CN114085802A - 重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法 - Google Patents

重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法 Download PDF

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Abstract

重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，涉及发酵工程技术领域；包括：构建重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌、菌种活化、种子液培养和分批补料高密度发酵；所述分批补料高密度发酵的步骤包括：1）将种子液培养得到的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的种子液接种于发酵培养基中进行高密度发酵；发酵培养基的溶氧值为30‑35%，培养温度为32‑37℃；2）当发酵培养基中重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的细胞浓度OD600=12‑15时，培养温度为16‑20℃，并加入诱导剂，保持发酵培养基的溶氧量为30‑35%，直至产酶结束。本发明的发酵方法，能显著提高亚胺还原酶的产酶量与产酶效率。

Description

重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法。
背景技术
手性胺广泛存在于临床药物、农业化学品、天然产物和表面活性剂中，是天然产物、药品、手性助剂和手型拆分剂的关键合成中间体。在医药方面，含有手性胺片段的合成药物具有非常显著的生物活性，超过70%的药物是手性胺及其衍生物，其中包括抗高血压类、神经类和心血管类的药物。在农业方面，约20%的农用化学品中存在手性胺结构单元。
不对称合成手性胺的主要方法有化学法和生物酶催化法。通过化学法合成手性胺，污染严重，条件严格，步骤多，阻碍了大规模生产。相比化学合成法，生物酶催化法更环保、更有效，具有高选择性和经济友好的优点。生物酶催化法合成手性胺的过程中常用到的酶有转氨酶、单胺氧化酶、脱氢酶和亚胺还原酶。相比其他酶，亚胺还原酶在催化合成手性仲胺和叔胺方面具有独特的优势。因此，近年来，通过生物酶催化法合成手性胺逐渐成为研究的热点。
亚胺还原酶（IRED，Imine Reductase）是一种氧化还原酶，可将前手性的亚胺不对称合成为相应的手性胺，此反应过程需消耗辅酶NADPH；并且可以实现碳氮双键间的不对称加成反应，满足许多药物分子中间体的生物合成。通过分子生物学、基因工程技术等现代生物技术，异源表达获得的亚胺还原酶，可催化多种环亚胺反应合成S型或R型的手性胺；且亚胺还原酶的催化反应具有立体选择性和高转化率。
在发酵方面，通过传统发酵方法发酵培养的产酶量少，材料损耗大，使产品的产量难以提升，同时伴随着产酶的成本居高不下。因此，开发一种重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法具有重大意义，通过此方法有利于工业化生产亚胺还原酶，应用于手性胺的高纯度生产中。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，其能显著提高亚胺还原酶的产酶量与产酶效率。
本发明采用如下技术方案实现：
重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，步骤包括：构建重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌、菌种活化、种子液培养和分批补料高密度发酵；
所述分批补料高密度发酵的步骤包括：
1）菌体快速繁殖阶段：将种子液培养得到的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的种子液接种于发酵培养基中进行高密度发酵；其中，发酵培养基的pH值为6.8-7.2，发酵培养基的溶氧值为30-35%，培养温度为32-37℃；
2）菌体产酶阶段：当发酵培养基中重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的细胞浓度OD600=12-15时，设置培养温度为16-20℃，并加入诱导剂，保持发酵培养基的pH值为6.8-7.2，发酵培养基的溶氧量为30-35%，直至产酶结束。
进一步地，所述重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌中，编码亚胺还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3），载体为pET-28a。
进一步地，所述菌种活化的步骤为：将重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌在LB固体培养基上划线，36-38℃下培养16-18 h后，挑取单菌落于LB液体培养基中，在温度为36-38℃，转速为180-220 rpm的条件下培养4-6 h。
进一步地，所述种子液培养的步骤为：将所述菌种活化得到的菌液接种至种子培养基中，36-38℃，180-220 rpm震荡培养10-18 h。优选地，震荡培养12-14 h。
进一步地，所述种子培养基包括：38-42 g/L葡萄糖，1.5-2.5g/L硫酸铵，1.5-2.5g/L磷酸二氢铵，0.8-1.2g/L七水合硫酸镁，19-21 g/L酵母提取物（Yeast Extract），1.5-2.5 g/L玉米浆干粉，78-82 mg/L七水合硫酸亚铁，78-82 mg/L一水合硫酸锰， 98-102 mg/L抗生素。
