DE10006204A1 - Ozon- und/oder Pathogen-induzierbare Genexpression in Pflanzen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die pflanzliche Abwehrgene umfassen, sowie Promotoren, die eine durch Pathogen und/oder Ozon induzierbare Genexpression vermitteln. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Erzeugung neuer Pflanzen, die diese Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente davon enthalten, diese neuen Pflanzen sowie die Verwendung der Promotoren zur Erzeugung Pathogen- und/oder Ozonresponsiver Genexpression in Pflanzen und Pflanzenzellen.

Description

Die Erfindung betrifft rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die pflanzliche Abwehrgene umfassen, sowie Promotoren, die eine durch Pathogen und/oder Ozon induzierbare Genexpression vermitteln. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Erzeugung neuer Pflanzen, die diese Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente davon enthalten, diese neuen Pflanzen sowie die Verwendung der Promotoren zur Erzeugung Pathogen- und/oder Ozon- responsiver Genexpression in Pflanzen und Pflanzenzellen.

Stilbenen wurde schon früh eine antibakterielle und fungitoxische Wirkung zugesprochen. Sie finden sich in einigen nicht miteinander verwandten Pflanzenfamilen, jedoch nur selten in wichtigen Kulturpflanzen. In der Kiefer (Pinus sylvestris) treten die konstitutiven Stilbene Pinosylvin (PS; 3,5-Dihydroxystilben) und Pinosylvinmonomethylether (PSM) ausschließlich im Kernholz auf (H. Kindl (1985), Biosynthesis of stilbenes in: Biosynthesis and Biodegradation of Wood Components (Hrsgb.: T. Higuchi), Academic Press, London, 349-377). Die Synthese dieser beiden Verbindungen wird allerdings in den Trieben, dem Phloem und den Nadeln als Antwort auf Verwundung oder den Angriff von Pilzen induziert (J. H. Hart (1981), Annu. Rev. Phytopathol. 19, 437-458; Kindl, supra; Lieutier et. al. (1996), Eur. J. For. Path. 26, 145-158).

Die Stilbene lassen sich allgemein in konstitutive Verbindungen zum Schutz des Holzabbaus vor Mikroorganismen und in induzierte Phytoalexine, die das Phloem gegen Borkenkäfer und andere Insekten sowie gegen mit Käfern symbiotisch assozierte Pilze schützen, einteilen (Hart, supra; Lieutier, supra). Der Stoffwechsel zu Methoxystilbenen geht von L-Phenylalanin aus und umfasst die Aktivitäten der Enzyme Phenylalaninammoniumlyase (PAL), Stilben­ synthase (STS) und Pinosylvin-3-O-methyltransferase (PMT). Es wurde gezeigt, dass die STS-Aktivität der limitierende Faktor im Metabolismus zu PS und PSM ist (S. Schanz et al. (1992), FEBS 313, 71-74). Änderungen in der Genexpression von STS und/oder PMT beeinflussen somit voraussichtlich entscheidend die induzierte Resistenz von Pflanzen durch als Phytoalexine wirkende Stilbenoide.

Es ist bekannt, daß Pflanzen vor verschiedenen Streßfaktoren durch PSM wesentlich effizienter geschützt werden als durch PS. Beispiele hierfür sind der Schutz vor pathogenen Organismen wie beispielsweise Pilzen (Lieutier, supra) und der Schutz gegen Ozon (Rosemann et al. (1991), Plant Physiol. 97, 1280-1286), wobei PSM wesentlich stärker antimikrobiell wirksam ist als PS, die analoge Verbindung zu Resveratrol, einem weiteren Stilben. Des weiteren ist bekannt, daß die Pinosylvin-3-O-methyltransferase (PMT) durch Ozon wesentlich stärker induzierbar ist als die Stilbensynthase (STS) (Trost, Dissertation LMU München, 1994). Somit ist die Regulation der Aktivität der Pinosylvin-3-O- methyltransferase von wesentlicher biologischer und wirtschaftlicher Bedeutung.

Methyltransferasen sind an sich bekannt. Sie katalysieren die Übertragung von Methylgruppen von einer Verbindung auf eine andere. Bekannt sind ferner pflanzliche O- Methyltransferasen, die eine Methylierung des Sauerstoffatoms bewirken. Beispiele hierfür sind die O-Methyltransferase aus Pinus radiata (Acc. No. U70873) die Kaffeesäure-O- Methyltransferase aus Pinus taeda (Acc. No. U39301) die Catechol-O-methyltransferase aus Nicotiana tabacum (Acc. No. X74452) sowie die Lignin-bispezifische Säure/5-Hydroxy­ ferulasäure-O-methyltransferase aus Populus tremoides (Acc. No. X62096).

DNA-Sequenzen, die für Stilbensynthaseenzyme, d. h. die Synthese von Stilbenen wie Resveratrol bzw. Pinosylvin katalysierende Enzyme, codieren, sind beispielsweise in der europäischen Patentschrift EP 0 309 862, der deutschen Patentanmeldung DE-A-41 07 396, der europäischen Patentanmeldung EP 0 464 461 sowie der US-Patentschrift US 5,500,367 beschrieben. In diesen Dokumenten wird die Isolierung von Stilbensynthase-Genen und ihre Verwendung zur Erzeugung von transgenen Pflanzen beschrieben. Die resultierenden transgenen Pflanzen weisen eine erhöhte Resistenz gegenüber verschiedenen Pflanzenschäd­ lingen wie Pilzen, Bakterien, Insekten, Viren und Nematoden auf. So wurde beispielsweise STS aus Weinrebe in Tabak und Reis exprimiert und führte dann zu einer erhöhten Resistenz gegenüber Pathogenen (Hain et al. (1993), Nature 361, 153-156; Stark-Lorenzen et al. (1997), Plant Cell Rep. 16, 668-673). Da, wie vorstehend erwähnt, PSM Pflanzen vor verschiedenen Streßfaktoren wesentlich wirksamer schützt als PS, wäre die Kenntnis der DNA-Sequenz, die für die die PSM-Synthese katalysierende PMT codiert, äußerst wünschenswert.

