TWI321151B - - Google Patents

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1321151 (1) 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於藉由來自自然界所分離出的新微生物之 新穎腈水解酶之酵素觸媒作用而由腈化合物製造出醯胺化 合物之技術。 【先前技術】 對於將腈化合物的腈基基水合後使其轉變成醯胺基所 對應的醯胺化合物之製造技術中，取代藉由過去的銅觸媒 之化學方法而使用以微生物的酵素作爲觸媒之方法成爲主 流。該酵素一般稱爲腈水解酶，但自出初次的報告以來， 多數的酵素由種種微生物中被發現。例如可舉出關節桿菌 屬（Arthrobacter )屬（Agricultural and Biological Chemistry Vo 1.44 p . 2 2 5 1 - 2 2 5 2,1 9 8 0 ) 、農桿菌 (Agrobacterium )屬（特開平 05-103681 )、擬似菌 (Acinetobacter)屬（特開昭 61-282089 )、氣單胞菌 (Aeromonas ) 屬（特開平05-030983 )、腸內桿菌 (Enterobacter )屬（特開平05 -2 3 69 7 5 )、伊文氏桿菌 (Erwinia)屬（特開平 05-161496 ) 、Xanthobacter 屬 (特開平〇5_161495 )、克列伯氏桿菌（Klebsiela )屬 (特開平 05-030982)，棒狀桿菌（Corynebacterium)屬 (特開昭54-129】90，後來判斷爲紅球菌屬）、綠膿菌 (Pseudomonas)屬（特開昭58-86093 )、檸檬酸桿菌 (C i t r 〇bac t er )屬（特開平 〇 5 - 0 3 09 8 4 )、放射線菌 (2) (2)1321151 (Streptomyces )屬（特開平 05-236976 )、桿囷 (Bacillus)屬（特開昭 51-86186、特開平 7·255494) ' 鐮胞菌屬（特開平01-086889)、紅球菌（Rhodococcus) 屬（特開昭6 3 - 1 3 76 8 8、特開平02-22 7069 '特開2002-369697 ' 特開平 2-470)、根瘤菌（Rhizobium )屬（特 開平 05-236977 ) ' 假諾卡氏菌（Pseudonocardia)屬（特 開平8-56684)等。這些酵素依據其胺基酸序列的多樣化 使其理化性質上亦爲多樣化，隨著各種目的而進行硏究。 作爲理化學性質中有關對於熱或醯胺化合物及腈化合物等 之安定性之硏究例子可舉出有關Rhodococcus rhodochrous J1 菌株之文獻（European Journal of Biochemistry Vol.196 p.581-589, 1 9 9 1. Applied and Microbiology Biotechnology V〇1.40 p.1 89- 1 95, 1 993.)、有關嗜熱假諾卡氏菌 (Pseudonocardia t h erm oph i 1 a ) J CM 3 0 9 5 株之文獻（特開 平 8- 1 8 7092、Journal of Fermentation and Bioengineering Vol. 83 ρ.474·477，1 997 )、有關桿菌（bacillus )屬 BR449 株之文獻(W 99/55719. Applied Biochemistry and Biotechnology Vol .77-79 p.671 -679, 1 9 9 9 )、有關 桿菌（bacillus )屬 RAPc8 株之文獻（Enzyme and Microbial Technology Vol.26 p.368-373, 2 0 0 0.

Extremophiles V o ]. 2 p.347-357， 1 9 9 8 )、有關 Bacillus palidus Dac52l株之文獻（Biochimica et Biophysica+Acta Vol.1431 p.249-260, 1 999 ) ' 有關 B a c i 11 u s s m i t h i i S C- J05-1株之文獻（Journal of Industrial Microbiology and -6- (3) 1321151

Biotechnology v〇1.20 2 2 0-226, 1 998 ) 〇

另一方面，使用這些特定的腈水解酶由腈化合物以I 業方式製造醯胺化合物時，醯胺化合物的製造成本中 酵素之製造成本爲重要之問題，可望使用確立工業水準 養法的宿主進行生產。因此以藉由基因工學方法使腈水g 酶大量表現爲目的，對於基因選殖進行檢討。例如綠膿胃 屬（特開平3-251 184)、紅球菌屬（特開平2-119778、特 開平 4-211379、特開平09-00973、特開平07-099980、特 開2001 -069978 ) '根瘤菌屬（特開平6-25296 )、克氏桿 菌屬（特開平6-303971 )、無色桿菌屬（特開平08_ 266277)、假諾卡氏菌屬（特開平9-275978)、桿菌屬 (特開平09-248 1 88 )等。 【發明內容】

作爲酵素的物理化學性質，以具有熱安定性或基質的 腈化合物或生成物之醯胺化合物爲高濃度下亦保持高度活 性之腈水解酶爲佳，雖已有具有該目的的報告，但因使用 於反應的酵素之實施型態、腈化合物的種類之不同使得該 絕對値有所變動，無法發現兼備所有性質之酵素。又，今 後使用進化工學等物理化學性質之改良作爲題材者’亦可 望開發出至今來源未被發現的多樣酵素。 使用進化工學的物理化學性質之改良’基因選殖與表 現爲必要之手段，由上述的醯胺化合物製造中之酵素生產 相關成本制度得知，可望製造出使用培養法經確1的宿主 (4) (4)1321151 之基因重組菌株。 即，本發明的目的爲提供一種由自然界中分離出對於 熱或高濃度化合物具有高安定性的腈水解酶，由該酵素的 生產方法及使用該酵素的腈化合物所對應的醯胺化合物之 製造方法。且提供該酵素的胺基酸序列及基因序列，以及 提供含有該基因的重組質體、含有該重組質體的轉形菌 株、使用該轉形菌株的該酵素產生方法及使用該轉形菌株 之腈化合物所對應的醯胺化合物之製造方法；本發明又提 供一種具有由該重組體之腈水解酶活化作用之蛋白質的胺 基酸序列及基因序列。 本發明者欲解決上述課題，進行詳細硏究結果，由埼 玉縣的溫泉旁的土壤分離出具有腈水解酶之微生物爲 Geobacillus thermogiucosidasius 。民，至今未知 屬微生物具有腈水解酶，而顯示腈水解活性。 又本微生物的培養一般使用65 °C的溫度，此溫度爲超過過 去具有腈水解酶之好熱性菌的一般培養溫度（45 °C〜60 °C )。 又，由該微生物所純化之腈水解酶酵素，其活性顯示 對於熱或高濃度腈化合物、及醯胺化合物爲兼備高安定 性。又，以純化酵素之各亞單位的N末端胺基酸序列爲 準，由該微生物的染色體DN A分離出腈水解酶基因，初次 解明該胺基酸序列及基因序列的結果，發現與既有的腈水 解酶之相同性非常低。又，推斷爲存在於該基因下游的活 化蛋白質之基因序列表現的同時’成功地製作出大量表現 (6) (6)1321151 組合所成之DNA ; (B)編碼具有對於含有序列表之序列號碼：1所記載 的胺基酸序列之α亞單位、與含有序列表之序列號碼：2 所記載的胺基酸序列之/3亞單位的任一方、或雙方而言’ 1或複數個胺基酸經取代、缺失、加成、轉譯後經修飾之 改變或無改變之α亞單位、或改變或無改變之/3亞單位’ 且具有腈水解酶活性之蛋白質的DN Α。 (3 ) —種DNA，其特徵爲如下（C)或（D)的任一 DNA， (C )含有序列表的序列號碼：3的鹼基序列之第695 · 1 3 1 2位置序列之DN A '與含有序列表的序列號碼3的鹼基 序列之第1〜68 1位置序列之DNA的組合所成爲特徵的 DNA、 (D)編碼包含具有序列表的序列號碼：3的鹼基序 列之第695〜1312位置序列之DNA、或對於該DNA以嚴謹 條件下進行雜交之DNA中任一 DNA所編碼之α亞單位、 與具有序列表的序列號碼：3的鹼基序列之第1〜6 8 1 位置序列之DNA、或對於該DNA以嚴謹條件下進行雜交織 DNA中任一DNA所編碼之；8亞單位， 且具有腈水解酶活性之蛋白質的DNA ;但除上述 (C )的情況以外。 (4 )如（1 )至（3 )中任一項之DN A ’其中再組合 含有編碼序列表的序列號碼：4所記載的胺基酸序列之鹼 基序列的DN A、或編碼其胺基酸序列中的]或複數個胺基 -10- (10) 1321151 (A )含有序列表之序列號碼·· 1所記載的 列之α亞單位、與含有序列表之序列號碼：2所 基酸序列之Θ亞單位基因之蛋白質； (Β )含有對於含有序列表之序列號碼：1所 基酸序列之α亞單位、與含有序列表之序列號® 載的胺基酸序列之沒亞單位的任一方、或雙方ff 複數個胺基酸經取代、缺失、加成、轉譯後經修 或無改變之α亞單位、或改變或無改變之/9亞單 有腈水解酶活性之蛋白質。 (19) 一種蛋白質，其特徵爲如下（C)或 任一蛋白質， (C) 編碼含有序列表的序列號碼：3的鹼基 6 95 -13 12位置序列之DNA的α亞單位、與編碼含 的序列號碼3的鹼基序列之第]〜6 8 1位置序列之 亞單位的蛋白質； (D) 包含具有序列表的序列號碼：3的鹼 第695〜13]2位置序列之DNA、或對於該DNA以 下進行雜交之DNA中任一 DNA所編碼之α亞單位 與具有序列表的序列號碼：3的鹼基序列之 位置序列之DNA、或對於該DNA以嚴謹條件下進 DNA中任一DNA所編碼之/3亞單位， 且具有腈水解酶活性之蛋白質；但除上述（ 況以外。 (20) —種蛋白質，其特徵爲至少含有任— 胺基酸序 記載的胺 記載的胺 看：2所記 0言，1或 飾之改變 位，且具 :(D )的 序列之第 有序列表 DNA 的 /S 基序列之 嚴謹條件 、 第1〜681 行雜交織 C )的情 方或兩者 -14- (15) (15)1321151 胺基酸經取代、缺失、插入、或轉譯後修飾之胺基酸序列 亦爲較佳例子。較佳爲1〜10個，更佳爲1〜5個，最佳爲1 〜3個。且’具有如此經取代、缺失或插入的胺基酸序列 之腈水解酶’可藉由公知的部位專一性突變導入法，例如 Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)所記載的方法，使用導入於對應的 鹼基序列之部位上進行取代 '缺失、或插入之dna，如後 述’導入宿主微生物後使其表現而得到，亦可嘗試製造出 可提高熱安定性或耐有機溶液性、或賦予基質專一性之變 化等之產業上可望的性質的突變酵素。有鑑於相關技術的 水準，這些具有腈水解酶活性時亦包含於本發明中。 又，本發明係如上述（1 9 )所記載的例子，這些爲對 本發明的DHA之詳細說明。 具有如上述物理化學性質的腈水解酶，例如可由培養 GeohcH/w屬之微生物而取得。本發明中所使用的微生 物，僅係屬屬，且具有將腈化合物轉變成醯胺 化合物之水合活性的微生物皆可。作爲屬GeohcH/M屬微 生物，可舉出 kausiophilus 、 Geobacillus lituani cus 、 Geobacillus stearothermophilus 、 Geobacillus subterraneus 、 Geobacillus thermocatenulatus 、 Geobacillus thermodenitrificans 、 Geobacillus thermoglucosidasius 、 Geobacillus thermoleovorans 、 Geobacillus to ebii 、 。又，雖無特別限定爲來自 -19- (16) (16)1321151 屬的微生物，亦含有來自其他微生物之腈水解 酶基因。作爲如此微生物可舉出農桿菌 (Agrobacterium)屬、無色桿菌屬（Achromobacter) 屬、擬似菌 （Acinetobacter ) 屬、氣單胞菌 (Aeromonas )屬、腸內桿菌（Enterobacter)屬、伊文氏 桿菌 （Erwinia) 屬、Xanthobacter屬、克列伯氏桿菌 (Klebsiela )屬、棒狀桿菌（Corynebacterium )屬、中 國根瘤菌屬（sinorhizobium)、綠騰菌（Pseudomonas) 屬、放射線菌（Streptomyces)屬、Norcardia屬、桿菌 (Bacillus)屬、鐮胞菌屬、球菌（Micrococcus)屬、紅 球菌 （Rhodococcus ) 屬、紅假單細胞屬 (Rhodopseudomonas)屬、根瘤菌（Rhizobium )屬、 假諾卡氏菌（Pseudonocardia)屬等。具體而言本發明可 由下述方法進行篩選。首先，於種種場所所採集的少量土 壤，放入裝有水或生理食鹽水的試管內，經2天至14天， 65 °C的震動培養器中進行震動培養。取出一部份的培養 液，放入含有一般使用於微生物的培養基之主要成分，例 如甘油、聚臃、酵母菌萃取物等之液體培養基中，於65°C 的培養溫度下，經1天至7天的培養。由此所得之一部份培 養液’塗抹於含前述微生物生長用培養基成分之洋菜平面 培養基進行65 °C的再培養後形成菌落，進而分離出微生 物。如此所得之微生物，使用裝有於前述培養基成分中再 加入正戊腈等腈化合物或甲基丙烯醯胺等醯胺化合物之液 體培養基之試管 '或錐形瓶中，於適當時間、例如約1 2小 -20- (18)1321151 3 .運動性：+ 鞭毛的著毛狀態：周毛 4.胞子：一 胞子的部位·‘端部 (b ) 培養性質

