TW201137125A - Method for making 5-(aminomethyl)-2-chlorothiazole - Google Patents

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201137125 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於5-(胺基曱基）-2-氯噻唑之製造方法等。 【先前技術】 5-(胺基曱基）-2-氣噻唑已知為醫藥品、農藥品等之 合成中間體（可參照例如US5180833 A)。 關於該化合物之製造方法，在US5180833 A中記載將 異硫氰酸烯丙酯衍生物經氯化劑反應後，再經氨水 (aqueous ammonia)或六亞甲四胺進行反應之方法。 N-胺曱醯基胺基化合物可作為5-(胺基甲基）-2-氣噻 嗤之前驅物。 【發明内容】 本發明之目的係提供作為合成中間體有用之5-(胺基 曱基）-2-氯噻唑之製造方法等。 本發明係提供以下者： 1. 一種5-(胺基曱基）-2-氣噻唑之製造方法（以下亦稱為 本發明之製造方法），其包含下述步驟： 反應步驟，係對於式（2)所示之N-胺曱醯基胺基化合 物（以下亦稱為化合物（2))，使藉由將聚核苷酸（以下亦稱 為本聚核苷酸）導入微生物細胞内所成之轉形體（以下亦稱 為本轉形體）的培養物或其處理物進行作用之步驟； 〇 C'^：Sy^N^NH2 (2) 3 322941 201137125 v、中該聚核苷酸包含編碼具有將該胺甲醯基胺基化合 物轉換為相對應之5 (胺基甲基一氣嚷峻的能力之酵素 (以下亦稱為本酵素）之胺基酸序列的鹼基序列； 2. 如則述第1項所述之製造方法’其巾，前述酵素係具有 下述任一胺基酸序列之酵素： a) 序列編號1所示的胺基酸序列； b) —種胺基酸序列，其係與由序列編號2所示之鹼基序列 所構成之DNA在嚴苛（stringent)條件下進行雜合 (hybr 1 d 1 ze)的MA鹼基序列所編碼之胺基酸序列，且為具 有將前述N-胺甲醯基胺基化合物轉換為相對應之5_(胺基' 甲基）-2-氯嗟ϋ坐的能力之酵素之胺基酸序列；或 c) 種胺基酸序列，其係在序列編號1所示的胺基酸序列 中缺失、取代或加成1個或複數個胺基酸之胺基酸序列， 且為具有將前述Ν-胺曱醯基胺基化合物轉換為相對應之 5-(胺基甲基）-2_氯噻唑的能力之酵素之胺基酸序列； 3. 一種藉由將聚核苷酸導入微生物細胞内所成之轉形體的 培養物或其處理物的用途（以下亦稱為本發明用途），/、 於作為將式⑵所示之Ν -胺甲酿基胺基化合物轉換為相2 應之5-(胺基甲基）_2_氯噻唑的催化劑；

Cl^<Sy^N^NH2 (2) 其中，該聚核苷酸包含編碼具有將該N-胺甲醯基胺烏 物轉換為相對應之5-(胺基甲基）-2-氯噻唑的能力 322941 4 201137125 之胺基酸序列的鹼基序列； 4. 如前述第3項所述之用途，其中，前述酵素係具有編碼 序列編號1所示的胺基酸序列之鹼基序列的酵素； 5. —種5-(胺基曱基）-2-氯噻唑之製造方法，其包含下述 步驟： 前步驟，係對於式（1)所示之異尿素（isourea)化合 物，使具有將該異尿素化合物轉換為相對應之N-胺曱醯基 胺基化合物的能力之酵素或具有產生該酵素的能力之微生 物的培養物或其處理物進行作用，而獲得式（2)所示之N-胺曱醯基胺基化合物之步驟；

NH c、sr κ 人。r (1) [式中，R表示直鏈狀或環狀之烷基，該烷基亦可具有取代 基，且該烷基之碳原子數為1至6]

反應步驟，係對於前步驟中所得之N-胺曱醯基胺基化 合物，使藉由將聚核苷酸導入微生物細胞内所成之轉形體 的培養物或其處理物進行作用之步驟；其中，該聚核苷酸 包含編碼具有將該N-胺曱醯基胺基化合物轉換為相對應 之5-(胺基曱基）-2-氣噻唑的能力之酵素之胺基酸序列的 5 322941 201137125 驗基序列； 6·如前述第5項所述之製造方法，其中，該具卜 述N-胺曱酿基胺基化合物轉換為相對應之5_(胺基別 =之=能力之酵素，為具有相編號丨所示的按ς 之製=提供，_(胺基甲基)_刚〜 【實施方式】 本說明書中所載之發明並未限定特定之方法論 (咖⑽1)、及試劑，而為可變更者。並且，本說明^ 所使用之用語並非僅用以記載特定 ς 之範圍並無任何之限定。 対本發明 除非特別限定，本說明書中所使用之所有技術用择 及化予用π ’均具有本發明所屬技術料之熟諳者所 可理解之相同意義者。在本發明之實施或試驗方面: 用與本說明書中所載者相同或同等之方法及材料之任 惟以下所載為其中較佳之方法、裝置、及材料。 以下再更詳細地說明本發明。 本發明之製造方法，係包含下述步驟： 反應γ驟’係對於式⑵所示之Ν_胺甲醯基胺基化合 物（即化。物⑵）’使藉由將聚核苦酸導人微生物細胞内所 成之轉形體（即本轉形體）的培養物或其處理物進行作用之 步驟； 322941 6 (2) 201137125

Cl

物轉換為:編碼具有將該N-胺甲醯基胺基化合 (即本酵素）之㈣，胺基甲基）~2_氯㈣的能力之酵素 '、胺基酸序列的鹼基序列。 體的製造方法中所使用之作為催化劑之本轉形 轉換:相對要使包含編碼具有將化合物⑵ ^ (胺基甲基）-2-氣噻唑的能力之酵素 之絲酸序列㈣麵列的聚核魏（即本聚 二，)’以一般之基因工程方法導入至微生物細胞内，即 可製備之。 以下再對本轉形體之關於導入外來基因之製備方法 加以說明。 本酵素可舉例如具有下述任—胺基酸序列之酵素。 a) 序列編號1所示的胺基酸序列； b) -種胺基酸序列’其係與由序列編號2所示之驗基序列 所構成之DNA在嚴苛條件下進行雜合的DM鹼基序列所編 碼之胺基酸序列，且為具有將前述N_胺甲醯基胺基化合物 轉換為相對應之5-(胺基曱基）_2_氯噻唑的能力之酵素\ 胺基酸序列；或 μ 〇-種胺鎌序列，其係在相編號丨所^的縣酸序列 中缺失、取代或加成1個或複數個胺基酸之胺基酸序列， 且為具有將前述Ν-胺甲醯基胺基化合物轉換為相對應之 322941 7 201137125 5-(胺基曱基）-2-氣噻唑的能力之酵素之胺基酸序列。 本聚核苷酸可為天然之聚核苷酸，或亦可為在天然之 聚核苷酸中導入變異（位置專一性（site-specific)導入變 異法、突變處理等）而製備之聚核苷酸。篩檢天然之聚核苷 酸時，可以具備會產生「具有將化合物（2)轉換為5-(胺基 曱基）-2-氣噻唑之能力之酵素」的能力之微生物、或具備 會產生「具有編碼序列編號1所示的胺基酸序列之鹼基序 列的酵素」的能力之微生物作為對象。 篩檢此等微生物時，具體而言，係在試管中加入5mL 已滅菌之培養基，於其中將由各菌種保存機構購得之菌體 或由土壤中經純種分離所製備之菌體予以接種。將其於30 °C、好氧（aerobic)之條件下振盪培養。培養終了後，以離 心分離回收菌體，製成生菌體。在製成之生菌體中加入 1. 5mL之0. 2M鱗酸钟緩衝溶液（pH7)，將其懸浮後，加入 1. 5mg之已溶於15yl之二曱基亞石風中之1^-(2-氯°塞°坐-5-基曱基）-尿素後，將該混合物於30°C下振盪培養2至3曰。 反應終了後，由該反應液取樣，並以液相層析法等分 析反應液中生成之5-(胺基曱基）-2-氣嘆吐之量。 以如此操作，可選拔出具備會產生「具有將N-胺甲醯 基胺基化合物轉換為相對應之5-(胺基曱基）-2-氯噻唑的 能力之酵素」的能力之微生物。 在本發明之製造方法所使用之作為催化劑之酵素或 具有產生該酵素之能力之轉形體的培養物或其處理物，可 列舉如源自由下述微生物群A中選出之1種以上之微生物 8 322941 201137125 者。 <微生物群A> 乳赂短桿菌（方case/)、密西根棒狀短桿菌 iCorynebacterium michiganense)、炎膜棄择魯 (Flavobacterium capsulatum)、法 Μ 反有抱漢支酵母菌 {Hanseniaspora valbyensis)、包故故動蛰{Mycoplana bullata)、榮先假翠胞儀（Pseudomonas fluorescens)、辕 ^ Mϋ {Pseudomonas pseudoalcaligenes)' lx ^ 珠魯 iRhodococcus erythropolis)、導旅HiRhizopus chinensis)、Μ l醇單胞菌屬（Sp/n’ngOinoiias sp.)、微今 後暮秦翠版蛰 iStenotrophomonas acidaminiphi la)、熟鮮 暮秦年紙魯{Stenotrophomonas koreensis)、蹲良還取暮 秦年版魯{Stenotrophomonas nitritireducens)、今紙暮 秦翠版壤iStenotrophomonas rhizophi la)、暮秦翠紙壤風 (Stenotrophomonas sp·)、争論多嗔菌（Variovorax paradoxus)、及續麥芽黃單跑菌（Xanthomonas maltophi1ia) 〇 再者，本發明之製造方法中所用的較佳之作為催化劑 之酵素或由具有產生該酵素之能力之轉形體的培養物或其 處理物，可舉例如源自由下述微生物群B中選出之1種以 上之微生物者。 <微生物群B> 乳酿短桿菌（万caseOJCM 2594t、密西根棒 狀短桿菌（化/777#3〔仏/^聊射-(^7/於9/^/?>^)人1'(^1〇202、 9 322941 201137125 炎膜黃桿菌（FJavobacteriuai capsulatu/n)](M 14：52t、法 爾皮有抱漢毛酵母菌（ffanseuiaspora va】byensis) IYQ 1758、泡狀枝動菌（处IFO 132090t、螢 光假單胞菌//i/orescens)Biotype F ATCC 17513、螢光假單胞菌（/Sewi/o/z/c^as //£/are>si：e/7s)IF0 3903、類產驗假單胞菌（/^ewi/oyz/aoaspsewi/oaYca7 JCM 5968t、紅串紅球菌eryi/p/Opoi/·?) IFO 12320、華根黴（e/z/zopiAScA/T^y^/sMFO 4768、勒氨醇單 胞菌屬（5]ρ/^·Λ取脱sp. )IF0 15164、勒氨醇單胞菌屬 (sp. )JCM 7514、微嗜酸寡養單胞菌 (Stenotrophomonas acidaminipfiila)KW l^、孰鮮暮 養單胞菌（5Ye/7〇 ir<9/?/?<9飢?77a>s /roreeTisys) JCM 13256、石肖基 還原寡養單胞菌（5Ye/2<9/?/ ir/i/rei/i/cees) JCM 13311、嗜根寡養單胞菌（5Ye77〇ί/·σρΛσ/ζ7〇/7«3·5 rhizop/jiJa) ] CM 13333、募養單胞菌屬（Stenotrop/io/nonas sp.)SC-l(FERM-BP 10785)、爭論多嗟菌（FaWomrai parac/anAsJ IFO 151491、及嗜麥芽黃單胞菌（J5/7 ίΛο/»〇7735 maltophi 1 ia)]QM 。 此等菌株可由天然分離，亦可容易地由例如下述之菌 種保存機構購得。 l.IFO(Institute of Fermentation Osaka:財團法人日 本醱酵研究所）菌種保存中心（culture col lection) 目前已移管至獨立行政法人曰本製品評價技術基盤 機構生物遺傳資源部門（NBRC)。欲取得時，可向NBRC申 10 322941 201137125 請購入，亦可連結至NBRC之網站 (http://www.nbrc. nite. go. jp/NBRC2/NBRCDispSearchSe rvlet?lang=jp) 〇 2. ATCC(American Type Culture Col lection ;美國菌種保 存中心） 可透過日本住商藥品國際股份有限公司ATCC事業集 團取得，欲購入時，亦可連結至該集團之網站 (http://www. suramitpharma. co. jp/japanese/service/s_ ATCC. html)。亦可直接由ATCC購入。 3. IAM菌種保存中心 目前，IAM菌種保存中心之保存菌株中，細菌、酵母 菌、絲狀菌已移管至獨立行政法人日本理化學研究所生 物資源中心微生物材料開發室（JCM)，此外，微細之藻類已 移管至獨立行政法人日本國立環境研究所微生物系統保 存設施（NIES)。欲取得時，可向此等機關申請購入，亦可 連結至此等機關之網站中關於菌種保存之網頁 (http://www. jcm. riken. go. jp/JCM/aboutJCM_J. shtml ' 或 http://mcc.nies.go. jp/aboutOnlineOrder.do)。 4 · J C M (日本理化學研究所微生物系統保存設施（J a p a n Collection of Microorganisms, JCM)) 目前，已移管至獨立行政法人日本理化學研究所生 物資源中心（RIKENBRC)微生物材料開發室。欲取得時，可 向該機關申請購入，亦可連結至該機關之網站中關於菌種 保存之網頁 11 322941 201137125 (http://www. jcm. riken. go. jp/JCM/aboutJCM_J. shtml)° 本發明之製造方法中所使用的更佳之作為催化劑之 酵素或具有產生該酵素之能力之轉形體的培養物或其處理 物’可列舉如源自由假單抱菌屬（/¾⑼也历⑽妨)及寡養單胞 菌屬所成群組中選出之1種以上之微 支物者。比外’募養單胞菌屬（Stenotrop/jo/Bouas sp·)以 寄存號碼FERM-BP 10785登錄在獨立行政法人日本產業技 術綜合研究所專利生物寄存中心中之菌株為更佳。再更佳 者可舉例如紅球菌屬R312 (R312 ) ⑽R312CCBS 717-73))等源自屬於紅球菌屬 之微生物者。可購入紅球菌屬R312 R312)之菌種保存機構，可列舉如荷蘭真菌 中心（匸6111^31&1131^6&1^00『3(^111111161。1111：1^63)。紅球菌 屬 R312)(短桿菌屬 R312 ⑽R312)(CBS 717-73))目前以「肋0i^cc>cc£/s sp· Zopf 1891 AL」之菌株名稱保存，欲取得時，可向上 述機關申請購入，亦可連結至該機關之網站 (http://www.cbs.knaw.nl/databases/nccb/search_bac plas. aspx)等。 本聚核苷酸包含：編碼具有將化合物（2)轉換為5-(胺 基曱基）-2-氯噻唑的能力之酵素之胺基酸序列的驗基序 列。 本聚核苷酸中之「與由序列編號2所示之鹼基序列所 構成之DNA在嚴苛條件下進行雜合的DNA」之例，係指在 322941 12 201137125 「選殖與定序（cloning and sequence)」（渡邊格監修，杉 浦昌弘編集’ 1989年，農村文化社發行）、「M〇iecLllar

Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons (1987-1997)) 專所載之南方雜合法（Southern hybridization)中，（1) 在高離子濃度下[可舉例如6xSSC(9〇〇mM之氣化鈉、9〇mM 之擰檬酸鈉）]於65°C下進行雜合，而由編碼序列編號1所 示的胺基酸序列之鹼基序列所構成之DNA ;或是與由序列 編號2所示之鹼基序列所構成之dna形成DNA-DNA雜合， 並且（2)在低離子濃度下[可舉例如〇. lxSSC(15mM之氣化 鈉、1.5mM之檸檬酸鈉）]於65〇c下保溫3〇分鐘後亦可維持 該雜合之DNA。 具體之例，可列舉如：由編碼序列編號1所示的胺基 酸序列之鹼基序列所構成之DNA ;或在由序列編號2所示 之鹼基序列所構成之DNA中，由缺失、取代或加成一部份 驗基之鹼基序列所構成之DNA ;與由編碼序列編號1所示 的胺基酸序列之鹼基序列所構成之DNA的序列相同性為 80%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上之DNA 等。此等DNA’可為從自然界中存在之MA中所選殖之dna， 亦可為在該等選殖之DNA鹼基序列中以人工方式導入部份 之驗基缺失、取代或加成的DNA，或人工合成之DNA。 在序列編號2所示之鹼基序列中缺失、取代或加成1 個或複數個鹼基之鹼基序列，可例舉如：（i)在序列編號2 13 322941 201137125 所示之鹼基序列中，缺失1至10個（例如1至5個，以1 至3個更佳，以1至2個又更佳）鹼基之鹼基序列；（ii) 序列編號2所示之鹼基序列中之1至10個（例如1至5個， 以1至3個更佳，以1至2個又更佳）鹼基經其他鹼基取代 之鹼基序列；（iii)在序列編號2所示之鹼基序列中加成1 至10個（例如1至5個，以1至3個更佳，以1至2個又 更佳）鹼基之鹼基序列；或（iv)將上述（i)至（iii)予以組合 之鹼基序列。 具有在序列編號2所示之鹼基序列中有1個或複數個 核酸發生缺失、取代或加成等變異之鹼基序列的聚核苷 酸，可依照「Molecular Cloning, A Laboratory Manual， 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))、「GinTent Protocols in Molecular Biology」 (John Wi ley & Sons (1987-1997)) ' Kunkel (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-92 ' Kunkel (1988), Method Enzymol.，85: 2763-6等所載之位置專一性誘發 突變法等方法而製備。 此外，欲在聚核苷酸中導入變異時，可依據Kunkel 法及Gapped dup 1 ex法等一般已知之方法，以利用位置專 一性誘發突變法之導入變異用套組，例如QuikChangeTM Si te-Directed Mutagenesis Ki t(Stratagene 公司製造）、 Gene TailorTM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen 公司製造）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K ' Mutan-Super Express Km 14 322941 201137125 等：TaKaRaBio公司製造）等而進行操作。 本聚核苷酸可如下製備。 R312 屬 由紅球菌屬R312)(短桿菌屬 (方厂/.£//» R312)(CBS 717-73))等屬於紅球g 之微生物等，依照一般基因工程之方去（如 「新細胞工學實驗協定」（東京大學醫科學研究所制_ 究部編’秀潤社’ 1993年）中所載之方法）製備DM基因庫 (DNA library) ’再以該製備成之DNA基因庫作為模版 (template)，並以適當之引子（primer)進行pcr，而製備· 由編碼序列編號1所不的胺基酸序列之驗基序列所構成之 DNA ’由編碼在序列編號1所示的胺基酸序列中缺失、取代 或加成1個或複數個胺基酸之胺基酸序列之鹼基序列所構 成之DM，及/或將具有序列編號2所示之鹼基序列的dna 等予以擴增（amplification)而製備成本聚核苷酸之dna。 此外，使用以前述DM基因庫為模版且含有序列編號 3所示之鹼基序列之寡核苷酸、與含有序列編號4所示之 鹼基序列之寡核苷酸作為引子進行PCR，即可將由序列編 號2所示之驗基序列所構成之DNA予以擴增，而製備本聚 核苷酸之DNA。 該PCR之條件，可列舉如：將以4種之dNTp各2〇βΜ、 2種之券核苦酸引子各15pm〇i、1. 3U之Taqpolymerase與 作為模版之cDNA基因庫予以混合而製成反應液，將該反應 液在97°C (2分鐘）下加熱後，以97。(：（〇. 25分鐘）-50°C (0. 5 分鐘）-72°C(l. 5分鐘）之循環操作10次，其次以97〇c(〇 25 15 322941 201137125 分鐘）-55°C (0.5分鐘）-72 C (2. 5分鐘）之循環操作20次， 再於72°C下維持7分鐘之條件。 又’該PCR中所使用之引子之5’末端亦可加成限制崎 辨識序列等。 具有編碼序列編號1所不的胺基酸序列之驗基序列之 寡核苷酸，亦可依據將序列編號1所示的胺基酸序列所相 對應之forward引子與reverse引子以各切成約40bp長之 狀態而合成，再使此等引子群以互相連接之方法（Assembly PCR法）合成。 即使是將以前述之DNA基因庫為模版並含有選自編碼 序列編號1所示的胺基酸序列之驗基序列中之部份驗基序 列的寡核苷酸等（例如由編碼序列編號1所示的胺基酸序 列之5’末端侧之約14個鹼基左右以上之鹼基序列所構成 之寡核苷酸）、以及由與建構DNA基因庫時所使用之載體之 DNA插入部位附近之鹼基序列為互補的鹼基序列所構成之 約14個鹼基左右之以上之寡核苷酸’作為引子使用而進行 PCR ’亦可將含有編碼序列編號1所示的胺基酸序列之驗基 序列之DNA、及編碼在序列編號1所示的胺基酸序列中缺 失、取代或加成1個或複數個胺基酸之胺基酸序列之驗基 序列之DNA等予以擴增，而製備本聚核苷酸之DNA。 如上述·ί呆作而擴增之DNA，可依照「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition」（1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」 （1987), John Wiley & Sons Inc.， 16 322941 201137125 ISBNO-471-50338-X等所載之方法選殖至載體而獲得基因 重組載體（recombinant vector)。其中使用之載體’具體 例可列舉如pUCl 19(寶酒造公司製造）、pTVl 18N(寶酒造公 司製造）、卩811163(：14口1:11(東洋紡公司製造）、？〇尺2.1-1'0?0 (Invitrogen 公司製造）、pTrc99A(Pharmacia 公司製造）、 pKK223-3(Pharmacia 公司製造）等。 此外，亦可藉由在經插入源自微生物或嗟菌體（phage) 之載體中之DNA基因庫，將由具有從編碼序列編號1所示 的胺基酸序列之驗基序列中選出之部份驗基序列的約15 個鹼基序列左右以上之鹼基序列所構成之DNA作為探針 (probe)，以後述之條件進行雜合，篩選該探針會專一地結 合之DNA，而製備本聚核苷酸之DNA。 在染色體DNA或DNA基因庫中使探針進行雜合之方 法’可舉例如菌落雜合法（colony hybridization)及溶菌 斑雜合法（plaque hybridization)，並可依照基因庫之製 作所使用之載體之種類而選擇方法。 當使用之DNA基因庫係使用質體載體（plasmid vector)而製作時，以利用菌落雜合法為佳。具體而言，係 藉由將基因庫之DNA導入宿主微生物中而製備轉形體，並' 將所得之轉形體稀釋後，將該稀釋物塗佈在洋菜培養基 上，培養至菌落出現為止。 當使用之基因庫係使㈣g體載體而製作時，以利用 溶菌斑雜合法為佳。具體而言’係將宿主微生物與基因庫 之嗟菌體在可感染之條件下齡，並將其與軟洋菜培養基 322941 17 201137125 混合後，再將該混合物塗佈在洋菜培養基上，培養至溶菌 斑出現為止。 其次，在使用任一雜合法時，均係在前述進行培養之 洋菜培養基上置放薄膜，使轉形體或噬菌體吸附/轉印至該 薄膜。該薄膜經鹼處理後，再進行中和處理，其次再進行 將DNA固定在該薄膜之處理。更具體而言，例如在使用溶 菌斑雜合法時，係在前述洋菜培養基上置放硝化纖維素膜 或尼龍膜（例如Hybond-N+(Amersham公司註冊商標）），放 置約1分鐘而使嗟菌體粒子吸附/轉印至薄膜。之後，將該 薄膜於驗溶液（例如1· 5M氣化鈉、0. 5M氫氧化鈉）中浸潰 約3分鐘，使噬菌體粒子溶解’以使噬菌體DNA溶出在該 薄膜上後’於中和溶液（例如1. 5M氯化納、〇.5M Tris-鹽 酸緩衝溶液ρΗ7· 5)中浸潰約5分鐘。其次將該薄膜以洗淨 液（例如0· 3Μ氯化鈉、30mM擰檬酸、0. 2 M Tris-鹽酸緩 衝溶液pH7. 5)洗淨約5分鐘後，於約80°C加熱約90分鐘， 使噬菌體DNA固定在該薄膜。 使用如此製備之薄膜’以上述DM為探針而進行雜 合。雜合可依據 J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis 著「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd edition (1989)」Cold Spring Harbor Laboratory Press 等之記 載而進行。 探針所使用之ΜΑ，可為經放射線同位素所標識者、 或經螢光色素所標識者。 將探針所使用之DNA以放射線同位素標識之方法，可 18 322941 201137125 列舉如利用Random Primer Labeling Kit(寶酒造公司製 造）等，將PCR反應液中之dCTP以（a-32p)dCTP取代，並 將探針所使用之DNA作為模版而進行PCR之方法。 此外，將探針所使用之DNA以螢光色素標識時，可利 用如 Amersham 公司製造之 ECL Direct Nuclear Acid Labeling and Detection System 等。 雜合可如下進行。 準備含有450至900mM之氣化鈉及45至90mM之擰檬 酸鈉、並以濃度0. 1至1.0重量％含有十二碳烷基硫酸鈉 (SDS)、且以濃度0至200 V Ι/mL含有已變性之非專一性 DNA、依情形可再各以濃度0至0.2重量％含有白蛋白 (albumin)、Ficoll、聚乙稀°比°各咬酮等的前雜合溶液 (prehybridization solution)(較佳係含有 900mM 之氯化 鈉、90mM之擰檬酸鈉、1· 0重量％之SDS及100/z Ι/mL之變 性Calf-thymus DNA的前雜合溶液）’使其相對於如上述操 作而製備之薄膜每lcm2，為50至200 // 1之比例，然後在 該前雜合液中浸潰前述薄膜，並在42至65°C保溫1至4 小時。

