BRPI0709553A2

BRPI0709553A2 - métodos para gerar uma planta de soja transgênica, e uma célula ou planta de soja, sequência de nucleotìdeo heteróloga, planta ou célula da soja, parte ou semente de uma planta de soja, método para a transformação subsequente de pelo menos duas construções de dna e uma planta de soja, planta de soja, composição para seleção, regeneração, crescimento, cultivo ou manutenção de uma célula vegetal transgênica, cultura de célula, e, meio de seleção

Info

Publication number: BRPI0709553A2
Application number: BRPI0709553-8A
Authority: BR
Inventors: Diana Arias; Leslie Grist; Ming Cheng; Haiping Hong; Libby Bernal; Paula Olhoft; Hee-Sook Song; Luke Mankin; Sara Price
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2011-07-19
Also published as: CA2638977A1; US20090083883A1; CN101405394B; AU2007228846A1; AR059915A1; JP2009529863A; AU2007228846B2; EP1996712A2; US8071383B2; WO2007107516A2; ZA200808791B; CL2007000696A1; CN101405394A; WO2007107516A3

Abstract

MéTODOS PARA GERAR UMA PLANTA DE SOJA TRANSGêNICA, E UMA CéLULA OU PLANTA DE SOJA, SEQUêNCIA DE NUCLEOTìDEO HETERóLOGA, PLANTA OU CéLULA DA SOJA, PARTE OU SEMENTE DE UM PLANTA DE SOJA, MéTODO PARA A TRANSFORMAçãO SUBSEQUENTE DE PELO MENOS DUAS CONSTRUçõES DE DNA EM UMA PLANTA DE SOJA, PLANTA DE SOJA, COMPOSIçãO PARA SELEçãO, REGENERAçãO, CRESCIMENTO, CULTIVO OU MANUTENçãO DE UMA CéLULA VEGETAL TRANSGêNICA, CULTURA DE CéLULA, E, MEIO DE SELEçãO. A presente invenção diz respeito a métodos melhorados e meios para a transformação de soja (Glycine max) fundamentados em uma seleção de D-alanina e/ou D-serina.

Description

"MÉTODOS PARA GERAR UMA PLANTA DE SOJA TRANSGÊNICA, EUMA CÉLULA OU PLANTA DE SOJA, SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOHETERÓLOGA, PLANTA OU CÉLULA DA SOJA, PARTE OU SEMENTEDE UM PLANTA DE SOJA, MÉTODO PARA A TRANSFORMAÇÃOSUBSEQÜENTE DE PELO MENOS DUAS CONSTRUÇÕES DE DNA EMUMA PLANTA DE SOJA, PLANTA DE SOJA, COMPOSIÇÃO PARASELEÇÃO, REGENERAÇÃO, CRESCIMENTO, CULTIVO OUMANUTENÇÃO DE UMA CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA,CULTURA DE CÉLULA, E, MEIO DE SELEÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a métodos melhorados para atransformação de soja (Glycine max) com base em uma seleção de D-alaninae/ou D-serina.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A soja (Glycine max) pertence à família das Fabaeeae(.Leguminosae). A soja é considerada ter se originado na China. Tiposselvagens de sojas são vinosas por natureza, o que pode explicar porque assojas foram primeiro introduzidas nos Estados Unidos como uma safraforrageira. As introduções da China, Manchuria, Coréia e Japão foramimportantes no desenvolvimento de variedades para os Estados Unidos. Osesforços de cruzamento modernos para melhorar os traços agronômicos, taiscomo crescimento mais ereto, alojamento reduzido e tamanho de sementeaumentado, têm sido primariamente responsáveis para o desenvolvimento desojas em uma safra de importância mundial. A área medida em acres e aproporção da safra colhida para grão tem aumentado constantemente e hoje assojas são uma mercadoria mundial principal.

A soja cultivada tem um valor comercial substancial por todoo mundo. Mais de 50 milhões de hectares no mundo são usados para produziruma safra anual de sojas em excesso de 100 toneladas métricas com um valorestimado excedendo 20 bilhões de dólares. O desenvolvimento de métodoscientíficos úteis na melhora da quantidade e qualidade desta safra é, portanto,de interesse comercial significante. As sojas são amplamente usadas comouma fonte de proteína, óleo, condimentos e estoque de alimentação químico.

Esforços significantes têm sido gastos para melhorar a qualidade de espéciesde soja cultivadas pelo cruzamento de planta convencional, e vários sucessosprincipais são registrados. Os métodos de cruzamento de planta convencionaltêm sido limitados, entretanto, pelo movimento de genes e traços de umavariedade de soja para a outra.

As pesquisas biotecnológicas modernas e o desenvolvimentotêm fornecido técnicas úteis para a melhora de produtos agrícolas peloeengenheiramento genético vegetal. O eengenheiramento genético vegetalenvolve a transferência de um gene ou genes desejados na linha germinativaherdável de plantas de safra tal que estes genes possam ser cruzados em ouentre as variedades de elite usadas na agricultura moderna. As técnicas detransferência de gene permitem o desenvolvimento de novas classes devariedades de safra de elite com resistência de doença melhorada, tolerância aherbicida e valor nutricional aumentado. Vários métodos têm sidodesenvolvidos para a transferência de genes em tecidos vegetais incluindomicroprojeção de alta velocidade, microinjeção, eletroporação, captação deDNA direta e transformação de gene mediado por Agrobacterium. Emboraamplamente usados para plantas dicotiledôneas, a liberação de DNA usando obombardeamento de partícula, eletroporação ou liberação mediada porAgrobacterium na soja têm mostrado serem difíceis. Isto é devido, em parte,ao pequeno número de células que foram descobertas serem totipotentes nasoja (Trick 1997). Dois métodos rotineiramente usados são um método combase em Agrobaeterium que alvejam os meristemas axilares dos nodoscotiledonários (Hinchee 1988) e um método usando o bombardeamento departícula de embriões zigóticos maduros (Finer 1991).A falta de agentes seletivos eficazes é um dos gargalos naeficiência de métodos de transformação de soja diferentes. A eficácia desistemas de seleção de cultura de tecido depende de muitos fatores incluindotipo de tecido, tamanho de explante, características químicas do agenteselecionável e concentrações e tempo de aplicação. O método mais usado deseleção é conhecido como seleção negativa, que utiliza marcadores de seleçãoque confere resistência contra um agente fitotóxico (tal como um herbicida ouantibiótico). Os marcadores de seleção negativa utilizados até agora sãoprincipalmente limitados à neomicina 3'-0-fosfotransferase (nptll),fosfinotricina acetiltransferases (PAT; também chamado de resistência aoBialophos®; bar; de Block 1987; EP O 333 033; US 4.975.374), 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS; que confere resistência aoGlifosato® (N-(fosfonometil)glicina); e higromicina B. Os sistemas demarcador de seleção alternativos, tais como um sistema com base nas enzimasque metabolizam D-aminoácido (por exemplo, D-aminoácido desidratases ouoxidases), foram recentemente descritos em uma base geral (WO 03/060133;Erikson 2004). Entretanto, nenhuma adoção e/ou otimização de um talsistema para o uso na soja foi descrita até agora. Conseqüentemente, oobjetivo da presente invenção é fornecer um método melhorado, eficientepara transformar plantas de Glycine max com base na Seleção de D-aminoácido. este objetivo é alcançado pela presente invenção..

Embora alguns dos problemas ligados à transformação desojas tenham sido superados pelos métodos descritos na técnica, existe aindauma necessidade significante quanto a melhoras, visto que todos os métodosconhecidos até agora têm apenas uma transformação e — especialmente —eficiência de regeneração de baixa a moderada. Embora avanços significantestenha sido feitos no campo dos métodos de transformação mediados porAgrobacterium, uma necessidade continua a existir quanto a métodosmelhorados para facilitar a facilidade, velocidade e eficiência de tais métodospara a transformação de plantas de soja. Portanto, foi o objetivo da presenteinvenção fornecer um método melhorado tendo eficiência global mais alta noprocesso de geração de plantas de soja transgênicas. Este objetivo é resolvidopela presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma primeira forma de realização da invenção diz respeito aum método para gerar uma planta de soja transgênica que compreende asetapas de

a. introduzir em uma célula ou tecido da soja uma construçãode DNA compreendendo pelo menos uma primeira construção de expressãoque compreende um promotor ativo na dita planta de soja e operavelmenteligada a esta uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capazde metabolizar D-alanina e/ou D-serina, e

b. incubar a dita célula ou tecido da soja da etapa a) em ummeio de seleção que compreenda D-alanina e/ou D-serina e/ou um derivadodas mesmas em uma concentração total de cerca de 0,5 mM a cerca de 100mM por um período de tempo de pelo menos 5 dias, e

c. transferir a dita célula ou tecido da soja da etapa b) para ummeio de regeneração e regenerar e selecionar plantas de soja quecompreendem a dita construção de DNA.

Embora vários promotores sejam conhecidos por seremfuncionais na soja e sejam adequados para realizar o método da invenção, foidescoberto que especialmente os promotores da ubiquitina resultam em umaeficiência surpreendentemente alta de seleção. Assim em uma forma derealização preferida o promotor ativo na soja é um promotor da ubiquitina deuma planta dicotiledônea. Mais preferivelmente, o promotor vegetal daubiquitina é o promotor da ubiquitina da salsa (.Petroselinum crispum ouLomatium foeniculacea) ou o promotor da ubiquitina da soja (Glycine max), omais preferivelmente o promotor da ubiquitina (ou um derivado ou fragmentodeste como descrito abaixo). As seqüências para a ubiquitina da salsa epromotor da ubiquitina da soja são fornecidas abaixo. E conhecido para apessoa habilitada na técnica que as seqüências promotoras podem sermodificadas (por exemplo, trancadas, fundidas, mutadas) a um grau grandesem modificar significantemente as suas propriedades de transcrição. Assim,em uma forma de realização preferida da invenção, o promotor ativo na soja éselecionado do grupo que consiste de

a) seqüências que compreendam a seqüência como descritopelas SEQ ID NO: 7 ou 8, e

b) seqüências que compreendam pelo menos um fragmento depelo menos 50 (preferivelmente 100 ou 150, mais preferivelmente 200 ou250, ainda mais preferivelmente 300 ou 500) pares de base consecutivas daseqüência como descrito pela SEQ ID NOs: 7 ou 8 e tendo atividadepromotora na soja,

c) seqüências que compreendam uma seqüência tendo pelomenos 60% (preferivelmente 70% ou 75%, mais preferivelmente 80% ou85%, ainda mais preferivelmente 90% ou 95%, o mais preferivelmente 98%)de identidade com a seqüência como descrito pelas SEQ ID NOs: 7 ou 8 etendo atividade promotora na soja,

d) seqüências que compreendam uma seqüência que hibridiza(preferivelmente sob condições equivalentes ou iguais à hibridização comuma solução tampão de 30 a (preferivelmente) 35% de formamida, NaCl a 1M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em IX a 2X SSC (preferivelmente IxSSC) de 50 a (preferivelmente) 55°C), mais preferivelmente em 40 a(preferivelmente) 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, SDS a 1% a 37°C euma lavagem em 0,5 X a 1 X SSC (preferivelmente 0,5x SSC) de 55 a(preferivelmente) 60°C) e o mais preferivelmente em 50% de formamida,NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1 χ SSC de 60 a(preferivelmente) 65°C) com a seqüência como descrito pela SEQ ID NO: 7ou 8 e tendo atividade promotora na soja.