培養條件：營養瓊脂膠（Oxoid, England, UK)培養 基 6 0T： 1 .顏色：奶油色 2. 光澤：+ 3. 色素生產：_ 培養條件：營養液體（Oxoid，England，UK)培養基 6 or 1 .表面生長：_ 2.培養基的混濁：+

培養條件：明膠穿刺培養 60t 1. 成長狀態：+ 2. 明膠液化：+ 培養條件：石蕊牛奶培養基 6 〇t 1. 凝固：一 2. 液化：一 生理學性質 1.革氏染色：不定 -22- (19) (19)1321151 2 .硝酸鹽的還原：一 3 .脫氮反應：_ 4 . M R測試：一 5.VP測試：— 6 .吲哚的生成：一 7 .硫化氫的生成：一 8.檸檬酸的利用 Κ 〇 s e r :—

Christensen:— 9 .無機氮源的利用 硝酸鹽：一 銨鹽：+ 1 0.色素的生成：一 11. 酶活性：_ 1 2 .氧化酶：+ 1 3 .過氧化氫：+ 14.生長的範圍 pH : 5.5 〜8_0 溫度：4 5 °C〜7 2 °C 1 5 .對於氧之反應：兼性厭氣性 16.0-F測試：—/ — (d)由醣類產生酸：產生氣體 1 . L-阿拉伯糖 -/ - -23- (20) (20)1321151 2. D-木糖 + / — 3. D-葡萄糖 + /_ 4. D-甘露糖 + /_ 5· D·果糖 +/ — 6. D-半乳糖 —/ — 7-麥芽糖 + / — 8. 蔗糖 + / — 9. 乳糖 一 / — 1 〇.海藻糖 + / — 11. D-山梨糖醇 —/一 12. D·麥芽糖醇 + / — 1 3 .肌醇 —/ ~ 14.甘油 一/ — (e )其他性質 1 · Θ -半乳糖苷酶活性：一 2 精胺酸二水解酶活性：_ 3. 賴胺酸脫羧基酶活性：- 4. 色胺酸脫胺酶活性：- 5. 明膠酶活性：+ 本發明中所使用的微生物之培養方法，依據一般微生 物培養方法進行，可爲固體培養或液體培養。

爲兼性厭氣性的微生物，故可與一般 兼性厭氣性微生物相同的培養條件下進行培養》培養溫度 可依據微生物的生長範圍作適當的變化，例如40 °C〜75 °C •24- (22) (22)1321151 編碼各α亞單位及亞單位，但並未限定於此，僅含有該 鹼基序列之DN A即可。又，與這些序列互補的鹼基序列所 成之DNA，既使於嚴謹條件下可雜交的DNA，若具有腈水 解酶亦包含與本發明中。作爲嚴謹條件，例如使用ECL direct nucleic acid labeling and detection system (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH 公司製作），手冊 上所記載的條件（洗淨溫度：42 °C，含有0.5 x S SC的第一 次淸洗緩衝液）。作爲於嚴謹條件下可進行雜交的DNA， 例如於前述的嚴謹條件下，作爲檢測出含有序列表的序列 號碼：3的鹼基序列之第695 - 1 3 1 2位置序列之DNA與含有 序列表的序列號碼3的鹼基序列之第1〜6 8 1位置序列之 DNA之互補鹼基序列中，一般至少20個、較佳爲至少50 個、特佳至少1 00個連續鹼基序列之檢測試料，可舉出與 此雜交的DNA。 編碼本發明的腈水解酶之DNA，可由下述方法得到。 本案說明書中，若無特別記載，可採用該領域下公知的基 因重組技術 '重組蛋白質之生產技術、分析法。 編碼本發明的腈水解酶之DNA，可依具本案說明書所 揭示的鹼基序列、或胺基酸序列、若需要由前述純化酵素 所決定之胺基酸序列等序列資訊，由含有本發明腈水解酶 之微生物’例如由 thermoglucosidasius Q-6 株取得。依據胺基酸序列所合成之寡核苷酸作爲探針使 用’以限制酶分解含有腈水解酶之微生物的染色體DN A之 DN A片段導入噬菌體或質體中，由宿主轉形所得之片段， -26- (23) (23)1321151 依據斑點雜交或菌落雜交可得到編碼本發明腈水解酶之 DNA。又，不以寡核苷酸作爲探針，依據前述純化酵素所 決定之兩亞單位的N末端胺基酸序列資訊等製造出引子， —部份腈水解酶基因依據P C R增幅者作爲探針，亦可同樣 過程取得。所得之DNA、質體載體、例如插入於Pucl 1 8進 行選殖’以二脫氧終結法（Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 74: 5463 - 5 46 7, 1 9 7 7 )等公知 方法進行鹼基序列定義。如此所調製的基因可經由，使用 該基因進行轉形之大腸桿菌宿主中的表現產物經前述記載 的一般活性測定方法而確認出編碼腈水解酶之DNA。 且，本發明提供以上述DNA連結於載體爲特徵之重組 載體。 本發明的重組載體爲，於適合宿主微生物的啓動子區 域之下游上’欲發揮其功能與如上述方法所得之DNA的5’ 末端連結，若必要該下游插入轉錄終止序列，與適當的表 現用載體連結而調製出。 作爲適當的表現載體，於宿主微生物內可複製增殖者 即可並無特別限定。又，可將染色體上插入基因的宿主即 可，該宿主無須具有自身複製的區域。例如，作爲宿主若 使用大腸桿菌，則含有強力啓動子，例如含有 lac 、 trp ' tac、trc、T7 ' PL或丙酮酸氧化酶基因之啓動子（專利公 報第 25 795 06 號）等 pUC 系、pGEX 系 ' PET 系、pT7 系、 pBluescript 系、ρΚΚ 系、pBS 系、pBC 系、pCAL 係等，可 由一般大腸桿菌所使用的任意載體選出。又，石亞單位基 -27- (24) (24)1321151 因及α亞單位基因可由各啓動子作爲獨立作用子而表現。 且獨立作用子的情況下，各亞單位基因可爲其他載體的上 面。 且，本發明中，發現上述腈水解酶的重組載體上，藉 由插入表現本發明腈水解酶基因下游的基因之DNA，可提 高腈水解酶活性，亦提供該載體。具體而言，使用含有與 上述相同之表現上必須的啓動子或轉錄終止因子等之質體 載體，將編碼與腈水解酶活化相關之蛋白質的基因、腈水 解酶的α亞單位基因及/3亞單位基因作爲各自獨立的作用 子而表現，或藉由共通控制區域作爲聚作用子而表現亦 可。同樣地，各基因可於其他載體上。 本發明中提供編碼與腈水解酶活化相關之蛋白質的 DNA。具體而言，可舉出序列表的序列號碼：3的鹼基序 列之第1 3 25〜1 66 3位置，但並未限定於此，僅含有該鹼基 序列之DN Α即可。又，對於與這些序列互補的鹼基序列所 成之DNA，係爲於嚴謹條件下進行雜交的DNA，僅與腈水 解酶活化相關亦包含於本發明中。即，使用這些DN A可活 化本發明的腈水解酶。作爲嚴謹條件，例如使用ECL direct nucleic acid labeling and detection system (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH 公司製作），手冊 上所記載的條件（洗淨溫度：42°C，含有〇·5 xS SC的第一 次淸洗緩衝液）。作爲於嚴謹條件下可進行雜交的DNA ’ 例如可舉出於前述的嚴謹條件下，與含有序列表的序列號 碼：3的鹼基序列之第1 3 2 5 - 1 66 3位置序列互補的鹼基序列 -28- (25) 1321151 中任意’一般爲至少20個’較佳爲至少5〇個，特佳爲至少 1 0 0個之連續鹼基序列作爲檢測試料，與此雜交的D n A。 又’與本發明的腈水解酶活化相關的蛋白質，係爲序列表 的序列號碼：4所示的1 1 2個胺基酸序列所示的蛋白質，僅 具有與腈水解酶活化相關能力，亦可具有胺基酸序列中， 1或複數個胺基酸之取代、缺失、或插入之胺基酸，依據 宿主種類’可容易推測出轉譯後進行修飾。該胺基酸序列 之中1〜2 5個胺基酸可經取代、缺失 '插入或轉譯後修飾 之胺基酸序列亦爲較佳例子。較佳爲1〜1〇個，更佳爲1〜 5個，最佳爲1〜3個。 又’本發明提供以上述DNA導入宿主細胞後使其轉形 爲特徵的轉形體。 轉形體爲使用上述方法所製得之表現載體，宿主細胞 經由轉形而取得。作爲宿主細胞可包含微生物、哺乳動 物、及植物細胞等’其中以利用微生物爲佳。作爲微生物 的例子可舉出如後述實施例中之大腸桿菌，雖無特別限 定’但可舉出假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、鏈球 菌屬、赤球菌屬 '放線菌屬或酵母菌屬等。 作爲將基金導入宿主微生物之方法，例如可舉出轉 形、形質導入、接合傳達 '或電擊法等該技術領域下爲公 知的任意方法，導入較佳宿主中。 且作爲本發明的腈水解酶或含有其之菌體處理物的製 造方法’如前述可由生產該腈水解酶之微生物、例如 屬微生物，特佳爲 -29- (26) 1321151 q_6株之培養物中使用組合公 化方法取得該酵素，且又可由如上述使用腈水解酶 經轉形所得之轉形體而取得。 取得該酵素時，屬微生物的培養方 述’但上述轉形體一般於含有這些微生物可分解之 的培養基中進行培養爲佳，例如可於生產酵素或抗 一般方法下進行培養。培養一般可使用液體培養或 養。例如可使用葡萄糖、蔗糖等碳水化合物；山梨 甘油等醇類；檸檬酸'乙酸等有機酸；大豆油碳素 些混合物；酵母萃取物、肉萃取物、硫胺、氨等含 有機氮源；磷酸鹽、鎂、鐵、鈷、錳、鉀等無機營 及適當混合生物素、硫胺素等維他命類之培養基。 如此培養基成分中加入0. IMg/mL以上之鐵離子或鈷 佳。培養條件一般於好氣條件下進行爲佳。培養溫 可生長宿主微生物之溫度即可並無特別限定。一舟 〜80 °C ’較佳爲20〜70 °C，更佳爲25〜42 t下進行 培養途中之pH僅爲可使微生物生長之pH即可並無 定’一般爲pH3〜9、較佳爲PH5〜8'更佳爲PH6、 行。 又’本發明中可使用本發明的酵素製造出腈化 該發明中’使用前述酵素時，僅不阻礙本發明的 用，對於其純化程度等並無特別限定，除經純化的 之酵素以外，可使用含有該酵素的物質，且可使用 酵素的微生物或導入該酵素基因後經轉形的轉形體 知的純 的基因 法如前 營養源 生素等 固體培 糖醇、 源或這 氮無機 養源； 較佳爲 離子爲 度僅爲 J 爲 5°C 。又， 特別限 -7下進 合物。 酵素作 本發明 生產該 等。使 -30· (27) (27)1321151 用微生物或轉形體等時，可利用菌體本身，作爲菌體可使 用活菌體、或以丙酮或甲苯等施予溶劑處理或冷凍乾燥等 處理’增加其化合物透過性之菌體。依據其情況，可成爲 菌體破碎物或菌體萃取物等之酵素含有物。含有該酵素的 菌體處理物之作成方法可舉出，首先分離培養物的固體及 液體’所得之濕菌體因應需要可懸浮於磷酸緩衝液或三鹽 酸緩衝液等緩衝液中，其此使用超音波處理、高壓破碎處 理或使用玻璃珠子的粉碎處理，或適當組合溶菌酶或蛋白 酶等細胞壁溶解酵素進行處理等菌體破碎處理，及菌體內 萃取出該酵素，得到粗製的含腈水解酶之液體。將該粗製 的酵素含有液，因應必要，藉由公知的蛋白質、酵素等分 離、純化方法，可再進一步地純化。例如，於粗製的酵素 含有液中，加入丙酮、乙醇等有機溶劑使其分離沈澱、或 加入硫胺使其進行鹽析，再由水溶液中沈澱分離出含有腈 水解酶之部分的回收方法。又，可使用陰離子交換、陽離 子交換、膠體過濾、抗體或螯合劑之親和層析法等適當組 合下進行純化。當然酵素或菌體、含有酵素的菌體處理物 等，可由公知方法塡充於柱子中或固體於載體上，特別爲 菌體之情況，可包埋於聚丙烯醯胺膠體等高分子中。將菌 體或菌體處理物懸浮於水或磷酸緩衝液等之緩衝液等水& 水溶液中，於此加入腈化合物而進行反應。所使用的菌n 或菌體處理物之濃度爲〇.〇1重量％〜2〇重量％，較佳爲 0.1重量％〜10重量％。反應溫度的上限較佳爲90 t，吏 佳爲8 5 °C，最佳爲70 °C，反應溫度的下限例如爲It，較 -31 - (28) (28)1321151 佳爲4°C，更佳爲10°C，反應pH例如爲5〜10，較佳爲6〜 8，反應時機例如可舉出1分鐘〜72小時。又，藉由腈化合 物的徐徐滴入，可將醯胺化合物生成累積至高濃度。由反 應液回收醯胺化合物的方法可舉出過濾或離心分離菌體或 菌體處理物等後取出，再以晶析等方法回收。 【實施方式】 以下舉出實施例對本發明作更詳細的說明，但這些實 施例並未能限定本發明的範圍。 實施例〗：菌體分離 於埼玉縣溫泉旁所採樣的少量土壤（約1 g )，放入裝 有5ml生理食鹽水之試管內，經3天，65 °C的震盪培養機內 震盪培養。取出一部份的該培養液（〇.5ml)，加入1.0重 量％的葡萄糖、0.5重量％的聚腺、0.3重量％的酵母菌萃 取物所成之培養基（PH7.0 )中，經2天65°C的重複震盪培 養。由此所得之一部份培養基（〇.1 mL )塗抹於含前述培 養基成分的洋菜平板培養基上，於65 °C下再培養2天後形 成菌落，分離出微生物。將所分離出的微生物接種於與上 述相同組成培養基中添加〇·1重量％正戊腈之液體培養基 後，於65 °C下培養24小時後得到具有高腈基分解力的微生 物之培養液。將該1 ml的培養液中加入9ml的1 .1重量％的 丙烯腈溶液（0.05M·磷酸緩衝液，ρΗ7·7)，於反應溫度 爲27°C下進行反應。10分鐘後，加入lml的IN HC1後反應 -32- (29) 1321151 停止。一部份的反應液以hplc進行分析，藉由檢定丙烯 醯胺的有無，篩選出具有腈水解酶活性之微生物。作爲具 有如此腈化合物轉變成醯胺化合物之水和活性之微生物得 Geobacillus thermoglucosidasius Q-6株。 (液體層析法分析條件） 本體：HITACHI D-7000 (日立公司製作） 柱子；Inertsil ODS-3 (GL 科學公司製作）