Es gibt inzwischen verschiedene Hinweise darauf, daß es für eine möglichst effiziente Krankheitsresistenz basierend auf der Expression von pflanzlichen Abwehrgenen wie beispielsweise STS oder PMT in transgenen Pflanzen vorteilhaft ist, wenn die Expression des heterologen pflanzlichen Abwehrgens (bzw. der heterologen pflanzlichen Abwehrgene) in der Pflanze erst durch den Angriff der Pathogene, d. h. erst durch die Interaktion von Pflanze und Krankheitserreger, stimuliert wird (Fischer und Hain (1994), Current Opinion in Biotechno­ logy 5, 125-130; Fischer, Optimierung der heterologen Expression von Stilbensynthasegenen für den Pflanzenschutz, Dissertation Universität Hohenheim, 1994). Beispielsweise zeigten Untersuchungen mit transgenen Tabakplanzen, in denen STS-Gene unter dem konstitutiven 35S RNA-Promotor von Cauliflower Mosaic Virus zur Expression gebracht wurden, daß die in diesen Pflanzen erzielte Krankheitsresistenz geringer ist als in Pflanzen, die die gleichen Gene unter Kontrolle des Pathogen-induzierbaren homologen STS-Promoters nach Pilzbefall exprimierten (Fischer und Hain (1994) supra; Fischer (1994) supra.) Eine Induktion der Pathogenabwehr erfolgt bei dem letztgenannten System somit nur zum benötigten Zeitpunkt und nicht permanent.

Es ist somit eine wichtige Aufgabe der vorliegenden Erfindung, DNA-Sequenzen bereitzustellen, die für PMT codieren. Insbesondere ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen durch Pathogene und/oder Ozon induzierbaren PMT-Promotor bereitzustellen, um eine erhöhte Krankheitsresistenz in Pflanzen zu erzielen, in welche die PMT-Gene oder ein anderes pflanzliches Abwehrgen unter Kontrolle eines Pathogen- und/oder Ozon induzierbaren Promotors eingeführt werden.

Ferner ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung transformierter Pflanzenzellen bzw. Pflanzen bereitzustellen, die eine erhöhte Pathogen- und/oder Ozon induzierbare Krankheitsresistenz aufweisen. Weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Patentansprü­ chen.

Zur Lösung dieser Aufgaben dienen die Merkmale der unabhängigen Schutzansprüche.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den jeweiligen Unteransprüchen definiert.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül gelöst, das regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors, der eine durch Pathogene und/oder Ozon induzierbare Genexpression vermittelt, und operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Pinosylvin-3-O-methyltransferase (PMT) codiert, umfasst. Derartige rekombinante Nukleinsäuremoleküle führen nach der Einbringung in Pflanzenzellen zu einer Akkumulation von PSM in den transgenen Pflanzenzellen bzw. Pflanzen und damit zu einem wirksamen Schutz gegenüber Ozon und/oder Pathogenen wie Pilzen. Da PSM eine wesentlich stärkere antimikrobielle Wirkung als PS aufweist, dessen Synthese durch das im Stand der Technik beschriebene STS-Genprodukt katalysiert wird, kann das erfindungsgemäße Nukleinsäure­ molekül mit überdurchschnittlichem Vorteil beispielsweise im modernen Pflanzenschutz verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle umfassen funktionelle Fragmente der DNA. Unter "funktionell" sind Fragmente der PMT-Sequenz mit spezifischen Funktionen zu verstehen, wie beispielsweise Promotoren, Enhancer sowie andere Steuersequenzen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Promotor und/oder die DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls aus Pinus sylvestris (Kiefer) isoliert.

Insbesondere wird eine genomische DNA-Sequenz mit der Sequenz SEQ No. 1 aus Pinus sylvestris bereitgestellt, die für ein PMT-Protein codiert. Diese genomische Sequenz umfasst einschließlich Exon-, Intron- und flankierenden Sequenzen insgesamt 1908 Basenpaare. Das Gen, das für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer PMT codiert, besteht aus zwei kodierenden Exonregionen und einer Intronregion. Das Intron weist mit 102 Basenpaaren eine Größe auf, die für Introns üblich ist (Introns bestehen üblicherweise aus zwischen 70 und Tausenden von Nukleotiden; G. J. Goodall und W. Filipowicz (1991), EMBO J. 10, 2635-2644). Die 5'-Exon/Intron- und 3'-Intron/Exon-Grenzen bestätigen die bekannte GT/AG- Donor/Akzeptor-Regel, die sowohl in Pflanzen als auch in Tieren gültig ist (J. W. S. Brown (1986), Nucl. Acids Res. 14, 9549-9559). Bei genauerer Betrachtung stimmt das AG/GTA- Motiv an der 5'-Exon/Intron-Spleißstelle mit der AG/GTAAG-Consensussequenz überein. Ferner enthält das Intron ein CAG/-Motiv an der 3'-Intron/Exon-Spleißstelle analog der TGCAG/G-Consensus-Sequenz für Pflanzengene (Goodall und Filipowicz, supra). Das Intron ist AT-reich, was für den Spleißvorgang essentiell ist (Goodall und Filipowicz, supra). Die stromaufwärts gelegenen Sequenzen zeigten konservierte prokaryotische Elemente wie das cap-Signal TCATTCGT an Position -18, ein als TATA-Box identifiziertes TGATAAAAGCA-Motiv an Position -46 und mutmaßliche CAAT-Boxen an den Positionen -80 und -210 (vgl. SEQ ID No. 1).

Bei einem wesentlichen Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird ein Promotor des PMT- Gens oder Fragmente davon bereitgestellt, die eine durch Pathogen- und/oder Ozon induzierbare Genexpression in Pflanzenzellen vermitteln. Ein derartiger induzierbarer Promotor weist gegenüber konstitutiven Promotoren den Vorteil auf, dass die Pathogen­ abwehr durch die Produkte der mit dem erfindungsgemäßen Promotor operativ verbundenen Gene bzw. kodierenden Sequenzen (z. B. cDNA-Sequenzen) nur zum benötigten Zeitpunkt und nicht permanent erfolgt und somit eine höhere Krankheitsresistenz in Pflanzen, die dieses chimäre Genkonstrukt enthalten, erzielt werden kann. Vorzugsweise wird der erfindungs­ gemäße Promotor aus Pinus sylvestris isoliert.

Beispiele für Fragmente des erfindungsgemäßen Promotors des PMT-Gens aus Pinus sylvestris (Kiefer) sind W-Boxen im Bereich von -450 bis -420, -280 bis -240, -220 bis -180 sowie -100 bis -30, die insbesondere für die Pathogenabwehr wichtig sind (Rushton und Somssich (1998), Curr. Opinion Plant Biol. 1, 311-315), wie nachstehend ausführlich erläutert wird.