Preferivelmente, o método da invenção compreende asseguintes etapas

(a) fornecer um tecido meristemático axilar de um nodo defolha primário ou superior de uma muda de soja e

(b) co-cultivar o dito tecido meristemático axilar com umabactéria Rhizobiaceae que compreenda um T-DNA transgênico, o dito T-DNA transgênico compreendendo uma construção de DNA que compreendepelo menos uma primeira construção de expressão que compreende umpromotor ativo na dita planta de soja e operavelmente ligada a esta umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capaz de metabolizarD-alanina e/ou D-serina

(c) transferir o dito tecido meristemático axilar co-cultivadoem um meio de indução e seleção de broto que compreende

(i) pelo menos um fator de crescimento vegetal em umaconcentração adequada para induzir a indução de broto de novo a partir dodito tecido meristemático axilar e

(ii) D-alanina e/ou D-serina e/ou um derivado das mesmas emuma concentração total de cerca de 3 mM a cerca de 100 mM para, e

(iii) opcionalmente um ou mais antibióticos adequados parainibir o crescimento de bactéria Rhízobiaceae,

e cultivar o dito tecido meristemático axilar co-cultivado porum período de pelo menos 5 dias no dito meio até que os brotos sejaminduzidos e desenvolvidos a partir destes e isolar os ditos brotos, e

d) transferir os ditos brotos isolados para um meio deenraizamento e cultivar os ditos brotos no dito meio de enraizamento até queos ditos brotos tenham formados raízes e ainda regenerar as plantinhas assimderivadas em plantas maduras, que compreendem inserido no seu genoma odito T-DNA transgênico.Em uma forma de realização preferida da invenção aconstrução de DNA ou de T-DNA (que compreende o dito primeiro cassetede expressão para a dita enzima capaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina) compreende ainda pelo menos uma segunda construção de expressãoque confere à dita planta de soja um traço agronomicamente valioso.

O método com base em tecido meristemático axilar podeutilizar tecido e/ou células de explante de várias fontes. Preferivelmente, òtecido meristemático axilar do nodo primário ou superior é fornecido em umaforma selecionada do grupo que consiste:

i) do meristema axilar da muda como fornecidosubstancialmente pela muda inteira e

ii) do meristema axilar da folha como fornecido peladissecação das folhas primárias ou superiores em um modo que o tecidomeristemático axilar permaneça ligado aos pecíolos das folhas, e

iii) meristema axilares propagadas.

Em uma forma de realização preferida da invenção(especialmente para o método com base no tecido meristemático axilar) omeio de pelo menos uma das etapas (b) (co-cultivo), e/ou (c) (indução eseleção de broto), compreende uma citocinina em uma concentraçãoequivalente a uma concentração de cerca de 1 μΜ a cerca de 10 μΜ de 6-benzilaminopurina. Além disso, o dito meio de pelo menos uma das etapas(b), e/ou (c) pode compreender ainda entre cerca de 0,1 μΜ e cerca de 2 μΜ

Acido Giberélico (GA3). Além disso, o dito meio de pelo menos uma dasetapas (b) e/ou (c) compreende ainda pelo menos um composto de tiol (talcomo DTT ou Cisteína).

Várias enzimas são conhecidas pela pessoa habilitada natécnica, que podem ser usadas como enzimas que metabolizam D-serina e/ouD-alanina. Preferivelmente, a enzima capaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina é selecionado do grupo que consiste de D-serina amônia-liases (EC4.3.1.18), D-Aminoácido oxidases (EC 1.4.3.3) e D-Alanina transaminases(EC 2.6.1.21). Mais preferivelmente, a enzima capaz de metabolizar D-serinaé selecionada do grupo que consiste

i) da D-serina amônia-liase da E. coli como codificada pelaSEQ ID NO: 2, e

ii) das enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade de pelo menos 60% (preferivelmente 70% ou 75%, maispreferivelmente 80% ou 85%, ainda mais preferivelmente 90% ou 95%, omais preferivelmente 98%) com a seqüência como codificada pela SEQ ID

NO: 2e

ii) das enzimas codificadas por uma seqüência de ácidonucléico capaz de hibridizar (preferivelmente sob condições equivalentes ouiguais à hibridização com uma solução tampão de 30 a (preferivelmente) 35%de formamida, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em IX a 2XSSC (preferivelmente Ix SSC) de 50 a (preferivelmente) 55°C), maispreferivelmente em 40 a (preferivelmente) 45% de formamida, 1,0 M deNaCl, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,5 X a 1 X SSC (preferivelmente0,5x SSC) de 55 a (preferivelmente) 60°C) e mais preferivelmente em 50% deformamida, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1 χ SSC de60 a (preferivelmente) 65°C) ao complemento da seqüência descrita pela SEQID NO: 1.

Para estas enzimas a seleção é preferivelmente feita em ummeio que compreende D-serina em uma concentração de cerca de 1 mM acerca de 100 mM.

Também mais preferivelmente, a enzima capaz de metabolizarD-serina e/ou D-alanina é selecionada do grupo que consiste

i) da D-aminoácido oxidase de Rhodotorula gracilis comocodificada pela SEQ ID NO: 4 ou 6 e

ii) das enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade de pelo menos 60% (preferivelmente 70% ou 75%, maispreferivelmente 80% ou 85%, ainda mais preferivelmente 90% ou 95%, omais preferivelmente 98%) com a seqüência como codificada pelas SEQ IDNOs: 4 ou 6 e

iii) das enzimas codificadas por uma seqüência de ácidonucléico capaz de hibridizar (preferivelmente sob condições equivalentes ouiguais à hibridização com uma solução tampão de 30 a (preferivelmente) 35%de formamida, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em IX a 2XSSC (preferivelmente Ix SSC) de 50 a (preferivelmente) 55°C), maispreferivelmente em 40 a (preferivelmente) 45% de formamida, 1,0 M deNaCl, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,5 X a 1 X SSC (preferivelmente0,5x SSC) de 55 a (preferivelmente) 60°C) e o mais preferivelmente em 50%de formamida, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1 χ SSCde 60 a (preferivelmente) 65°C) ao complemento da seqüência descrita pelasSEQ ID NOs: 3 ou 5,

Para estas enzimas, a seleção é preferivelmente feita em ummeio que compreende D-alanina e/ou D-serina em uma concentração total decerca de 1 mM a cerca de 100 mM.

Existem vários modos para conduzir o esquema de seleçãocom base em D-aminoácidos ou compostos relacionados abaixo.Preferivelmente, em que a seleção (por exemplo, da etapa b) do método geralou etapa c) do método com base nos meristemas axilares) é feita

i) usando cerca de 3 a cerca de 20 mM de D-alanina e/ou D-serina, e/ou

ii) por cerca de 3 a 4 semanas sob condiçõesdesdiferenciadoras.

Preferivelmente, D-alanina (por exemplo, se utilizada apenascomo composto de seleção) é utilizada em uma concentração de cerca de 0,5mM a cerca de 100 mM, preferivelmente de cerca de 1 mM a cerca de 70mM, mais preferivelmente de cerca de 2 mM a cerca de 50 mM, o maispreferivelmente de cerca de 3 mM a cerca de 20 mM. Preferivelmente, D-serina (por exemplo, se utilizado apenas como composto de seleção) éutilizado em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 100 mM,preferivelmente de cerca de 1 mM a cerca de 70 mM, mais preferivelmente decerca de 2 mM a cerca de 50 mM, o mais preferivelmente de cerca de 3 mM acerca de 15 mM.

Em uma forma de realização preferida a introdução daconstrução de DNA é mediada pela transformação mediada pela bactériaRhizobiaceae. Preferivelmente, a bactéria Rhizobiaceae é uma bactériaAgrobaeterium tumefaeiens ou Agrobaeterium rhizogenes desarmada. Maispreferivelmente, a cepa de Agrobaeterium é uma cepa K599 daAgrobaeterium rhizogenes desarmada.

Como mencionado acima, especialmente a utilização depromotores da ubiquitina mostrou ser vantajosa. As construções fornecidasabaixo são novas e especialmente úteis para realizar a invenção. Além disso,estas podem fornecer uso também em outras espécies vegetais. Emconseqüência, uma outra forma de realização da invenção diz respeito a umaseqüência de nucleotídeo heteróloga que compreende

a) um promotor selecionado do grupo que consiste de umpromotor da ubiquitina de uma espécie vegetal dicotiledônea e operavelmenteligada a esta

b) uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzimacapaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,

em que o dito promotor é heterólogo com respeito à ditaseqüência de ácido nucléico.

Preferivelmente, o promotor da ubiquitina é o promotor daubiquitina da salsa ou o promotor da ubiquitina da soja. Como descrito acimaas seqüências destes promotores podem ser modificadas sem mudar a suacapacidade de transcrição. Em conseqüência uma outra forma de realizaçãoda invenção diz respeito a uma seqüência de nucleotídeo heteróloga quecompreende

a) um promotor selecionado do grupo que consiste

i) das seqüências que compreendem a seqüência como descritapelas SEQ ID NOs: 7 ou 8, e

ii) seqüências que compreendem pelo menos um fragmento depelo menos 50 (preferivelmente 100 ou 150, mais preferivelmente 200 ou250, ainda mais preferivelmente 300 ou 500) pares de base consecutivas daseqüência como descrita pelas SEQ ID NOs: 7 ou 8 e tendo atividadepromotora na soja,

iii) seqüências que compreendem uma seqüência tendo pelomenos 60% (preferivelmente 70% ou 75%), mais preferivelmente 80% ou85%), ainda mais preferivelmente 90%> ou 95%, o mais preferivelmente 98%)de identidade com a seqüência como descrita pelas SEQ ID NOs: 7 ou 8 etendo atividade promotora na soja,

iv) seqüências que compreendem uma seqüência que hibridiza(preferivelmente sob condições equivalentes ou iguais à hibridização comuma solução tampão de 30 a (preferivelmente) 35% de formamida, NaCl a 1M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em IX a 2X SSC (preferivelmente IxSSC) de 50 a (preferivelmente) 55°C), mais preferivelmente em 40 a(preferivelmente) 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, SDS a 1% a 37°C euma lavagem em 0,5 X a 1 X SSC (preferivelmente 0,5x SSC) de 55 a(preferivelmente) 60°C) e o mais preferivelmente em 50% de formamida,NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1 χ SSC de 60 a(preferivelmente) 65°C) com a seqüência como descrita pelas SEQ ID NOs: 7ou 8 e tendo atividade promotora na soja,

Uma outra forma de realização da invenção diz respeito àscélulas e plantas da soja fabricadas pelo método fornecido abaixo. Assim,uma outra forma de realização diz respeito a uma planta ou célula da soja quecompreendem uma construção de DNA que compreende um promotor ativonas ditas plantas ou células da soja e operavelmente ligado a esta umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capaz de metabolizarD-alanina ou D-serina, em que o dito promotor é heterólogo em relação à ditaseqüência que codifica a enzima. Preferivelmente, o promotor e/ou a enzimacapazes de metabolizar D-alanina ou D-serina são definidos como acima.

