序列所编码的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列为具有将所述N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力的酶的氨基酸序列；或者

c)序列号1所示的氨基酸序列中缺失、置换或增加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列为具有将所述N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力的酶的氨基酸序列。

3.一种转化体的培养物或其处理物作为用于将式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的催化剂的用途，所述转化体是将具有编码酶的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸导入微生物细胞内而得到的转化体，所述酶具有将该N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力

4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述酶为具有编码序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列的酶。

5.一种5-(氨甲基)-2-氯噻唑的制造方法，其包括以下工序：

前工序：使酶或者具有产生该酶的能力的微生物的培养物或其处理物作用于式(1)所示的异脲化合物，得到式(2)所示的N-氨基甲酰氨基化合物，所述酶具有将该异脲化合物转化为对应的N-氨基甲酰氨基化合物的能力，

以及

反应工序：使将多核苷酸导入微生物细胞内而得到的转化体的培养物或者其处理物作用于由前工序得到的N-氨基甲酰氨基化合物，所述多核苷酸具有编码酶的氨基酸序列的碱基序列，所述酶具有将该N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力。

6.根据权利要求5所述的制造方法，其中，所述具有将N-氨基甲酰氨基化合物转化为对应的5-(氨甲基)-2-氯噻唑的能力的酶为具有序列号1所示的氨基酸序列的酶。