長度；2 0 0 m m

柱溫度；3 5 °C 流量；1 m 1 / m i η 樣品注入量；1 Ο μ 1 溶液；o.l Wt%磷酸水溶液 實施例2:菌體培養之生長上限溫度 將施例 1所得之 thermoglucosidasius Q-

6株塗佈於含用於實施例1的培養基成分之洋菜平板培養基 上’於複數種相異溫度下進行培養，調查其菌體生長情 形。其結果如表 1所不。ί/ier/Mog/wcosiVfli/wj Q-6株於70°C下顯示一般增殖，且於72。(：下亦可能生長。 -33- (30) 1321151 表1 評估基準：一無增殖；+增殖；++增殖情況良好 培養溫度 (°C ) Geobacillus thermoglucosidasius Q-6之增殖度 20 30 40 • 50 + + 60 + + 65 + + 7 0 + + 72 + 75 參 實施例 3: /Aer/Mo容/ wcohi/asiws Q-6株菌體 中之腈水解酶活性測定與其溫度依賴性 將裝有100ml的含有0.2重量％的甘油、0.2重量％的 檸檬酸三鈉二水合物、0.1重量％的磷酸二氫鉀、0.1重量 %的聚腺、0.〗重量％的酵母菌萃取物、0.1重量％的氯化 鈉' 1重量％的正戊腈、〇.〇2重量％的硫酸鎂七水合 物、0.003重量％的硫酸鐵（Π)七水合物、0.0002%的氯 化鈷六水合物之經殺菌培養基（PH7.0)之500ml的三角錐 形瓶中，接種另外以相同培養基培養的 株之培養液 lml。將此於 65cC 下培 -34- (31) (31)1321151 養一天，於200stroke/min下轉動震盪培養，得到菌體培養 液。將 300ml 的該 thermoglucosidasius Q-6 株菌體培養液藉由離心分離（1 0000 xg，15分鐘）收集菌 體，以0.05M磷酸緩衝液（PH7.5 )洗淨後，懸浮於50ml的 相同緩衝液中。對於如此調製出的菌體懸浮液，以上述方 法反應5分鐘，測定出腈化合物轉變成醯胺化合物之水合 活性。酵素活性的單位（unit )定義爲，1分鐘內將1 μηι〇1 之丙烯腈基轉換成丙烯醯胺之活性作爲I單位（以下稱爲 U )，於27°C中每單位濕菌體的腈水解酶活性（U/mg )爲 9.37U/mg。且於10°C下調製出5U/ml之含0.5重量％的丙烯 腈之菌體懸浮液，使用菌體懸浮液，於30 °C、40 °C、50 °C、6 0 °C、7 0 °C的條件下求得相同的腈水解酶活性，如表 2所示。其結果，使用菌體反應時的最適溫度爲60°C左 右，顯示高溫區域下特高活性。 表2 反應溫度（°c ) 腈水解酶活性（U / m 1) 10 5.0 30 19.2 40 39.4 50 49.2 60 50.6 70 42.4 -35- (32) 1321151 體中腈水解酶之熱安定性 對於 Q-6株的囷體中 腈水解酶活性之熱安定性進行調查，將實施例3的培養法 所得之菌體懸浮於蒸餾水終至Ιθυ/ml，進行30分鐘的所定 溫度保溫處理，測定其殘存活性。於0.5 ml的1重量％丙烯 腈溶液（0.05M磷酸鉀緩衝液，ρΗ7·5)中加入〇.5ml的經 保溫處理後之菌體液，於27 °C攪拌下開始反應。經5分鐘 後，加入100 μί的1當量鹽酸使反應停止。算出對於保存 處理前的活性之保存處理後的活性，以保存處理前的活性 做爲基準（1 00 )所得之換算値如表3所示。由此結果得 知，i/jerwo容/ wcoiz’dahwi· Q-6株的菌體中之 腈水解酶活性於高溫下亦可保持安定，且於70°C的高溫下 亦可保持80%以上的活性，於80°C的高溫下還可保持30 % 以上的活性。 ‘ 表3 處理溫度rc ) 活性（U/ml) 殘存活性（％) _ 30 5 100 40 4.8 96 _5〇 4.5 90 _ 6〇 4.4 88 70 4.2 84 80 1.6 32 實施例5 :各種腈化合物作爲基質之反應 -36- (33) 1321151 對於下述表4所記載的各種腈化合物轉變爲所對應的 醯胺化合物之腈水解酶活性作調查。9 m 1的1 . 1 %腈溶液 (0,0 5 Μ磷酸鉀緩衝液，p Η 7 · 5 )中加入1 m 1的具體懸浮 液，於反應溫度3 0 °C下開始反應。1 〇分鐘後，加入1 m 1的 IN HC1使反應停止。HPLC的分析條件雖與實施例1相同， 但含有1 Owt%的丙烯腈之溶液作爲蒸餾水。其結果顯示所 有皆具有腈水解酶活性。 表4 提供測試的腈化合物 己二腈 正丁腈 乙腈 己腈 異丙腈 苯甲腈 正戊腈 實施例6以下所記載的來自 GeoftflCiV/w·? thermoglucosidasius Q_6株之睛水解酶ύ!亞單位 (ORF2 ) '冷亞單位（ORF1 )及腈水解酶活化因子 (ORF3 )之胺基酸序列及鹼基序列之本發明的解明流程 槪要如下所記載。 培養 Geobacilius Aermog/wcos /dan’ws Q-6株所得之 菌體經絞碎後以硫酸銨之沈澱物’以陰離子交換柱層析 法、DEAE柱、羥基磷灰石柱’進行膠體過濾層析法進行 透析，純化腈水解酶。 定義經純化的腈水解酶之a亞單位及沒亞單位之N末 -37- (34) (34)1321151 端約30殘基之胺基酸序列，考慮到使用基於該菌屬的胺基 酸密碼子，製造出基因增幅用寡核苷酸退化引子，由該菌 體所萃取的染色體DN A作爲鑄型進行退化PCR，取得增幅 DN A片段。經增幅的DN A片段經選殖後定義。藉由該鹼基 序列所推測的胺基酸序列、與 GeobaciHus Mermog/wcohdahws Q-6株所純化出的腈水解酶α亞單位 及石亞單位之Ν末端胺基酸序列作比較，確認經選殖的序 列爲編碼腈水解酶者。 其結果 ’ Geobacilius iAerwog/MCOi'Woiz’w·?· Q-6 株 中，由5 ’末端側上游之腈水解酶基因以/3亞單位、α亞單 位的順序鄰接。 由公知的種種腈水解酶α亞單位之下游基因的相同性 較高序列，製造出基因增幅用寡核苷酸退化引子，由該菌 體所萃取的染色體DN Α作爲鑄型進行PCR退化，取得增幅 DNA片段。所得之該菌體的α亞單位部分之增幅DNA片段 經選殖而定易鹼基序列。 以上取得的 Q-6株 之腈水解酶α亞單位及亞單位導入適當的表現載體中。 使用構築之表現質體，使適當的宿主菌株進行轉形。作爲 宿主的例子可舉出紅球菌（Rhodococcus)屬、棒狀桿菌 (Corynebacterium)屬、大腸桿菌等。較佳爲不具有醯胺 酶的宿主爲佳。且培養所得之轉形體所得之菌體與丙烯菁 於水性媒體中藉由接觸而生成丙烯醯胺，比較其生成效率 及腈水解酶活性。 -38- (35) (35)1321151 其次’如上述所得之DN A片段作爲探針，進行菌落雜 父’選殖含有 Q-6株的 腈水解酶α亞單位及^亞單位之下游基因的周邊基因。 下游基因與腈水解酶α亞單位及$亞單位同時表現， 與腈水解酶活性作比較。其結果’發現下游基因係爲與腈 水解酶活性顯著提高之相關基因。 貫施例 6:來自 Geoiaci/Zw·? /Aermog/wcohi/flhwi Q-6 株 之腈水解酶的純化 培餐 Geobacillus Mermog/wcosit/as/ws Q-6株，提供 於種種柱子上而純化腈水解酶活性部分。 層析法中腈水解酶活性部分之測定方法如下進行。以 HEPES緩衝液（lOOmM，pH7.2)稀釋的各部分之溶離液 中添加1重量％的丙烯腈，於27°C下反應1分鐘。添加1N HC1添加於10液量％反應液中使反應停止，所生成的丙烯 醯胺濃度藉由實施例1所記載的HPLC分析法進行測定。 欲純化來自 thermogiucosidasius Q-6 株 的腈水解酶，首先於含有0.1重量％的正戊腈之V/F培養基 (0.2重量％之甘油、0.2重量％的檸檬酸3鈉2水合物、〇_1 重量％的磷酸2氫鉀、0.1重量％的磷酸氫2鉀、0.1重量％ 的聚腺' 0.1.重量％的酵母菌萃取物、〇·〗重量％的氯化 鈉、0」重量％的正戊腈' 0.02重量％的硫酸鎂7水合物、 0.003重量％的硫酸鐵（II) 7水合物、〇.〇〇〇2重量％的氯 化鈷 6水合物）植菌 thermoglucosidasius Q- -39- (36) (36)1321151 6株，經65°C下培養24小時。培養使用96孔2ml的深底培養 皿（COSTAR公司）。培養終了後，經8000g，1〇分鐘之 離心分離收集菌體，將3g的所得之濕菌體再懸浮於HEPES 緩衝液（lOOmM，pH7.2)。冷卻菌體後使用超音波破碎 機進行破碎後，菌體破碎液中加入硫酸銨（3 0 %飽和濃 度）於4°C下緩和攪拌30分鐘，進行20 OOOg，10分鐘的離 心分離，得到澄淸液。離心澄淸液中加入硫酸銨（%飽 和濃度）於4°C下緩和攪拌30分鐘後，進行20000g，10分 鐘的離心分離後得到之沈澱物於9ml的HEPES緩衝液 (lOOmM，ρΗ7·2)進行再溶解，對於1L的同液於4°C下進 行24小時的透析，提供於陰離子交換層析法（Amersham 生化科學公司；HiTrap DEAE FF (柱子體積5mL X 5 根））。延展液使用HEPES緩衝液（100mM，pH7.2)， 將氯化鉀濃度由0.0M至0.5M成直線增加而溶離，得到含 腈水解酶之部分。該部分提供於磷灰石柱層析法（BIO-RAD公司製；CHT2-I(柱體積爲2mL) ) 。0.01M磷酸鉀 水溶液（PH7.2)作爲延展液，將磷酸鉀濃度由0.01M至 〇·3 Μ成直線增加而溶離，得到含腈水解酶之部分。該部分 以含有0.15Μ NaCl的0.05Μ磷酸鈉水溶液（ΡΗ7·2 )作爲延 展液提供於膠體過據層析法（Amersham生化科學公司； Superdex 200 HR 10/30)，取得腈水解酶活性部分。使用 如此所得之膠體過濾層析法的腈水解酶活性部分進行以下 的實施例。 實施例 7 :經 ’々"wog/wcoiiVahws q_6 株純 -40- (37) (37)1321151 化之腈水解酶活性部分中腈水解酶之反應溫度依賴性 腈水解酶活性部分溶液（3.2mg/mL，0.05M磷酸緩衝液 (pH 7 · 5 ))，於如表5所示的反應溫度下測定將腈化合物 轉變成醯胺化合物之腈水解酶活性。]m】的0.5重量％丙烯 腈溶液（0.05M磷酸鉀緩衝液，ρΗ7·5 )中加入腈水解酶 活性部分溶液，於各溫度中攪拌下開始反應。2分鐘後’ 加入100 μί的1Ν鹽酸後使反應停止。酵素活性單位 (unit)爲，1分鐘內將1μηι〇1之丙烯腈轉換成丙烯醯胺之 活性定爲1單位（以下記爲U )，每酵素重量單位之水合 活性（U/mg )如表5所示。由該結果得知，由 r/jermog/wcohdflhw·? Q-6株純化的腈水解酶活性部分之腈 水解酶的活性至60度之高溫，隨著反應溫度的上昇而上 昇。最適溫度爲使用於菌體反應時相同之60 °C附近，於70 度的高溫下亦可顯示相當高的腈水解酶活性。 表5 反應溫度（°c ) 活性（U/mg) 20 2 10.4 27 5 5 0.7 40 1135.3 50 2228.8 60 2823.3 70 2781.1 -41 - (38) (38)1321151 實施例 8:由 Geoftac/Z/ws Merwog/wciMzVasiws Q-6 株純 化之腈水解酶之熱安定性 對由 GeoftcrcrAer/nog/wconVas/ws Q-6株純化之 腈水解酶之熱安定性進行調查時，將腈水解酶活性部分溶 液（3.2mg/ml，0.05M磷酸緩衝液（ρΗ7·5))進行30°C下 所定溫度之保溫處理並測定其殘存活性。lmL的0.5重量％ 丙烯腈溶液（0.05M磷酸鉀緩衝液，pH7.5)中加入5μ1的 保溫處理後的腈水解酶溶液，於27 °C下邊攪拌邊開始反 應。2分鐘後，加入1〇〇μΙ的IN HC1使其反應停止。算出對 於保存處理前的活性之保存後的活性（殘存活性），保存 處理前的活性做爲基準（1 0 0 )其換算値如表6所示。其結 果得知，由 Geo6flCi_//wj· r/zer/no 容/ wi Q-6 株純化 的腈水解酶活性部分之水溶液中之腈水解酶活性於高溫下 亦可保持安定，且於6(TC的高溫下亦保持60%以上的活 性’且70°C的高溫下亦可保持3 5 %以上的活性。 表6 處理溫度（°c ) 殘存活性（％) 20 89.2 27 85.6 40 82.3 50 7 8_9 60 66.9 70 3 8.8 -42- (39) (39)1321151 實施例 9:由 Geo6flCi_//w·? r/jermo 发/ Q-6 株純 化之腈水解酶的丙烯腈濃度依賴性及濃度耐性 欲對於有關由 thermoglucosidasius Q-6 株純化的腈水解酶，進行對基質的丙烯腈濃度之依賴性與 耐性作調查，將4μ1的腈水解酶活性部分溶液 (3.2mg/ml，0.05Μ磷酸緩衝液（ρΗ7.5))加入各種重量 %的51111丙烯腈溶液（0.05Μ磷酸鉀緩衝液，ρΗ7.5)，於 2 7 °C下攪拌開始反應。於5分鐘、10分鐘、20分鐘、40分 鐘後分別取出1ml，加入10〇μ]的IN HC1使其反應停止，所 生成的丙烯醯胺濃度以HPLC定量，如表7所示。由該結果 得知，i/ier/wog/wcoifi/flWMS Q-6株所純化的 腈水解酶活性部分之水溶液中的腈水解酶酵素活性於高丙 烯腈濃度下亦可保持安定。於6%的高濃度丙烯腈溶液中 既使反應40分鐘，與較低丙烯腈濃度下比較並無觀察到活 性降低，相反地隨著基質濃度的提高性亦上昇。 表7 反應開始 5分鐘過後 10分鐘過 20分鐘過 40分鐘過 時的丙烯 的丙烯醯 後的丙烯 後的丙烯 後的丙烯 腈濃度 胺濃度 醯胺濃度 醯胺濃度 醯胺濃度 (重量％) (重量°/〇) (重量％) (重量％) (重量％) 0.5% 0.0 18 0.032 0.052 0.087 2.0% 0.023 0.042 0.070 0.107 4.0% 0.026 0.046 0.077 0.137 6.0% 0.030 0.05 1 0.082 0.169 -43- (40) (40)1321151 實施例 1〇:由 i/jer/MOg/wcoiidflhi/i Q-6株純 化之腈水解酶的丙烯醯胺濃度耐性 欲對於有關由 Geo6flc///ws thermoglvcosidasius Q-6 株純化的腈水解酶，進行對生成物丙烯醯胺所產生的阻礙 作調查，將1〇μ1的腈水解酶活性部分溶液（3.2mg/ml， 0.05M磷酸緩衝液（pH7.5))加入Im丨含有0.5重量％的丙 烯腈與35重量％的丙烯醯胺溶液（0.05M磷酸鉀緩衝液， PH7.5)，於27°C下攪拌反應10分鐘，反應後的液體中的 丙烯醯胺濃度以HPLC定量時，所有的丙烯腈皆轉換成丙 烧醒胺。由該結果得知，Merwo 容 ZwCOiiVfli/Wi Q-6株所純化的腈水解酿活性部分之水溶液中的腈水解酶 酵素活性於3 5 %高濃度的丙烯醯胺濃度下亦可保持活性。 實施例 H:來自 t h e r m 〇 g I u c 〇 s i d a s i u s Q-6株 的腈水解酶α亞單位及/3亞單位部分之基因選殖 (1)來自 i/jermog/wcon’daii'wj· Q-6株的腈 水解酶之確認及N末端胺基酸序列定義 實施例6所得之膠體過濾層析法之腈水解酶活性部分 溶離液於還原條件下，供給於還原型SDS·聚丙烯醯胺電泳 中。電泳後進行 Coomassie brilliant blue (CBB)的蛋白 質染色，脫色後確認出其爲具有約25K達爾頓及約28K達 爾頓之分子量的2條主要片段。將該2條主要純化蛋白質， 使用點墨（Blotting)裝置（BIO-RAD公司）進行PVDF膜 -44 - (41) (41)1321151 (MILLIPORE公司）的轉印，經CBB染色後，吸附目的之 2條片段的部分由PVDF膜切出。其此使用全自動蛋白質一 次構造分析裝置PPSQ-23A (島津製作所）解讀2種類的蛋 白質N末端胺基酸序列。其結果，分子量25K達爾頓之蛋 白質的N末端胺基酸序列爲序列表的序列號碼：2 3所記載 的序列，分子量28K達爾頓之蛋白質的N末端胺基酸序列 爲序列表的序列號碼：2 4所記載的序列。 與已知的腈水解酶之胺基酸序列比較結果，25K達爾 頓之聚肽鏈爲腈水解酶α亞單位，28K達爾頓之聚肽鏈爲 腈水解酶Θ亞單位，雖然低但依舊顯示相同性，且爲編碼 該蛋白質者。 (2)對應Ν末端胺基酸序列之寡核苷酸引子的合成 由上述所解讀的2種類蛋白質之Ν末端胺基酸序列’ 使用該菌屬的密碼子合成以下12種類的退化PCR用寡核苷 酸引子。序列表的序列號碼：5所記載的引子1 ( a F1 )、 序列表的序列號碼：6所記載的引子2 ( a F2 )、序列表的 序列號碼：7所記載的引子3 ( a F3 )、序列表的序列號 碼：8所記載的引子4 ( a R1 )、序列表的序列號碼：9所 記載的引子5 ( a R2 )、序列表的序列號碼：1 〇所記載的 引子6 ( a R3 )、序列表的序列號碼：1]所記載的引子7 (石F1 )、序列表的序列號碼：〗2所記載的引子8 (冷 F2 )、序列表的序列號碼：1 3所記載的引子9 (冷F3 )、 序列表的序列號碼：1 4所記載的引子1 〇 ( Θ R 1 )、序列表 -45- (42) (42)1321151 的序列號碼：1 5所記載的引子1 1 (石R2 )、序列表的序列 號碼：16所記載的引子12 ( /SR3)。且y表不c或t，r表示 a或g，m表示a或c，k表示g或t，s表示c或g ’ w表示a或t， d表示a、g或t，n表示a、c、g或t。又’考慮到編碼α亞單 位及Θ亞單位之基因於染色體位置而製作出引子。 (3 ) ^ Geobacillus thermoglucosidasius Q-6株之染色