进一步地，所述分批补料高密度发酵的步骤中，所述发酵培养基包括：38-42 g/L葡萄糖，1.6-2 g/L硫酸铵，2.5-3.5 g/L磷酸二氢铵，1.8-2.2 g/L七水合硫酸镁，0.8-1.2g/L 酵母提取物，1.8-2.2 g/L玉米浆干粉，78-82 mg/L七水合硫酸亚铁，78-82 mg/L一水合硫酸锰，0.05-0.07 g/L消泡剂，98-102 mg/L抗生素。
进一步地，所述抗生素为硫酸卡那霉素，所述消泡剂为生物发酵用消泡剂。
进一步地，所述种子液培养步骤中，以种子培养基的体积计，将菌种活化后得到的菌液以0.4-0.6%的接种量接种至种子培养基中；
所述分批补料高密度发酵步骤中，以发酵培养基的体积计，所述种子液的接种量为4-10%。
进一步地，所述分批补料高密度发酵步骤中，通过控制溶氧串级转速和恒速流加补料液以控制溶氧值，具体为：
1）菌体快速繁殖阶段：将种子液培养得到的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的种子液接种于发酵培养基中进行高密度发酵，培养温度为32-37℃，培养时间为5-10 h，同时通过控制溶氧串级转速和恒速流加补料液以控制溶氧值，重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的比生长速率为0.4-0.9 h-1；其中，发酵培养基的pH值为6.8-7.2，发酵培养基的溶氧值为30-35%，转速为200-800 rpm，通气量为3.6-4.2 L/min，压力为0.04-0.065 Mpa，所述补料液为78-82wt%葡萄糖溶液，补料速度为9-11 mL/h；
2）菌体产酶阶段：当发酵培养基中重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的细胞浓度OD600=12-15时，设置培养温度为16-20℃，并加入诱导剂进行产酶，产酶时间为4-10 h，同时通过控制溶氧串级转速和恒速流加补料液以控制溶氧值，重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的比生长速率为0.1-0.3 h-1；保持发酵培养基的pH值为6.8-7.2，发酵培养基的溶氧量为30-35%，转速为400-600 rpm，通气量为3.6-4.2 L/min，压力为0.04-0.065 Mpa；所述补料液为78-82wt%葡萄糖溶液，补料速度为9-11 mL/h。
进一步地，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，浓度为0.35-0.45 mM。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
（1）本发明的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，运用分批补料高密度发酵进行工程菌的发酵培养，有效控制发酵培养基的溶氧量，
为菌体生长提供所需的营养成分以及生长所需的环境，极大地提高了发酵结束时产酶量。发酵结束时细菌浓度OD600从原来的9提高到70以上；产酶量从原来的3.98 g/L提高到98 g/L；整个高密度发酵过程只需要9-20 h，缩小产酶时间使产酶效率大幅提高，同时降低了酶的生产成本。
（2）本发明提供的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，稳定性高，重现性好，适合用于工业化生产中。
附图说明
图1为本发明的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法的细胞浓度变化图。
图2为本发明的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法的残糖数值变化图。
图3为亚胺还原酶活性测定中液相色谱法的混标检测结果图。
图4为亚胺还原酶活性测定中产物的液相色谱法检测结果图。
具体实施方式
下面，结合附图与具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
下列实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件或制造厂商所建议的实验条件，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。
实施例1
重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的构建：
获取亚胺还原酶，编码亚胺还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其利用酶切位点EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ连接在大肠杆菌（大肠杆菌BL21（DE3））表达载体pET-28a上，得到重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌，并将该工程菌命名为BL21（DE3）/pET-28a-IRED。
实施例2
发酵前准备：
1、常规试剂的配制：
80%葡萄糖溶液：称量240g葡萄糖，用纯水定容到300 mL，高温高压灭菌，即得；灭菌条件为115℃，20 min；
50%消泡剂：取50 mL消泡剂，加入50 mL纯水，高温高压灭菌，即得；灭菌条件为115℃，20 min；
50%氨水：量取100 mL氨水，加入100 mL经过高温高压灭菌的灭菌水，即得；
1 mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）：根据浓度配制后，用注射器过膜除菌；
100 mg/mL硫酸卡那霉素：根据浓度配制后，用注射器过膜除菌。
2、种子培养基和发酵培养基的配制：