Der erfindungsgemäße PMT-Promotor aus der schottischen Kiefer enthält potentielle cis- Elemente. Myb-responsive Elemente (MRE) befinden sich an den Positionen -121, -129, -194, -230, -310 und -358. Das Element ACTTACCACCCT an Position -358 stimmt in acht von zwölf Positionen mit der Consensus-Sequenz T/A CT C/A ACCTA C/A C C/A in mit UV- Licht und mit Pilzelicitoren induzierten Pflanzengen-Promotoren des Phenylpropanoid- Metabolismus überein (Lois et al. (1989), EMBO J. 8, 1641-1648). An den Positionen -121 und -230 stimmen die (A + C) reichen Motive CCAACCACCTCC und CCAACCACTC mit einem zweiten Consensusmotiv (CCA A/C C A/T AAC C/T CC) in zehn bzw. neun von zwölf Positionen überein (Lois et al., supra). Das Element GTTG an Position -194 ist die inverse Stelle des Kernmotivs CAAC. Ein weiteres Motiv an Position -129, TCCCATCTCC, stimmt in neun von zehn Positionen mit der Consensus-Sequenz der boxE (A/T CCC A/T T/A C A/T A/T G/C) überein, die offensichtlich in Stress-induzierbaren Phenylpropanoidgen-Promotoren konserviert ist (B. Grimmig und U. Matern (1997), Plant Mol. Biol. 33, 323-341).

In dem erfindungsgemäßen PMT-Promotor aus Pinus sylvestris befinden sich ferner folgende regulatorische cis-wirkende Elemente, die für Flavonoid- und Stilben-biosynthetisierende Gene bekannt sind: G-Box artige Motive (GTGG an den Positionen -147 und -165, CACC an Position -353; Faktor et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32, 849-859), das H-Box artige Motiv CCATCC in inverser Orientierung (GGTAGG an Position -140), die GC-Box GGGGCAGAAT (Consensus-Sequenz G/T GGGCGG G/A G/A C/T) an Position -72; Elicitor-responsive Elemente, d. h. W-Boxen (ACTG an den Positionen -55, -199 und -263, und TGAC an Position -440; Rushton und Somssich, supra) und ein SV40-Enhancerkern in inverser Orientierung (TTACCAC an Position -356).

Die Charakterisierung des erfindungsgemäßen Promotors aus Pinus sylvestris ermöglicht die Bestimmung von potentiellen cis-regulatorischen Elementen, die möglicherweise in Beziehung mit der schnellen vorübergehenden Akkumulierung von PMT-mRNA durch die Behandlung von Kiefern mit Ozon und Pilzelicitoren stehen. PAL-, Cinnamat-4-hydroxylase und 4-Coumarat-CoA-ligase(4CL)-codierende Gene sind dafür bekannt, daß sie auf der Ebene der Transkription einer starken Kontrolle unterliegen und daß sie als Reaktion sowohl auf Entwicklungs- als auch auf Umgebungsstimuli in vielen Pflanzenspezies koordiniert exprimiert werden. Die Mitglieder der Myb-Familie sind in die Regulierung dieser Phenylpropanoid-Gene involviert (Rushton und Somssich, supra).

MREs befinden sich in dem erfindungsgemäßen PMT-Promotor aus Pinus sylvestris an den Positionen -121, -129, -194, -230, -310 und -358. Die MREs an den Positionen -358, -310 und -230 wurden in Petersilie als Boxen L, A bzw. P für nahezu alle bekannten PAL- und 4CL-Gene (Logemann et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5905-5909) und ebenso für CCoAOMT-Gene in Petersilie (Grimmig und Mattem, supra) beschrieben. Diese Elemente alleine oder eine Promotorregion, die alle diese Elemente zusammen enthält, können jedoch keine Elicitor- oder Licht-Responsivität eines Reportergenes in transienten Expressions- Assays vermitteln. Folglich sind diese Elemente offenbar notwendig, aber nicht ausreichend für eine Elicitor- oder Licht-vermittelte PAL- und 4CL-Genaktivierung (Logemann et al. supra). Ferner ist außer diesen Genen kein weiteres Beispiel eines in den allgemeinen Phenylpropanoid-Stoffwechsel involvierten Gens bekannt, dessen Promotor einen vollständigen Satz aller dieser drei Boxen enthält, was deren funktionelle Wichtigkeit bei der koordinativen Regulierung dieser Gene weiter unterstreicht.

Eine G-Box, die sich in der Nähe der TATA-Box befindet, ist ein weit verbreitetes Sequenzmotiv in eukaryontischen Promotoren. Derartige G-Boxen liegen bei dem erfindungsgemäßen PMT-Promotor aus Pinus sylvestris an den Positionen -147 und -165 und in einer inversen Orientierung an der Position -353 vor. Die funktionelle Analyse von Pflanzenpromotoren hat gezeigt, dass die G-Box eine Rolle bei der Promotoraktivierung durch verschiedene Signale wie Licht, Abscisinsäure und UV-Licht spielt (Faktor et al., supra).

Die Konservierung der G-Box sowie der H-Box zwischen TATA- und G-Boxen in unterschiedlichen CHS-Promotoren unterstreicht ihre Wichtigkeit als regulatorische Motive (Faktor et al., supra). Eine H-Box liegt in dem erfindungsgemäßen Promotor der Kiefer in einer inversen Orientierung an der Position -140 zwischen der TATA- und den G-Boxen. Sowohl G- als auch H-Boxen wurden in dem Promotoren-nahen Bereich einer Anzahl von Genen gefunden, die für Phenylpropanoid-biosynthetisierende Enzyme codieren, wie beispielsweise PAL, 4CL und CHS (Zhu et al. (1996), Current Oppinion in Genetics & Development 6, 624-630). Die G- und H-Box in der Nähe der TATA-Box wurden beide als essentiell für die florale Expression beschrieben (Faktor et al., supra).

G-Boxen sind, ausgelöst durch Entwicklungssignale sowie durch pathogene Signale wie Abscisinsäure, Licht, UV-Bestrahlung und Verwundung, in die Regulation von diversen Genen involviert. Die H-Box ist nicht so weit verbreitet, wobei sie charakteristisch für Phenylpropanoid-biosynthetisierende Genpromotoren ist (Zhu et al. supra). Die G-Box und die H-Boxen sind zusammen notwendig und offensichtlich ausreichend für eine feed-forward- Stimulierung durch 4-Coumarinsäure (Loake et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9230-9234). Die H-Box liegt ebenfalls in CHS- und PAL-Promotoren der Petersilie vor, und durch funktionelle Analyse wurde gezeigt, daß dieses cis-Element in die UV-Induktion involviert ist (Loake et al., supra).

Enhancer- oder Aktivatorelemente erhöhen die transkriptionelle Aktivität von bestimmten eukaryontischen Genen dramatisch. Eine Kopie der SV40-Enhancer-Kernsequenz wird an Position -356 im PMT-Promotor gefunden. Derartige Enhancer-Sequenzen wurden im Zusammenhang mit den Promotoren von PAL-Genen aus Phaseolus vulgaris (Cramer et al. (1989), Plant. Mol. Biol. 12, 367-383) und Petersilie-CCoAOMT (Grimmig und Mattem, supra) berichtet.