體DNA萃取及退化PCR

Geobacillus thermoglucosidasius Q-6株以與實施 例6相同之方法進行培養、回收，使用QIAGEN公司的 Genomic-tip System ( 500/G)套組由菌體中萃取出染色體 DNA 。以 O.lpg 的溶解於 TE 溶液的 i/jerwog/wcohi/iihw·? Q-6株染色體DNA作爲鑄型進行退化 P C R。退化P C R爲，組合序列表的序列號碼：5至1 0所記載 的引子1至6、與序列表的序列號碼：1 1至〗6所記載的引子 7至12之36種下進行。1 OOpmol的2種類引子，使用各含有 5U的Takara公司之Ex Taq DNA聚合酶及緩衝液之全量 ΙΟΟμΙ的反應液，進行PCR嘗試DNA片段的增幅。反應條件 如下所示。9 6 °C，3分鐘的熱變性，9 6。(：，3 0秒的熱變性 後’進行42 °C，30秒的煅燒，再於72 °C下進行1分鐘30秒 的伸長反應’重複進行3 6循環後，於7 2 °C下進行5分鐘的 伸長反應’再保冷於4°C下。各PCR產物提供於1重量％的 脂糖（agrose)電泳中’確認DNA增幅時，僅於組合序列表 的序列號碼：9所記載的引子5 ( a R 2 )與序列表的序列號 -46- (43) (43)1321151 碼：1 1所記載的引子7 ( yS F 1 )、及組合序列表的序列號 碼：9所記載的引子5 ( a R2 )與序列表的序列號碼：1 2所 記載的引8 ( /3 F 2 )下進行P C R時，確認約7 0 0 b ρ的D Ν Α片 段之增幅。 (4 )退化PCR產物的選殖及增幅DNA片段的鹼基序列解 讀 增幅DNA片段由膠體中切出，使用QIAquick Gel Extraction Kit ( QIAGEN 公司）進行萃取，pGEM-T Vector ( Promega公司）使用 T4 DNA 連接酶（Takara 公 司）進行連接。藉由Ex Taq所得之PCR結果爲，3’末端上 A爲利用附加1鹼基之性質。連接反應後，轉形大腸桿菌 JM109株，於LB洋菜培養基（5〇Mg/ml安匹西林，0.5重量 %Bato·酵母菌萃取物、1重量％的88(^〇-胰化蛋白，0.5重 量 ％ 的 NaCl，2.0重量 ％ 的 Bacto Agar (pH7.5))中 37 °C下培養一晚，以安西匹林選擇出轉形體。於含有安西匹 林的LB培養基進行培養之轉形體中依據常法萃取出質體 DNA，將約700bp的插入序列，以載體上的SP6及T7啓動子 之序列作爲引子使用而解讀鹼基序列。 其結果，確認出增幅DNA片段內具有681 bp的開放讀 架（以下稱爲ORF1 ) 。0RF1的轉譯停止密碼子與以下的 開放讀架（以下稱爲ORF2 )之轉譯開始密碼子ATG之間 爲13bp。由0RF1鹼基序列所推定出的N末端側25個胺基酸 序列’與上述純化的2 8 K達爾頓之聚肽鏈N末端側的2 5個 -47- (44) (44)1321151 胺基酸序列完全相同，相當於序列表的序列號碼：2所記 載之胺基酸序列的第1號至第25號之序列。0RF1的胺基酸 序列與已知的腈水解酶之/3亞單位的胺基酸序列雖顯示低 相同性，但依舊具有相同性，且表示編碼該蛋白質。