Mais preferivelmente, a dita planta ou célula da soja ainda compreendem pelomenos uma segunda construção de expressão que confere à dita planta de sojaum traço agronomicamente valioso. Outras formas de realização da invençãodiz respeito a partes da dita planta de soja incluindo mas não limitada àssementes de soja (sojas) e ao seu uso para propósitos alimentícios, ração eindustrial.

Quando fundamentados nas D-aminoácido oxidases o métododa invenção pode ser usado como um esquema de seleção/deleção demarcador combinado. Fundamentados no D-aminoácido utilizado, as D-aminoácido oxidases podem atuar como marcador de seleção negativo oucontrário. Assim, a invenção fornece ainda um método para fornecer células eplantas de soja (que são preferivelmente isentas de marcador), o dito métodocompreende as etapas de:

i) transformar uma célula de planta de soja com uma primeiroconstrução de DNA que compreende

a) pelo menos uma primeira construção de expressão quecompreende um promotor ativo na dita planta de soja e operavelmente ligadaa este uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima D-aminoácido oxidase, em que o dito primeiro cassete de expressão éflanqueado pelas seqüências que permitem a deleção específica do ditoprimeiro cassete de expressão, e

b) pelo menos um segundo cassete de expressão adequado paraconferir à dita planta um traço agronomicamente valioso, em que o ditosegundo cassete de expressão não está localizado entre as ditas seqüênciasque permitem a deleção específica do dito primeiro cassete de expressão, e

ii) tratar as ditas células de planta de soja transformadas daetapa i) com um primeiro composto selecionado do grupo que consiste de D-alanina, D-serina ou derivados das mesmas em uma concentração fitotóxica eselecionar as células vegetais que compreendem no seu genoma a ditaprimeira construção de DNA, que confere resistência às ditas células vegetaistransformadas contra o dito primeiro composto pela expressão da dita D-aminoácido oxidase, e

iii) induzir a deleção do dito primeiro cassete de expressão apartir do genoma das ditas células vegetais transformadas e tratar as ditascélulas vegetais com um segundo composto selecionado do grupo queconsiste de D-isoleucina, D-valina e derivados das mesmas em umaconcentração tóxica para as células vegetais que ainda compreendem o ditoprimeiro cassete de expressão, selecionando deste modo as células vegetaisque compreendem o dito segundo cassete de expressão mas carecendo do ditoprimeiro cassete de expressão.

Preferivelmente, as seqüências promotoras e as enzimas de D-aminoácido oxidase são definidas como acima para o método geral.

Existe uma falta de sistemas de transformação eficientes eespecialmente marcadores de seleção para a soja. Esta falta refere-seespecialmente aos métodos, que contam com as transformações subseqüentesmúltiplas. Um modo de superar este problema é o método de seleção edeleção de marcador combinadas fornecido acima. Um outro método estáfundamentado na combinação de sistemas de seleção diferentes. Emconseqüência, uma outra forma de realização da invenção diz respeito a ummétodo para a transformação subseqüente de pelo menos duas construções deDNA em uma planta de soja que compreende as etapas de:

a) uma transformação com uma primeira construção da ditaconstrução que compreende pelo menos uma construção de expressão quecompreende um promotor ativo nas ditas plantas de soja e operavelmenteligada a esta uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capazde metabolizar D-alanina ou D-serina, e

b) uma transformação com uma segunda construção da ditaconstrução que compreende um segundo gene marcador de seleção, que nãoestá conferindo resistência contra D-alanina ou D-serina.

Preferivelmente, o dito segundo gene marcador é que confereresistência contra pelo menos um composto selecionado do grupo queconsiste de fosfinotricina, dicamba, glifosato, herbicidas do tipo sulfoniluréiae imidazolinona ou um antibiótico. Também os produtos do dito métodocomo tais são novos e inventivos em relação à técnica. Assim uma outraforma de realização da invenção diz respeito a uma planta de soja quecompreende

a) uma primeira construção de expressão que compreende umpromotor ativo nas ditas plantas de soja e operavelmente ligada a este umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capaz de metabolizarD-alanina ou D-serina, e

b) uma segunda construção de expressão para um genemarcador de seleção, que não está conferindo resistência contra D-alanina ouD-serina.

Não apenas sistemas marcadores de seleção diferentes podemser combinadas com os marcadores fornecidos abaixo. Também osmarcadores diferentes aqui fornecidos podem ser combinados (sem deleçãoanterior) para se obter transformações subseqüentemente múltiplas.Conseqüentemente uma outra forma de realização da invenção diz respeito aum método para transformação subseqüente de pelo menos duas construçõesde DNA em uma planta de soja que compreende as etapas de:

a) uma transformação com uma primeira construção a ditaconstrução compreendendo uma construção de expressão que compreende umpromotor ativo nas ditas plantas de soja e operavelmente ligada a esta umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima dsda e selecionandocom D-serina, e

b) uma transformação com uma segunda construção da ditaconstrução que compreende uma construção de expressão que compreendepromotor ativo nas ditas plantas de soja e operavelmente ligada a este umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima dao e selecionando comD-alanina.

Também os produtos do dito método são considerados seremnovos e inventivo na técnica. Assim, uma outra forma de realização dainvenção diz respeito a um planta de soja que compreende a) uma

primeira construção a dita construção compreendendo uma construção deexpressão que compreende um promotor ativo nas ditas plantas de soja eoperavelmente ligada a esta uma seqüência de ácido nucléico que codificauma enzima dsda, e

b) uma segunda construção a dita construção compreendendouma construção de expressão que compreende promotor ativo nas ditasplantas de soja e operavelmente ligada a esta uma seqüência de ácido nucléicoque codifica uma enzima dao.

Outros objetivos, vantagens e características da presenteinvenção tornar-se-ão evidentes a partir do seguinte relatório descritivo.DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOSFig. 1 Curva de morte no explante de meristema axilar damuda não inoculada (cultivar 98822).

Fig. 2 Curva de morte para D-Serina em explantes demeristema axilar da muda inoculada por Agrobacterium.

Fig. 3 Indução de broto em 3 semanas em D-Serina

A. SHA07/pSBl/ET017; Topo: 15 mM, Meio: 30 mM, fundo:45 mM de D-Ser

B. SHA07/pSB 1/EW008; Topo: 15 mM, Meio: 30 mM, fundo:45 mM de D-Ser

DEFINIÇÕES GERAIS

As divulgações, métodos, seqüências etc. utilizados e descritosnos pedidos de patente internacional WO 03/004659 (RECOMBINATIONSYSTEMS AND A METHOD FOR REMOVING NUCLEIC ACIDSEQUENCES FROM THE GENOME OF EUKARYOTIC ORGANISMS),WO 03/060133 (SELECTIVE PLANT GROWTH USING D-AMINOACIDS), pedido de patente internacional PCT/EP 2005/002735, pedido depatente internacional PCT/EP 2005/002734 (WO 2005/090581), Pedido No.60/606.789, depositado em 2 de setembro de 2004 e pedido internacionalPCT/EP2005/009366 são por meio deste incorporadas por referência.

Abreviações: BAP - 6-benzilaminopurina; ácido 2,4-D-2,4-dicloro-fenoxiacético; MS - Meio de Murashige e Skoog (Murashige T eSkoog F (1962) Physiol. Plant. 15, 472-497); NAA - ácido 1-naftalenoacético;MES, ácido 2-(N-morfolino-etanossulfônico, IAA ácido indol acético; IBA:ácido indol butírico; Kan: sulfato de canamicina; GA3 - Acido Giberélico;Timentina®: ticarcilin dissódico/clavulanato potássico.

Deve ser entendido que esta invenção não é limitada àmetodologia, protocolos, linhagens de célula, espécies ou gêneros vegetais,construções e reagentes particulares descritos como tais. Também deve serentendido que a terminologia aqui usada é com o propósito apenas dedescrever formas de realização particulares e não é intencionada a limitar oescopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicaçõesanexas. Deve ser mencionado que como aqui usado e nas reivindicaçõesanexas, as formas singulares "um/uma," "e," e "o/a" incluem referênciasplurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Assim, porexemplo, referência a "um vetor" é uma referência a um ou mais vetores einclui equivalentes destes conhecidos por aqueles habilitados na técnica eassim por diante.

O termo "cerca de" é aqui usado para significar aproximada,grosseiramente, em torno ou na região de. Quando o termo "cerca de" é usadoem conjunção com uma faixa numérica, este modifica esta faixa pela extensãodos limites acima e abaixo dos valores numéricos apresentados. No geral, otermo "cerca de" é aqui usado para modificar um valor numérico acima eabaixo do valor estabelecido por uma variação de 20 por cento,preferivelmente 10 por cento, mais preferivelmente 5 por cento para cima epara baixo (mais alto ou mais baixo).

Como aqui usado, a palavra "ou" significa qualquer membrode uma lista particular e também inclui qualquer combinação de membrosdesta lista.

"Traço agronomicamente valioso" inclui qualquer fenótipo emum organismo vegetal que seja útil ou vantajoso para a produção de alimentoou produtos alimentícios, incluindo partes de planta e produtos vegetais. Osprodutos agrícolas não alimentícios tais como papel, etc. são tambémincluídos. Uma lista parcial de traços agronomicamente valiosos incluiresistência à pragas, vigor, tempo de desenvolvimento (tempo para acolheita), teor de nutriente realçado, novos padrões de crescimento, saboresou cores, tolerância a sal, calor, seca e frio e outros. Preferivelmente, traçosagronomicamente valiosos não incluem genes marcadores selecionáveis (porexemplo, genes que codificam resistência a herbicida ou antibiótico usadosapenas para facilitar a detecção ou seleção de células transformadas), genes dabiossíntese de hormônio que levam à produção de um hormônio vegetal (porexemplo, auxinas, giberlinas, citocininas, ácido abscísico e etileno que sãousados apenas para a seleção) ou genes repórteres (por exemplo, luciferase,glicuronidase, cloranfenicol acetil transferase (CAT, etc.). Tais traçosimportantes agronomicamente valiosos podem incluir a melhora da resistênciaàs pragas (por exemplo, Melchers 2000), vigor, tempo de desenvolvimento(tempo para a colheita), teor de nutriente realçado, padrões de crescimentonovos, sabores ou cores, tolerância a sal, calor, seca e frio (por exemplo,Sakamoto 2000; Saijo 2000; Yeo 2000; Cushman 2000) e outros. Aqueles dehabilidade reconhecerão que existem numerosos polinucleotídeos a partir dosquais a escolha para conferir estes e outros traços agronomicamente valiosos.