Elicitor-responsive Elemente (W-Boxen) TTGACC wurden von Raventos et al. (Plant J. 7, 147-155 (1995)) sowie von Rushton et al. (supra) beschrieben. Derartige W-Boxen finden sich bei dem erfindungsgemäßen PMT-Promotor aus Pinus sylvestris an Position -440 und in inverser Orientierung an den Positionen -55, -199 und -263. Sequenzen mit derartigen Elicitor-responsiven Elementen treten in Promotoren von verschiedenen mit Abwehrgenen verwandten Genen einschließlich PR1 aus Petersilie (Rushton, Supra), im CHS-Promotor von Mais (Franken et al (1991) EMBO J. 10, 2605-2612) und im STS-Promotor von Wein auf (Schubert et al. (1997), Plant Mol. Biol. 34, 417-426; Ernst et al. (1999) "Ozone induced genes mechanisms and biotechnological applications" in Plant Responses to environmental stress (Hrsgb.: M. S. Smallwood, C. M. Calvert, D. J. Bowles), BIOS Scientific Publishers, Oxford, 33-41). Elicitor-responsive Elemente sind allgemein verantwortlich für die Induktion von Pflanzenabwehrmechanismen.

Im STS-Promotor aus Wein unterscheidet sich die Ozon-responsive Region (-430 bis -280) von der Pathogen-responsiven Region (-280 bis -140) (Schubert et al., supra; Ernst el al., supra). In dem erfindungsgemäßen PMT-Promotor liegen die Pathogen- bzw. Elicitor- responsiven W-Boxen im größeren Umfang in dem Bereich zwischen -263 und -50 vor.

Bei einem weiteren wesentlichen Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Erfindung chimäre Nukleinsäuremoleküle, in die der vorstehend genannte erfindungsgemäße Promotor oder Fragmente davon wie beispielsweise die vorstehend genannten W-Boxen eingeführt wurden. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen chimären Nukleinsäuremoleküle neben dem vorstehend genannten Promotor oder Fragmenten davon operativ mit dem Promotor verknüpfte DNA-Sequenzen, die für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine codieren.

Phytoalexine im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, die von Pflanzen aufgrund einer Ozon-Belastung oder aufgrund einer Infektion zur Abwehr der Pathogene, meist Pilzen, gebildet werden können.

Somit können die in den erfindungsgemäßen chimären Nukleinsäuresequenzen enthaltenen codierenden Regionen durch Ozon und/oder Pathogene induzierbar in Pflanzen exprimiert werden. Besonders bevorzugt sind diese codierenden Regionen Abwehrgene, am meisten bevorzugt Gene für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine, die natürlicher­ weise nicht Ozon- und/oder Pathogen-induzierbar sind.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können beliebige Nukleinsäuremoleküle sein, insbesondere DNA- oder RNA-Moleküle, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA usw. Sie können natürlich vorkommende oder durch gentechnische oder chemische Syntheseverfahren hergestellte Moleküle sein.

Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, welche die vorstehend genannten rekombinanten Nukleinsäuremoleküle, Promotoren oder chimären Nukleinsäuremoleküle enthalten. Die vorliegende Erfindung umfasst somit auch Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten und ggf für den Transfer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eingesetzt werden können.

Ebenso betrifft die Erfindung transformierte Mikroorganismen, wie Bakterien, Viren, Pilze, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten.

Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, Promotoren oder Vektoren besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnologischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie eine Ozon- und/oder Pathogen induzierbare Merkmalsausprägung aufweisen. Insbesondere besteht nun die Möglichkeit pflanzliche Zellen mittels gentechnologischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie ein oder mehrere pflanzliche Gene für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine, deren Expression natürlicherweise nicht oder nicht wesentlich durch Ozon und/oder Pathogene induziert wird, durch Fusion des erfindungsgemäßen Promotors oder eines Fragments davon mit derartigen pflanzlichen Genen Pathogen- bzw. Ozon-induzierbar ausprägen.

Ebenso können pflanzliche Zellen mittels gentechnologischer Methoden dahingehend verändert werden, daß sie durch Einfügen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder mindestens eines Fragments davon in solche Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die diese DNA- Sequenzen natürlicherweise nicht enthalten, eine Ozon- und/oder Pathogen induzierbare Merkmalsausprägung aufweisen.

Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung, neue Pflanzen und Pflanzenzellen bereitzustellen, die sich durch eine Ozon- und/oder Pathogen induzierbare Expression von Genen auszeichnen, die entweder natürlicherweise nicht in diesen Pflanzen, bzw. Pflanzenzellen vorliegen oder die natürlicherweise nicht über den erfindungsgemäßen Promotor oder Fragmente davon verfügen.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen für die PMT codierenden DNA-Sequenz sowie der Bereitstellung des für die Ozon- und/oder Pathogen- Induktion verantwortlichen Promotors oder Fragmenten davon, die eine durch Ozon und/oder Pathogene induzierbare Genexpression der durch sie kontrollierten Abwehrgene in Pflanzen und pflanzlichen Zellen ermöglichen, gelöst.

Gegenstand der Erfindung sind somit transgene Pflanzen, die die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle, Promotoren oder chimären Nukleinsäuremoleküle integriert in das pflanzliche Genom vorliegend enthalten. Bei diesen Pflanzen kann es sich im Prinzip im jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutzpflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Secale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören. Dikotyle Nutzpflanzen umfassen unter anderem Baumwolle, Leguminosen wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen sowie Bäume. Weitere Nutzpflanzen können Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal sowie bei Heilpflanzen Rauwolfia und Digitales umfassen. Besonders bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Zuckerrübe, Raps, Soja, Tomate, Kartoffel und Tabak.

Gegenstand der Erfindung ist ferner Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstücke usw., sowie Teile dieser Pflanzen wie Pflanzenzellen, Protoplasten und Kalli.

Die Pflanzenzellen umfassen differenzierte und undifferenzierte Pflanzenzellen einschließlich Protoplasten, in denen die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle, Promotoren oder chimären Nukleinsäuremoleküle integriert in das pflanzliche Genom oder als autonome Moleküle (einschließlich transiente Transformation) vorliegen.

Bei einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische und eukaryontische Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül, einem erfindungsgemäßen Promotor oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert bzw. infiziert wurden, und Zellen, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebenen Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirtszellen können Bakterien oder Pilzzellen sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein.