Geobacillus i/jerTnog/wcohi/flhw·? Q-6株的膳水解酶 /3亞單位爲編碼226胺基酸，與既存的數據中具有相同性 蛋白質的胺基酸序列之相同度順序爲，與克列伯氏桿菌 (Klebsiela)屬MC12609株的腈水解酶/9亞單位爲43%相 同度，農桿菌（Agrobacterium)屬的腈水解酶/3亞單位 爲42%相同度，紅假單細胞屬（11110<1〇?56 11£1〇11101135)屬 CG A3 095株的腈水解酶/3亞單位爲40%之非常低的相同 度。又，與來自與屬近緣的桿菌屬蛋白質之胺 基酸的相同度爲，與嗜熱菌Bacillus BR449株的腈水解酶 /3 亞單位爲 35.0%，嗜熱菌 Bacillus smithii SC-J05-1 株的 腈水解酶/3亞單位爲34.5%皆極低。另一方面，嗜熱菌 Bacillus BR449株的腈水解酶冷亞單位，與嗜熱菌Bacillu $11^1^5(：-〗05-1株的腈水解酶）3亞單位爲85.6%之高相同 度。另一方面，由ORF2的鹼基序列推定出的N末端之胺基 酸序列與上述純化的25K達爾頓之聚肽鏈的胺基酸序列完 全一致。 由上述得知，thermoglucosidasius Q-6 株中，以編碼由5 ;末端側上游的2 8K達爾頓之腈水解酶冷 亞單位的基因、編碼25Κ達爾頓之腈水解酶α亞單位的基 因之順序鄰接。 -48- (45) (45)1321151 (5 ) Geobacillus Μ"wwjQ_6 株腈水解酶 α亞單位部分的基因之選殖 办条殖上述所得之 GeoZ^flc/Z/ws thermoglucosidasius Q-6株腈水解酶Θ亞單位部分之基因的周邊基因、及^亞 單位部分的基因’進行退化PCR。參考位於已知腈水解酶 α亞單位的下游之基因，作爲以下2種類的退化PCR寡核 苷酸引子。序列表的序列號碼：1 7所記載的引子1 3 (pRl )、序列表的序列號碼：1 8所記載的引子14 (pR2)。 又，先前解讀鹼基序列的 r/jerwog/wcosidflsi'wj· Q-6株之腈水解酶冷亞單位部內作成 以下2種類的PCR增幅用寡核苷酸引子。序列表的序列號 碼：19所記載的引子15 ( Q6AP〇SF )、序列表之序列號 碼：20所言己載的引子16 ( Q6abFl ) 。 O.lpg的 i/ierwog/wfohc/flhw·? Q-6株的染色體DNA作爲鑄型進行退 化PCR。退化PCR於煅燒溫度50°C下，組合序列表中序列 號碼1 7、1 8所記載的引子1 3、1 4、與序列表中序列號碼 1 8、1 9所記載的引子〗5 6等4種進行。其結果，組合序 列表的序列號碼：I 7所記載的引子1 3 ( pR ])與序列表的 序列號碼18所記載的引子15 ( Q6AposF )進行PCR時確認 存在約〇 . 8 k b增幅D N A產物。且組合序列表的序列號碼：

1 6所記載的引子1 3 ( pR〗）與序列表的序列號碼1 9所記載 的引子16 (Q6abFl)進行PCR時確認存在約1.5k增幅DNA -49- (46) (46)1321151 產物。且，其他組合進行P C R時，無法確認增幅D N A產物 的存在。 組合序列表的序列號碼：1 6所記載的引子1 3 ( pRl ) 與序列表的序列號碼19所記載的引子15 ( Q6AP〇sF )進行 退化PCR所增幅的0.8kbDNA片段由瓊脂糖膠切出，依據常 法萃取出DNA，插入pGEM-T Vector ( Promega公司），使 大腸桿菌JM109株轉形，藉由50pg/ml的安西匹林選擇出 重組體。含安西匹林的LB培養基中培養轉形體’依據常 法萃取出質體DNA，解讀約0.8 kb的插入部分之鹼基序 列。其結果，確認出6 1 8 b p的開放讀架（以下稱爲 0RF2)。由0RF2的鹼基序列所推定出的N末端側29個胺 基酸序列，與上述純化的2 5 K達爾頓之聚肽鏈之N末端側 之2 9個胺基酸序列完全一致，相當於序列表的序列號碼： 1所記載的胺基酸序列的第1號至第29號之序列。ORF2的 胺基酸序列雖與已知的腈水解酶α亞單位之胺基酸序列雖 低但爲具有相同性，係爲編碼該蛋白質者。

Geobacillus i/ier/wog/wcos/i/fls/wj· Q-6株的腈水解酶 α亞單位爲編碼205胺基酸，與既存的數據中具有相同性 蛋白質的胺基酸序列之相同度順序爲，與嗜熱菌Bacillus BR4 49株的腈水解酶/3亞單位爲較低之66.3%，與嗜熱菌 Bacillus smithii SC-J05-1株的腈水解酶/3亞單位爲較低之 63.9%。另一方面，嗜熱菌Bacillus BR449株的腈水解酶 /3亞單位與嗜熱菌83£^111^511^1^5(：-】05-1株具有88.8% 之高相同性。 -50- (47) (47)1321151 實施例】2 : ，/Q-6株的腈 水解酶α亞單位及万亞單位部分之表現載體的插入、與於 大腸桿菌中的表現 (1) Geobacillus r/jerwog/wcoiw’dflhws Q-6株的腈水解 酶α亞單位及/5亞單位部分之表現載體的插入 以上述經解讀的鹼基序列爲準，作成以下2種 Geobacillus i/jerwo君/ wcoi/dflhwi Q-6株的腈水解酶 α 亞 單位及/3亞單位部分以PCR增幅時的寡核苷酸引子。序列 表的序列號碼：21所記載的引子17 ( Q6ab-Fl-T)、序列 表的序列號碼：22所記載的引子18 ( Q6Aball·Rl-BglII-T ) 。序列表的序列號碼2 1所記載的引子1 7爲設計成限制 ϋ ρβ ilL N d e I φ ’ Geobacillus thermoglucosidasius Q-6 株 的腈水解酶Θ亞單位的轉譯開始密碼子。序列表的序列號 碼 ：22 所記載的引子 18中 ，Geobacillus i/jerwog/wcos/i/iiiiwi Q-6株的腈水解酶〇:亞單位之轉譯終 止密碼子的下面直接導入限制酶Bg11 site。以Geohc/Z/wj rherwog/wcoi/i/tfiiwi Q-6株的染色體DNA作爲鑄型，使用 各lOOpmol的序列表的序列號碼：21、22所記載的引子 1 7、I 8進行PCR。使用Ex Taq DNA聚合酶，以全量爲 ΙΟΟμΙ下進行96°C，3分鐘的熱變性後，96°C30秒熱變性， 6(TC 30秒的煅燒，72 °C 1分鐘30秒的伸長反應之條件下進 行30次循環之PCR後，進行75 °C下5分鐘的伸長反應，再 於下冷卻。PCR後的溶液提供於1.5重量％的瓊脂糖膠 (48) (48)1321151 電泳時，取認出約1.3kb的DNA片段增幅。該增幅DNA產 物由瓊脂糖膠以常法萃取，連接於Promega公司的pGEM-Teasy Vector上，轉形大腸桿菌JM 109株。由轉形體萃取 出質體DNA，解讀插入部分的鹼基序列，確認以PCR增幅 是否產生錯誤。 其次，該質體以Ndel、EcoRl限制酶消化後提供於1 .5 重量％瓊脂糖膠電泳中，約1.3 Kb的插入DNA由瓊脂糖膠 中切出，依據常法萃取。表現載體使用No vagene公司之 p E T - 2 6 b ( + ) Vector 及 pET-28a ( + ) Vector。該 2種 類的載體DNA以Ndel、EcoRl限制酶消化後，提供於1重量 %瓊脂糖膠電泳中，約5.3Kb的DNA片段依據常法萃取。 這些插入片段與載體依據常法進行連接反應，轉形大腸桿 菌JM 109株，以卡那霉素耐性選擇出的轉形體萃取出質體 DNA，選出導入插入片段之質體。由上述，取得以 Geobacillus Mermog/wcos/i/ahwi Q-6株之膳水解酶 α 亞 單位及万亞單位部分作爲插入片段導入之表現質體。這些 完成的質體稱爲pET-26b ( + ) -/S α及PET-28a ( + )-召 (2 )以大腸桿菌表現之 r/jermog/wcoHi/iJiiws Q-6株的腈水解酶活性 使用表現質體pET-26b ( + )α及pET-28a ( + ) · 召α ，進行Novagene公司的大腸桿菌BL21 (DE3) LysE株 之轉形，將 iAerwog/wcon'i/ai/wi· Q-6株的腈 -52- (49) (49)1321151 水解酶/3亞單位及α亞單位的蛋白質藉由T7啓動子作爲聚 順反子（polycistron)同時表現。 使用各表現質體，進行對於Novagene公司製作的大腸 桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) L y s E株之勝任細胞的轉形，於含有 30pg/ml的卡那霉素之LB洋菜1¾•養基（0.5重量％Bacto -酵 母菌萃取物、1重量％Bacto -胰化蛋白、〇.5重量％NaC】、 2_〇重量％ Agar ; ρΗ7·5 )上塗上經轉形處理後的菌液，經 3〇 °C下培養一晚，藉由卡那霉素進行選擇。將該轉形體植 菌於含有30pg/ml的卡那霉素之LB培養基2ml中，進行30 °C下一晚的200rpm震盪培養。將前培養液植菌於含有 20pg/ml的氯化鈷六水合物（CoCl2 · 6H20 )及3〇Hg/ml的 卡那霉素之LB培養基10ml中成2重量％，於30 °C下進行約 3小時，於200rpm下之震盪培養至OD600= 0.5，再添加 O.lmM的IPTG，誘導T7啓動子的表現後，再進行4小時 200rpm下的震盪培養，回收菌體。 使用該菌體，測定於2 7 t使腈化合物轉變爲醯胺化合 物之腈水解酶水合活性。 將表現來自 Gec»6aci7/w5 Merwog/wcoj·/·，·ws Q-6株 之腈水解酶的大腸桿菌之菌體，再溶解於含有20mM之 Tris-HCl及1 5mM的NaCl的TBS緩衝液（ρΗ7·5 )，稀釋至 OD= 0.2，作成最終濃度爲0.2重量％的丙烯腈溶液之反應 液。於27 °C下邊攪拌邊進行反應，經30分鐘後機入100 μί 的1當量鹽酸使反應停止。酵素活性之單位（unit )爲，1 分鐘內將]μπιοί的丙烯腈轉變成丙烯醯胺之活性作爲】單位 -53- (50) (50)1321151 (以下記爲u ) ’每單位濕菌體之水合活性（υ/mg )如表 8所示。 表8 表現質體 活性（U/mg) pET-26b( + )載體 0 pET-26b( + )- β a 0.200 pET-28a( + )載體 0 pET-28a( + )- β a 0.2 12 由該結果得知，Geohcmwi thermoglucosidasius Q-6株的腈水解酶α:亞單位及Θ亞單位於大腸桿菌中表現 時’確定具有將丙烯腈轉換成丙烯醯胺的腈水解酶活性。 實施例13:藉由菌落雜交取得來自Geohc/Uw r/ierwog/wcoht/i/hws Q-6株之腈水解酶周邊基因。 (1 )螢光標識DIG探針的製作 使用序列表的序列號碼：25所記載的 Merwog/wcohi/flhw5 Q_6株之腈水解酶α亞單位及/5亞單 位部分之DNA作爲鑄型，由羅修公司製作的DIG-DNA標識 套組作成螢光標識探針。製造方法爲依據羅修公司的D I G 手冊。 (2)染色體南方雜交法 將於實施例 ]1 所調製的 Geobacillus -54- (51) (51)1321151 Q-6株的染色體DNA使用種種限制酶 進行消化’提供於1重量％瓊脂糖膠電泳中。將瓊脂糖膠 內的DNA轉錄於尼龍膜Hybond-N+ ( AMERSHAM公司） 後，使用先前調製的螢光標識DIG探針，進行染色體南方 雜交法。每片經DNA轉錄' 固定之薄膜上浸漬於i〇ml的雜 交緩衝液（含有1重量％脫脂奶粉、0.1重量％的>1-月桂醯 基肌胺酸、〇·〇2重量％的305、50重量％的甲醯胺之5χ SSC) ’於42 °C下進行2小時的預先雜交。將與上述相同 所做成的螢光標識探針lOOng於95 °C下進行10分鐘的煮沸 及急冷處理而使其進行熱變性，再添加於預先雜交緩衝液 中，進行42 °C —晚之雜交。雜交後的膜以150ml的含有0.1 重量％SDS之2xSSC於室溫下洗淨2次。其次於65°C下加 熱，再以150ml的含有0.1重量％的50吕之lxSSC於室溫下 洗淨5分鐘進行2次。繼續以100ml的馬來酸緩衝液（0.1M 馬來酸，0.15M NaCl，使用NaOH調製pH7.5)洗淨5分鐘 後，於50ml的封鎖溶液（blocking solution，含有0.3重量 %的丁％661120、0.15M NaCl及1重量％的脫脂奶粉之0.1M 馬來酸緩衝液；PH7.5 )中，室溫下進行30分鐘的封鎖處 理。以20ml的封鎖溶液稀釋至抗羥基洋地黃毒配質-AP爲 75mU/ml，室溫下進行30分鐘的抗體反應後，於100ml的 洗淨緩衝液（含有0.3重量％Tween20、0.15M NaCl之0.1M 的馬來酸緩衝液；pH 7.5)中將膜洗淨5次，將未結合的抗 體洗掉。於20ml的檢測緩衝液（0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，ΡΗ9·5 )中進行5分鐘的平衡化處理後，l〇ml的檢測 -55- (52) (52)1321151 緩衝液中將34μ1的lOOmg/ml之NBT (亞硝基藍雙偶氮氯化 物）溶液以35μ1的50mg/ml的BCIP溶液稀釋之發色基質溶 液NBT/BCIP ( 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽），將膜完全浸 漬於其中，避光下恆溫培養約1分鐘至1 6小時。恆溫培養 中，不可移動或搖晃桌子下確認其發色。其結果，藉由限 制酶Hind III分解的約2.3kb基因片段中，含有腈水解酶α 亞單位部分的下游基因。 (3)藉由菌落雜交得到目的克隆 ①使用於菌落雜交的質體基因庫之製作 其次，使用相同螢光標識DIG探針進行菌落雜交。將 10// g^) Geobacillus fAerznog/wcoi/i/fli/ws Q-6株的染色 體DN A提供於1重量％的瓊脂糖膠電泳上，由該瓊脂糖膠 上切出含有約2.0kb至2.6kb的DNA片段，以前述相同方法 萃取及純化DNA片段。所得之DNA片段使用DNA連接套組 (Takara公司製作）導入PUC118質體載體（Takara公司製 作）之多選殖位置（multicloning site)內之Hind III限制 酶部位。使用於連接的pUC 19質體載體DNA爲，經限制酶 Hind III消化後進行藉由酚/氯仿處理及乙醇沈澱之純化， 繼續使用鹼性磷酸酶（Takara公司製作）進行5’末端之脫 磷酸化處理後再次進行酚/氯仿處理及乙醇沈澱，提供於 瓊脂糖膠電泳上，再藉由瓊脂糖膠萃取並純化者。 使用將約2.0kb至2.6kb之片段化 Q-6株的染色體 DNA 與 pUC118質體載 -56- (53) (53)1321151 體於Hind III限制酶部位進行連接之溶液，進行大腸桿菌 JM109株的轉形，植菌於含有50pg/ml的安西匹林、ImM的 IPMG (異丙基- 召-D-硫代半乳糖吡喃苷）及2重量 Gal ( 5·溴·4-氯-3-吲哚基· y? -D_半乳糖吡喃苷）之LB洋菜 培養基（0.5重量％Bact〇 -酵母菌萃取物' 1重量％的