Como aqui usado, o termo "seqüência de aminoácido" refere-se a uma lista de abreviações, letras, caracteres ou palavras que representamresíduos de aminoácido. Os aminoácidos podem ser aqui aludidos pelos seussímbolos de três letras habitualmente conhecidos ou pelos símbolos de umaletra recomendados pela IUP AC-IUB Biochemical NomenclatureCommission. Nucleotides, do mesmo modo, podem ser aludidos pelos seuscódigos de uma letra habitualmente aceitos. As abreviações aqui usadas sãocódigos de uma letra convencionais para os aminoácidos: A, alanina; B,asparagina ou ácido aspártico; C, cisteína; D ácido aspártico; E, glutamato,ácido glutâmico; F, fenilalanina; G, glicina; H histidina; I isoleucina; K,lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R,arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptofano; Y, tirosina; Z,glutamina ou ácido glutâmico (ver L. Stryer, Biochemistry, 1988, W. H.Freeman and Company, Nova Iorque. A letra "x" como aqui usada dentro deuma seqüência de aminoácido pode representar qualquer resíduo deaminoácido.

O termo "ácido nucléico" refere-se aos desoxirribo-nucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros ou híbridos destes na forma defilamento único ou duplo, de sentido ou anti-sentido. A menos que de outromodo indicado, uma seqüência de ácido nucléico particular tambémimplicitamente abrange variantes desta conservativamente modificadas (porexemplo, substituições de códon degenerado) e seqüências complementares,assim como a seqüência explicitamente indicada. O termo "ácido nucléico" éaqui usado intercambiavelmente com "gene", "cDNA, "mRNA","oligonucleotídeo," e "polinucleotídeo".

A frase "seqüência de ácido nucléico" como aqui usada refere-se a uma lista consecutiva de abreviações, letras, caracteres ou palavras, querepresenta nucleotídeos. Em uma forma de realização, um ácido nucléicopode ser uma "sonda" que é um ácido nucléico relativamente curto,usualmente menor do que 100 nucleotídeos no comprimento. Freqüentementeuma sonda de ácido nucléico é de cerca de 50 nucleotídeos no comprimento acerca de 10 nucleotídeos no comprimento. Uma "região alvo" de um ácidonucléico é uma porção de um ácido nucléico que é identificada ser deinteresse. Uma "região codificadora" de um ácido nucléico é a porção doácido nucléico, que é transcrita e traduzida em uma maneira específica deseqüência para produzir em um polipeptídeo ou proteína particulares quandocolocadas sob o controle de seqüências regulatórias apropriadas. A regiãocodificadora é dita codificar um tal polipeptídeo ou proteína. A menos que deoutro modo indicado, uma seqüência de ácido nucléico particular tambémimplicitamente abrange variantes conservativamente modificadas desta (porexemplo, substituições de códon degenerado) e seqüências complementares,assim como a seqüência explicitamente indicada. O termo "ácido nucléico" éaqui usado intercambiavelmente com "gene", "cDNA, "mRNA","oligonucleotídeo," e "polinucleotídeo".

O termo "seqüência de nucleotídeo de interesse" refere-se aqualquer seqüência de nucleotídeo, a manipulação da qual pode ser julgadadesejável por qualquer razão (por exemplo, conferir qualidades melhoradas),por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Tais seqüências denucleotídeo incluem, mas não são limitadas a, seqüências codificadoras degenes estruturais (por exemplo, genes repórteres, marcadores de seleção degene, oncogenes, genes de resistência a medicamento, fatores de crescimento,etc.) e seqüências reguladoras não codificadoras que não codificam ummRNA ou produto de proteína, (por exemplo, seqüência promotora, seqüênciade poliadenilação, seqüência de terminação, seqüência realçadora, etc.). Umaseqüência de ácido nucléico de interesse pode preferivelmente codificar umtraço agronomicamente valioso.

O termo "anti-sentido" é entendido significar um ácidonucléico tendo uma seqüência complementar a uma seqüência alvo, porexemplo uma seqüência de RNA mensageiro (rnRNA) o bloqueio de cujaexpressão é procurado ser iniciado pela hibridização com a seqüência alvo.

O termo "sentido" é entendido significar um ácido nucléicotendo uma seqüência que é homóloga ou idêntica a uma seqüência alvo, porexemplo uma seqüência que liga a um fator de transcrição de proteína e queestá envolvido na expressão de um dado gene. De acordo com uma forma derealização preferida, o ácido nucléico compreende um gene de interesse eelementos que permitem a expressão do dito gene de interesse.

Como aqui usados, os termos "complementar" ou"complementaridade" são usados em referência às seqüências de nucleotídeorelacionadas pelas regras de emparelhamento de base. Por exemplo, aseqüência 5'-AGT-3' é complementar à seqüência 5'-ACT-3'. Acomplementaridade pode ser "parcial" ou "total." A complementaridade"parcial" é onde uma ou mais bases de ácido nucléico não são emparelhadasde acordo com as regras de emparelhamento de base. A complementaridade"total" ou "completa" entre ácidos nucléicos é onde cada e todas as bases deácido nucléico são emparelhadas com uma outra base sob as regras deemparelhamento de base. O grau de complementaridade entre os filamentosde ácido nucléico tem efeitos significantes na eficiência e força dehibridização entre filamentos de ácido nucléico. Um "complemento" de umaseqüência de ácido nucléico como aqui usado refere-se a uma seqüência denucleotídeo cujos ácidos nucléicos mostram complementaridade total com osácidos nucléicos da seqüência de ácido nucléico.

Os termos "genoma" ou "DNA genômico" estão se referindo àinformação genética herdável de um organismo hospedeiro. O dito DNAgenômico compreende o DNA do núcleo (também aludido como DNAcromossômico) mas também o DNA dos plastídeos (por exemplo,cloroplastos) e outras organelas celulares (por exemplo, mitocondria).Preferivelmente os termos genoma ou DNA genômico estão se referindo aoDNA cromossômico do núcleo.

O termo "DNA cromossômico" ou "Seqüência de DNAcromossômico" deve ser entendido como o DNA genômico do núcleoOcelular independente da situação do ciclo celular. O DNA cromossômicoportanto pode ser organizado em cromossomas ou cromátides, estes podemser condensados ou não espiralados. Uma inserção no DNA cromossômicopode ser demonstrado e analisado por vários métodos conhecidos na técnicacomo por exemplo, análise da reação da cadeia de polimerase (PCR), análisede Southern blot, hibridização in situ na fluorescência (FISH) e PCR in situ.

O termo "isolado" como aqui usado significa que um materialfoi removido do seu ambiente original. Por exemplo, um polinucleotídeo oupolipeptídeo que ocorrem naturalmente presentes em um animal vivo não éisolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separados de algunsou todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Taispolinucleotídeos podem ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos oupolipeptídeos podem ser parte de uma composição e podem ser isolados emque um tal vetor ou composição não é parte do seu ambiente original.Preferivelmente, o termo "isolado" quando usado em relação a um ácidonucléico refere-se a uma seqüência de ácido nucléico que é identificada eseparada de pelo menos um ácido nucléico contaminante com o qual a mesmaestá habitualmente associada no seu ambiente natural.

Como aqui usado, o termo "purificado" refere-se às moléculas,seqüências de nucléico ou aminoácido que são removidas do seu ambientenatural, isolado ou separado. Uma "seqüência de ácido nucléico isolada" éportanto uma seqüência de ácido nucléico purificada. As moléculas"substancialmente purificadas" são pelo menos 60% livres, preferivelmentepelo menos 75% livres e mais preferivelmente pelo menos 90% livres deoutros componentes com que eles são naturalmente associados.

Uma "construção de polinucleotídeo" refere-se a um ácidonucléico pelo menos parcialmente criado pelos métodos recombinantes. Otermo "construção de DNA" está se referindo a uma construção depolinucleotídeo que consiste de desoxirribonucleotídeos. A construção podeser de filamento único ou - preferivelmente - duplo. A construção pode sercircular ou linear. O trabalhador habilitado é familiar com uma variedade demodos para se obter um de uma construção de DNA. as construções podemser preparadas por meio de recombinação costumeira e técnicas de clonagemcomo são descritas, por exemplo, em Maniatis 1989, Silhavy 1984 e emAusubel 1987.

O termo "tipo selvagem", "natural" ou de "origem natural"significa com respeito a um organismo, polipeptídeo ou seqüência de ácidonucléico, que o dito organismo está ocorrendo naturalmente ou disponível empelo menos um organismo que ocorre naturalmente que não é mudado,mutado ou de outro modo manipulado pelo homem.

O termo "gene estranho" refere-se a qualquer ácido nucléico(por exemplo, seqüência de gene) que é introduzido no genoma de uma célulapelas manipulações experimentais e podem incluir seqüências de geneencontrados nesta célula contanto que o gene introduzido contenha algumamodificação (por exemplo, uma mutação pontual, a presença de um marcadorde gene selecionável, etc.) em relação ao gene que ocorre naturalmente.

Os termos "seqüência de ácido nucléico heterólogo" ou "DNAheterólogo" são usados intercambiavelmente para se referir a uma seqüênciade nucleotídeo, que é ligado a ou é manipulado para se tornar ligado a, umaseqüência de ácido nucléico à qual a mesma não é ligada na natureza ou àqual a mesma é ligada a um local diferente do natural. O DNA heterólogo nãoé endógeno para a célula na qual o mesmo é introduzido, mas foi obtido deuma outra célula. No geral, embora não necessariamente, tal DNA heterólogocodifica RNA e as proteínas que não são normalmente produzidas pela célulana qual a mesma é expressada. Um promotor, seqüência que regula atranscrição ou outro elemento genético é considerado ser "heterólogo" emrelação a uma outra seqüência (por exemplo, que codifica uma seqüênciamarcadora ou um traço agronomicamente relevante) se as ditas duasseqüências não são combinadas ou operavelmente ligadas de modo diferentedo seu ambiente natural. Preferivelmente, as ditas seqüências não sãooperavelmente ligadas no seu ambiente natural (isto é, vêm de genesdiferentes). O mais preferivelmente, a dita seqüência reguladora écovalentemente unida e adjacente a um ácido nucléico ao qual o mesmo não éadjacente no seu ambiente natural.

O termo "transgene" como aqui usado refere-se a qualquerseqüência de ácido nucléico, que é introduzida no genoma de uma célula ouque foi manipulada pelas manipulações experimentais pelo homem.

Preferivelmente, a dita seqüência é resultante de um genoma que é diferentede um organismo que ocorre naturalmente (por exemplo, a dita seqüência, seendógena ao dito organismo, é introduzida em um local diferente do seu localnatural ou o seu número de cópia é aumentado ou diminuído). Um transgenepode ser uma "seqüência de DNA endógena", "uma "seqüência de DNAexógena" (por exemplo, um gene estranho) ou uma "seqüência de DNAheteróloga". O termo "seqüência de DNA endógena" refere-se a umaseqüência de nucleotídeo, que é naturalmente encontrada na célula na qual amesma é introduzida contanto que a mesma não contenha nenhumamodificação (por exemplo, uma mutação pontual, a presença de um genemarcador selecionável, etc.) em relação à seqüência que ocorre naturalmente.