Der vorliegenden Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen aufzuzeigen, die eine erhöhte Pathogen- und/oder Ozon- induzierbare Krankheitsresistenz aufweisen. Diese Aufgabe wird durch Verfahren gelöst, mit deren Hilfe die Erzeugung neuer Pflanzen bzw. Pflanzenzellen möglich ist, bei denen natürlicherweise keine pflanzlichen Abwehrgene gegen Ozon sowie Pathogene vorliegen bzw. die gewünschte Abwehrgenexpression nicht in ausreichendem Maß vorliegt und/oder die keine bzw. keine ausreichende, natürlicherweise vorkommende Ozon- und/oder Pathogen- induzierbare Genexpression aufweisen.

Zur Erzeugung solcher neuer Pflanzen bzw. Pflanzenzellen bieten sich verschiedene Methoden an. Zum einen können Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologischer Transformationsmethoden derart verändert werden, daß die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. Promotoren in das pflanzliche Genom integriert werden, so daß stabile Transformanten erzeugt werden.

Erfindungsgemäß werden Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogen- und/oder Ozon-induzierbarer Krankheitsresistenz durch ein Verfahren hergestellt, bei dem ein oder mehrere Abwehrgene, vorzugsweise Gene, die für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine codieren, in Form der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle, die den erfindungsgemäßen Promotor und eine für PMT codierende Sequenz umfassen, oder in Form der erfindungsgemäßen chimären Nukleinsäuremoleküle, die den erfindungsgemäßen Promotor und ein oder mehrere Abwehrgene und vorzugsweise Gene umfassen, die für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine codieren, eingeführt werden.

Alternativ werden Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogen- und/oder Ozon- induzierbarer Krankheitsresistenz durch ein Verfahren hergestellt, bei dem ein oder mehrere Abwehrgene, bevorzugt Gene, die für die Synthese von Phytoalexinen katalysierende Proteine codieren, zwar natürlicherweise vorliegen, aber nicht durch Ozon und/oder Pathogene induzierbar sind, durch Einführung des erfindungsgemäßen Promotors oder von funktionellen Fragmenten davon induzierbar gemacht werden.

Bei der Einführung der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle, umfassend den erfindungsgemäßen Promotor und eine für PMT codierende Sequenz, umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere folgende Schritte:

• a) soweit erforderlich das Einbringen der für eine Stilbensynthase codierenden DNA- Sequenz in eine Pflanzenzelle, falls in der Pflanzenzelle keine oder keine ausreichende STS-Genaktivität vorliegt (durch die Stilbensynthase wird Pinosylvin bereitgestellt, das als Substrat für die PMT dient, welche durch die DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle codiert wird),
• b) das Einbringen des erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in die Pflanzenzelle, und ggf.
• c) das Regenerieren vollständig transformierter Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen, und ggf.
• d) das Gewinnen der gewünschten Pflanzenteile einschließlich der Samen der so erhaltenden Pflanzen.

Bevorzugt wird das rekombinante PMT-Enzym in einer solchen Menge exprimiert, daß durch die Methylierung von Pinosylvin ein zumindest teilweiser Schutz gegenüber Ozon und/oder durch pathogene Organismen verursachte Erkrankungen der Pflanzen bewirkt wird. Es kann ausreichend sein, daß lediglich die funktionellen Teile des rekombinanten Proteins exprimiert werden, um einen derartigen Schutz zu bewirken.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das rekombinante Protein oder ein funktioneller Teil davon zur Methylierung von Pinosylvin oder einem Derivat von Pinosylvin benutzt, wobei sich dieser Anwendungszweck auch auf pharmazeutische Einsatzgebiete oder sonstige Gebiete erstrecken kann, bei denen einen Methylierung von Pinosylvin von hoher Spezifität erforderlich ist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, vorteilhafte Verwendungen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder der erfindungsgemäßen Promotoren aufzuzeigen.

Die Erfindung umfaßt daher Verwendungen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle bzw. der erfindungsgemäßen Promotoren zur Erzeugung der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Pflanzen und Pflanzenzellen, die sich aufgrund der Anwesenheit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle durch eine Ozon- und/oder Pathogen-induzierte Merkmalsausprägung von nicht-transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen unterscheiden.

Des weiteren umfaßt die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure­ moleküle bzw. der erfindungsgemäßen Promotoren oder von Fragmenten davon zur Auffin­ dung und Identifizierung von Ozon- und/oder Pathogen-responsiven Nukleinsäureelementen in pflanzlichen Genen.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nukleinsäuremoleküle oder Fragmente davon, die mit einer der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisieren. Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben sind.

Nukleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können beispielsweise aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden.

Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nuleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teilen dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, beispielsweises mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe beispielsweise Sambrook et al. supra).

Somit betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz oder von Teilen davon zur Identifizierung und Isolierung homologer Sequenzen aus Pflanzen oder anderen Organismen.

Als Hybridisierungssonde können beispielsweise Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt oder im wesentlichen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teile dieser Sequenzen aufweisen. Bei den als Hybridisierungssonde verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften erforderlich. Hierzu stehen dem Fachmann eine Reihe von molekularbiologischen, biochemischen und biotechnologischen Standardverfahren zur Verfügung.

Die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der vorstehend beschriebenen DNA- Sequenzen, die eine Ozon- und/oder Pathogen-responsive Sequenz, in aktiver oder inaktivier­ ter Form, enthalten. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der vorstehend beschriebenen Nuklein­ säuremoleküle an einer oder mehrerer Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentiät von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Die Abweichungen zu den vorstehend beschrie­ benen Nukleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.

Bei den Nukleinsäuremolekülen, die homolog zu den vorstehend beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die diesselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispiels­ weise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Modifika­ tionen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese einge­ führt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten handeln.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor einge­ führt werden. Das erhaltende Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen ver­ wendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktions­ analysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation können die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA- Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl bekannter Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwie­ rigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizo­ genes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Dabei können sowohl stabile als auch transiente Transformanten erzeugt werden.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine spe­ ziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide wie beispielsweise pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Dem Fachmann sind die gängi­ gen Selektionsmarker bekannt und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen. Gebräuchliche Seklektionsmarker sind solche, die den transformierten Pflan­ zenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonyl-Harnstoff, Genta­ mycin oder Phosphinotricin und dergleichen vermitteln.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA- Sequenzen erforderlich sein. Werden beispielsweise für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- und Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flanken­ bereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformationen Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einem binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri- Plas­ mid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T- DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizie­ ren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefa­ ciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978), Molecular and General Genetics 163, 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzlich T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig trans­ formierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzelle ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 515 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßiger­ weise mit Agrobacierium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (beispielsweise Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeig­ netem Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die Regeneration der Pflanzen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.

Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplasten-Transformation sind dem Fachmann bekannt (vgl. L. Willmitzer (1993) Transgenic Plants in: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (Herausgeber: H. J. Rehm et al.), Band 2, 627-659, VCH Weinheim, Deutschland).