其次，準備含有450至900mM之氯化鈉及45至90mM 之檸檬酸鈉、並以濃度0·1至1.0重量％含有SDS、且以濃 度0至200 /z g/mL含有已變性之非專一性DNA、依情形可 再各以濃度0至0.2重量％含有白蛋白、Ficoll、聚乙稀吡 B各咬酮等的雜合溶液（hybridization solution)(較佳係 含有900mM之氯化鈉、90mM之檸檬酸鈉、1. 0重量％之SDS 19 322941 201137125 及10 0 // g/mL之變性Ca 1 f - thymus DNA的雜合溶液）與以如 上述方法製付之探針（相對於每lcm2薄膜，為相當於 1. Oxl04至2. Oxl05cpm之量）混合的溶液，使其相對於每 lcm薄膜而為50至200 /z 1之比例’然後在該雜合溶液中 浸潰並在42至65°C保溫12至20小時。 在該雜合後，取出薄膜，並以含有15至300mM之氣 化鈉、1· 5至30mM之檸檬酸鈉及〇. 1至丨.〇重量％之SDS 等的42至65°C之洗淨液（較佳係含有i5mM之氣化鈉、 1. 5mM之檸檬酸鈉及1. 0重量％之SDS的65°C之洗淨液）等 洗淨。該經洗淨之薄膜再以2xSSC(300 mM之氣化鈉、30mM 之擰檬酸鈉）輕緩沖洗後’加以乾燥。將該薄膜供於例如自 動放射攝影術（autoradiography)等’藉由檢測該薄膜上之 探針之位置’而在原先之洋菜培養基上辨識出相當於與所 用之探針進行雜合之DNA之在薄膜上之位置的選殖體 (clone)，藉由將其取菌，即分離含有該DNA之選殖體。 將如此操作而得到之選殖體經培養後，即可由培養之 菌體製備本聚核苷酸。 若欲使本聚核苷酸在宿主細胞中表現，例如將由在宿 主細胞中可表現機能之啟動子（promoter)與本聚核苷酸以 可表現機能之形態而連接成之DNA導入宿主細胞中。 其中之「可表現機能之形態」，意指將該DNA導入宿 主細胞中而使宿主細胞轉形時，本聚核苷酸係在啟動子之 調控下以會表現之方式與啟動子連接的狀態。其中之啟動 子，可列舉如大腸菌之乳糖操縱子（lactose operon)之 20 322941 201137125 啟動子、大腸菌之色胺酸操縱子（Tryptophan operon)之 啟動子、或he啟動子、ire啟動子等經獨自改變/設 計而可在大腸菌内表現機能之合成啟動子等。此外，可列 舉如源自λ-噬菌體之/^啟動子及乃？啟動子、源自枯草 菌之葡萄糖酸合成酶啟動子（洲ί)、鹼性蛋白酶啟動子 (apr)、中性蛋白酶啟動子（即r)、殿粉酶啟動子（a耶） 專°此外’在紅球菌屬R312等中亦可使用 調控本聚核苷酸表現之啟動子。 一般而言，與在宿主細胞中可表現機能之啟動子以可 表現機能之形態連接而成之DM，可依照「Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition」(1989)， Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」 （1987)， John Wiley &

Sons Inc.，ISBNO-471-50338-X等所載之方法選殖在載體 而製備基因重組載體。 其中使用之載體，只要為可保持本聚核苦酸，且可進 行複製（例如包含在宿主細胞中為了使質體增殖而需要之 DNA序列、啟動子、核糖體（ribosome)結合序列、轉錄終 止子（transcription terminator)(轉錄終止序列）、選擇 性標識基因）者即可’並無特別之限定，可使用適合各宿主 之載體。可舉例如質體DNA、噬菌體等。 質體DNA之例，可列舉如源自大腸菌之質體（pBR322、 pUC18、pUC19、pUC118、pUC119(寶酒造公司製造）、 pTV118N(寶酒造公司製造）、卩81此3(：14卩1；11(東洋紡公司製 322941 21 201137125 造）、pCR2. l-T0P0(Invitrogen 公司製造）、pTrc99A (Pharmacia 公司製造）、pKK223-3(Pharmacia 公司製造） 等ColE系質體等）、源自放線菌之質體（PIJ486等）、源自 酵母菌之質體（YEpl3、YEp24、Ycp50等）。噬菌體DNA之 例可列舉如 λ _嗟菌體（Charon4A、Charon21A、EMBL3、 EMBL4、AgtlO、Agtll等）、反轉錄轉位子 (retrotransposon)DNA、人工染色體 DNA 等。 當載體係使用含有選擇性標識基因（例如二氫葉酸還 原酶基因、及康黴素（kanamycin)财性基因、安比西林 (ampicillin)耐性基因、新黴素（neomycin)耐性基因、殺 稻疲菌素（blasticidin)耐性基因等賦予抗生物質耐性之 基因等）之載體時，導入該載體之轉形體可將該選擇性標識 基因之表現型等作為指標而進行篩選。此外，核糖體結合 序列係以SD序列及Kozak序列為已知者，可將此等序列插 入變異基因之上游。在使用原核生物作為宿主時可將SD 序列藉由PCR法等予以加成，在使用真核生物作為宿主時 可將Kozak序列藉由PCR法等予以加成。SD序列可例舉如 源自大腸菌、源自紅球菌屬（及//Oi/CPCOCCiAS)細菌或枯草菌之 序列等’但只要為可在期望之宿主内表現機能之序列即 可，並無特別之限定。可藉由DNA合成而製作由與16S核 糖體RNA之3,末端區域為互補之序列之4個鹼基以上所連 續接成之共有序列（consensus sequence)，並利用談共有 序列。轉錄終止序列未必為必須者，可使用p因子非依存 性者’例如脂蛋白（Hp〇pr〇tein)終止子、的操縱子終止 322941 22 201137125 子等。 +右奴在此等載體中插人本聚核苷酸，則可將含有本聚 ^苷mM以適當之限制酶切斷，再依照需要而加成適 田之連，序？Klinker)後，與經適當之限制酶切斷之載體 連接藉此而進仃之。此外，亦可將含有本聚核苦酸之DNA 使用含有適當之限制酶辨識序列之引子進行 PCR擴增，該 擴&產物再經限制酶處理後，使其與經適當之限制酶切斷 之载體連接，藉此而進行之。 將與在宿主細胞中可表現機能之啟動子以可表現機 能之形態連接之本聚核㈣或保有該本聚核魏之基因重 組載體等導入宿主細胞之方法，只要為因應所使用之宿主 、’’田胞且叙可用之導入方法即可，可舉例如「Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition」 （1989)，

Cold Spring Harbor Laboratory Press ' rCurrent

Protocols in Molecular Biology」（1987)，John Wiley & Sons Inc.，ISBNO-471-50338-X等所載之氣化鈣法、及在 「Methods in Electroporation: Gene Pulser/ £ co// Pulser System」Bio-Rad Laboratories, (1993)等所載之 電穿孔法（electroporation)等。 在此，「宿主細胞」可列舉如大腸菌（具體例為K12株、 B 株、JM109 株、XLl-Blue 株、C600 株、W3110 株）、枯草 菌、酵母菌、真菌、紅球菌屬細菌等微生物。其中，較佳 者可列舉如屬於大腸桿菌屬（尤、芽抱桿菌屬 (方ac/y/i/s)、棒狀短桿菌屬（化、葡萄球菌 23 322941 201137125 屬（Siap/z/iococci/s)、鏈黴菌屬（Sirepio/zzyees1)、酵母菌 屬（Saccharo/nyces)(具體例為 °年酒酵母菌（Saccharo/nyces cerevisiae))、裂造酵母菌餍（Schizosaccharomyces)(具 體例為粟酒裂瘦酵母菌（po/z7々e))、 畢赤酵母菌屬（戶/c/?ya)(具體例為巴斯德畢赤酵母菌 (Pichia pastoris))、先魯緣酵母菌餍 UUuyvero/nyces)、 麴菌屬（yi / 7 i/s)及紅球菌屬（(具體例 為皮塊江珠菌（Rhodococcus rhodochrous) MCC Ί26Ί4： 株、玫瑰紅球菌J-1 株（FERM BP-1478)之微生物等。 其次，使本轉形體之培養物作用於化合物（2)。可藉 由分析反應生成物中之5-(胺基甲基）-2-氣噻唑之量，而 確認所得之DNA已編碼具有該能力之酵素之胺基酸序列。 此外，DNA之鹼基序列可以一般慣用之方法決定其序 列，藉此而進行確認。例如，可藉由二去氧核苷酸鏈鏈終 止法（dideoxynucleotide chain termination method)(參 考例如 F. Sanger, S. Nicklen，A. R. Coulson 著， Proceeding of National Academy of Science U. S.A. (1977)，74: 5463-5467頁）等進行解析。鹼基序列分析用 之試樣之製備，亦可使用Perkin Elmer公司之ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 等市售之試劑。此外，亦可利用適當之DNA定序器（DNA sequencer)解析鹼基序列。 將前述表現載體導入宿主細胞中之方法，只要為可將 24 322941 201137125 DNA導入之方法即可，並無特別之限定。可列舉如使用舞 離子之方法、電穿孔法等。 對大腸菌導入表現載體之方法，可列舉如使用熱休克 (heat shock)之方法，此時亦可使用預先製備之勝任細胞 (competent cell)。對酵母菌導入表現載體之方法，只要 為可將DNA導入酵母菌之方法即可，並無特別之限定，可 列舉如電穿孔法、原生質球狀體（spheroplast)法、乙酸鐘 法等。 若欲篩選與在宿主細胞中可表現機能之啟動子以可 表現機能之形態連接之本聚核苷酸、或經導入保有該本聚 核苷酸之基因重組載體等的轉形體，則可將前述包含在載 體中之選擇性標識基因之表現型作為指標而進行筛選。 在該轉形體中保有本聚核苷酸時，可依照「Mo 1 ecu 1 ar Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition」（1989)， Cold Spring Harbor Laboratory Press 等所載之一般方 法’進行限制酶部位之確認、鹼基序列之解析、南方雜合、 西方雜合（Western hybridization)等而予以確認。 將如此製備之表現載體導入宿主細胞中，即可得到高 度表現本酵素之轉形體。藉由培養該轉形體，即可表現本 酵素。 其次’再說明本轉形體之培養之製備方法。 本轉形體可使用適當地含有碳源、氮源、有機鹽、無 機鹽等之用以培養各種微生物之培養基而進行培養。 碳源可例舉如葡萄糖、糊精、蔗糖等糖類，甘油等醣 25 322941 201137125 醇’反丁稀二酸、檸檬酸、丙酮酸等有機酸，動物油、植 物油及糖蜜。此荨碳源在培養基中之添加量，相對於培養 液一般係 0. l%(w/v)至 30%(w/v)左右。 氮源可例舉如肉萃取物、蛋白腺（pept〇ne)、酵母萃取 物、麥芽萃取物、大豆粉、玉米浸液（Corn Steep Liquor)、 綿籽粉、乾燥酵母、酿蛋白胺基酸（casam i no ac i d)等天然 有機氮源，胺基酸類、頌酸納等無機酸之銨鹽，氣化錢、 硫酸銨、磷酸銨等無機酸之銨鹽，反丁烯二酸銨、檸檬酸 銨等有機酸之銨鹽及尿素。其中之有機酸之敍鹽、天然有 機氮源、胺基酸類等係在許多情形下亦可作為碳源使用。 此等氮源在培養基中之添加量，相對於培養液一般係〇. (w/v)至 30%(w/v)左右。 有機鹽及無機鹽可例舉如鉀、鈉、鎂、鐵、錳、銘、 鋅等之氣化物，硫酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽及填酸鹽。其具 體之例可列舉如氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫 酸猛、氣化姑、硫酸鋅、硫酸銅、乙酸鈉、碳酸詞、礙酸 氫一卸及磷酸氫二鉀。此等有機鹽及/或無機鹽在培養基中 之添加量’相對於培養液一般係0.0001%(w/v)至5%(w/v) 左右。 在培養經導入由作為啟動子之誘導性啟動子與本聚 核苷酸以可表現機能之形態連接而成之DNA的轉形體時， 可依照需要而在培養基中加入誘導物（inducer)。例如在培 養經導入由鈷c啟動子、ire啟動子及/ac啟動子等被異 乳糖（allolactose)誘導之類型之啟動子與本聚核苦酸以 322941 26 201137125 可表現機能之形態連接而成之廳的轉频時，亦可在培 養基中添加少量之異丙基硫化十D-半乳糖苦（isopropyl thi〇-yS-D-galactoside，IpTG)，以作為用於誘導產生本 酵素之誘導劑。此外，在培養經導入由的啟動子等被巧 嗓乙酸（IAA)誘導之類型之啟動子與本聚核荅酸以可表現 機能之形態連接而成之DNA的轉形體時，亦可在培養基中 添加少量之IAA，以作為用於誘導產生本酵素之誘導 培養方法可列舉如固體培養、液體培養（試管培養、 燒航培養、缸式醱酵槽（jar fermenter)培養等）。 培養溫度及培養液之pH，只要在本轉形體可生長之 範圍即可’並無特別之限定，可列舉如培養溫度為約吹 至約45°C，更好是10t至約3rc之範圍；培養液之pH為 約4至約8之範圍。培養時間可依照培養條件適當選擇， 惟一般為約1日至約7日。並且，屬於紅球菌屬 (必〇而⑺“仍）之微生物之較佳之培養操作，可於4充至祁 °C，更好是20°C至30°C進行18小時至96小時。 本轉形體之培養物，可直接作為本發明之製造方法之 催化劑使用。使用本轉形體之培養物之方法中，關於直接 使用本轉形體之g體之方法’可列舉如⑴直接❹培養液 之方法、（2)使用將培養液經離心分離等而回收之菌體（依 照需要，使用經緩衝液或水洗淨後之濕菌體）之方法等。 本發明之製造方法之催化劑’亦可使用本轉形體的培 養物之處理物。該處理物可列舉如：將培養而得之菌體^ 經有機溶劑（丙酮、乙醇等）處理者、經冷凍乾燥處理者或 322941 27 201137125 經驗處理者、或是將菌體經物理性或酵素性破碎處理者、 或從此等巾經分離/萃取而得之粗酵料。並且，前述處理 物中，亦包含經前述處理後再以—般所知之方法進行固定 化處理者。 由本轉形體之培養物精製本酵素之方法，可使用一般 蛋白質之精製中所使用之方法。可列舉如以下之方法。 首先，從本轉形體之培養物以離心分離等而收集菌體 後’將其以超音波處理、微粉碎機（DynQ_mi⑴處理、法式 壓碎機（French Press)處理等物理性破碎法或是以使用界 面活性劑或溶_(lysGzyme)等耗酵素之化學性破碎法 等進灯破碎。從所得之破碎液巾經離^分離、過滤膜過遽 等而去除其中之雜質，製備成無細胞萃取液，將其適當地 使用陽離子交換層析法、陰離子交換層析法、疏水性層析 法、膠體過濾層析法、或金屬螯合層析法等分離精製方法 區分，即可精製本酵素。 層析中所使用之擔體，可例舉如經導入缓曱基（Cj^)、 二乙基胺基乙基（DEAE)、笨基或丁基之纖維素、糊精或洋 菜糖（agarose)等不溶性高分子擔體。亦可使用市售之已充 填擔體之管柱，該市售之已充填擔體之管柱可舉例如 Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP(商品名，均為