种子培养基：在锥形瓶内称取0.4 g硫酸铵，0.4 g磷酸二氢铵，0.2 g七水合硫酸镁，4 g 酵母提取物，0.4 g玉米浆干粉，0.016 g七水合硫酸亚铁和0.016 g一水合硫酸锰，加入纯水0.19 L，高温高压灭菌，灭菌条件为115℃，20 min，使用前加入10 mL 80%葡萄糖溶液和200 μL硫酸卡那霉素，并用50%氨水调节pH至7.0。
发酵培养基：在5 L发酵罐内称取3.6 g硫酸铵，6 g磷酸二氢铵，4 g七水合硫酸镁，2 g酵母提取物，4 g玉米浆干粉，0.16 mg七水合硫酸亚铁，0.16 mg一水合硫酸锰和消泡剂3滴，加入纯水1.9 L，高温高压灭菌，灭菌条件为115℃，20 min，使用前加入100 mL80%葡萄糖溶液和2 mL硫酸卡那霉素，并通过流加50%氨水调节pH至7.0。
实施例3
菌种活化和种子液培养：
取-20℃保藏的E.coil BL21（DE3）/pET-28a-IRED甘油菌在LB固体培养基上划线，37℃倒置培养16小时；挑取单菌落于1 mL LB液体培养基中，37℃，200 rpm震荡培养6小时，得到活化的菌种。
将活化的菌种全部接入到200 mL种子培养基中，37℃，200 rpm震荡培养12小时，得到种子液。
实施例4
分批补料高密度发酵：
（1） 发酵罐的安装：
安装发酵罐，冷却系统链接盘管出水口和盘管进水口，链接进气口，链接消泡电极和温度电极，链接pH电极和溶氧电极；在接种前完成pH标定和溶氧标定，完成蠕动泵标定；80%葡萄糖溶液、50%消泡剂、50%氨水通过补料口分别链接入发酵罐。
（2） 菌体快速繁殖阶段：
将实施例3得到的种子液接入到所述发酵培养基中，在经过完成安装的发酵罐内进行发酵培养，其中发酵培养基体积为2 L，初始转速为200 rpm，温度为37℃，pH为7.0，通气量为4 L/min，罐压为0.05 MPa，开启pH自动调节、消泡剂自动感应、转速自动控制和温度自动控制。开始发酵，溶氧逐渐下降，两小时后，开始向发酵体系恒速流加80%葡萄糖溶液，流加速度为10 mL/h，并通过溶氧串级转速控制溶氧稳定于30-35%。
（3） 菌体产酶阶段：
当上述发酵液OD600达到12时，对发酵体系进行调整，具体为：转速调整为600 rpm，温度为20℃，pH为7.0，通气量为4 L/min，罐压为0.05 MPa，保持pH自动调节、消泡剂自动感应、转速自动控制和温度自动控制，并加入终浓度为0.4 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。通过恒速流加80%葡萄糖溶液和溶氧串级转速，控制溶氧值维持在30-35%，直至产酶结束。
产酶结束，离心收集菌体称重，得到其产酶量为98 g/L。
对照组：发酵体系为3 L，使用M9培养基，接种量1%，通气量4 L/min，pH=7（用25%氨水调节），补料培养基为87.5%葡萄糖（没有补料控制溶氧值），恒定转速200 rpm（没有溶氧串级转速），37℃发酵24 h后，降温为20℃，并加入0.5 mM IPTG，继续发酵6 h后结束，离心收集菌体称重，重量为3.98 g/L。
与对照组相比，本发明的产酶量从原来的3.98 g/L提高到98 g/L；整个高密度发酵过程只需要9-20 h，缩小产酶时间使产酶效率大幅提高，同时降低了酶的生产成本。
实施例5
发酵过程细胞浓度的变化：
针对实施例4中的菌体快速繁殖阶段和菌体产酶阶段，每小时取样，通过分光光度计测定OD600，得细胞浓度变化情况，结果如图1所示。
从图1可以看出，OD600值随着时间的增加而不断递增，其中，培养7小时即可使发酵液OD600达到12。
实施例6
发酵液中残余糖量的监控：
针对实施例4中的菌体快速繁殖阶段和菌体产酶阶段，每小时取样，13,000 rpm离心1 min，吸取上清液200 μL，通过便携式糖度计测定每小时残余糖量数值，结果如图2所示。
实施例7
亚胺还原酶酶活快速测定：
针对实施例4中菌体产酶阶段，每小时取样所收集的菌体进行亚胺还原酶酶活的快速测定，反应体系具体为：底物0.5 mg/mL，葡萄糖0.925 mg/mL，亚胺还原酶酶25 mg/mL，GDH（商业用酶）0.005 mg/mL，NAD 0.0225 mg/mL，用0.1 M磷酸盐溶液作缓冲液，反应条件为：30℃，200 rpm，1 h。
实施例8
酶活快速测定中产物的测定方法：
实施例7中产物含量测定方法为高效液相色谱法，具体为：流动相A：乙酸氨：0.15%乙酸，用氨水调节pH到9.5；流动相B：100%乙腈；其他条件：色谱柱：Xtimate-C18（4.6×250mm，5 μm）；检测波长：254 nm，流速1 mL/min；柱温为30℃；进样量 5 μL，梯度洗脱（梯度情况，见表1）。产物检测结果见图3和图4。
表1高效液相色谱法检测产物梯度洗脱流动相情况
Figure 976193DEST_PATH_IMAGE002
如图3所示，该混标的高效液相色谱图中，10.384min和11.472min处具有波峰，其中，10.384min处为产物的峰，11.472min处为底物的峰，可以看出，发生产酶的过程。
如图4所示，酶活反应后，该高效液相色谱图中，在10.274 min处具有产物的波峰，且峰面积较大，底物没有出峰，所以底物已经消耗完，全部转化生成产物，因此，通过本方法证明产酶可行性。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东金骏康生物技术有限公司
<120> 重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2334
<212> DNA
<213> 人工合成
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Claims (10)

1.重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，其特征在于，步骤包括：构建重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌、菌种活化、种子液培养和分批补料高密度发酵；
所述分批补料高密度发酵的步骤包括：