Während die Transformation dikotyler Pflanzen bzw. derer Zellen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen bzw. deren Zellen der Transformation mittels auf Agrobakterien basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (siehe u. a. Chan et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22, 491-506).

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen bzw. deren Zellen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al. (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al. (1990), Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), die Protoplasten-Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen sowie die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen besitzen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich einer vorhandenen bzw. nicht vorhandenen Ozon- und/oder Pathogen-Responsivität untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.

Selbstverständlich können Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, auch als Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten, Kalli, Suspensionskulturen und dergleichen) weiterkultiviert werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle zur Identifizierung und Isolierung homologer Moleküle, die Ozon- und/Pathogen-responsive Elemente umfassen, aus Pflanzen oder anderen Organismen. Die Definition des Begriffes "Homologie" ist vorstehend angegeben.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne diese in irgendeiner Weise einzuschränken.

Beispiele Beispiel 1 Pflanzen- und Pilzmaterial

Sieben Jahre alte Kiefernsetzlinge wurden von der Baumschule Bauchery, Crouy-sur-Cosson, Loir et Cher, Frankreich bezogen und für weitere fünf Monate in einem Gewächshaus gezüchtet. Nach den experimentellen Behandlungen wurden die Bäume zurück in das Gewächshaus gebracht, und nach einem Jahr wurde deren Überlebensrate bestimmt. Der Pilz Leptographium wingfieldii stammt aus der INRA-Sammlung (Orleans, Frankreich) und wurde ursprünglich aus dem Borkenkäfer Tomicus piniperda isoliert. Er wurde durch eine Monospurenkultur weiter gereinigt und im Dunkeln bei 22°C auf Malz-Agar gezüchtet (Lieutier et. al. (1989), Ann. Sci. For. 46, 201-216). Die Kulturen wurden bei 4°C mit einem jährlichen Durchlauf auf Baumstämmen der schottischen Kiefer bei 22°C aufbewahrt, um ihre Aktivität aufrecht zu erhalten.

Beispiel 2 Ozonbehandlung

Die Setzlinge wurden sechs Tage lang in Klimakammern akklimatisiert (Thiel et al. (1996), J. Plant Physiol. 148, 456-463). Die Lichtdauer betrug 14 Stunden pro Tag (PAR: 1300 µE m^-2 s^-1; UV-A: 22,5 Wm^-2; UV-B: 0,45 MEDh^-1); die Tages-/Nachttemperaturen betrugen 22°C bzw. 16°C und die relativen Feuchtigkeiten bei Tag bzw. bei Nacht betrugen 70% bzw. 85%. Die Setzlinge wurden mit Ozon (0,15 oder 0,3 µl l^-1) zehn Stunden täglich für eine Dauer von zwei Tagen behandelt.

In allen RT-PCR-Experimenten wurden ausschließlich einzelne Banden bei 1,15 kb für PMT, 1,17 kb für STS und 0,8 kb für cab detektiert. Mit cab-Primern durchgeführt RT-PCR Kontrollexperimente zeigten ein gleichbleibendes Niveau an cab-Transkripten in nicht Ozon- behandelten Geweben und eine Abnahme dieser Transkripte in Geweben, die 0,15 bzw. 0,3 µl l^-1 Ozon ausgesetzt waren.

In Kontrollbäumen, die ozonfreier Luft ausgesetzt waren, waren STS- oder PMT-Transcripte in den Nadeln und dem Phloem fast nicht detektierbar. Zwei zehnstündige Perioden Ozonbegasung waren ausreichend, um die STS und PMT-Transkript-Niveaus in Nadeln von Bäumen der schottischen Kiefer dramatisch zu erhöhen. Die Begasung mit 0,15 µl l^-1 Ozon resultierte in einem ersten Peak der STS-Transkripte nach sechs Stunden Aussetzung, gefolgt von einem weiteren Anstieg 48 Stunden nach dem Beginn der Behandlung, während die PMT-Transcripte zunächst bis 24 Stunden nach dem Beginn der Begasung auf dem Kontrollniveau blieben und erst dann begannen, sich zu akkumulieren. Die Aussetzung an 0,3 µl l^-1 Ozon führte zu einem weiteren Anstieg der beiden Transkriptniveaus und blieb in den Nadeln auf einem hohen Niveau. Im Gegensatz dazu wurden die Mengen an STS- und PMT- mRNA im Phloem nicht wesentlich durch Ozon beeinflußt.

Beispiel 3 Beimpfungen

48 Stunden nach dem Beginn der Ozonbegasung wurden zwei sterile Beimpfungen und zwei Pilzbeimpfungen bei jedem Baum in jedem Raum durchgeführt. Gemäß der von Wright beschriebenen Methode (Phytopathol. 23, 487-588 (1933)) wurden kalibrierte Agar-Disks (Durchmesser 3 mm) einer drei Wochen alten, sporulierenden Leptographium wingfieldii- Kultur in Höhe des Kambiums in den Baum eingeführt. Scheinbeimpfungen ohne Pilz wurden mit sterilen Malz-Agar-Disks (Durchmesser 3 mm) durchgeführt. Die Beimpfungen wurden an zwei unterschiedlichen Höhen des Stammes mit einem Abstand von mindestens 20 cm durchgeführt. Ein 4 cm (horizontal) × 7 cm (vertikal) großes Rechteck um die jeweilige Infektionsstelle des Phloem-Gewebes wurde entfernt und für die RNA-Analayse verwendet, nachdem ein 1 cm × 2 cm großes Rechteck des Phloem-Gewebes, das direkt um den Infektionspunkt lag, entfernt wurde.

Die Scheinbeimpfung führte zu einer Akkumulierung beider Transkripte am Tag 5 (drei Tage nach der Beimpfung). Die STS mRNA zeigte eine progressive Anhäufung bis zum Tag 9 (120 ng ng^-1 cDNA), nahm dann langsam ab und war nach 16 Tagen immer noch auf einem hohen Niveau. Die PMT-mRNA nahm progressiv nach Tag 5 (50 ng ng^-1 cDNA) ab, um am Ende des Experiments wieder auf dem Kontrollniveau zu sein.

Die zwei Kinetiken als Reaktion auf die Scheinbeimpfung wurde durch eine vorangehende Ozonbegasung stark beeinflußt. 0,15 µl l^-1 Ozon führten zu einer dramatischen Abnahme des STS mRNA-Reaktionsmusters. Die PMT-mRNA-Reaktionskurve wurde ebenfalls erniedrigt. Eine Vorbehandlung mit 0,3 µl l^-1 Ozon führte zu einem Peak an STS-Transkripten am selben 9. Tag wie bei der Scheinbeimpfung alleine, verlängerte jedoch die Akkumulierung bis zum 16. Tag. Die PMT-Transcripte zeigten eine progressive Anhäufung bis zum Tag 16 (75 ng ng^-1 cDNA).