Amersham Pharmacia Biotech 公司製造）、TSK-gel G3000SW(商品名，東曹公司製造）等。 此外’若欲篩選含有本酵素之區分（fracti〇n)，可根 據本發明中之「將式（2)所示之N-胺甲醯基胺基化合物轉 28 322941 201137125 換為相對應之5-(胺基曱基)+氣噻唑之能力」之存在盥 否或其程度而進行篩選。 、 其具體之形態，可列舉如本轉形體之培養物、該培養 物之處理物（例如無細胞萃取液、粗精製蛋白質、精製蛋白 質及此等之ϋ定化物等）。在此，培養物之處理物可列舉如 冷柬乾燥微生物、有機溶劑處理微生物、乾燥微生物、微 生物磨碎物、极生物之自溶物（嫩Qlysate)、微生物之超 音波處理物、微生物萃取物或微生物之驗處理物。又，製 備固定化物之方法，可例舉如擔體結合法（使本酵素等吸附 於矽膠及陶竞等無機擔體、纖維素、離子交換樹脂等之方 法）及捕獲（entrapment)法（將本酵素等關在聚丙烯醯胺、 含硫多醣膠體（例如紅藻膠膠體（carrageenan ge丨））、褐藻 酸膠體、洋采膠體（agar gel)荨馬分子之網狀構造中之方 法）〇 在考慮使用本轉形體之工業生產性時，相較於使用未 處理狀態之微生物之方法，以使用將該微生物經滅絕化之 處理物之方法在製造設備之限制等方面上有較佳的情況。 用於此處之滅菌化處理方法，可列舉如物理性殺菌法（加 熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、過濾、通電）、及使用化 學藥品之殺菌法（鹼、酸、鹵素、氧化劑、硫、硼、砷、金 屬、醇、紛、胺U物、醚n同、氰、抗生素）。一 般而言，以選擇此等殺菌法中儘可能使本酵素之前述「將 式（2)所示之N-胺f醢基胺基化合物轉換為相對應之 5-(胺基甲基）-2-氟"塞唑之能力」不致失活，且對反應系之 322941 29 201137125 殘留、污染等影響少之處理方 以下再更具體地說明。 ~ 1.培養物之處理物（其之” 若欲從本轉形體之培表 缺 養物中回收菌體，可使用離心分 離法和膜過慮法。離心分離^ "nn“ _ 。 無特別之限定，可在例如 3, 000 至 4, 500xg、5 至 2〇 公拉,0 刀產里、4 C之條件進行。可將戶斤 回收之本轉形體依照需要㈣ 千射 ^ 4〇 ，馱鈉綾衝液、磷酸緩衝液等 洗淨’懸〉”以如物作即製備g體懸浮液。 菌體之破碎方法，可則 和均質機進行之高壓處理L “ ^ 乂破璃珠專進行之磨碎處理、 使用溶菌酶、纖維素酶、果賑疏垃 ^ ^ 禾膠轉等之酵素處理、凍結融解 處理、低滲透壓溶液處理、Μ菌體進行之誘導溶菌處理 等。破碎處理係錢需要而在冰冷卻下進行。例如，可將 菌體懸浮液使用超音波破，，15咖心公司，日 本），並以輸出功率調整旋鈕4、DUTY ααΕ 4〇%、pULS、 TIMER=B模式10s之條件在冰冷卻下進行破碎丨至5分鐘， 更好是3分鐘。此外，亦可將菌體懸浮液在1〇〇MPa之加壓 條件下以NiroSoavi公司製造之均質機pMDA2K型進行破 碎0 進行破碎後，從本轉形體之破碎物中，可依照需要而 去除菌體之破碎殘渣。去除殘渣之方法可舉例如離心分離 及過濾等。亦可依照需要而使用凝集劑及過濾輔助劑等以 提高去除殘渣之效率。離心分離並無特別之限定，可在例 如4,000至25，Q00xg、3至45分鐘、4°C之條件下進行。 30 322941 201137125 以如此操作即可從破碎物中去除殘渣。 2.培養物之處理物（其之2) 、可藉由將㈣本轉雜之破碎物及無細胞萃取液予 處理’使本酵素以外之多數蛋白質變性。因此，即 :精由將本轉形體之破碎物或無細胞萃取料以加熱處 ^而以可溶性區分之形式獲得本酵素液。本酵素中包 έ如上述所獲得之本酵素液。 ,、 在此，「加熱處理」係指為了使源自本轉形體之本酵 =以外之蛋白質進行變性所進行之加熱失活操作該加熱 处理之溫度較佳為阶以上饥以下，更好是·以上 C以下。加熱處理之時間並無特別之限定，惟以使本轉 形體之破碎物及無細料取液錢狀溫錢歷經1〇分 ‘里以上為佳。以歷經1小時以上5小時以下更佳。 <例如T藉由將本轉形體之破碎物等置人試管中，於 叹定為預疋/皿度之水洛（water bath)中培養預定時間，而 2行加熱處理。此外’亦可在时溫度計之三口燒瓶中將 轉形體之破碎物等置人，加熱至預定溫度後，再以預定 時間進行加熱處理。 外本發明令，亦可在將本轉形體之破碎物加熱處 里（則加熱）後’去除破碎缝’織再次進行加熱處理。 再加熱時，亦可存在有辞鹽。 去除由加域理所產生之秘性物之方法 ，可列舉如 離。刀離及，’慮等，亦可依照需要而使用凝集劑及過滤輔 _等以提同其去除效率。必要時，亦可再使用各種層析 31 322941 201137125 法等（膠體過濾、 精製。 離子交換層析法、親和層析法等）進一步 本毛明之製造方法—般係在水存在下進行。該情形下 之水’亦可為緩衝液之形態。該緩衝液中所使用之緩衝劑， 可列舉如嶙@_、魏钾料酸之驗金屬鹽，乙酸納、乙 酸鉀等乙酸之鹼金屬鹽等。 本發明之製造方法，亦可更進-步使用疏水性有機溶 ，並在水與疏水性有機_之存在下進行。此時所使用 之，水性有機溶劑，可列舉如甲酸乙自旨、乙酸乙酯、乙酸 丙酉曰i乙酉夂丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯類，正丁醇、 正戊醇4辛料_，苯、甲苯、二甲苯料族煙類， 土ϋ _異丙基醚、甲基第三丁基驗等趟類，氣仿、 i’2-二氯乙烷等齒化烴類及此等之混合物。 力本發明之製造方法亦可更進一步使用親水性有機溶 /並在水與水性媒質之存在下進行。此時所使用之親水 財機溶劑，可解如甲醇、乙醇㈣類，丙酮等酮類’ - T氧基乙燒、四氫β比喃、二嘴燒物類，二甲基亞石風及 此等之混合物。 本發明之製造方法-般係在水層之邱為3至1〇之 圍内進行，惟村在反應會進行之軸㈣當地變化。 本^之製造方法-般係在約代至約阶之範圍1 仃 Φ可在反應會進行之範圍内適當地變化。 2明之製造方法—般係在約Q 5小時至約㈣之 圍内進行。關於反應之終點，可藉由在作為原料化合物 322941 32 201137125 之式（2)所示之N-胺甲醯基胺基化合物（即 加終了後，將反應液中之該式（2)所示之恥胺^ ^ =臭 化合::量以液相層析法、氣相層析法等進行測定而二 本發明之製造方法中，作為原料化合物之式 之N-胺曱酿基胺基化合物（即化合物（2))之 示 _雜下，為了使反應系中之該式⑵所:之 1胺基化合物之濃度保持大致—定，亦可將該式⑵心 基胺基化合物（即化合物（2))連續或逐次添加 本發明之製造方法中，亦可依照需 加如葡萄糖、蔗糖、果糖等糖類，或Tri 添 60等界面活性劑等。 以]〇〇或Tween 可依照一般 從反應液回收5-(胺基甲基）-2-氣噻唑 所知之任意方法進行。 。例如，可列舉如將反應液之有機溶劑萃取操作、濃縮 操作等後處理’依照需要而與管柱層析法、聽等组合， 並進行精製之方法。 、口 其具體例較佳可列舉如在反應液中加入鹽酸等無機 酉文，以5-(胺基曱基）_2_氯噻唑之無機酸鹽的形式進行結 晶精製之方法。 本發月之製方法，亦可再包含下述步驟做為前步 驟·作為原料化合物之式（2)所示之N-胺曱醯基胺基化合 物（即化合物（2))之製造步驟。 此前步驟係包含下述步驟： 33 322941 201137125 對於式（1)所示之異尿素化合物（以下亦稱為化合物（1))，