1）菌体快速繁殖阶段：将种子液培养得到的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的种子液接种于发酵培养基中进行高密度发酵；其中，发酵培养基的pH值为6.8-7.2，发酵培养基的溶氧值为30-35%，培养温度为32-37℃；
2）菌体产酶阶段：当发酵培养基中重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的细胞浓度OD600=12-15时，设置培养温度为16-20℃，并加入诱导剂，保持发酵培养基的pH值为6.8-7.2，发酵培养基的溶氧量为30-35%，直至产酶结束。
2.如权利要求1所述的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，其特征在于：所述重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌中，编码亚胺还原酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3），载体为pET-28a。
3.如权利要求1所述的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，其特征在于，所述菌种活化的步骤为：将重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌在LB固体培养基上划线，36-38℃下培养16-18 h后，挑取单菌落于LB液体培养基中，在温度为36-38℃，转速为180-220 rpm的条件下培养4-6 h。
4.如权利要求1所述的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，其特征在于，所述种子液培养的步骤为：将所述菌种活化得到的菌液接种至种子培养基中，36-38℃，180-220 rpm震荡培养10-18 h。
5.如权利要求4所述的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，其特征在于，所述种子培养基包括：38-42 g/L葡萄糖，1.5-2.5 g/L硫酸铵，1.5-2.5 g/L磷酸二氢铵，0.8-1.2 g/L七水合硫酸镁，19-21 g/L酵母提取物，1.5-2.5 g/L玉米浆干粉，78-82mg/L七水合硫酸亚铁，78-82 mg/L一水合硫酸锰，98-102 mg/L抗生素。
6.如权利要求1所述的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，其特征在于，所述分批补料高密度发酵的步骤中，所述发酵培养基包括：38-42 g/L葡萄糖，1.6-2 g/L硫酸铵，2.5-3.5 g/L磷酸二氢铵，1.8-2.2 g/L七水合硫酸镁，0.8-1.2 g/L 酵母提取物，1.8-2.2 g/L玉米浆干粉，78-82 mg/L七水合硫酸亚铁，78-82 mg/L一水合硫酸锰，0.05-0.07 g/L消泡剂，98-102 mg/L抗生素。
7.如权利要求5或6所述的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，其特征在于，所述抗生素为硫酸卡那霉素。
8.如权利要求1或4所述的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，其特征在于，所述种子液培养步骤中，以种子培养基的体积计，将菌种活化后得到的菌液以0.4-0.6%的接种量接种至种子培养基中；
所述分批补料高密度发酵步骤中，以发酵培养基的体积计，所述种子液的接种量为4-10%。
9.如权利要求1所述的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，其特征在于，所述分批补料高密度发酵步骤中，具体为：
1）菌体快速繁殖阶段：将种子液培养得到的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的种子液接种于发酵培养基中进行高密度发酵，培养温度为32-37℃，培养时间为5-10 h，同时通过控制溶氧串级转速和恒速流加补料液以控制溶氧值，重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的比生长速率为0.4-0.9 h-1；其中，发酵培养基的pH值为6.8-7.2，发酵培养基的溶氧值为30-35%，转速为200-800 rpm，通气量为3.6-4.2 L/min，压力为0.04-0.065 Mpa，所述补料液为78-82wt%葡萄糖溶液，补料速度为9-11 mL/h；
2）菌体产酶阶段：当发酵培养基中重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的细胞浓度OD600=12-15时，设置培养温度为16-20℃，并加入诱导剂进行产酶，产酶时间为4-10 h，同时通过控制溶氧串级转速和恒速流加补料液以控制溶氧值，重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的比生长速率为0.1-0.3 h-1；保持发酵培养基的pH值为6.8-7.2，发酵培养基的溶氧量为30-35%，转速为400-600 rpm，通气量为3.6-4.2 L/min，压力为0.04-0.065 Mpa；所述补料液为78-82wt%葡萄糖溶液，补料速度为9-11 mL/h。
10.如权利要求1所述的重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的快速高密度发酵方法，其特征在于，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，浓度为0.35-0.45 mM。
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