Die Pilzbeimpfung führte zu vorübergehenden Peaks an STS- und PMT-Transkripten nach 5 (200 ng ng^-1 cDNA) bzw. 9 (130 ng ng^-1 cDNA) Tagen nach Beginn des Experiments. Durch die Ozonbegasung mit 0,15 µl l^-1 nahm der Peak der STS-Transkript-Akkumulierung leicht ab und verzögerte den Peak an PMT-Transcripten bis Tag 16 (110 ng ng^-1 cDNA). Die Ozonbegasung mit 0,3 µl l^-1 verlängerte den Peak von STS auf ein stabiles Niveau von 150 ng ng^-1 cDNA, während die Menge an PMT-Transkripten bis 16 Tage nach Beginn des Experiments auf 170 ng ng^-1 cDNA anstieg. Durch die Pilze wurde der Peak an STS- und PMT-Transkriptmengen, der während der Beimpfung auftrat, etwa verdoppelt, wobei er für STS vier Tage früher auftrat. Die STS- und PMT-Transkriptmengen zeigten ähnliche Reaktionen auf Ozon. Bei 0,15 µl l^-1 trat eine wesentliche Abnahme auf, während bei 0,3 µl l^-1 die Peakhöhe verlängert wurde oder geringfügig zunahm.

Die dosisabhängige Anhäufung nach Ozoninduktion von STS- und PMT-Transkripten in Nadeln stimmt gut mit früher gefundenen Anstiegen von Stilbengehalten, STS- und PMT Enzymaktivitäten und STS-Transcripten in Setzlingen der schottischen Kiefer überein (Rosemann et al. supra; Zinser et al. (1998), Planta 204, 169-176). Der Vergleich dieser Daten liegt nahe, das die Stilbenmetaboliten auf der Ebene der Transkription reguliert werden.

Ozon induziert keine STS- und PMT-mRNA in Phloem, was andeutet, daß kein systematischer Ozoneffekt vorliegt.

Verwundungen führten zu vorübergehenden Induktionen der SDS- und PMT-Transcripte, die durch Pilze während der ersten Woche nach der Impfung anstiegen. Die Stilbene PS und PSM wurden im Reaktionsbereich nur in Phloem dedektiert, das verwundet bzw. durch einen mit dem Borkenkäfer verwandten Pilz beimpft wurde, was mit der vorgeschlagenen Stilbeninvolvierung in die Baumresistenz übereinstimmt (Lieutier et al. supra; Bois und Lieutier (1997), Plant Physiol. Biochem. 35, 819-825). Die Ozonbehandlung führt zu einem vorübergehenden Anstieg an STS- und PMT-mRNA in den Nadeln, was eine Ähnlichkeit zwischen dem ozon- und pathogen-induzierten Anstieg an Transkripten aufzeigt.

Beispiel 4 Gesamt-RNA-Extraktion

Lyophilisierte Nadeln (70 bis 90 mg) unter Verwerfung der aktuellen Jahresblüte sowie lyophilisiertes Phloem-Gewebe (100 mg) wurden zu einem feinen Pulver gemahlen, und die Gesamt-RNA wurde auf herkömmliche Weise isoliert.

Beispiel 5 Extraktion der genomischen DNA

Die genomische DNA wurde aus den Nadeln von ausgewachsenen schottischen Kiefern gemäß des Protokolls 1 in Csaikl el. al (Plant Mol. Biol. Rep. 16, 69-86 (1998)) extrahiert.

Beispiel 6 Isolierung des genomischen PMT-Klons

Die Promotor-Sequenz wurde erhalten, in dem genspezifische reverse Primer aus der PMT cDNA-Sequenz (Deutsche Patentanmeldung DE-A-198 36 774; Ernst et al. (1999) Forest Biotechnology, University of Oxford, 11.-16. Juli 1999; Ernst et al. (1999) IUFRO Conference, University of Munich, 12.-17. Sept. 1999) gemäß dem durch Cormack und Somssich beschriebenen Verfahrens (Gene 194, 273 bis 276 (1997)) entwickelt wurden. 1,5 µg der genomischen DNA der schottischen Kiefer wurden mit 20 Einheiten EcoRI vollständig verdaut. Die DNA wurde fünf Minuten lang auf Eis mit 2 Volumeneinheiten Isopropanol ausgefällt, mit 70%igem Ethanol gewaschen und in 15 µl H₂O wieder suspendiert. Nach einer fünfminutigen Inkubation bei 90°C wurde die DNA bei 37°C mit 0,5 mM dATP und 1,5 mM CoCl₂ in Puffer 1,5 Stunden lang polyadenyliert. Als Puffer diente dabei 20 µl terminaler Transferase (TdT)-Puffer (Roche) mit 50 Einheiten TdT. Die Reaktion wurde durch fünfminütige Erwärmung der Probe bei 72°C beendet.

Die erste Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit einem Zehntel des Volumens der polyadenylierten DNA (150 ng), 100 pmol des Gen-spezifischen Primers 1 (5'- TCCCCGAGTTCCATGCCCAGAA-3'), 100 pmol des universal-T17-Primers (5'- GTAAAACGACGGCCAGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'), 200 µM dNTPs und 5 Einheiten AGS-Gold^TM DNA-Polymerase (AGS) in 100 µl 1 × AGSGold^TM Puffer durchgeführt, wobei die Wärmezyklus-Bedingungen einen anfänglichen Denaturierungsschritt bei 94°C für 1 Minute, gefolgt von 35 Zyklen von 1 Minute Denaturierung bei 94°C, Primer-Anheftung bei 60°C für 1 Minute, und 3 Minuten Verlängerung bei 72°C mit einem abschließenden zehnminütigen Verlängerungsschritt bei 72°C umfaßten.

Die zweite PCR wurde unter Verwendung von 1 µl des ersten PCR-Produkts unter denselben Bedingungen wie bei der ersten PCR durchgeführt, außer daß 100 pmol des Gen-spezifischen Primers 2(5'-GCCGATCCCATTTCGAATCC-3') und 100 pmol des Universal-Primers (5'- GTAAAACGACGGCCAGT-3') verwendet wurden. Das PCR-Endprodukt wurde gereinigt und in den pGEM-T-Vektor (Promega) entsprechend den Anweisungen des Herstellters kloniert. Die Plasmide wurden kommerziell sequenziert (MWG).