Bacto-胰化蛋白、〇.5重量％的NaCl' 2.0重量％的入§3!·; pH 7.5 )，經3 7 °C °C下一晚培養後，其結果得到多數片中 出現50個至500個的白色菌落之培養皿。 對於這些染色體DN A之質體基因庫，使用先前調製之 螢光標識DIG探針進行菌落雜交，選殖出含有目的腈水解 酶α亞單位的下游基因之克隆。 ②藉由菌落雜交取得目的克隆 首先，將出現白色菌落之約1 000克隆，使用經殺菌接 種針，畫線培養於LB洋菜培養基上，此時欲使膜雜交的 LB洋菜培養基、與保存用LB洋菜培養基同樣進行畫線培 養’於30 °C下培養一晚。 其次，生成菌落的培養皿上靜置AMERS Η AM公司製 作的尼龍膜Hybond_N+，1分鐘後使用鑷子慢慢地取出。 將剝開的膜以菌體附著面朝上的情況下浸漬於變性溶液 (含有 1.5M 的 NaC 丨與 ImM 之 EDTA· 2Na 之 0.5M Tris-鹽酸 水溶液；ρΗ7·2 ) 3分鐘，再浸漬於新中和溶液中3分鐘。 其次，再於2xSSC溶液（1L的lxSSC中含有18.76g的 NaCl ' 4.4 1 g的檸檬酸鈉）進行〗次洗淨後，乾燥的濾紙上 -57- (54) (54)1321151 將膜風乾。且在進行120m】/cm2的UV照射進行膜上的DNA 固定。 ③藉由DIG抗體的檢測及目的克隆之分離 將經由上述處理後且DN A被固定的膜浸漬於每片爲 10ml的雜交緩衝液（含有1重量％脫脂奶粉' 0」重量％的 N -月桂醯基肌胺酸、〇.〇2重量％的5口5、50重量％的甲驢 胺之5xSSC)，於42。(：下進行2小時的預先雜交。將與上 述相同所做成的螢光標識探針l〇〇ng於95°C下進行1〇分鐘 的煮沸及急冷處理而使其進行熱變性’再添加於預先雜交 緩衝液中，進行42 °C —晚之雜交。雜交後的膜以15〇ml的 含有0.1重量％SDS之2xSSC於室溫下洗淨2次。其次於65 。(：下加熱，再以150ml的含有0.1重量％的505之lxSSC於 室溫下洗淨5分鐘進行2次。繼續以10 0ml的馬來酸緩衝液 (0.1M馬來酸，0.15M NaCl，使用NaOH調製pH7.5)洗淨 5分鐘後，於50ml的封鎖溶液（blocking solution’含有 0.3重量％的丁你661120、0.15M NaCl及1重量％的脫脂奶粉 之0.1M馬來酸緩衝液；pH7.5)中，室溫下進行30分鐘的 封鎖處理。以20ml的封鎖溶液稀釋至抗羥基洋地黃毒配 質-AP爲75mU/ml，室溫下進行30分鐘的抗體反應後，於 100ml的洗淨緩衝液（含有0.3重量％ Tween20、0.15M NaCl之0.1M的馬來酸緩衝液；pH7.5)中將膜洗淨5次， 將未結合的抗體洗掉。於20ml的檢測緩衝液（0.1]^1^5-HC1，O.lMNaCl，ρΗ9·5)中進行5分鐘的平衡化處理後， -58- (55) (55)1321151 10ml的檢測緩衝液中將34μ1的lOOmg/ml之NBT (亞硝基藍 雙偶氮氯化物）溶液以35μ1的50mg/ml的BCIP溶液稀釋之 發色基質溶液NBT/BCIP ( 5 -溴_4 -氯-3-吲哚基磷酸鹽）’ 將膜完全浸漬於其中，避光下恆溫培養約1分鐘至1 6小 時。恆溫培養中，不可移動或搖晃桌子下確認其發色。其 結果，該膜上的1〇〇〇克隆中，發現正信號的有4處，與該 位置重複的正克隆由原先培養皿作確定。 (含有 Geobacillus /Aerwi)茗/ wconViu/wi Q-6株的腈 水解酶α亞單位部分的下游基因之正克隆解析 經確認的正克隆由培養皿接種至含有安西匹林的LB 液體培養基上，進行37°C，250rpm的一晚震盪培養。菌體 經離心後回收，依據常法萃取質體DNA。質體DNA以限制 酶Hind III消化後，提供1.5重量％的瓊脂糖膠電泳中，進 行插入片段之尺寸時’得到約2 · 3 k b。又’將插入片段爲 含有 Geobacillus rhermog/wcohdfliz'wj· Q-6株的腈水解酶 α亞單位部分，藉由數種形式的PCR及限制酶的消化形式 來確定。 由上述取得之本質體命名爲Pucll8-Q6Hin2·3’定義 插入片段之全驗基序列。•以Μί Q-6株的腈水解酶及下游基因群的限制酶地圖及基因構成 於圖1表示。 其結果，確認出插入片段中3 3 9 b p的驗基序列至開放 讀架（以下稱爲0RF3)爲’與腈水解酶*2亞單位 -59- (56) (56)1321151 (0RF2 )的5’末端側下游同方向下存在。〇 RF2的轉譯終 止密碼子與ORF3的轉譯開始密碼子之間爲12bp，ORF3的 轉譯終止密碼子與再下游位置的◦ RF之轉譯開始密碼子間 爲〗45bp。ORF3爲編碼1 12胺基酸，其與既有的資料庫中 的以下蛋白質有者極低之相同性。既有的資料庫中與相同 性高的序列之胺基酸爲一致的比率爲，與桿菌屬BR449株 的 P12K 爲 31%，與 Rhodococcus rhodochrous J1菌株的 NhhG 爲 31% ，與 Rhodococcus rhodochrous J1 菌株的

NhlE爲21% ，與嗜熱假諾卡氏菌 （Pseudonocardia thermophila) JCM3 095 株的 P16 爲 24%。 實施例 14: Q-6株的腈 水解酶α亞單位及万亞單位及下游基因0RF3的表現質體 之構築 pET-26b ( + ) - yS α 及 pET-28a ( + )-泠 α 質體以 限制酶Hindlll分解進行脫磷氧化反應，藉以酚氯仿萃 取，進行脫磷酸化處理。此消化產量提供於1重量％瓊脂 糖膠電泳，依據常法萃取約6.1 kb的DNA片段。該DNA片 段含有 pET載體及位於 thermoglucosidasius Q-6株之腈水解酶α亞單位及乃亞單位的第60個胺基酸之 Hindlll限制酶部位。 其次，pUC118-Q6Hin2.3質體以限制酶Hindlll分解後 提供於1重量瓊脂糖膠電泳’萃取出約2.3kb的插入DNA。 該插入片段先與萃取出的片段進行連接後’轉形大腸桿菌 -60- (57) (57)1321151 JM109，以卡那霉素選擇出之轉形體選擇出含有插入DNA 的質體。插入方向以PCR確認，而取得PET-26b ( + )及 pET-28a ( + )載體含有 thermoglucosidasius Q-6株的腈水解酶α亞單位及0亞單位及下游基因〇R F3與 更下游區域之質體。將如完成的質體於下述稱爲pET-26b (+ ) — /5 α 12 及 pET-28a( + ) — β a \ 2。 其次導入 Geobacillus /ms Q-6株的 腈水解酶α亞單位、/3亞單位及下游基因ORF3的轉譯終 止密碼子，構築出3種類蛋白質可共表現的之表現質體。 先前構築的質體pET-26b ( + )—石〇: 12以限制酶Ndel及 Bglll分解，提供於1.5重量％瓊脂糖膠電泳上，依據常法 萃取出含有α亞單位及/3亞單位及至下游基因〇RF3的轉 譯終止密碼子的1.7kb基因片段。同時將表現載體pET-26b (+ )及pET-28a( + )以限制酶Ndel及Bglll分解，提供 於1重量％瓊脂糖膠電泳上’依據常法萃取出5.3kb的載體 部分的基因片段。這些載體，與含有先前萃取的α亞單位 及/3亞單位及至下游基因ORF3的轉譯終止密碼子之1 .7kb 基因片段作爲插入片段’依據常法進行連接反應。該反應 時，以Bglll限制酶分解之末端與BamHI限制酶分解之末端 連接。使用連接反應後的溶液進行大腸桿菌JM 109株的轉 形，由以卡那霉素耐性選出之轉形體中萃取出質體DNA， 選擇出導入插入片段的質體。由上述取得將 /Aerwo君/wconVtfi/wj Q-6株的腈水解酶α亞單位及彡亞單 位部分及下游基因ORF3作爲插入片段導入之3種類的蛋白 -61 - (58) (58)1321151 質可共表現的表現載體。將這些目的質體於下述稱爲pET_ 26b ( + )—冷 α 1 及 pET-28a ( + ) — β a \。 實施例1 5 :使大腸桿菌之下游基因共表現之〇?e〇kc;//w5 Mermog/wcohi/w/M·? Q-6株的腊水解酶活性 使用表現載體pET-26b ( + )—々α及pET-28a ( + ) —/5 α ，進行Novagene公司的大腸桿菌BL21 (DE3) LysE 株的轉形，將 Geoiflci/ZMS iAerwog/wcoj/i/fli/w·? Q-6株的 腈水解酶α亞單位及yS亞單位的蛋白質藉由T7啓動子共表 現。同樣地，使用pET-26b ( + ) —冷α 1及pET-28a (+ ) - /3 α 1，進行Novagene公司的大腸桿菌BL21 (DE3 ) LysE 株 的 轉 形 ， 將 Geobacillus r/zerwog/wcoi'/iffli/w·? Q-6株的睛水解酶α亞單位 '卢亞單 位及下游基因0RF3的蛋白質藉由Τ7啓動子共表現。作爲 對照組，使用表現載體pET-26b ( + )及pET-28a ( + )， 進行Novagene公司的大腸桿菌BL21 (DE3) LysE株的轉形 之轉形體。 使用各表現載體，進行Novagene公司的大腸桿菌 BL21 ( DE3 ) LysE株的對勝任細胞之轉形’於含有 30pg/ml的卡那霉素的LB洋菜培養基（〇·5重量％ Bacto-酵 母菌萃取物、1重量％的胰化蛋白、〇·5重量％的1^…1' 2_0重量％的Agar ’ ρΗ7·5 )上灑上轉形處理後的菌液’經 3 的一晚培養，藉由卡那霉素耐性而作選擇。該轉形體 植菌於含有30μ§/ηι1的卡那霉素之LB培養基2m〗中’經30 -62- (59) 1321151 。(：下，200rpm的一晚震盪培養。將2重量％的前培養液體 植菌於含有20pg/ml的氣化銘/、水合物（C0CI2· 6H2O)及 30pg/ml的卡那霉素之LB培養基l〇ml中’於30°C下培養約 3小時，於200rpm下震盪培養至〇D600= 0.5後’添加 O.lmM的IPTG，由T7啓動子誘導其表現，再進行約4小時 的200rpm震盪培養後回收菌體。 將如此所得之表現來自 i/ierffjog/wcos/i/iu/wi Q-6株的腈水解酶之大腸桿菌菌體再 次懸浮於含有20mM的Tris-HCl及15mM的NaCl之TBS緩衝 液（pH7.5)，稀釋至〇D=0.2，作成最終濃度爲0.2重量 %丙烯腈溶液的反應液。於27 °C下邊攪拌邊進行反應，1 〇 分鐘後、30分鐘後加入ΙΟΟμί的1當量鹽酸而停止反應。 酵素活性之單位（unit)爲1分鐘將Ιμιυοί的丙烯腈轉換成 丙烯醯胺之活性定爲I unit (以下記爲U )，每單位濕菌重 量之水合活性（U / m g )如表9所示。 表9 表現質體 活性（U/mg) pET-26b( + )載體 0 pET-26b( + )- β a 0.20 pET-26b( + )- β a 1 2.74 pET-28a( + )載體 0 pET-28a( + )- β a 0.2 1 pET-28a( + )- β a 1 4.22 -63- (60) 1321151 由結果得知’僅表現 Geoftflc/·//!/_? Mermog/wcowVflnw Q-6株的腈水解酶《亞單位及β亞單位時’與與下游基医1 ORF3共表現時比較’因下游基因〇RF3的存在使腈水解酶 活性顯著增力Π 。得知ORF3具有可使 Q-6株的腈水解酶活性顯著提局之功 能。