Os termos "transgênico" ou "recombinante" quando usados emreferência a uma célula ou um organismo (por exemplo, com respeito a umaplanta ou célula da soja) refere-se a uma célula ou organismo que contêm umtransgene ou cujo genoma foi alterado pela introdução de um transgene. Umorganismo ou tecido transgênicos podem compreender uma ou mais célulastransgênicas. Preferivelmente, o organismo ou tecido está substancialmenteconsistindo de células transgênicas (isto é, mais do que 80%, preferivelmente90%, mais preferivelmente 95%, o mais preferivelmente 99% das células nodito organismo ou tecido são transgênicos). O termo "recombinante" comrespeito aos ácidos nucléicos significa que o ácido nucléico é covalentementeunido e adjacente a um ácido nucléico ao qual o mesmo não é adjacente noseu ambiente natural. Polipeptídeos ou proteínas "recombinantes" referem-seaos polipeptídeos ou proteínas produzidos pelas técnicas de DNArecombinante, isto é, produzidos a partir de células transformadas por umaconstrução de DNA recombinante que codifica o polipeptídeo ou proteínadesejados. Os ácidos nucléicos e polipeptídeo recombinantes também podemcompreender moléculas que como tal não existe na natureza mas sãomodificadas, mudadas, mutadas ou de outro modo manipuladas pelo serhumano.

Um "polipeptídeo recombinante" é um polipeptídeo que nãoocorre naturalmente que difere na seqüência de um polipeptídeo que ocorrenaturalmente em pelo menos um resíduo de aminoácido. Os métodospreferidos para produzir o dito polipeptídeo e/ou ácido nucléicorecombinantes podem compreender a mutagênese direcionada ou nãodirecionada, embaralhamento de DNA ou outros métodos de recombinaçãorecursiva.

Os termos "homologia" ou "identidade" quando usados emrelação aos ácidos nucléicos ou seqüências de aminoácido referem-se a umgrau de relação ou complementaridade de seqüência. Os seguintes termos sãousados para descrever as relações de seqüência entre dois ou mais ácidonucléicos ou seqüências de aminoácido: (a) "seqüência de referência", (b)"janela de comparação", (c) "identidade de seqüência", (d) "porcentagem deidentidade de seqüência" e (e) "identidade substancial".

(a) Como aqui usado, "seqüência de referência" é umaseqüência definida usada como uma base para a comparação de seqüência.Uma seqüência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de umaseqüência especificada; por exemplo, como um segmento de um cDNA detamanho natural ou seqüência de ou o cDNA ou seqüência de gene completos.

(b) Como aqui usado, "janela de comparação" faz referência aum segmento contíguo e especificado de uma seqüência de polinucleotídeo,em que a seqüência de polinucleotídeo na janela de comparação podecompreender adições ou deleções (isto é, intervalos) comparada com aseqüência de referência (que não compreende adições ou deleções) para oalinhamento ótimo das duas seqüências. No geral, a janela de comparação éde pelo menos 20 nucleotídeos contíguos no comprimento e opcionalmentepode ter 30, 40, 50, 100 ou mais longa. Aqueles de habilidade na técnicaentendem que para evitar uma alta similaridade com uma seqüência dereferência devido a inclusão de intervalos na seqüência de polinucleotídeo umvalor padrão de intervalo é tipicamente introduzido e é subtraído do númerode emparelhamentos.

Os métodos de alinhamento de seqüências para comparaçãosão bem conhecidos na técnica. Assim, a determinação da identidadepercentual entre quaisquer duas seqüências pode ser realizada usando-se umalgoritmo matemático. Os exemplos preferidos, não limitantes de taisalgoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller, 1988; o algoritmode homologia local de Smith et ai. 1981; o algoritmo de alinhamento dehomologia de Needleman e Wunsch 1970; o método de similaridade parapesquisa de Pearson e Lipman 1988; o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990,modificado como em Karlin e Altschul, 1993. Para comparar as seqüênciasabaixo, preferivelmente os algoritmos BLASTN para as seqüências denucleotídeo, BLASTX para as proteínas com seus respectivos parâmetros devalor padrão são usados. O programa BLASTN (para as seqüências denucleotídeo) usa como valores padrão um comprimento de palavra (W) de 11,um expectativa (E) de 10, um corte de 100, M = 5, N = -4 e uma comparaçãode ambos os filamentos. Para as seqüências de aminoácido, o programaBLASTP usa como valores padrão um comprimento de palavra (W) de 3,uma expectativa (E) de 10 e a matriz de contagem BLOSUM62 (ver Henikoff& Henikoff, 1989). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. O alinhamento tambémpode ser realizado manualmente pela inspeção. Os alinhamentos múltiplos(isto é, de mais do que 2 seqüências) são preferivelmente realizados usando oalgoritmo Clustal W (Thompson 1994; por exemplo, no softwareVectorNTI®, versão 9; Invitrogen Inc.) com a matriz de contagemBLOSUM62MT2 com os ajustes de valor padrão (penalidade de abertura deintervalo 15/19, penalidade de extensão de intervalo 6,66/0,05; faixa depenalidade de separação de intervalo 8;% de identidade para a demora dealinhamento 40; usando intervalos específicos de resíduo e intervalos deresíduo hidrofílico). A comparação é preferivelmente feita usando o programaBlastN (versão 1.4.7 ou posterior) com seus parâmetros de valor padrão ouqualquer programa equivalente. Por "programa equivalente" é intencionadoqualquer programa de comparação de seqüência que, para qualquer duasseqüências em questão, gera um alinhamento tendo emparelhamentos denucleotídeo ou resíduo de aminoácido idênticos e uma identidade deseqüência percentual idêntica quando comparados com o alinhamentocorrespondente gerado pelo programa preferido. O software para realizar aanálise BLAST está publicamente disponível através do National Center forBiotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Além de calculara identidade de seqüência percentual, o algoritmo BLAST também realizauma análise estatística da similaridade entre duas seqüências (ver, porexemplo, Karlin & Altschul (1993). Uma medida de similaridade fornecidapelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N))5 que forneceuma indicação da probabilidade pela qual um emparelhamento entre doisnucleotídeo ou seqüências de aminoácido ocorreriam por acaso. Por exemplo,uma seqüência de ácido nucléico de teste é considerada similar a umaseqüência de referência se a menor probabilidade de soma em umacomparação da seqüência de ácido nucléico de teste para a seqüência dereferência de ácido nucléico for menor do que cerca de 0,1, maispreferivelmente menor do que cerca de 0,01 e o mais preferivelmente menordo que cerca de 0,001.

O termo "hibridização" como aqui usado inclui "qualquerprocesso pelo qual um filamento de ácido nucléico une-se com um filamentocomplementar através do emparelhamento de base." (Coombs 1994). Ahibridização e a força de hibridização (isto é, a força da associação entre osácidos nucléicos) são impactadas por fatores tais como o grau decomplementaridade entre os ácidos nucléicos, severidade das condiçõesenvolvidas, a Tm do híbrido formado e a razão G:C dentro dos ácidosnucléicos. Como aqui usado, o termo "Tm" é usado em referência à"temperatura de fusão." A temperatura de fusão é a temperatura na qual umapopulação of moléculas de ácido nucléico de filamento duplo torna-se semidissociada em filamentos únicos. A equação para calcular a Tm de ácidosnucléicos é bem conhecida na técnica. Como indicado pelas referênciaspadrão, uma estimativa simples do valor Tm pode ser calculada pela equação:Tm = 81,5 + 0,41 (% G+C), quando um ácido nucléico está em soluçãoaquosa em NaCl 1 M [ver por exemplo, Anderson e Young, 1985)]. Outrasreferências incluem computações mais sofisticadas, que levam emconsideração características estruturais assim como de seqüência para ocálculo da Tm.

Um exemplo de condições de lavagem altamente severas é0,15 M de NaCl a 72°C por cerca de 15 minutos. Um exemplo de condiçõesde lavagem severas é uma lavagem com 0,2 X SSC a 65°C por 15 minutos(ver, Maniatis, infra, para uma descrição de tampão de SSC). Freqüentemente,um lavagem de severidade alta é precedida por uma lavagem de severidadebaixa para remover o sinal de sonda de fundo. Um exemplo de lavagem deseveridade média para um duplex, por exemplo, de mais do que 100nucleotídeos, é 1 X SSC a 45°C por 15 minutos. Um exemplo de lavagem deseveridade baixa para um duplex, por exemplo, de mais do que 100nucleotídeos, é 4 a 6 X SSC a 40°C por 15 minutos. Para sondas curtas (porexemplo, de cerca de 10 a 50 nucleotídeos), as condições severas tipicamenteenvolvem concentrações de menos do que cerca de 1,5 M, maispreferivelmente de cerca de 0,01 a 1,0 M, a concentração de íon Na (ou outrossais) no pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é tipicamente de pelo menos cerca de30°C e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, >50nucleotídeos). As condições severas também podem ser obtidas com a adiçãode agentes desestabilizantes tais como formamida. No geral, uma razão desinal para ruído de 2 X (ou superior) do que aquela observada para uma sondanão relacionada no ensaio de hibridização particular indica a detecção de umahibridização específica. Os ácidos nucléicos que não hibridizam entre si sobcondições severas são ainda substancialmente idênticos se as proteínas queeles codificam são substancialmente idênticas. Isto ocorre, por exemplo,quando uma cópia de um ácido nucléico é criada usando a degenerescência decódon máxima permitida pelo código genético.

As condições muito severas são selecionadas para serem iguaisà Tm para uma sonda particular. Um exemplo de condições altamente severaspara a hibridização de ácidos nucléicos complementares que têm mais do que100 resíduos complementares em um filtro em um Southern ou Northern bloté 50% de formamida, por exemplo, hibridização em 50% de formamida, NaCl1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1 χ SSC de 60 a 65°C. Ascondições de severidade baixa exemplares incluem a hibridização com umasolução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCl 1 M, SDS a 1% (dodecilsulfato de sódio) a 37°C e uma lavagem em IX a 2X SSC (20 X SSC - NaCl3,0 M/citrato de trissódio 0,3 M) de 50 a 55°C. As condições de severidademoderada exemplares incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, NaCl1,0 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,5 X a 1 X SSC de 55 a 60°C.

O termo "equivalentes" quando feito em referência a umacondição de hibridização como tal diz respeito a uma condição dehibridização de interesse significa que a condição de hibridização e acondição de hibridização de interesse resultam na hibridização de seqüênciasde ácido nucléico que têm a mesma faixa de homologia percentual (%). Porexemplo, se uma condição de hibridização de interesse resulta na hibridizaçãode uma primeira seqüência de ácido nucléico com outras seqüências de ácidonucléico que têm de 80% a 90% de homologia com a primeira seqüência deácido nucléico, então uma outra condição de hibridização é dita serequivalente à condição de hibridização de interesse se esta outra condição dehibridização também resulta na hibridização da primeira seqüência de ácidonucléico com as outras seqüências de ácido nucléico que têm de 80% a 90%de homologia com a primeira seqüência de ácido nucléico.