Beispiel 7 RT-PCR-Analyse

Die Gesamt-RNA (5 µg) aus Kiefernadeln oder Phloem-Gewebe wurden mit DNaseI verdaut und durch 200 Einheiten Superscript II RT (Live Technologies) 1 Stunde lang bei 42°C revers transkribiert, wobei ein entsprechender Puffer, 10 mM DTT; 0,4 mM eines jeden dNTP's, 100 nM oligo-dT_12-18-Primer (Life Technologies) und 10 Einheiten RNase-Inhibitor (Lfve Technologies) zugegeben wurden.

Die cDNA wurde gemäß des von Kiefer et. al. (supra) beschriebenen Verfahrens quantifiziert, und 10 ng wurden für die PCR mit 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), einem entsprechenden Puffer, 0,2 mM eines jeden dNTP's und 0,2 µ 3'- und 5'- Primern verwendet. Die Amplifizierung wurde während 35 Zyklen von 1 Minute Denaturierung bei 94°C, 1 Minute Primer-Anheftung bei 58°C (PMT- und cab-Primer) oder 62°C (STS-Primer) und 2 Minuten Verlängerung bei 72°C durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese mittels eines 1%igen Agarosegels analysiert, und unter UV-Licht nach Ethidiumbromid-Anfärbung sichtbar gemacht und unter Verwendung des Picogreen-Verfahrens (Molecure Probes) quantifiziert. Die Echtheit der PCR-Produkte wurde durch zwei gerichtete partielle Sequenzierungen unter Verwendung der Thermo Sequenase-Kits (Amersham Pharmacia Biotech) überprüft.

Abbildungen Abb. 1 (= SEQ ID No. 1)

Nukleotidsequenz des PMT-Gens aus Pinus sylvestris und die davon abgeleitete Proteinsequenz: Die vorhergesagte Transkriptionsstartsstelle wird als + 1 bezeichnet. Konservierte eukaryotische Promotorelemente (CAP-Signal, TATA-, CATA-, CAAT- und GC-Boxen) und potentielle pflanzenregulatorische Elemente (G- und H-Boxen) sind unterstrichen, und Myb-responsive Elemente (MREs) sind übergelegt. Elicitor-regulatorische Elemente (W-Boxen) sind fett gedruckt und der SV40-Enhancer ist kursiv gedruckt.

SEQUENZPROTOKOLL/G7173

Claims (21)

1. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend

• a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzen aktiven Promotors, der eine durch Pathogene und/oder Ozon induzierbare Genexpression vermittelt; und
• b) operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Pinosylvin-3-O-methyltransferase (PMT) kodiert.

2. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei der Promotor und/oder die DNA-Sequenz aus der Kiefer (Pinus sylvestris) isoliert ist.

3. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend die in Sequenz SEQ ID No. 1 angegebene Promotorsequenz oder Fragmente davon, die eine pathogen- und/oder ozon- responsive Expression einer damit operativ verbundenen kodierenden Region vermitteln.

4. Isolierter Promotor eines Pinosylvin-3-O-methyltransferase (PMT)-Gens oder Fragmente davon, die eine pathogen- und/oder Ozon induzierbare Genexpression in Pflanzenzellen vermitteln.

5. Promotor nach Anspruch 4, isoliert aus Kiefer (Pinus silvestris).

6. Promotor wie in SEQ ID No. 1 angegeben.

7. Chimäres Nukleinsäuremolekül, umfassend den Promotor nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder Fragmente davon.

8. Chimäres Nukleinsäuremoleküle nach Anspruch 7, das mindestens eine operativ mit dem Promotor verknüpfte DNA-Sequenz umfasst, die für ein Abwehrgen, insbesondere für ein die Synthese von Phytoalexinen katalysierendes Protein codiert.

9. Chimäres Nukleinsäuremoleküle nach Anspruch 8, wobei die DNA-Sequenz für ein Protein codiert, das natürlicherweise nicht Pathogen- und/oder Ozon-induzierbar ist.

10. Vektoren, welche einen Promotor oder ein Nukleinsäuremolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche enthalten.

11. Transgene Pflanzen, welche einen Promotor, ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach einem der vorangehenden Ansprüche enthalten, sowie Teile dieser Pflanzen und deren Vermehrungsmaterial, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklinge usw., sowie die Nachkommen dieser Pflanzen.

12. Dikotyle Pflanzen nach Anspruch 11, insbesondere Nutzpflanzen, wie Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Baumwolle, Tabak sowie Zierpflanzen oder Bäume.

13. Monokotyle Pflanzen nach Anspruch 11, insbesondere Getreide wie Hafer, Weizen, Roggen, Gerste, Reis, Hirse oder Mais.

14. Transgene Pflanzenzellen, einschließlich Protoplasten, welche einen Promotor, ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10 enthalten.

15. Pflanzenzellen nach Anspruch 14, in denen aufgrund der Einführung des Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3, eines Promotors nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder eines chimären Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 7 bis 10 oder mindestens eines Fragments davon eine Ozon- und/oder Pathogen induzierbare Expression eines natürlicherweise nicht über die entsprechende DNA-Sequenz verfügenden Gens erfolgen kann.

16. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen bzw. transgener Pflanzen mit erhöhter Pathogen- und/oder Ozon-induzierbarer Krankheitsresistenz, bei ein Abwehrgen, insbesondere ein Gen für ein die Synthese von Phytoalexinen katalysierendes Protein, in Form der Nukleinsäuremoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder in Form der Nukleinsäuremoleküle nach Anspruch 8 oder 9 eingeführt werden.

17. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen bzw. transgener Pflanzen mit erhöhter Pathogen- und/oder Ozon-induzierbarer Krankheitsresistenz, in denen ein Abwehrgen, insbesondere ein Gen für ein die Synthese von Phytoalexinen katalysierendes Protein, unter Kontrolle eines Promotors nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder von Fragmenten davon, die eine durch Ozon und/oder Pathogene induzierbar Expression vermitteln, steht.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei das durch das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodierte Protein in einer solchen Menge exprimiert wird, daß durch die Methylierung von Pinosylvin ein zumindest teilweiser Schutz gegenüber durch pathogene Organismen und/oder Ozon verursachte Erkrankungen der Pflanzen bewirkt wird.

19. Verfahren zur Erzeugung von Ozon- und/oder Pathogen-induzierbarer Merkmalsausprägung in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch Übertragen des Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3, eines Promotors nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder eines chimären Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 7 bis 9 oder mindestens eines Fragments davon auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen.

20. Verwendung der Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 7 bis 10 oder eines Fragments davon zur Erzeugung erhöhter Pathogen- und/oder Ozon- induzierbarer Krankheitsresistenz in transgenen Pflanzen.

21. Verwendung der Promotorregion nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder eines Fragments davon zur Erzeugung von Ozon- und/oder Pathogen-induzierbarer Merkmalsausprägung in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen zur Expression heterologer pflanzlicher Abwehrgene.