NH c^y^»x〇R ⑴ [式中’ R表示直鏈狀或環狀之烷基，該烷基亦可具有取代 基’該烧基之碳原子數為1至6] 使具有將該異尿素化合物轉換為相對應之N-胺甲醢基胺 基化合物的能力之酵素（以下亦稱為前步驟酵素）或具有產 生該酵素之能力之微生物（以下亦稱為前步驟微生物）之培 養物或其處理物進行作用，而獲得式（2)所示之N-胺曱醯 基胺基化合物之步驟。 （2) 在此’化合物（丨）中之「直鏈狀或環狀之烷基」可例 舉如甲基、乙基、正丙基或正丁基等直鏈狀烷基，或例如 環戊基或環己基等環狀絲等。該烧基亦可具有取代基， «亥取代基可列舉如碳原子數！至4左右之直鏈狀烧基、齒 素原子、或域子數1至4左右之直鏈狀烧氧基等，具有 取代基之（直鏈狀或環狀）縣可例舉如異丙基或第三丁基 ，狀烷基，如氟化甲基、氣化甲基、三氟甲基、或三 氯甲基等i化燒基，或如甲氧甲基料氧基烧基等。 R以曱基或乙基等較佳。 刖述之則步驟中’所使用之作為催化劑之酵素或具有 34 322941 201137125 產生該酵素之能力之微生物的培養物或其處理物，係具有 將化合物（1)轉換為化合物（2)之能力者。具有該能力之微 生物（即前步驟微生物）可例舉如由假單孢菌屬 {Pseudomonas)及募秦單胞镜凰（Stenotrophomonas)所成 群組中選出之1種以上之微生物。 此外’具有此能力之微生物（即前步驟微生物），可列 舉如由下述微生物群C中選出之1種以上之微生物。 <微生物群C> 猶他游動故線菌（Acti’nopianes uta/wnsi’s)、液化產氣單 版菌 iAeromonas liquefaciens)、節稈遠慝{Arthrobacter 印.）、出芽短梗黴（74£//*己0如1^(//膽/?[///^/73/715)、短芽抱桿 議{Bacillus brevis)、表田簧抱得儀{Bacillus moritai)、 土生隱球酵母菌（iocacci/s Z?£//z/ycoiwsO、馬克斯克魯 維酵母菌、迪爾諾弗分枝桿菌 (Mycobacterium diernfioferi)、異常畢赤酵母菌（Pichia anomala)、美常辱赤酵母镜（Pjchia anomala)、惡臭假草 胞菌（Pseudomonas putida)、稻草假單胞菌（J^eudomonas stramnea)、鱼營假故始儀（Pseudonocardia autotrophica)、紅球WiMi(RIioclococcus sp.)、硝基還原 暮秦專紙魯 iStenotrophomonas nitritireducens)、气板 暮秦專版潘{Stenotrophomonas rhizophila)、暮秦隼版壤 MiQStenotrophomonas sv·)、肉質逯数蛰iStreptomyces carnosus)、緣抱酵母儀（Trichosporon aquatile)。 再者，具有此能力之較佳微生物，可列舉如由下述微 35 322941 201137125 生物群D中選出之1種以上之微生物。 <微生物群D> 猶他游動放線菌i/ia/7e/7sy>s)IFO 13244t、 液化產氣單胞菌（deri通ο/73·5 /IF0 12978、節 桿菌屬sp. )ATCC 27778、出芽短梗黴 6353、短芽抱桿菌 (方ac/"£AS 3331、森田芽抱桿菌（方ac/"£/5 Λ7〇τj ia/) ATCC 212 8 2、土 生隱球酵母菌（f/y/? iococci/s /?⑽yco/wsMFO 1527、馬克斯克魯維酵母菌 IF0 0541、迪爾諾弗分枝桿菌 (Mycobacterium diernhoferi)\?Q 3Ί(Π、異常畢赤铸母嵐 (/7c/?/a a;?c>則/a)IF0 0963、異常畢赤酵母菌（/Vc/zia 3卯膨/a) IF0 1181、惡臭假單胞菌（s ρί/ί/办） ΙΑΜ 1002、惡臭假單胞菌（户pwi/i/a)IF0 14671、 惡臭假單胞菌（卯/755洲iii/a) IFO 14 79 6、惡臭假 單胞菌（户sei/i/o历σ/735 pi/i/da) JCM 6156、惡臭假單胞菌 (pi/ί』·ί/a) JCM 6157、稻草假單胞菌 (si/*a/z//72ea)JCM 2783t、自營假放射菌 (aί/ίο ί/τ>/?Λ/ ca) IF0 12 74 3T、紅球菌屬 (处c^ococcws sp. )ATCC 19148、石肖基還原寡養單胞菌 (5Ye/7〇i/O；?/7iM〇/7as77/iW"rei/i/ce/75)JCM 13311、嗜根寡 養單胞菌（Stenotrophoinonas rhizophila)]CM Ί3333、暮 養單胞菌屬（iSYe/Joi/Op/io/z/cwas sp. )SC-1 (FERM-BP 10785)、 肉質鍵黴菌（Sirepio/z/yces camosi/sMFO 13025t、及絲抱 36 322941 201137125 酵母菌（Tri’chosporon aquatiie) nCC 2231Q。 此等菌株可由天然分離，亦可容易地由各菌種保存機 構購得。此外，寡養單胞菌屬（trop/?0/376)/335 sp.)係 以寄存號碼FERM-BP 10785登錄在獨立行政法人日本產業 技術綜合研究所專利生物寄存中心之菌株更佳。 關於可購得此等菌株之菌種保存機構，可列舉如下述 之菌種保存機構。 l.IFO(Institute of Fermentation Osaka:財團法人日 本醱酵研究所）菌種保存中心 目前，已移管至獨立行政法人日本製品評價技術基 盤機構生物遺傳資源部門（NBRC)。欲取得時，可向NBRC 申請購入，亦可連結至NBRC之網站 (http://www. nbrc. nite. go. jp/NBRC2/NBRCDispSearchSe rvlet?lang=jp) ° 2. ATCC(American Type Culture Collection ;美國菌種保 存中心） 可透過日本住商藥品國際公司ATCC事業集團取得， 欲購入時，可連結至如該集團之網址 (http://www. summitpharma. co. jp/japanese/service/s ATCC.html)。亦可直接從ATCC購入。 3. IAM菌種保存中心 目前，IAM菌種保存中心之保存菌株中，細菌、酵母 菌、絲狀菌已移管至獨立行政法人日本理化學研究所生物 資源中心微生物材料開發室（JCM),此外，微細之藻類已移 37 322941 201137125 管至獨立行政法人日本國立環境研究所微生物系統保存 設施（NIES)。欲取得時，可向此等機關申請購入，亦可連 結至此等機關之網站中關於菌種保存之網頁 (http://www. jcm. riken. go. jp/JCM/aboutJCM_J. shtml ' 或 http://mcc.nies. go. jp/aboutOnlineOrder. do)。 4. JCM(日本理化學研究所微生物系統保存設施（japan Collection of Microorganisms, JCM)) 目前’已移管至獨立行政法人日本理化學研究所生 物資源中心（RIKEN BRC)微生物材料開發室。欲取得時，可 向該機關申請購入’亦可連結至該機關之網站中關於菌種 保存之網頁 (http://www. jcm. riken. go. jp/JCM/aboutJCM_J. shtml)° 前步驟中所使用之作為催化劑之酵素或具有產生該 酵素之能力之微生物的培養物或其處理物，亦可藉由搜索 具有將化合物（1)轉換為化合物（2)的能力之酵素或微生 物而獲得並製備。具體而言，例如在試管中加入已滅菌之 培養基5mL，再於其中將由各菌種保存機構購得之菌體或 由土壤中經純種分離而製備之菌體予以接種。將其於 C在好氧條件下進行振盪培養。培養終了後，經離心分離

而回收菌體，獲得生菌體。於所得之生菌體中加入15mL 之0· 2M之磷酸鉀緩衝液（pH7)，經懸浮後，於其中加入 1.5mg之已溶於15/U之二曱基亞砜中之N-(2-氯噻唑-5- 基曱基）-〇-曱基異尿素，使所得之混合物在3〇〇c下振盪2 至3日。 322941 38 201137125 反應終了後，將反應液予以取樣，並以液相層析法等 勿析反應液中所生成之N-(2-氯嘆嗤-5-基曱基）_尿素之 量。 以如此操作，而篩選具備會產生「具有將異尿素化合 物轉換為相對應之N-胺曱醯基胺基化合物之能力之酵素」 的能力之微生物。 其次’說明前步驟微生物之製備方法。 前步驟微生物可使用適當地含有碳源、氮源、有機 鹽、無機鹽等之用以培養各種微生物的培養基而進行培養。 碳源可例舉如葡萄糖、糊精、蔗糖等糖類，甘油等醣 醇反丁烯二酸、檸檬酸、丙酮酸等有機酸，動物油、植 物’由及糖蜜。此等碳源在培養基中之添加量，相對於培養 液—般係 0. 1%(W/V)至 30%(w/v)左右。 —氮源可例舉如肉萃取物、蛋白腺、酵母萃取物、麥芽 t取物、大旦粉、玉米浸液、綿籽粉、乾燥酵母、酪蛋白 基酉文專天然有機氮源，胺基酸類、硝酸鈉等無機酸之敍 =，氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等無機酸之銨鹽，反丁烯二 酉文銨、檸檬酸銨等有機酸之銨鹽及尿素。其中之有機酸之 氣天然有機氮源、胺基酸類等係在許多情形下亦可作 為灰源使用。此等氮源在培養基中之添加量，相對於培養 液般係0. l%(w/v)至30%(w/v)左右。 有機鹽及無機鹽可例舉如卸、納、鎮、鐵、锰、鈷、 辞等之氣化物，硫酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽及磷酸鹽。具體 之例，可列舉如氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫 39 322941 201137125 酸錳、氯化鈷、硫酸鋅、硫酸銅、乙酸鈉、碳酸鈣、磷酸 氫一鉀及磷酸氳二鉀。此等有機鹽及/或無機鹽在培養基中 之添加量，相對於培養液一般係0.0001%(w/v)至5%(w/v) 左右。 培養方法可列舉如固體培養、液體培養（試管培養、 燒瓶培養、缸式酿酵槽培養等）。 培養溫度及培養液之pH ，只要是在前步驟微生物可 生長之範圍即可，並無特別之限定，可列舉如培養溫度為 約15°C至約45°C之範圍、培養液之Ph為約4至約8之範 圍。培養時間可依照培養條件而適當選擇，惟一般為約1 日至約7日。 前步驟微生物之培養物，可直接作為前步驟之催化劑 使用。使用前步驟微生物之培養物之方法中，關於直接使 用前步驟微生物之菌體之方法，可列舉如（1)直接使用培養 液之方法、（2)使用將培養液經離心分離等而回收之菌體 (依照需要而使用經緩衝液或水洗淨後之濕菌體）之方法 等。 前步驟之催化劑，亦可使用前步驟微生物之培養物之 處理物。該處理物之例可列舉如：將培養所得之菌體再經 有機溶劑（丙酮、乙醇等）處理者、經冷凍乾燥處理者或經 鹼處理者，或是將菌體經物理性或酵素性破碎處理者，或 是將此等物再經分離/萃取而得之粗酵素等。並且，前述處 理物中，亦包含經前述處理後再以一般所知之方法進行固 定化處理者。 40 322941 201137125 從前步驟微生物之處理物精製本酵素之方法，可使用 一般蛋白質之精製所使用之方法。例如可列舉如以下之方 法0 首先，從前步驟微生物之處理物中以離心分離等而收 集菌體後，將其以超音波處理、微粉碎機處理、法式壓碎 機處理等物理性破碎法或是以使用界面活性劑或溶菌酶等 溶菌酵素之化學性破碎法等進行破碎。從所得之破碎液中 經離心分離、過濾膜過濾等而去除其中之雜質，以製備無 細胞萃取液，將其適當地使用陽離子交換層析法、陰離子 交換層析法、疏水性層析法、膠體過濾層析法、或金屬螯 合層析法等分離精製方法進行區分，即可精製前步驟酵素。 層析中所使用之擔體，可例舉如經導入羧甲基（CM)、 二乙基胺基乙基（DEAE) '苯基或丁基之纖維素、糊精或洋 菜糖等不溶性高分子擔體。亦可使用市售之已充填擔體之 管柱’該市售之已充填擔體之管柱可舉例如Q_gephar0Se FF、Phenyl-Sepharose HP(商品名，均為 Amersham Pharmacia Biotech 公司製造）、TSK-gel G3000SW(商品 名，東曹公司製造）等。 含有前步驟酵素之區分，可根據前步驟中之「將異尿 素化合物轉換為相對應之N-胺曱醯基胺基化合物之能力」 之存在與否或其程度而進行筛選。 其具體之形態，可列舉如前步驟微生物之培養物、該 培養物之處理物（如無細胞萃取液、粗精製蛋白質、精製蛋 白質及此等之固疋化物等）。在此’培養物之處理物可歹4舉 41 322941 201137125 如冷凍乾燥微生物、有機溶劑處理微生物、乾燥微生物、 微生物磨碎物、微生物之自溶物、微生物之超音波處理物、 微生物萃取物、微生物之鹼處理物。又，獲得固定化物之 方法’可例舉如擔體結合法（使本酵素等吸附於矽膠及陶瓷 等無機擔體、纖維素、離子交換樹脂等之方法）及捕獲法（將 本酵素等關在聚丙烯麟胺、含硫多醣膠體（例如紅藻膠膠 體）、褐藻酸膠體、洋菜膠體等高分子之網狀構造中之方 法）。 在考慮使用前夕麟微生物之工業生產性時，相較於使 用未處理狀態之微生物之方法’以使用使該微生物滅絕化 之處理物之方法在製遠設備之限制等方面上有更佳之情 形。用於此處之滅菌化處理方法，可列舉如物理性殺菌法 (加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、過濾、通電）、及使 用化學藥品之殺菌法（驗、酸、鹵素、氧化劑、硫、硼、砷、 金屬、醇、酚、胺、硫化物、醚、醛、酮、氰、抗生素）。 一=而言，以選擇此等殺菌法中儘可能使前步驟酵素之前 述「將異尿素轉換為相對應之N-胺甲醯基胺基化合物之能 力」致失活，且對反應系之殘留、污染等影響少之處理 方法為佳。 心前步驟一般係在水存在下進行。該情形下之水，亦可 為緩衝液之形態。該緩賊巾所使用之緩衝劑，可列舉如 碟酸卸等磷酸之驗金屬鹽，乙酸納、乙酸鉀等乙 酸之驗金屬鹽等。 月|J步驟亦可更進一步使用疏水性有機溶劑，並在水與 322941 42 201137125 疏水性有機溶劑之存在下進行。此時所使用之疏水性有機 溶劑，可列舉如曱酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁 酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯類，正丁醇、正戊醇、正辛 醇等醇類，苯、甲苯、二曱苯等芳族烴類，二乙基醚、二 異丙基醚、甲基第三丁基醚等醚類，氯仿、1，2-二氯乙烷 等鹵化烴類及此等之混合物。 前步驟亦可更進一步使用親水性有機溶劑，並在水與 水性媒質之存在下進行。此時所使用之親水性有機溶劑， 可列舉如曱醇、乙醇等醇類，丙酮等酮類，二曱氧基乙烷、 四氫吡喃、二卩等烷等醚類，二甲基亞砜及此等之混合物。 前步驟一般係在水層之pH為3至10之範圍内進行， 惟亦可在反應會進行之範圍内適當地變化。 前步驟一般係在約0°C至約60°C之範圍内進行，惟亦 可在反應會進行之範圍内適當地變化。 前步驟一般係在約0. 5小時至約10日之範圍内進 行。關於反應之終點，可藉由在作為原料化合物之式（1) 所示之異尿素化合物（即化合物（1))添加終了後，以液相層 析法、氣相層析法等測定反應液中之該式（1)所示之異尿素 化合物之量，而予以確認。 前步驟中之作為原料化合物之式（1)所示之異尿素化 合物（即化合物（1))之濃度，一般為50%(w/v)以下，為了 使反應系中之該式（1)所示之異尿素化合物之濃度保持大 致一定，亦可將該式（1)所示之異尿素化合物（即化合物（1)) 連續或逐次添加至反應系中。 43 322941 201137125 前步驟中，亦可依照需要而在反應系中添加葡萄糖、 蔑糖、果糖等糖類，或Triton X-100或Tween 60等界面 活性劑等。 從反應液回收式（2)所示之N-胺曱醯基胺基化合物， 可依照一般所知之任意之方法進行。 可列舉如將反應液之有機溶劑萃取操作、濃縮操作等 後處理，依照需要而與管柱層析法、蒸餾等組合，並進行 精製之方法。 作為原料化合物之式（1)所示之異尿素化合物（即化 合物（1))之製造方法，可藉由將5-(胺基曱基）-2-氯噻唑 與式（3)所示之化合物（以下亦稱為化合物（3))混合，再依 如下之操作而製備。