Quando usado em referência à hibridização de ácido nucléicouma pessoa habilitada na técnica sabe bem que numerosas condiçõesequivalentes podem ser utilizadas para compreender condições de severidadebaixa ou alta; fatores tais como o comprimento e natureza (DNA, RNA,composição de base) da sonda e natureza do alvo (DNA, RNA, composiçãode base, presentes em solução ou imobilizados, etc.) e a concentração dos saise outros componentes (por exemplo, a presença ou ausência de formamida,sulfato de dextrano, polietileno glicol) são considerados e a solução dehibridização pode ser variada para gerar condições de hibridização deseveridade baixa ou alta diferentes, mas equivalentes às condições listadasacima. Aqueles habilitados na técnica sabem que ao passo que severidadesmais altas podem ser preferidas para reduzir ou eliminar a ligação nãoespecífica, severidades mais baixas podem ser preferidas para detectar umnúmero maior de seqüências de ácido nucléico tendo homologias diferentes.

O termo "gene" refere-se a uma região codificadoraoperavelmente unidas às seqüências regulatórias apropriadas capazes deregular a expressão do polipeptídeo de alguma maneira. Um gene incluiregiões regulatórias não traduzidas de DNA (por exemplo, promotores,realçadores, repressores, etc.) que precedem (a montante) e a seguir (ajusante) da região codificadora (matriz de leitura aberta, ORF) assim como,onde aplicável, seqüências interventoras (isto é, introns) entre regiõescodificadoras individuais (isto é, exons). O termo "gene estrutural" como aquiusado é intencionado significar uma seqüência de DNA que é transcrita emmRNA que é depois traduzida em uma seqüência de aminoácidoscaracterísticos de um polipeptídeo específico.

Como aqui usado o termo "região codificadora" quando usadoem referência a um gene estrutural refere-se às seqüências de nucleotídeo quecodificam os aminoácidos encontrados no polipeptídeo nascente como umresultado de translação de uma molécula de mRNA. A região codificadora élimitada, nos eucariotas, no lado 5' pelo tripleto de nucleotídeo "ATG" quecodifica a metionina iniciadora e no lado 3' por um dos três tripletos, queespecificam códons de parada (isto é, TAA, TAG, TGA). Além de conterintrons, as formas genômicas de um gene também podem incluir seqüênciaslocalizadas tanto na extremidade 5' quanto na 3' das seqüências, que estãopresentes no transcrito de RNA. Estas seqüências são aludidas comoseqüências ou regiões "flanqueadoras" (estas seqüências flanqueadoras estãolocalizadas 5' ou 3' em relação às seqüências não traduzidas presentes notranscrito de mRNA). A região flanqueadora 5' pode conter seqüênciasreguladoras tais como promotores e realçadores, que controlam ouinfluenciam a transcrição do gene. A região flanqueadora 3' pode conterseqüências, que direcionam a terminação da transcrição, clivagem póstranscricional e poliadenilação.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", "oligopeptídeo","polipeptídeo", "produto de gene", "produto de expressão" e "proteína" sãousados aqui intercambiavelmente para se referir a um polímero ou oligômerode resíduos de aminoácido consecutivos.

O termo "organismo geneticamente modificado" ou "GMO"refere-se a qualquer organismo que compreende DNA transgênico. Osorganismos exemplares incluem plantas, animais e microorganismos.

O termo "planta" como aqui usado refere-se a uma pluralidadede células vegetais, que são amplamente diferenciadas em uma estrutura queestá presente em qualquer estágio de um desenvolvimento da planta. Taisestruturas incluem um ou mais órgãos vegetais incluindo, mas não sãolimitados a, fruta, broto, haste, folha, pétala de flor, etc.

O termo "célula" ou "célula vegetal" como aqui usado refere-se a uma célula única. O termo "células" refere-se a uma população decélulas. A população pode ser uma população pura que compreende um tipode célula. Do mesmo modo, a população pode compreender mais do que umtipo de célula. Na presente invenção, não há nenhum limite no número detipos de célula que uma população de célula pode compreender. As célulaspodem ser sincronizadas ou não sincronizadas. Uma célula vegetal dentro dosignificado desta invenção pode ser isolada (por exemplo, em cultura desuspensão) ou compreendida em um tecido vegetal, órgão vegetal ou plantaem qualquer estágio desenvolvimental.

O termo "órgão" com respeito a uma planta (ou "órgãovegetal") significa partes de uma planta e pode incluir (mas não deve serlimitado a) por exemplo raízes, frutas, brotos, haste, folhas, anteras, sépalas,pétalas, pólen, sementes, etc.

O termo "tecido" com respeito a uma planta (ou "tecidovegetal") significa arranjo de células vegetais múltiplas incluindo tecidosdiferenciados e não diferenciados de plantas. Os tecidos vegetais podemconstituir parte de um órgão vegetal (por exemplo, a epiderme de uma folhavegetal) mas também podem constituir tecidos de tumor (por exemplo, tecidode calo) e vários tipos de células em cultura (por exemplo, células únicas,protoplastos, embriões, calos, corpos equivalentes a protocorm, etc.). O tecidovegetal pode estar in planta, em cultura de órgão, cultura de tecido ou culturade célula.

Os termos "DNA cromossômico" ou "seqüência de DNAcromossômico" devem ser entendidos como o DNA genômico do núcleocelular independente da situação do ciclo celular. O DNA cromossômicoportanto poderia ser organizado nos cromossomas ou cromátides, estespoderiam ser condensados ou não espiralados. Uma inserção no DNAcromossômico pode ser demonstrada e analisada por vários métodosconhecidos na técnica como por exemplo, análise de PCR, análise deSouthern blot, hibridização in situ na fluorescência (FISH) e PCR in situ.

O termo "gene estrutural" como aqui usado é intencionado asignificar uma seqüência de DNA que é transcrita no mRNA, que é depoistraduzido em uma seqüência de aminoácidos característica de umpolipeptídeo específico.

O termo "expressão" refere-se à biossíntese de um produto degene. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão envolve atranscrição do gene estrutural em mRNA e - opcionalmente - a traduçãosubseqüente de mRNA em um ou mais polipeptídeos.

Os termos "cassete de expressão" ou "construção deexpressão" como aqui usados é intencionado a significar a combinação dequalquer seqüência de ácido nucléico a ser expressada em ligação operávelcom uma seqüência promotora e - opcionalmente — elementos adicionais(como por exemplo, seqüências terminadoras e/ou de poliadenilação) quefacilitam a expressão da dita seqüência de ácido nucléico.

"Promotor", "elemento promotor," ou "seqüência promotora"como aqui usados, referem-se às seqüências de nucleotídeo na extremidade 5'de uma seqüência de nucleotídeo que direciona o início de transcrição (isto é,é capaz de controlar a transcrição da seqüência de nucleotídeo em mRNA).Um promotor está tipicamente, embora não necessariamente, localizado 5'(isto é, a montante) de uma seqüência de nucleotídeo de interesse (porexemplo, próximo ao sítio de início transcricional de um gene estrutural) cujatranscrição no mRNA o mesmo controla e fornece um sítio para a ligaçãoespecífica pela RNA polimerase e outros fatores de transcrição para o iníciode transcrição. As seqüências promotoras são necessárias, mas nem sempresuficientes, para direcionar a expressão de um gene a jusante. No geral,promotores eucarióticos incluem uma seqüência de DNA característicahomóloga para a caixa 5'-TATAAT-3' (TATA) de consenso de cerca de 10 a30 pares de base 5' em relação ao sítio de início de transcrição (capuz), que,por convenção, é numerado +1. Às bases 3' em relação ao sítio deencapuzamento são dados números positivos, ao passo que as bases 5' emrelação ao sítio de encapuzamento recebem números negativos, refletindo asua distância do sítio de encapuzamento. Um outro componente promotor, acaixa CAAT, é freqüentemente encontrada a cerca de 30 a 70 pares de base 5'em relação à caixa TATA e tem homologia com a forma canônica 5'-CCAAT-3' (Breathnach 1981). Em plantas a caixa CAAT é algumas vezessubstituída por uma seqüência conhecida como a caixa AGGA, uma regiãotendo resíduos de adenina que simetricamente flanqueiam o tripleto G(ouT)NG (Messing 1983). Outras seqüências que conferem influênciasreguladoras sobre a transcrição podem ser encontradas dentro da regiãopromotora e estendendo-se tanto quanto 1000 pares de base ou mais 5' apartir do sítio de encapuzamento. O termo "constitutivo" quando feito emreferência a um promotor significa que o promotor é capaz de direcionar atranscrição de uma seqüência de ácido nucléico operavelmente ligada naausência de um estímulo (por exemplo, choque térmico, produtos químicos,luz, etc.). Tipicamente, promotores constitutivos são capazes de direcionar aexpressão de um transgene substancialmente em qualquer célula e qualquertecido.

Controle Regulatório refere-se à modulação da expressão degene induzida pelos elementos de seqüência de DNA primariamentelocalizados, mas não exclusivamente, a montante de (5') em relação ao sítiode início de transcrição. A regulagem pode resultar em uma resposta tudo ounada aos estímulos ambientais ou pode resultar em variações no nível deexpressão do gene. Nesta invenção, os elementos regulatórios de choquetérmico funciona para realçar transitoriamente o nível de expressão de gene ajusante em resposta à elevação de temperatura súbita.

O sinal de poliadenilação refere-se a qualquer seqüência deácido nucléico capaz de efetuar o processamento de mRNA, usualmentecaracterizado pela adição de traços de ácido poliadenílico às extremidades 3'dos precursores de mRNA. O segmento de DNA do sinal de poliadenilaçãopor si só pode ser um compósito de segmentos derivados de diversas fontes,que ocorre naturalmente ou sintético e pode ser de um DNA genômico ou umcDNA derivado de RNA. Os sinais de poliadenilação são habitualmentereconhecidos pela presença de homologia para a forma canônica 5'-AATAA-3', embota a variação da distância, "leitura" parcial e seqüências canônicasem tandem múltiplas não são incomuns (Messing 1983). Deve serreconhecido que um "sinal de poliadenilação" canônico de fato pode causar aterminação transcricional e não a poliadenilação por si (Montell 1983).

Elementos de choque térmico referem-se às seqüências deDNA que regulam a expressão de gene em resposta ao estresse de elevaçõesde temperatura súbitas. A resposta é observada como um realce transitório sebem que imediato no nível de expressão de um gene a jusante. O trabalhooriginal sobre genes de choque térmico foi feito com Drosophila mas muitasoutras espécies incluindo plantas (Barnett 1980) exibiram respostas análogasao estresse. O componente primário essencial do elemento de choque térmicofoi descrito em Drosophila para ter a seqüência de consenso 5'-CTGGAATNTTCTAGA-3' (onde N = A, T, C ou G) e estar localizado naregião entre os resíduos -66 até -47 pares de base a montante do sítio de iníciode transcrição (Pelham 1982). Uma cópia de oligonucleotídeo quimicamentesintetizada desta seqüência de consenso pode substituir a seqüência naturalem que confere a indutibilidade do choque térmico.