實施例16 : 於大腸桿菌表現的 Geo6flCi‘//wi Q-6株之睛水解酶熱安定性 欲調查活性之熱安定性，將具有表現載體pET-26b (+ ) — β CL ' 表現 Geobacillus thermoglucosidasius Q-6株的腈水解酶之大腸桿菌液（含有20mM的Tris-HC丨及 15mM的NaCl的TBS緩衝液（ρΗ7·5))進行30分鐘30°C、

6 5 °C及70 °C的保溫處理。保溫處理後於冰上冷卻，保溫於 2 7 t：之一定溫度後，反應溫度爲2 7 °C下測定腈水解酶活 性。將表現 Merwog/wcoWi/flhwi Q-6株的腈 水解酶之大腸桿菌懸浮至〇D = 0.2之濁度，作成最終濃度 爲0.5重量％之丙烯腈溶液的反應液，於27 eC下邊攪拌邊 開始反應’ 30分鐘後加入10液量％之1當量鹽酸使反應停 止。30 °C下的保溫處理時的活性作爲基準（100%)，其 換算値如表1 0所示。 -64 - (61) (61)1321151 表1 Ο 處理溫度（°c ) 殘存活性（％) 30 100.0 65 102.5 70 83.9 由結果得知，表現 GeofcflCi'Z/ws thermoglucosidasius Q-6株的腈水解酶之大腸桿菌的腈水解酶活性，既使於70 °C之高溫下亦可保持約8成的活性，於大腸桿菌中表現時 亦具有高耐熱性，故於工業上爲極有用的酵素。 (產業上可利用性） 本發明的組成物係爲具有對熱或高濃度腈、醯胺化合 物之高安定性，可有效率地轉變爲腈化合物所對應的醯胺 化合物。本發明的組成物適用於，既使於高溫、及高腈化 合物濃度或高醯胺化合物濃度下反應時，亦可轉變爲腈化 合物所對應的醯胺化合物之領域上。 【圖式簡單說明】 圖 1表示 Geobacillus thermoglucosidasius Q-6 株的 腈水解酶；S亞單位、α亞單位及下游基因群之基因構成及 限制酵素圖。其中亦表示菌落雜交所取得之片段 (HU2.3)及、大腸菌中表現所使用的片段（/3 a、yS α 1 ' /S β 1 2 )的位置。 -65- 1321151 753262 序列表

<110> Asahi Kasei Corporation < 120> 來自 Geobacillus thermoglucosidasius的新穎腈水解酶 <130> A41354A <160〉 25 <210〉 1 <211〉 205 <212〉 PRT <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223〉腈水解酶a ·亞單位 <400〉 1

Met Ser Val Gin Lys Val His His Asn Val Leu Pro Glu Lys Pro Ala 15 10 15

Gin Thr Arg Thr Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu lie Glu Ser Gly Leu 20 25 30

Val Ser Thr Asp Ala Leu Asp Ala lie lie Glu Ala Tyr Glu Asn Asp 35 40 45 lie Gly Pro Met Asn Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ala Trp Val Asp 50 55 60

Pro Asp Tyr Lys Glu Arg Leu Leu Arg Asp Gly Thr Ser Ala lie Ala 65 70 75 80

Glu Leu Gly Phe Leu Gly Leu Gin Gly Glu His Met Val Val Val Glu 85 90 95

Asn Thr Pro Lys Val His Asn Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys 100 105 110

Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Ser Trp Tyr Lys Ser Ala 115 120 125 1/16 1321151

Ser Tyr Arg Ala Arg lie Val Ser Glu Pro Arg Thr Val Leu Lys Glu 130 135 140

Phe Gly Leu Glu Leu Asp Asp Asp Val Glu lie Arg Val Trp Asp Ser 145 150 155 160

Ser Ala Glu lie Arg Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr 165 170 175

Glu Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Thr Arg Asp Ser 180 185 190

Met lie Gly Val Ala Lys lie Lys Ser Pro Val Lys Lys 195 200 205

<210〉 2 <211〉 226 <212〉 PRT <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223〉腈水解酶/3-亞單位 <400〉 2

Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Lys Arg Asp Phe Gly Pro 15 10 15 lie lie Lys His Asp Gin Glu Pro Leu Phe His Glu Glu Trp Glu 20 25 30

Ala Lys Val Leu Ala Met His Phe Ala Leu Leu Gly Gin Gly Val 35 40 45 lie Asn Trp Asp Glu Phe Arg His Gly He Glu Arg Met Gly Tyr 50 55 60

Val Tyr Tyr Leu Thr Ser Ser Tyr Tyr Glu His Trp Leu Ala Ser 65 70 75

Leu Glu Thr Val Leu Ala Glu Lys Asn lie He Asn Ser Glu Gin 2/16 1321151 80 85 90

Tyr Arg Lys Arg He Arg Glu lie Glu Tyr Gly Met Ser Val Pro 95 100 105

Val Ser Glu Lys Pro Glu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Ser Glu Val 110 115 120 lie Tyr Gly Thr Lys lie Ser Ser Glu Arg Arg Glu Ser Thr Val 125 130 135

Ser Pro Arg Phe Arg Pro Gly Asp Arg Val Arg Val Lys His Phe 140 145 150

Tyr Thr Asn Lys His Thr Arg Cys Pro Gin Tyr Val Met Gly Lys 155 160 165

Val Gly Val Val Glu Leu Leu His Gly Asn His Val Phe Pro Asp 170 175 180

Ser Asn Ala His Gly Asp Gly Glu Ala Pro Gin Pro Leu Tyr Asn 185 190 195

Val Arg Phe Glu Ala Arg Glu Leu Trp Gly Gly Glu Ala His Glu 200 205 210

Lys Asp Ser Leu Asn Leu Asp Leu Trp Asp Ser Tyr Leu Thr His 215 220 220

Ala 226

〈210〉 3 <211〉 1663 <212〉 DNA <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223〉腈水解酶，yS-亞單位，a-亞單位，orf3 3/16 1321151 <221〉 CDS <222〉1..681<223〉腈水解酶/S-亞單位 <221〉 CDS <222〉695.. 1312<223〉腈水解酶α-亞單位 〈221> CDS <222〉1325..1663 <223〉 orf3 <400〉 3 atg aac ggc ccg cac gat tta ggt gga aaa cgt gat ttt ggc cca Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Lys Arg Asp Phe Gly Pro 15 10 15 ate att aaa cat gat caa gaa cct ett ttt cat gaa gaa tgg gaa lie lie Lys His Asp Gin Glu Pro Leu Phe His Glu Glu Trp Glu 20 25 30 gca aaa gta ctg geg atg cat ttt get tta ett gga caa gga gta Ala Lys Val Leu Ala Met His Phe Ala Leu Leu Gly Gin Gly Val 35 40 45 ate aac tgg gat gaa ttt agg cat ggt ata gaa egg atg gga tat lie Asn Trp Asp Glu Phe Arg His Gly lie Glu Arg Met Gly Tyr 50 55 60 gtt tat tac ett act tea age tat tat gaa cat tgg ett get tea Val Tyr Tyr Leu Thr Ser Ser Tyr Tyr Glu His Trp Leu Ala Ser 65 70 75 eta gaa acc gta ttg gee gag aaa aat ate att aac agt gaa cag Leu Glu Thr Val Leu Ala Glu Lys Asn lie lie Asn Ser Glu Gin 45 90 135 180 225 4/16 270 3151321151 80 85 90 tat aga aag aga att agg gaa ata gaa tat ggc atg agt gta cct Tyr Arg Lys Arg lie Arg Glu lie Glu Tyr Gly Met Ser Val Pro 95 100 105 gtc age gaa aag cct gag tta aaa gag tet ttg tta tcc gaa gtg Val Ser Glu Lys Pro Glu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Ser Glu Val 110 115 120 ate tat ggc aeg aaa ata tea tcc gaa egg aga gaa age act gta lie Tyr Gly Thr Lys lie Ser Ser Glu Arg Arg Glu Ser Thr Val 125 130 135 tet ccg egg ttt cgt cct gga gat aga gtg agg gta aaa cac ttt Ser Pro Arg Phe Arg Pro Gly Asp Arg Val Arg Val Lys His Phe 140 145 150 tat aca aac aag cat act aga tgt cct caa tat gtc atg ggg aaa Tyr Thr Asn Lys His Thr Arg Cys Pro Gin Tyr Val Met Gly Lys 155 160 165 gta gga gtt gta gaa ett ett cat ggg aat cat gtt ttc cca gac Val Gly Val Val Glu Leu Leu His Gly Asn His Val Phe Pro Asp 170 175 180 tet aac get cat ggt gat ggc gag get ccg caa ccg ett tac aat Ser Asn Ala His Gly Asp Gly Glu Ala Pro Gin Pro Leu Tyr Asn 185 190 195 gtg ege ttt gaa gca aga gaa ctg tgg gga ggc gag get cac gaa Val Arg Phe Glu Ala Arg Glu Leu Trp Gly Gly Glu Ala His Glu 200 205 210 aaa gat agt eta aat etc gac tta tgg gat age tat eta act cac Lys Asp Ser Leu Asn Leu Asp Leu Trp Asp Ser Tyr Leu Thr His 360 405 450 495 540 595 630 5/16 675 215 220 225 geg taa aggaggaaaa ate 694 Ala 226 1321151 atg agt gta caa aaa gtt cat cac aac gtt ctg cct gaa aag cct 739

Met Ser Val Gin Lys Val His His Asn Val Leu Pro Glu Lys Pro 15 10 15 get caa act egg aca aag get ttg gaa teg ctg ttg ate gaa tet 784

Ala Gin Thr Arg Thr Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu lie Glu Ser 20 25 30 gga ttg gtc tee act gat gee ett gat geg att att gaa gee tat 829

Gly Leu Val Ser Thr Asp Ala Leu Asp Ala lie He Glu Ala Tyr 35 40 45 gaa aat gat att ggg cct atg aat ggg gca aaa gtt gtt gca aaa 874

Glu Asn Asp lie Gly Pro Met Asn Gly Ala Lys Val Val Ala Lys 50 55 60 get tgg gtt gat cct gat tac aaa gaa aga ttg ett egg gat ggg 910

Ala Trp Val Asp Pro Asp Tyr Lys Glu Arg Leu Leu Arg Asp Gly 65 70 75 act teg get att gca gag ett ggc ttt tta ggg ttg cag ggg gag 964

Thr Ser Ala lie Ala Glu Leu Gly Phe Leu Gly Leu Gin Gly Glu 80 85 90 cac atg gtt gtt gtc gaa aat aeg cct aaa gtt cat aat gta gta 1009

His Met Val Val Val Glu Asn Thr Pro Lys Val His Asn Val Val 95 100 105 gtt tgt aeg eta tgt tee tgc tat ccg tgg cct gtc eta ggc ttg 1054

Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu 6/16 10991321151 110 115 120 cct cct tea tgg tat aaa agt get tea tac agg get ega att gtt Pro Pro Ser Trp Tyr Lys Ser Ala Ser Tyr Arg Ala Arg lie Val 125 130 135 tea gag cca aga act gta ett aaa gag ttt ggg ett gaa ctg gat Ser Glu Pro Arg Thr Val Leu Lys Glu Phe Gly Leu Glu Leu Asp 140 145 150 gat gat gtt gaa att agg gtt tgg gac age agt get gaa att ega Asp Asp Val Glu lie Arg Val Trp Asp Ser Ser Ala Glu lie Arg 155 160 165 tat tta gtt ett cca gaa aga cct gca ggt act gaa ggg tgg teg Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Glu Gly Trp Ser 170 175 180 gaa gag gaa ctg get aaa ett gta aeg cgt gac tet atg ate ggt Glu Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Thr Arg Asp Ser Met lie Gly 185 190 195 gtg gee aag ata aag teg cct gtt aaa aaa taa ggggggacaa aa Val Ala Lys He Lys Ser Pro Val Lys Lys 200 205 atg gtt caa tea aat ett caa ata aaa ccg gat gag att eta cct Met Val Gin Ser Asn Leu Gin lie Lys Pro Asp Glu lie Leu Pro 15 10 15 gaa cct agg aga aca gaa aat gag ccg gtt ttt aat tee ccg tgg Glu Pro Arg Arg Thr Glu Asn Glu Pro Val Phe Asn Ser Pro Trp 20 25 30 gaa gee egg att ttt get atg aca ate aat ttg tat gac aaa aaa Glu Ala Arg lie Phe Ala Met Thr lie Asn Leu Tyr Asp Lys Lys 1144 1189 1234 1279 1324 1369 1414 7/16 1459 1321151 35 40 45 ttc ttt gat tgg gag gac ttt cga caa gga tta ata get gaa att 1504

Phe Phe Asp Trp Glu Asp Phe Arg Gin Gly Leu lie Ala Glu lie 50 55 60 gca gtt geg gac age ett cct gag aat gaa cga cca acc tac tac 1549

Ala Val Ala Asp Ser Leu Pro Glu Asn Glu Arg Pro Thr Tyr Tyr 65 70 75 gaa agt tgg ctg gcc get ttg gaa aag ttg tta ate aag gat ggt 1594

Glu Ser Trp Leu Ala Ala Leu Glu Lys Leu Leu lie Lys Asp Gly 80 85 90 ata tta aca aaa gaa caa ata gat gaa ege act aaa gaa ttg aaa 1639 lie Leu Thr Lys Glu Gin lie Asp Glu Arg Thr Lys Glu Leu Lys 95 100 105 1663 gaa ggt ata aga aaa agt tgc tag Glu Gly lie Arg Lys Ser Cys 110

<210〉 4 <211〉 112 <212〉 PRT <2l3> Geobacillus thermoglucosidasius <223> 0RF3 <400> 4

Met Val Gin Ser Asn Leu Gin He Lys Pro Asp Glu lie Leu·Pro Glu 15 10 15

Pro Arg Arg Thr Glu Asn Glu Pro Val Phe Asn Ser Pro Trp Glu Ala 20 25 30

Arg lie Phe Ala Met Thr lie Asn Leu Tyr Asp Lys Lys Phe Phe Asp 8/16 1321151 35 40 45

Trp Glu Asp Phe Arg Gin Gly Leu lie Ala Glu lie Ala Val Ala Asp 50 55 60

Ser Leu Pro Glu Asn Glu Arg Pro Thr Tyr Tyr Glu Ser Trp Leu Ala 65 70 75 80

Ala Leu Glu Lys Leu Leu lie Lys Asp Gly He Leu Thr Lys Glu Gin 85 90 95

He Asp Glu Arg Thr Lys Glu Leu Lys Glu Gly He Arg Lys Ser Cys 100 105 HO

<210〉 5 <211〉 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400〉 5 gtncaraarg tncaycayaa yg 22

<210〉 6 <211〉 20 <212〉 DNA <213> Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 〈400〉 6 20 ccncaraarc cngcncarac 9/16 1321151

<210〉 7 <211〉 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220〉 〈223> 經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400〉 7 caycancanc ayytncc 17

<210〉 8 <211〉 23 <212〉 DNA <213> Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400〉 8 acrttrtgrt gnacyttytg nac 23

〈210〉 9 <211〉 20 〈212〉 DNA <213> Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400〉 9 gtytgngcng gyttytgngg 20 10/16 1321151

<210〉 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400> 10 ggnarrtgnt gntgrtg 17

<210〉 11 <211〉 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400〉 11 atgaayggnc cncayga 17

<210〉 12 <211〉 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400〉 12 aarmgngayt tyggncc 17 11/16 1321151

<210> 13 <211〉 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400> 13 athathaarc aygaycarga rcc 23

<210> 14 <211〉 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400〉 14 arrtcrtgng gnccrttcat 20

<210〉 15 <211〉 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220〉 〈223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400〉 15 thrtcrtgyt tdatdatngg 20 12/16 1321151

<210> 16 <211〉 20 <212> DNA <213〉 Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400> 16 tcytcytcra araanarngg 20

<210〉 17 <211〉 15 <212〉 DNA <213> Artificial sequence 〈220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400> 17 gcgraartcy yccca 15

<210〉 18 <211〉 17 <212〉 DNA <213> Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400〉 18 ccartgytcr tarttcc 17 13/16 1321151

<210〉 19 <211> 25 <212〉 DNA <213> Artificial sequence <220> <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400〉 19 agatagtcta aatctcgact tatgg 25

<210〉 20 <211〉 26 〈212〉 DNA <213> Artificial sequence <220〉 <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 〈400〉 20 atgaacggcc cgcacgattt aggtgg 26

<210〉 21 <211〉 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220〉 〈223> 經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部份DNA片斷 <400> 21 catatgaacg gcccgcacga tttaggtgg 29 14/16 1321151

<210〉 22 <211〉 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223〉經退化PCR增幅之Geobacillus thermoglucosidasius Q6 的部伽NA片斷 〈400〉 22 cagatcttat tttttaacag gcgactttat cttggcg 37

<210〉 23 <211> 29 <212〉 PRT <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223〉腈水解酶a-亞單位的N-末端胺基酸序列 <400〉 23

Met Ser Val Gin Lys Val His His Asn Val Leu Pro Glu Lys Pro 15 10 15

Ala Gin Thr Arg Thr Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu lie Glu 20 25

<210〉 24 <211〉 25 <212> PRT <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223〉腈水解酶石-亞單位的N·末端胺基酸序列 <400> 24

Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Lys Arg Asp Phe Gly Pro 15 10 15 15/16 1321151 lie lie Lys His Asp Gin Glu Pro Leu Phe 20 25

<210〉 25 <211〉 618 <212> DNA <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223〉菌落雜交之探針(腈水解酶a-亞單位） <400〉 25 atgagtgtac aaaaagttca tcacaacgtt ctgcctgaaa agcctgctca aactcggaca 60 aaggctttgg aatcgctgtt gatcgaatct ggattggtct ccactgatgc ccttgatgcg 120 attattgaag cctatgaaaa tgatattggg cctatgaatg gggcaaaagt tgttgcaaaa 180 gcttgggttg atcctgatta caaagaaaga ttgcttcggg atgggacttc ggctattgca 240 gagcttggct ttttagggtt gcagggggag cacatggttg ttgtcgaaaa tacgcctaaa 300 gttcataatg tagtagtttg tacgctatgt tcctgctatc cgtggcctgt cctaggcttg 360 cctccttcat ggtataaaag tgcttcatac agggctcgaa ttgtttcaga gccaagaact 420 gtacttaaag agtttgggct tgaactggat gatgatgttg aaattagggt ttgggacagc 480 agtgctgaaa ttcgatattt agttcttcca gaaagacctg caggtactga agggtggtcg 540 gaagaggaac tggctaaact tgtaacgcgt gactctatga tcggtgtggc caagataaag 600 tcgcctgtta aaaaataa 618 16/16

Claims (1)

1321151 拾、申請專利範圍 月丨曰修正替 種 第93 1 1 6724號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國98年10月15日修正 DNA，其特徵爲如下（A)或（B)的任一 DNA， (A )含有編碼序列表之序列號碼：1所記載的胺基 酸序列之α亞單位基因之鹼基序列、與含有編碼序列表之 序列號碼：2所記載的胺基酸序列之/3亞單位基因之鹼基 序列之組合所成之DNA ; (Β )編碼具有對於含有序列表之序列號碼：1所記 載的胺基酸序列之α亞單位、與含有序列表之序列號碼： 2所記載的胺基酸序列.之；8亞單位的任一方、或雙方而言 ，1或複數個胺基酸經取代、缺失、加成、轉譯後經修飾 之改變或無改變之α亞單位、與改變或無改變之亞單位 ，且具有腈水解酶活性之蛋白質的DNA » 2·—種DNA’其特徵爲如下（C)或（D)的任一 DNA， (C )含有序列表的序列號碼：3的鹼基序列之第 695- 1 3 1 2位置序列之DNA、與含有序列表的序列號碼3 的驗基序列之第1〜681位置序列之DNA的組合所成爲特 徵的DNA、 (D)包含具有序列表的序列號碼：3的鹼基序列之 第695〜13 12位置序列之DNA、或對於該DNA以嚴謹條 1321151 件下進行雜交之DNa中任一 DNA所編碼之CK亞單位、 與具有序列表的序列號碼：3的鹼基序列之第1〜681 位置序列之DNA、或對於該Dna以嚴謹條件下進行雜交 之DNA中任一DNA所編碼之石亞單位， 且編碼具有腈水解酶活性之蛋白質的DNA ;但不包 含上述（C )情況之DNA。 3 ·如申請專利範圍第1項或第2項之DN A，其中再組 合含有編碼序列表的序列號碼：4所記載的胺基酸序列之 鹼基序列的DNA、或其胺基酸序列中的1或複數個胺基 酸經取代、缺失、加成、轉譯後修正，且編碼與腈水解酶 的活化相關之蛋白質的DNA中任一 DNA。 4. 如申請專利範圍第1項或第2項之DNA，其中再 組合含有編碼序列表的序列號碼：3所記載的胺基酸序列 第1325〜1663位置序列之DNA、 或對於該DNA於嚴謹條件下進行雜交，且編碼與腈 水解酶活化有關之蛋白質的DNA中任一 DNA者。 5. —種DNA，其特徵爲含有編碼序列表的序列號碼： 1所記載的胺基酸序列之腈水解酶的α亞單位基因。 6. —種DN A，其特徵爲含有編碼序列表的序列號碼： 2所記載的胺基酸序列之腈水解酶的；S *位基因。 I 7. —種DN A，其特徵爲含有與編碼序列表的序列號碼 :4所記載的胺基酸序列之腈水解酶活化相關的基因。 8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之DN A， 其中該DNA爲來自屬。 1321151 9.如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之DNA， 其中該 DNA 爲來自 種。 10·如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之DNA ’其中該 DNA 爲來自 Ge<?daci7/wi thermoglucosidasius Q-6 株(BCRC 9 1 0263 )。 11. —種重組載體，其特徵爲插入如申請專利範圍第l 項至第10項中任一項之DN A。 12. —種微生物，其特徵爲由如申請專利範圍第1項 至第10項中任一項之 DNA經轉形之微生物、或 Geobacillus thermo glucosidasius Q-6 株(BCRC 9 1 0 2 6 3 ) 及其變異體之任一微生物。 13. —種蛋白質或含有蛋白質之菌體處理物的製造方 法，其特徵爲含有以如申請專利範圍第1項至第10項中 任一項之DNA進行轉形之微生物於培養基中培養後製造 蛋白質.、或含有該蛋白質的菌體處理物。 14. 一種蛋白質或含有該蛋白質之菌體處理物，其特 徵爲該蛋白質爲由以如申請專利範圍第13項之製造方法 所培養的微生物所取得者。 15. —種蛋白質，其特徵爲如下（A)或（B)的任一 蛋白質， (A)含有α亞單位與/3亞單位之蛋白質，其中α亞 單位爲含有序列表之序列號碼：1所記載的胺基酸序列， 石亞單位爲含有序列表之序列號碼：2所記載的胺基酸序 列； -3- I32J151 (B) 含有對於0：亞單位、與yg亞單位的任一方、或 雙方而言’ 1或複數個胺基酸經取代、缺失、加成、轉譯 後經修飾之改變或無改變之亞單位、或改變或無改變之 /5亞單位，且具有腈水解酶活性之蛋白質，其中α亞單位 含有序列表之序列號碼：1所記載的胺基酸序列，/3亞單 位爲含有序列表之序列號碼：2所記載的胺基酸序列。 16· —種蛋白質，其特徵爲如下（C)或（D)的任一 蛋白質， (C) 含有α亞單位與万亞單位之蛋白質，其中α亞 單位爲含有序列表的序列號碼：3的鹼基序列之第695-1 3 1 2位置序列之DNΑ所編碼，；S亞單位爲含有序列表的 序列號碼3的鹼基序列之第1〜68 1位置序列之DNA所編 碼； (D) 包含具有序列表的序列號碼：3的鹼基序列之 第695〜13 12位置序列之DNA、或對於該DNA以嚴謹條 件下進行雜交之DNA中任一 DNA所編碼之α亞單位、 與具有序列表的序列號碼：3的鹼基序列之第1〜681 位置序列之DNA、或對於該DNA以嚴謹條件下進行雜交 織DNA中任一 DNA所編碼之石亞單位， 且具有腈水解酶活性之蛋白質；但不包含上述（c) 情況之DNA 1321151 公告本 第93116724號專利申請案 中文圖式修正頁 民國98年10月15日修正 753262

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