H2N 〇r [式中，R表示與前述相同之意義]。 化合物（3)可例舉如0-曱基-N-硝基異尿素、0-乙基 -N-硝基異尿素等。 依照日本特開平10-120666號公報之實施例1至16 之方法，首先，使5-(胺基曱基）-2-氯噻唑與化合物（3)在 水中於室溫下反應，而主要製造式（4)所示之化合物（以下 亦稱為化合物（4))， 44 322941 (4) (4)201137125

N

[式中，R所表與前述之意相同] 其次’再賴得之化合物⑷進行脫硝基化，而彳製成化合 物⑴。 上述方法中，在主要製造化合物（4)時，由於亦會直 接製把出作為田|j產物之化合物⑴，故亦可將其回收利用。 更具體*吕M吏（胺基甲基）-2-氯售吐與化合物（3) 反應而製成作為中間體為有用之化合物(4)之方法，可列舉 如♦將化合物⑶依照需要而溶解在水中後，於抓至35 C左右之溫度T與5-C胺基甲基）_2-氯射混合，而製成 含有化合物⑷及化合物⑴之混合物，並將作為結晶而析 出之化合物⑷經過渡 '離心分離等而固液分離，以取出化 合物⑷之方法等。該已以結晶之形式取出化合物⑷之滤 液，則可製備成含有化合物（1)之水溶液。 實施例 其次列舉實施例’更詳細說明本發明。 實施例1 (含有本聚核苦酸之質體之合成法（其之υ) 從依照下述參考例3所栽之方法所 篩選的具有將Ν-胺 甲醯基胺基化合物轉換為相對應之5_(胺基曱基）2_氯嘆 θ坐之月b力之微生物（紅球菌屬，处Sp .)，使用 QIAGEN Genomic-tip(Qiagen 公司製造）製備染色體 DNA(A)。 依照紅球鹵屬R312 (他oi/ococci/5 R312)(短桿菌屬 45 322941 201137125 R312(价⑽ R312)(CBS 717-73))之醯胺酶基因 序列，合成含有序列編號3所示之鹼基序列的寡核苷酸引 子及含有序列編號4所示之鹼基序列的寡核苷酸引子。 以合成之2種寡核苷酸引子作為1組之引子組，並以 前述製備之染色體DNA(A)作為模版，以下述之反應液組 成、反應條件進行PCR(使用Roche Diagnostics公司製造 之 Expand High Fidelity PCR System)。 [反應液組成] 染色體MA溶液（A) 20/z 1 dNTP(各 2. 5mM-mix) 1 β 1 引子（20pmol/ /ζ 1) 各 0. 4" 1 5xbuffer(with MgCl) 10μ 1 enz. expand HiFi(5U//zl) 0.5/zl 超純水 Π.Ί μΐ [反應條件] 將已置入上述組成之反應液之容器裝設在PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400，加熱至 94°C (2 分鐘）後， 再以94°C(10秒鐘）-6(TC(0.5分鐘）-72°C(1.5分鐘）之循 環進行操作30次，之後再於72°C下保持7分鐘。 之後，取出部份之PCR反應液，進行洋菜糖膠體電泳， 檢測到約1. 6kbp之DNA片段之色帶。 直接使用各個檢測到約1. 6kbp之DNA片段之色帶的 PCR反應液，將上述約1. 6kbp之DNA片段連接（ligatiQn；) 至pCR2.卜Τ0Ρ0載體之已存在之「PCR Product插入部位」 46 322941 201137125 (使用 Invitrogen 公司製造之 Τ0Ρ0ΤΜΤΑ cloning 套組）， 以所得之連接液將大腸菌DH5a株進行轉形。 於含有50 /Z g/mL安比西林之LB(1%之Bacto-胰化蛋 白月東（Bacto-tryptone)、〇· 5%之Bacto-酵母萃取物、之 氯化納）洋菜培養基上塗佈3〇# 1之5-溴-4-氣-3-叫卜朵基 -Θ-D-半乳糖苷（以下稱為X_gal)之4%水溶液及3〇/U之 0· 1M IPTG，再於其上接種所得之轉形體並進行培養。在已 形成之菌落中，各取1個白色菌落，將各菌落接種於含有 50/zg/mL安比西林之已滅菌LB培養基（2mL)，並在試管中 振盪培養（30°C，24小時）。從各培養菌體中使用QUprep Spin Mini prep Kit (Qiagen公司製造）取出質體。 以下，源自所得之DNA片段的質體亦稱為質體pCRami。 刀析插入質體pCRam i中之DNA片段的驗基序列，可 知插入之DNA片段的鹼基序列具有序列編號2所示之驗基 序列。 插入質體中之DNA片段之驗基序列之分析，係使用Dye Terminator Cycle Sequencung FS Ready Reaction Kit(Perkin Elmer公司製造），以各質體作為模版而進行 定序反應（sequence reaction)，並將所得之dm之驗基序 列以DNA定序器-373A(Perkin Elmer公司製造）進行分析。 將所得之質體pCRami以2種限制酶（Saci及κρηι)進 行2重切斷（double-digestion)，其次將如此經2重切斷 之約1. 6kbp的MA片段予以精製。 另一方面，將質體載體PTV118N(寶酒造公司製造）並 322941 47 201137125 以2種限制酶（SacI及KpnI)進行2重切斷，其次再將如此 經2重切斷之DNA片段予以精製。

將所得之2種已精製之DNA片段混合，並以T4 MA 連接酶進行連接反應後，其次以所得之連接液將大腸菌 DH5a株進行轉形。 將所得之轉形體於含有50 μ g/mL安比西林之LB洋菜 培養基上進行培養，並隨機地從生長之菌落中選取3個菌 落。將所選取之菌落各自接種於含有5〇/ig/mL安比西林之 滅菌LB洋菜培養基（2mL)，並在試管中進行振盪培養（3〇 C ’ 24小時）。從各培養菌體中，使用QiAprep spin Miniprep Kit(Qiagen公司製造）取出質體。 將取出之質體之各一部份，以SacI及KpnI之2種限 制酶進行2重切斷後，將經2重切斷之DMA片段進行膠體 電泳’而確認取出之質體整體中已插入有前述約h6kbp 之DNA片段（以下亦將該質體稱為質體pTVami)。 使用以如此操作而獲得之質體pTVami，將大腸菌 DH5a株進行轉形。將所得之轉形體接種於含有5()/zg/mL 安比西林之滅菌LB培養基（i〇〇mL)，進行振盪培養（3〇°c， 26小時）。藉由將所得之培養液予以離心分離，而獲得本 轉形體。 實施例2(使用生產本酵素之大腸菌重組體，由^胺曱醯基 胺基化合物製造5-(胺基甲基）—2_氣嘆嗤之製造例）

將實施例1所得之本轉形體（亦即含有質體pTVami之 大腸菌DH5a株）接種於含有5〇々g/mL安比西林之滅菌LB 48 322941 201137125 培養基（lOOmL)，並進行振盪培養（30°C，26小時）。將所 得之培養液予以離心分離，獲得約0. 6g之濕菌體。於所得 之濕菌體中，混合5mg之N-(2-氯°塞°圭-5-基曱基）-尿素、 50μ 1之二甲基亞砜、5mL之0. 2M磷酸緩衝液（pH7. 0)，並 於37°C下攪拌144小時。 反應終了後，將反應液予以取樣0. 6mL。從該試樣溶 液中去除菌體後，以液相層析法分析所生成之5-(胺基甲 基）-2-氯噻唑之量。結果可知，相對於反應中所使用之 N-(2-氯噻唑-5-基曱基）-尿素之量，生成91.6%之5-(胺基 曱基）-2-氯噻唑。 <含量分析條件> 管柱：Cadenza CD-C18(4. 6πιιηΦχ15αη，3//m)(Imtakt 公 司製造） 移動相·· A液（5 mmol/L辛烧讀酸納+ 50 mmol/L填酸二氫 鉀水溶液） B液乙腈 時間（分鐘） A液«) : B液（％) 0 90 ： 10 5 90 ： 10 25 50 ： 50 40 50 ·· 50 40. 1 90 ： 10

流量：lmL/分鐘 管柱溫度：40°C 49 322941 201137125 檢測：254nm 實施例3(本酵素之製備） 從依照參考例3所載之方法而篩選的具有將胺曱醯 基胺基化合物轉換為相對應之5-(胺基甲基）-2-氣嗟嗤的 能力之微生物（紅球菌屬，Sp·)製備約2. ^ 之濕菌體，使其懸浮於2OmL之2OmM麟酸卸緩衝液（pjj7 〇) 中，並以Multi-Beads Shocker (安井器械公司製造，玻璃 珠為0. ΙππηΦ，2500rpm，20分鐘）進行破碎。將所得之破 碎液進行離心分離（l〇〇〇〇rpm，10分鐘），於所得之上清液 中加入魚精蛋白硫酸鹽（pr〇tamine suifate)後，再度離心 分離（lOOOOrpm，1〇分鐘），獲得離心上清液。