Seqüência líder refere-se a uma seqüência de DNA quecompreende cerca de 100 nucleotídeos localizados entre o sítio de início detranscrição e o sítio de início de tradução. Personificado dentro da seqüêncialíder está uma região que especifica o sítio de ligação de ribossoma.

Os introns ou seqüências interventoras referem-se nestetrabalho àquelas regiões de seqüência de DNA que são transcritas junto comas seqüências codificadoras (exons) mas são depois removidas na formaçãodo mRNA maduro. Os introns podem ocorrer em qualquer lugar dentro deuma seqüência transcrita — entre as seqüências codificadoras dos mesmosgenes ou diferentes, dentro da seqüência codificadora de um gene,interrompendo e dividindo as suas seqüências de aminoácido e dentro daregião promotora (5' em relação ao sítio de início de tradução). Os introns notranscrito primário são excisados e as seqüências codificadoras são simultâneae precisamente ligadas para formar o mRNA maduro. As junções de introns eexons formam os sítios de união. A seqüência base de um intron começa comGU e termina com AG. O mesmo sinal de união é encontrado em muitoseucariotas superiores.

Os termos "ligação operável" ou "operavelmente ligado"devem ser entendidos como significando, por exemplo, o arranjo seqüencialde um elemento regulatório (por exemplo, um promotor) com uma seqüênciade ácido nucléico a ser expressada e, se apropriado, outros elementosregulatórios (tais como por exemplo, um terminador) em um tal modo quecada um dos elementos regulatórios possa preencher a sua função pretendidapara permitir, modificar, facilitar ou de outro modo influenciar a expressão dadita seqüência de ácido nucléico. A expressão pode resultar dependendo doarranjo das seqüências de ácido nucléico em relação ao RNA de sentido ouanti-sentido. Para esta finalidade, a ligação direta no sentido químico não énecessariamente requerida. As seqüências de controle genético tais como, porexemplo, as seqüências realçadoras, também podem exercer a sua funçãosobre a seqüência alvo a partir de posições, que são mais distantes ou de fatode outras moléculas de DNA. os arranjos preferidos são aqueles em que aseqüência de ácido nucléico a ser expressada recombinantemente éposicionada atrás da seqüência que atua como promotor, de modo que as duasseqüências são ligadas covalentemente entre si. A distância entre a seqüênciapromotora e a seqüência de ácido nucléico a ser expressadarecombinantemente é de modo preferível menor do que 200 pares de base, demodo especialmente preferível menor do que 100 pares de base, muito demodo especialmente preferível menor do que 50 pares de base. A ligaçãooperável e um cassete de expressão, pode ser gerado por meio de técnicas derecombinação e clonagem habituais como descrito (por exemplo, em Maniatis1989; Silhavy 1984; Ausubel 1987; Gelvin 1990). Entretanto, seqüênciasadicionais, que - por exemplo - atuam como um ligador com sítios declivagem específicos para enzimas de restrição ou como um peptídeo de sinal,também podem ser posicionadas entre as duas seqüências. A inserção deseqüências também pode levar à expressão de proteínas de fusão.Preferivelmente, o cassete de expressão, que consiste de uma ligação depromotor e seqüência de ácido nucléico a ser expressada, pode existir em umaforma integrada no vetor e ser inserida em um genoma vegetal, por exemplopela transformação.

O termo "transformação" como aqui usado refere-se àintrodução de material genético (por exemplo, um transgene) em uma célula.A transformação de uma célula pode ser estável ou transitória. Os termos"transformação transitória" ou "transitoriamente transformado" referem-se àintrodução de um ou mais transgenes em uma célula na ausência deintegração do transgene no genoma da célula hospedeira. A transformaçãotransitória pode ser detectada, por exemplo, pelo ensaio imunossorventeligado a enzima (ELISA) que detecta a presença de um polipeptídeocodificado por um ou mais dos transgenes. Alternativamente, a transformaçãotransitória pode ser detectada detectando-se a atividade da proteína (porexemplo, β-glicuronidase) codificada pelo transgene (por exemplo, o uidAgené) como aqui demonstrado [por exemplo, ensaio histoquímico daatividade da enzima GUS pelo tingimento com X-gluc que dá um precipitadoazul na presença da enzima GUS; e um ensaio quimioluminescente daatividade da enzima GUS usando o kit GUS-Light (Tropix)]. O termo"transformante transitório" refere-se a uma célula que tem transitoriamenteincorporada um ou mais transgenes. Ao contrário, o termo "transformaçãoestável" ou "estavelmente transformado" refere-se à introdução e integraçãode um ou mais transgenes no genoma de uma célula, preferivelmenteresultando na integração cromossômica e hereditariedade estáveis através dameiose. A transformação estável de uma célula pode ser detectada pelahibridização de Southern blot de DNA genômico da célula com as seqüênciasde ácido nucléico, que são capazes de ligar a um ou mais dos transgenes.

Alternativamente, a transformação estável de uma célula também pode serdetectada pela reação da cadeia da polimerase de DNA genômico da célulapara amplificar seqüências transgênicas. O termo "transformante estável"refere-se a uma célula, que tem estavelmente integrada um ou mais transgenesno DNA genômico (incluindo o DNA dos plastídeos e do núcleo),preferivelmente a integração no DNA cromossômico do núcleo. Assim, umtransformante estável é distinguido de um transformante transitório em que,considerando que o DNA genômico do transformante estável contém um oumais transgenes, o DNA genômico do transformante transitório não contêmum transgene. A transformação também inclui a introdução de materialgenético nas células vegetais na forma de vetores virais vegetais queenvolvem a replicação epicromossômica e expressão de gene, que pode exibirpropriedades variáveis com respeito à estabilidade meiótica. A transformaçãotambém inclui a introdução de material genético nas células vegetais na formade vetores virais vegetais que envolvem a replicação epicromossômica eexpressão de gene, que podem exibir propriedades variáveis com respeito àestabilidade meiótica. Preferivelmente, o termo "transformação" inclui aintrodução de material genético em células vegetais resultando na integraçãocromossômica e hereditariedade estável através da meiose.

Os termos "infectar" e "infecção" com uma bactéria referem-se à co-incubação de uma amostra biológica alvo, (por exemplo, célula,tecido, etc.) com a bactéria sob condições tais que as seqüências de ácidonucléico contidas dentro da bactéria são introduzidas em uma ou mais célulasda amostra biológica alvo.

O termo iiAgrobacterium" refere-se a uma bactériatransportada pelo solo, Gram-negativa, na forma de vareta fitopatogênica, quecausa a galha da copa. O termo iiAgrobaeterium" inclui, mas não é limitado àscepas Agrobacterium tumefadens, (que tipicamente causa a galha da copa emplantas infectadas) e Agrobacterium rhizogenes (que causa a doença da raizpilosa em plantas hospedeiras infectadas). A infecção de uma célula vegetalcom Agrobacterium no geral resulta na produção de opinas (por exemplo,nopalina, agropina, octopina etc.) pela célula infectada. Assim, as cepas deAgrobaeterium que causam a produção de nopalina (por exemplo, cepaLBA4301, C58, A208) são aludidas como Agrobaeteria "tipo nopalina"; ascepas de Agrobaeterium que causam a produção de octopina (por exemplo,cepa LBA4404, Ach5, B6) são aludidas como Agrobaeteria "tipo octopina"; ecepas de Agrobaeterium que causam a produção de agropina (por exemplo,cepa EHA105, EHA101, A281) são aludidas como Agrobaeteria "tipoagropina".

Os termos "bombardear, "bombardeamento," e"bombardeamento biolístico" referem-se ao processo de acelerar partículascontra uma amostra biológica alvo (por exemplo, célula, tecido, etc.) paraefetuar o ferimento da membrana celular de uma célula na amostra biológicaalvo e/ou a entrada das partículas na amostra biológica alvo. Os métodos parao bombardeamento biolístico são conhecidos na técnica (por exemplo, US5.584.807, os conteúdos das quais são aqui incorporadas por referência) e sãocomercialmente disponíveis (por exemplo, o acelerador de microprojétilacionado por gás hélio (PDS-1000/He) (BioRad).

O termo "microferimento" quando feito em referência aotecido vegetal refere-se à introdução de ferimentos microscópicos naqueletecido. Os microferimentos podem ser obtidos, por exemplo, pelobombardeamento de partícula como aqui descrito.

A "eficiência de transformação" ou "freqüência detransformação" como aqui usadas podem ser medidas pelo número de célulastransformadas (ou organismos transgênicos cultivados a partir de célulastransformadas individuais) que são recuperadas sob condições experimentaispadrões (isto é, padronizadas ou normalizadas com respeito à quantidade decélulas contatadas com DNA estranho, a quantidade de DNA liberado, tipo econdições de liberação de DNA, condições de cultura geral etc.) Por exemplo,quando explantes isolados de tecido meristemático axilar são usados comomaterial de partida para a transformação, a freqüência de transformação podeser expressada como o número de linhagens de plantas transgênicas obtidaspor 100 explantes isolados transformados.

Os termos "meristema" ou "células meristemáticas" ou tecidomeristemático" podem ser usado intercambiavelmente e são intencionados asignificar tecido vegetal não diferenciado, que continuamente se divide,formando novas células, como aquelas encontradas na ponta de uma haste ouraiz. Os termos "nodo" ou "nodo de folha" são intencionados a significar oponto em uma haste onde uma folha é ligada ou foi ligada. O termo"internodo" é intencionado a significar a seção ou parte entre dois nodos emuma haste. O termo "pecíolo" é intencionado a significar o pedúnculo peloqual uma folha é ligada a uma haste, também chamada de um pedúnculofoliar. O termo "broto axilar" é intencionado a significar uma pequenaprotuberância ao longo de uma haste ou ramo, algumas vezes incluído emescamas protetoras e contendo um broto, folha ou flor não desenvolvidos;também chamado de um broto lateral. O termo "hipocotilo" é intencionado asignificar a parte da haste entre as folhas sementes (os cotilédones) e a raiz. Otermo "axila foliar" é intencionado a significar o ângulo entre uma folha e ahaste na qual ela nasceu. O broto axilar ocorre na axila foliar. O termo"cotilédone" é intencionado a significar uma folha do embrião de uma plantade semente, que na germinação permanece na semente ou emerge, amplia e setorna verde; também chamada de uma folha de semente. O eixo do embriãoestá localizado entre os cotilédones e é ligado a eles próximo à extremidademais próxima ao micrópilo.

Os termos "desdiferenciação", "tratamento dedesdiferenciação" ou "pré tratamento de desdiferenciação" significam umprocesso de obtenção de cachos de célula, tais como calo, que mostramcrescimento desorganizado pelo cultivo de células diferenciadas de tecidosvegetais em um meio de desdiferenciação. Mais especificamente, o termo"desdiferenciação" como aqui usado é intencionado a significar o processo deformação de células que se dividem rapidamente sem função particular noescopo do corpo vegetal. Estas células freqüentemente possuem uma potênciaaumentada com respeito à sua capacidade para se desenvolver em váriostecidos vegetais. Preferivelmente o termo é intencionado a significar areversão de um tecido diferenciado ou especializado a uma forma maispluripotente ou totipotente (por exemplo, embrionária). A desdiferenciaçãopode levar à reprogramação de um tecido vegetal (primeiro reverter às célulasnão diferenciadas, não especializadas, depois a caminhos novos e diferentes).