將20mL之所得之離心上清液以超濾膜（3〇kNMWL)濃縮 至2mL。將所得之濃縮物於離子交換層析管柱[HiTrap Q FF(Amersham Bioscience公司製造）][經墙酸钟緩衝液 (20mM ’ pH7)平衡者]中展開，以已溶解有氯化鈉之磷酸钾 缓衝液（氣化鈉濃度之濃度梯度）作為移動層，進 行溶出’而獲得4mL之氣化鈉濃度為〇. 14至0. 65M之區 分，其係具有還原酶活性之區分。 將所得之4mL之活性區分以超濾膜（3〇kNMWL)濃縮至 2mL後’於所得之濃縮物中緩緩加入硫酸銨直到其濃度成 為1.5M為止。將其在疏水性交互作用層析管柱[HiTrap

Butyl FF(Amersham Bioscience 公司製造）][經含有 1.5M 硫酸銨之磷酸鉀緩衝液（20mM，pH7)平衡者]中展開，並以 已溶解有硫酸銨之磷酸鉀緩衝液（硫酸銨濃度1· 5M—0M之 50 322941 201137125 濃度梯度）作為移動層，進行溶出，而獲得lmL之硫酸銨濃 度為0· 25至0.47M之溶出區分，其係具有還原酶活性之區 分。 將所得之4mL之活性區分，以超濾膜（3〇kNMWL)而在 含有0. 15M NaCl之磷酸納緩衝液（5〇爐，pfj7)中進行脫鹽， 以交換其中之緩衝液後，再將其濃縮至約〇. lmL。將所得 之濃縮物經膠體過濾[管柱：Superdex 200(10/300GL) (Amersham Bioscience 公司製造）][移動層：含有 〇.

NaCl之磷酸鈉緩衝液（50mM，pH7)]，而獲得含有分子量為 約98000道耳頓（dalton)之本酵素的之活性區分，其 係具有將N-胺甲醯基胺基化合物水解成相對應之5_(胺基 曱基）-2-氯噻唑的活性之區分。 此外，對於經層析等而製成之區分，係依據如下之操 作而測定水解酵素之活性。添加1 · 5mg之已溶解於15以1 之二曱基亞颯中的N-(2-氣噻唑-5-基甲基）-尿素後，恭加 經由層析等而製成之溶出區分及〇. 2M磷酸鉀緩衝液 (pH7)，並使總量成為1. 5mL，將所得之混合物於3(Tc下振 盪反應1至2日。 反應終了後’將反應液予以取樣〇· 6mL，以液相層析 法測定反應液中所生成之5-(胺基曱基）-2-氣噻唑之量， 求出區分中之水解酵素活性。 <含量分析條件> 管柱：Cadenza CD-C18(4.6mmOxl5cm，3/zm)(Imtakt 公 司製造） 51 322941 201137125 移動相：A液（5 mmol/L辛烧確酸納+50 mmol/L填酸二氫 钟水溶液） B液乙腈 時間（分鐘） A液（％) ·· B液（0/〇) 0 90 : 10 5 90 : 10 25 50 ： 50 40 50 : 50 40. 1 90 : 10 流量：lmL/分鐘 管柱溫度：40°C 檢測：254nm 實施例4(含有本聚核苷酸之質體之合成法（其之2))

將對應於序列編號1所示的胺基酸序列之forward引 子與reverse引子以切成各約40bp長度之形態，而各自合 成39個引子。將此等引子依以下之條件進行Assembly PCR 法0 [反應液組成] dNTP(各 2. 5mM-mix) ΙβΙ 引子 mix(250//M) 0. 5 // 1 5xbuffer(with MgCl) 10^ 1 enz. expand HiFi(5U/^ 1) 0.5^1 超純水 38 β 1

將已置入上述組成之反應液之容器裝設在PERKIN 52 322941 201137125 ELMER-GeneAmp PCR System 9700 之後，以 94°C(30 秒 鐘）-52°C (30秒鐘）-68°C (30秒鐘）之循環進行操作55次。 反應終了後，以反應液作為模版，再度依以下述之反 應條件進行PCR。加熱至94°C (2分鐘）後，以94°C (30秒 鐘）-53°C (30秒鐘）-68°C (1. 5分鐘）之循環進行操作30次。 此時’係使用具有序列編號3所示之鹼基序列的寡核皆酸 引子及序列編號4所示之寡核苷酸引子。 [反應液組成] 模版 1#1 dNTP(各 2. 5mM-mix) 1^1 引子（250 //M) 各 0.5/zl 5xbuffer(with MgCl) 10μ 1 enz. expand HiFi(5U//z 1) 0. 5 /z 1 超純水 36.5以1 之後’取部份之PCR反應液以洋菜糖膠體進行精製， 加入2種限制酶（SacI及ΚρηΙ)，將約1500bp之DNA片段 進行2重切斷，之後再精製該經酵素切斷之dm片段。 另一方面，將質體載體pTV118N(TaKaRa公司製造）以 2種限制酶（SacI及ΚρηΙ)進行2重切斷，並精製該經酵素 切斷之DNA片段。

將此等2種經酵素切斷之DNA片段混合，並以Τ4 DNA 連接酶進行連接反應，再以所得之連接液將大腸菌DH5a 株進行轉形。 將所得之轉形體以含有50y g/mL安比西林之LB洋菜 53 322941 201137125 培養基進行培養，並將生長之菌落各接種於含有50/zg/mL 安比西林之滅邊LB培養基（2mL) *在試官中進行振盈培養 (37°C，17小時）。以如此操作，即可製備含有質體pTVami 之大腸菌DH5a株（亦即本轉形體）。 從上述之培養菌體，使用QI Apr ep Spin Mini prep Kit (Qiagen公司製造）而取出質體，以獲得質體pTVami。 參考例1 (化合物（1)之製造方法） 一邊將50g之N-(2-氯噻唑-5-基曱基）-0-曱基-N / -硝基異尿素（化合物（4)中之R為曱基之化合物）於400mL 之乙腈中攪拌，一邊在該混合物中於25至30°C下滴入 58. 6g之28%氨水。 將所得之混合物經保溫1小時後，在減壓下蒸餾去除 乙腈。將所得之殘渣以120mL之乙酸乙酯稀釋，並以5g 之無水硫酸鎂脫水，過濾其不溶成分後，減壓濃縮。 對於如此所得之油狀物質加入50mL之曱苯、30mL之 正己烷而溶解，於所得之溶解物中緩緩加入正己烷而析出 結晶。將其過濾後，同樣地以曱苯/正己烷進行再結晶並過 濾、之，之後再經減壓乾燥，即獲得18g之N-(2-氯嗟°坐-5-基甲基）-〇-曱基異尿素之白色結晶。所得之白色結晶之物 理性質如下。 <白色結晶之物理性質> 依液相層析法之面積百分率之純度：98. 3%

熔點：71至72°C j-NMR : 3. 7(s，3H)、4. 4(s，2H)、4. 9(s，2H)、7. 4(s，1H) 54 322941 201137125 參考例2 (化合物（2)之製造方法） 將24. 3g之氰酸鉀溶解於34〇mL之水中，於5〇〇c下在 該溶解物中滴入135g之5-(胺曱基）-2-氣噻唑鹽酸鹽水溶 液（含量35wt%)。 將所得之混合物經保溫1小時，而析出結晶。將其冷 卻至室溫後’加以過濾並以溫水洗淨，其次再減壓乾燥， 即獲得45g之N-(2〜氯噻唑-5-基曱基）-尿素之白色結晶。 所得之白色結晶之物理性質如下。 <白色結晶之物理性質>

依液相層析法之面積百分率之純度：98. 6〇/0 熔點：173°C 'H-NMR： 4. 3(s, 2H)>5.7(s, 2H) > 6. 6(s, 1H) > 7. 5(s, 1H) 參考例3 (搜索具備會產生「具有將卜胺曱醯基胺基 化合物轉換為相對應之5-(胺基曱基）_2_氣噻唑的能力之 酵素」的能力之微生物） 在試管中加入5mL之已滅菌之培養基（在il之水中加 入20g之葡萄播、5g之聚蛋白腺（p〇lypept〇ne)、3g之酵 母萃取物、3g之肉萃取物、2g之硫酸銨、lg之磷酸二氫 鉀及0. 5g之硫酸鎂7水合物後，調整pH為7. 〇)，再於其 中接種由各菌株保存機構購得之菌體或由土壤中經純種分 離而製備之菌體。將其於3代在好氧條件下振盪培養。於 培養終了後，以離心分離回故菌體，製備生菌體。在旋口 試管中加人1· 5mL之〇. 2M磷酸鉀緩驗（pH7)，於其中添 加上述生g體後，使錢浮。在所得之料液中，加入 322941 55 201137125 1. 5mg之已溶解於15//丨之二甲基亞颯中之N_(2_氯噻唑 —5_基曱基）~尿素後’將所得之混合物於30°C下振盪培養2 至3日。 在反應終了後，將反應液予以取樣〇. 6mL。從經取樣 之反應液中去除菌體後’以液相層析法分析反應液中所生 成之5-(胺基甲基）_2一氯雀唾之量。 以如此之操作，而篩選具備會產生「具有將N-胺甲醯 基胺基化合物轉換為相對應之5-(胺基甲基）-2-氯噻唑的 能力之酵素」的能力之微生物。 <含量分析條件> 管柱.Cadenza CD-C18(4. 6mmd>xl5cm，3/zm)(Imtakt 公 司製造） 移動相：A液（5 mmol/L辛烧續酸納+50 mmol/L構酸二氫 鉀水溶液） B液乙腈 時間（分鐘） A液: B液（％) 0 90 ： 10 10 90 : 10 30 50 ： 50 45 50 : 50 45. 1 90 ： 10 流量：lmL/分鐘 管柱溫度：40°C 檢出：254nm 56 322941 201137125 參考例4 (由異尿素化合物製造N〜胺曱醯基胺基化合物之 製造例） 在試管中加入5mL之已滅菌之培養基（在让之水中， 加入20g之葡萄糖、之聚蛋白腺、3g之酵母萃取物、3g 之肉萃取物、2g之硫酸銨、lg之磷酸二氫鉀及〇. 5g之硫 酸鎂7水合物後，調整PH為7.0)，於其中接 示 之各種菌體。將其於30°C在好氣條件下振盪培養。於培養 終了後，以離心分離回收菌體，製備生菌體。在旋口試管 中加入1.5mL之〇. 2M磷酸鉀緩衝液（pH7)，於其中添加上 述生菌體後，使其懸浮。在所得之懸浮液中，加入Umg 之已溶解於15//1之二曱基亞项中之n-(2-氯。塞唑-5-基甲 基）-0-甲基異尿素後，將所得之混合物於3(rc下振盪培養 2至3日。 在反應終了後’將該反應液予以取樣〇. 6mL。從經取 樣之反應液中去除菌體後，以液相層析法分析反應液中所 生成之N-(2-氯噻唑-5-基曱基）-尿素之量。其結果如表2 所示。 <含量分析條件> 管柱：Cadenza CD_C18(4. 6mm<X)xl5cm，3 // m)(Imtak1;公 司製造） 移動相：A液（5 mmol/L辛炫續酸鈉+50 mmol/L磷酸二氫 鉀水溶液） B液乙腈 時間（分鐘） A液（％) : B液（％) 57 322941 201137125 0 90 ： 10 10 90 ： 10 30 50 ： 50 45 50 ： 50 45. 1 90 ： 10 流量：lmL/分鐘 管柱溫度：40°C 檢出：254nm 58 322941 201137125 [表l] 菌株 ^(2-氯°塞°坐 -5-基甲基)-尿 素的產率(°/〇 猶他游動放線菌（Actinoplanes utahensis)IF0 13244t 0.3 液化產氣單胞菌（Aeromonas liquefaciens)IFO 12978 1.8 節桿菌屬（Arthrobacter sp. )ATCC 27778 1.9 出芽短梗黴(Aureobasidium pullulans)IF0 6353 0.8 短芽孢桿菌（Bacillus brevis)IF0 3331 5.6 森田芽孢桿菌（Bacillus moritai)ATCC 21282 0.6 土生隱球酵母菌（Cryptococcus humicolus)IF0 1527 2.4 馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus)IF0 0541 1.3 迪爾諾弗分枝桿菌（Mycobacterium diernhoferi)IFO 3707 3.0 異常畢赤酵母菌（Pichia an〇mala)IF0 0963 0.7 異常畢赤酵母菌（Pichia anomala)IFO 1181 0.6 惡臭假專^菌（Pseudomonas putida)IAM 1002 1.0 恶臭假單胞菌（Pseudomonas putida)IFO 14671 1.3 恶臭假單胞菌（Pseudomonas putida)IFO 14796 1.2 恶臭假單胞菌（Pseudomonas putida)JCM 6156 1.1 」惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)JCM 6157 1.6 稻草假單胞菌（Pseudomonas straminea)JCM 2783t 1.9 目營假放射菌（Pseudonocardia autotrophica) IFO 12743T 0.7 紅球菌屬（Rhodococcus sp. )ATCC 19148 0.7 场基還原寡養單胞菌（Stenotrophomonas nitritireducens)JCM 13311 0.6 嗜很募養單胞菌（Stenotrophomonas rhizophi la)JCM 13333 1.1 表蚕單胞菌屬（Stenotrophomonas sp. )SC-1 1.4 鏈黴菌（Streptomyces carnosus)IFO 13025t 0.3 酵母菌（Trichosporon aquatile)ATCC 22310 0.4 [產業上之可利用性] 依本發明，可提供一種5-(胺基曱基）-2-氯噻唑之新 59 322941 201137125 穎之製造方法等。 [序列表之非關鍵詞文字（free text)] 序列編號3 :用於PCR之引子 序列編號4 :用於PCR之引子 【圖式簡單說明】無 【主要元件符號說明】無 201137125 序列表 <110>住友化學股份有限公司 <120> 5-(胺基曱基)-2_氯噻唑的製造方法 <130> S26868WO01 <150〉 JP 2010-071808 <151〉 2010-03-26 <160> 4 <170> Patentln version 3·1 <210> 1 <211> 521 <212> PRT <213> Rhodococcus <400> 1

Met Ala Thr lie Arg Pro Asp Asp Lys Ala lie Asp Ala Ala Ala Arg 15 10 15

His Tyr Gly lie Thr Leu Asp Lys Thr Ala Arg Leu Glu Trp Pro Ala 20 25 30

Leu lie Asp Gly Ala Leu Gly Ser Tyr Asp Val Val Asp Gin Leu Tyr 35 40 45 1 322941 201137125

Ala Asp Glu Ala Thr Pro Pro Thr Thr Ser Arg Glu His Ala Val Pro 50 55 60

Ser Ala Ser Glu Asn Pro Leu Ser Ala Trp Tyr Val Thr Thr Ser lie 65 70 75 80

Pro Pro Thr Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Arg Arg Val Ala lie Lys 85 90 95

Asp Asn Val Thr Val Ala Gly Val Pro Met Met Asn Gly Ser Arg Thr 100 105 110

Val Glu Gly Phe Thr Pro Ser Arg Asp Ala Thr Val Val Thr Arg Leu 115 120 125

Leu Ala Ala Gly Ala Thr Val Ala Gly Lys Ala Val Cys Glu Asp Leu 130 135 140

Cys Phe Ser Gly Ser Ser Phe Thr Pro Ala Ser Gly Pro Val Arg Asn 145 150 155 160

Pro Trp Asp Arg Gin Arg Glu Ala Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ala 165 170 175 2 322941 201137125

Ala Leu Val Ala Asn Gly Asp Val Asp Phe Ala lie Gly Gly Asp Gin 180 185 190

Gly Gly Ser lie Arg lie Pro Ala Ala Phe Cys Gly Val. Val Gly His 195 200 205

Lys Pro Thr Phe Gly Leu Val Pro Tyr Thr Gly Ala Phe Pro lie Glu 210 215 220

Arg Thr lie Asp His Leu Gly Pro lie Thr Arg Thr Val His Asp Ala 225 230 235 240

Ala Leu Met Leu Ser Val lie Ala Gly Arg Asp Gly Asn Asp Pro Arg 245 250 255

Gin Ala Asp Ser Val Glu Ala Gly Asp Tyr Leu Ser Thr Leu Asp Ser 260 265 270

Asp Val Asp Gly Leu Arg lie Gly lie Val Arg Glu Gly Phe Gly His 275 280 285

Ala Val Ser Gin Pro Glu Val Asp Asp Ala Val Arg Ala Ala Ala His 290 295 300 3 322941 201137125

Ser Leu Thr Glu lie Gly Cys Thr Val Glu Glu Val Asn lie Pro Trp 305 310 315 320

His Leu His Ala Phe His lie Trp Asn Val lie Ala Thr Asp Gly Gly 325 330 335

Ala Tyr Gin Met Leu Asp Gly Asn Gly Tyr Gly Met Asn Ala Glu Gly 340 345 350

Leu Tyr Asp Pro Glu Leu Met Ala His Phe Ala Ser Arg Arg lie Gin 355 360 365

His Ala Asp Ala Leu Ser Glu Thr Val Lys Leu Val Ala Leu Thr Gly 370 375 380

His His Gly lie Thr Thr Leu Gly Gly Ala Ser Tyr Gly Lys Ala Arg 385 390 395 400

Asn Leu Val Pro Leu Ala Arg Ala Ala Tyr Asp Thr Ala Leu Arg Gin 405 410 415

Phe Asp Val Leu Val Met Pro Thr Leu Pro Tyr Val Ala Ser Glu Leu 420 425 430 4 322941 201137125

Pro Ala Lys Asp Val Asp Arg Ala Thr Phe lie Thr Lys Ala Leu Gly 435 440 445

Met lie Ala Asn Thr Ala Pro Phe Asp Val Thr Gly His Pro Ser Leu 450 455 460

Ser Val Pro Ala Gly Leu Val Asn Gly Leu Pro Val Gly Met Met lie 465 470 475 480

Thr Gly Arg His Phe Asp Asp Ala Thr Val Leu Arg Val Gly Arg Ala 485 490 495

Phe Glu Lys Leu Arg Gly Ala Phe Pro Thr Pro Ala Glu Arg Ala Ser 500 505 510

Asn Ser Ala Pro Gin Leu Ser Pro Ala 515 520 <210> 2 <211> 1566 <212> DNA <213> Rhodococcus <400> 2 5 322941 201137125 atggcgacaa tccgacctga cgacaaagca atagacgccg ccgcaaggca ttacggcatc 60 actctcgaca aaacagcccg gctcgagtgg ccggcactga tcgacggagc actgggctcc 120 tacgacgtcg tcgaccagtt gtacgccgac gaggcgaccc cgccgaccac gtcacgcgag 180 cacgcggtgc caagtgcgag cgaaaatcct ttgagcgctt ggtatgtgac caccagcatc 240 ccgccgacgt cggacggcgt cctgaccggc cgacgcgtgg cgatcaagga caacgtgacc 300 gtggccggag ttccgatgat gaacggatct cggacggtag agggatttac tccgtcacgc 360 gacgcgactg tggtcactcg actactggcg gccggtgcaa ccgtcgcggg caaagctgtg 420 tgtgaggacc tgtgtttctc cggttcgagc ttcacaccgg caagcggacc ggtccgcaat 480 ccatgggacc ggcagcgcga agcaggtgga tcatccggcg gcagtgcagc actcgtcgca 540 aacggtgacg tcgattttgc catcggcggg gatcaaggcg gatcgatccg gatcccggcg 600 gcattctgcg gcgtcgtcgg gcacaagccg acgttcgggc tcgtcccgta taccggtgca 660 tttcccatcg agcgaacaat cgaccatctc ggcccgatca cacgcacggt ccacgatgca 720 gcactgatgc tctcggtcat cgccggccgc gacggtaacg acccacgcca agccgacagt 780 gtcgaagcag gtgactatct gtccaccctc gactccgatg tggacggcct gcgaatcgga 840 atcgttcgag agggattcgg gcacgcggtc tcacagcccg aggtcgacga cgcagtccgc 900 gcagcggcac acagtctgac cgaaatcggt tgcacggtag aggaagtaaa catcccgtgg 960 6 322941 1020 201137125 catctgcatg ctttccacat ctggaacgtg atcgccacgg acggtggtgc ctaccagatg ttggacggca acggatacgg catgaacgcc gaaggtttgt acgatccgga actgatggca cactttgctt ctcgacgcat tcagcacgcc gacgctctgt ccgaaaccgt caaactggtg gccctgaccg gccaccacgg catcaccacc ctcggcggcg cgagctacgg caaagcccgg aacctcgtac cgcttgcccg cgccgcctac gacactgcct tgagacaatt cgacgtcctg gtgatgccaa cgctgcccta cgtcgcatcc gaattgccgg cgaaggacgt agatcgtgca accttcatca ccaaggctct cgggatgatc gccaacacgg caccattcga cgtgaccgga catccgtccc tgtccgttcc ggccggcctg gtgaacgggc ttccggtcgg aatgatgatc accggcagac acttcgacga tgcgacagtc cttcgtgtcg gacgcgcatt cgaaaagctt cgcggcgcgt ttccgacgcc ggccgaacgc gcctccaact ctgcaccaca actcagcccc gcctag 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1566 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 3 7 322941 201137125 27 cgagctcgat ggcgacaatc cgacctg <210> 4

<211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 4 gggtacccct aggcggggct gagttg 26 8 322941

Claims (1)

1. 201137125 七、申請專利範圍： 1. 一種5-(胺基曱基）-2-氣噻唑之製造方法，其包含下述 步驟： 反應步驟’係對於如式（2)所示之N-胺甲酿基胺基 化合物，使藉由將聚核苷酸導入微生物細胞内所得之轉 形體的培養物或其處理物進行作用之步驟； α_}^人叫（2) 其中’該聚核苷酸包含編碼具有將該Ν_胺曱醯基胺基 化合物轉換為相對應之5-(胺基曱基）-2-氯噻唑的能 力之酵素之胺基酸序列的驗基序列。 2. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中，前述酵 素係具有下述任一胺基酸序列之酵素： a) 如序列編號1所示的胺基酸序列； b) —種胺基酸序列，其係與由序列編號2所示之鹼基序 列所構成之DNA在嚴苛條件下進行雜合的dm鹼基序列 所編竭之胺基酸序列，且為具有將前述N_胺曱醯基胺 基化合物轉換為相對應之5-(胺基甲基）-2-氯噻唑的 能力之酵素之胺基酸序列；或 C)一種胺基酸序列’其係在序列紐1所*的胺基酸序 列中缺失、取代或加成丨個或複數個胺基酸之胺基酸序 且為具有將前述卜胺甲醯基胺基化合物轉換為相 對應之5-(胺基甲基）_2—氣射的能力之酵素之胺基 322941 1 201137125 酸序列。 3. —種藉由將聚核苷酸導入微生物細胞内所成之轉形體 的培養物或其處理物的用途，係用於作為將式（2)所示 之N-胺曱醯基胺基化合物轉換為相對應之5-(胺基甲 基）-2 -氯°塞β坐的催化劑；

   其中，該聚核苷酸包含編碼具有將該Ν-胺曱醯基胺基 化合物轉換為相對應之5-(胺基曱基）-2-氯噻唑的能 力之酵素之胺基酸序列的鹼基序列。 4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中，前述酵素係 具有編碼序列編號1所示的胺基酸序列之鹼基序列的 酵素。 5. —種5-(胺基曱基）-2-氣坐之製造方法，其包含下述 步驟： 前步驟，係對於式（1)所示之異尿素化合物，使具 有將該異尿素化合物轉換為相對應之Ν-胺曱醯基胺基 化合物的能力之酵素或具有產生該酵素的能力之微生 物的培養物或其處理物進行作用，而獲得式（2)所示之 Ν-胺曱醯基胺基化合物之步驟；

   2 322941 201137125 [式中，R表示直鏈狀或環狀之烷基，該烷基亦可具有 取代基，且該烷基之碳原子數為1至6]

   以及 反應步驟，係對於前步驟所得之N-胺曱醯基胺基 化合物，使藉由將聚核苷酸導入微生物細胞内所得之轉 形體的培養物或其處理物進行作用之步驟；其中，該聚 核苷酸包含編碼具有將該N-胺甲醯基胺基化合物轉換 為相對應之5-(胺基曱基）-2-氯噻唑的能力之酵素之 胺基酸序列的鹼基序列。 6.如申請專利範圍第5項所述之製造方法，其中，具有將 前述N-胺甲醯基胺基化合物轉換為相對應之5-(胺基 曱基）-2-氯噻唑的能力之酵素，係具有序列編號1所示 的胺基酸序列之酵素。 3 322941 201137125 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（）圖。（本案無圖式) (二) 本代表圖之元件符號簡單說明：（無） 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： CI

   nh2 乂 (2) 322941