O termo "totipotência" como aqui usado é intencionado a significar umacélula vegetal contendo toda a informação genética e/ou celular requeridapara formar uma planta inteira. A desdiferenciação pode ser iniciada porcertos reguladores do crescimento vegetal (por exemplo, compostos de auxinae/ou citocinina), especialmente por certas combinações e/ou concentraçõesdestas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção é um método para a transformaçãogenética de linha germinativa direta de variedades de soja, Glycine max,fundamentados em um sistema de seleção de D-aminoácido. Uma primeiraforma de realização da invenção diz respeito a um método para gerar umaplanta de soja transgênica que compreende as etapas de

a. introduzir em uma célula ou tecido da soja uma construçãode DNA que compreende pelo menos uma primeira construção de expressãoque compreende um promotor ativo na dita planta de soja e operavelmenteligada a esta uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capazde metabolizar D-alanina e/ou D-serina, e

b. incubar a dita célula ou tecido da soja da etapa a) em ummeio de seleção que compreende D-alanina e/ou D-serina e/ou um derivadodas mesmas em uma concentração total de cerca de 3 mM a cerca de 100 mMpor um período de tempo de pelo menos 5 dias, e

c. transferir a dita célula ou tecido da soja da etapa b) para ummeio de regeneração e regenerar e selecionar plantas de soja quecompreendam a dita construção de DNA.

A pressão de seleção aplicada depois do co-cultivocompreende em uma forma de realização uma ou mais das seguintes etapas:

a. primeiro sem seleção na indução de broto;

b. selecionar durante a indução de broto,

c. selecionar por todo o alongamento do broto.

Preferivelmente a concentração de D-ala é de 40 mM ouabaixo, mais preferido 30 mM ou abaixo se adicionados ao meio, porexemplo, a um meio como o meio SEM. Além disso, a concentração está emuma forma de realização em torno de 2 mM, 3 mM ou 5 mM ou mais, maispreferido são em torno de 10 mM. Assim, em uma forma de realização, aconcentração está entre 7,5 e 20 mM de D-ala no meio para seleção. Emcombinação com a concentração abaixo de 10 mM de D-serina aconcentração de D-ala é preferivelmente de 30 mM ou abaixo, ainda maispreferido são 20 mM ou mais baixo. A pessoa na técnica sabe, partindo destesdados, como adaptar o D-ala ou as concentrações de D-ala e D-ser àscondições específicas de cada esquema de seleção individual, por exemplo, asconcentrações podem variar se um outro meio, uma outra idade dos brotos,um outro tempo de incubação ou uma outra construção etc. são usados. Porexemplo, uma taxa de expressão mais alta ou atividade das enzimas, porexemplo, devido ao uso de um promotor mais forte, permite queconcentrações mais altas de D-ala e/ou D-ser sejam usadas. Assim, em umaforma de realização a seleção deve estar em torno de 5 e 20 mM de D-Ala,por exemplo, 10 a 15 mM na indução de broto combinados com IalO mM,preferivelmente abaixo de 7,5 mM, mais preferido entre 2 e 5 mM de D-Ala,por exemplo, em torno de 3 mM de D-Ala no alongamento do broto. Assim,em uma forma de realização a seleção deve estar em torno de 5 e 20 mM deD-Ser, por exemplo, 10 a 15 mM na indução de broto combinados com IalOmM, preferivelmente abaixo de 7,5 mM, mais preferido entre 2 e 5 mM de D-Ser, por exemplo, em torno de 3 mM de D-Ser no alongamento de broto.

Assim, em uma forma de realização a seleção deve estar em torno de 5 e 20mM de D-Ser e D-Ala, por exemplo, de 10 a 15 mM na indução de brotocombinada com 1 a 10 mM, preferivelmente abaixo de 7,5 mM, maispreferido entre 2 e 5 mM de D-Ser e D-Ala, por exemplo, em torno de 3 mMde D-Ser e D-Ala no alongamento de broto. Por exemplo, a seleção é feita

i) usando cerca de 3 a cerca de 30 mM de D-alanina;

ii) usando cerca de 30 a 50 mM de D-serina, e/ou

iii) usando cerca de 1 a 10 mM de D-serina em combinaçãocom 30 mM de D-alanina ou menos, preferivelmente em torno de 5 a 7 mMde D-serina, por exemplo, 7,5 mM e 10 mM a 20 mM de D-alanina por cercade 3 a 4 semanas sob condições desdiferenciadoras. Conseqüentemente, emuma forma de realização, a seleção depois da transformação com um genedsda compreende as seguintes etapas:

a. de 5 a 10 dias, por exemplo, 7 dias na indução de broto semseleção,

b. de 2 a 4 semanas, por exemplo, 3 semanas em meio deindução de broto com 5 mM a 10 mM, por exemplo, D-serina a 7,5 mM;

c. de 2 mM a 7 mM, por exemplo, 5 mM de D-serina por todoalongamento de broto.

Conseqüentemente, em uma outra forma de realização, aseleção depois da transformação com um gene daol compreende as seguintesetapas:

a. de 5 a 10 dias, por exemplo, de 6 a 7 dias na indução debroto sem seleção,

b. de 2 a 4 semanas, por exemplo, 3 semanas em meio deindução de broto com 5 mM a 10 mM, por exemplo, 7,5 mM de D-alanina;

c. de 2 mM a 7 mM, por exemplo, 5 mM de D-alanina portodo alongamento de broto.

Além disso, a seleção depois da transformação com um genedaol compreende por exemplo as seguintes etapas:

a. de 5 a 10 dias, por exemplo, de 5 a 7 dias na indução debroto sem seleção,

b. de 2 a 4 semanas, por exemplo, 3 semanas em meio deindução de broto com 5 mM a 10 mM, por exemplo, 7,5 mM de D-alanina ecom 5 mM a 10 mM, por exemplo, D-serina a 7,5 mM;

c. de 2 mM a 7 mM, por exemplo, 5 mM de D-serina e 2 mMto 7 mM, por exemplo, 5 mM de D-alanina por todo alongamento de broto.

Em uma forma de realização, o método da presente invençãocompreende uma ou mais, por exemplo, todas, das seguintes etapas:

a. Esterilização das mudas;

b. Cultivo das mudas por 3 a 10 dias, preferivelmente por 5 a 8dias, por exemplo, por 7 dias na luz;

c. Cultivo do epicótilo com as folhas unifoliadas até ocomprimento dos cotilédones ou mais longo;

d. Cultivo do epicótilo até entre 0,5 cm e 4 cm; por exemplo,0,7 cm ou mais, 1,0 cm ou mais ou 2 cm ou menos.

e. Remover todas as folhas pré formadas incluindo omeristema apical

f. Lesionar o nodo localizado no primeiro conjunto de folhascom vários cortesg. Co-cultivar o nodo ferido com mistura de Agrobacteriumpor 0,1 hora a 1 hora, por exemplo, 0,5 hora em meio líquido.

h. Co-cultivar o nodo com Agrobaeterium por 3 a 5 dias noescuro em meio de co-cultivo sólido;

i. Colocar os explantes para seleção sob um ciclo de 18 horasde luz /6 horas de escuro de 70 a 100 microE/m2s até que os meristemasaxilares cresçam até o primeiro nodo acima do epicótilo;

j. Remover os brotos formados antes da transformação até 2semanas depois do co-cultivo e opcionalmente cortar durante este tempo oexplante em pedaços menores;

k. Transferir os explantes para meio de alongamento inicial debroto depois de 2 a 4 semanas depois do co-cultivo e transferir os explantes acada 2 a 3 semanas para meio fresco com agente de seleção removendodepois o tecido morto até os brotos alongarem;

1. Remover os brotos de 3 cm ou maiores do explante e colocarem meio indutor de raiz por uma semana até que as raízes comecem a seformar;

m. Transferir os brotos enraizados para o solo e fortalecidosem uma câmara de crescimento por 2 a 3 semanas antes de transferir os brotosenraizados para a estufa.

Conseqüentemente, o método da invenção usando o gene dsdacompreende em uma etapa preferida o uso de meristemas axilares de broto deGileine max como explante para a transformação. Em particular, uma cepa A.rhizogenes SHAO17 ou uma A. tumefaeiens podem ser usadas para atransformação, preferido é o uso de A. rhizogenes SHAO17, por exemplo, acepa K599 como descrito abaixo. Em uma forma de realização, a infecçãoocorre em torno de 30 min, por exemplo, entre 25 e 35 min na temperaturaambiente, por exemplo, entre 18°C e abaixo de 25°C, preferivelmente entre20°C e 23°C. A OD pode estar em uma forma de realização em torno de 1,5.Além disso, o co-cultivo ocorre preferivelmente em torno de 5 dias, porexemplo, entre 3 e 8 dias, mais preferido 4 ou 5 dias, preferivelmente noescuro, por exemplo, de 23°C a 27°C, preferivelmente de 24°C a 25°C. Arecuperação dos explantes transformados leva em uma forma de realizaçãoem torno de 5 a 8 dias, por exemplo, 6 ou 7 dias, preferivelmente na luz, porexemplo, em torno de 25°C ou 23°C a 27°C, preferivelmente de 24°C a 26°C.Como já descrito acima e mais descrito abaixo a seleção durante o início debroto/calo pode estar em uma concentração por exemplo de 3 mM a 10 mMde D-ser, preferivelmente em torno de 7,5 mM de D-ser ou em outrasconcentrações e composições adequadas aqui descritas em torno de 3semanas, por exemplo, por 15 a 24 dias, preferivelmente por 20 a 22 dias,preferivelmente na luz e por exemplo, em torno de 25°C ou 23°C a 26°C,preferivelmente de 24°C a 25°C. Além disso, a etapa de seleção durante oalongamento de broto/calo a regeneração pode ocorrer a uma concentraçãopor exemplo de 3 mM a 10 mM de D-ser, preferivelmente em torno de 5 mMde D-ser ou em outras concentrações e composições adequadas aqui descritasem torno de 4 a 5 semanas, por exemplo, por 25 a 35 dias, preferivelmente emtorno de 30 dias, preferivelmente na luz e por exemplo, em torno de 25°C ou23°C a 26°C, preferivelmente 24°C a 25°. A etapa de enraizamento podeocorrer sem ou com muito pouca quantidade de seleção, por exemplo emtorno de 0 mM de D-ser em torno de 1 a 2 semanas, por exemplo, por 5 a 10dias, preferivelmente na luz e por exemplo, de 23°C a 27°C, preferivelmentede 24°C a 25°C.

1. A construção de DNA da invenção

1.1A primeira construção de expressão da invenção

A primeira construção de expressão compreende um promotorativo nas sojas e operavelmente ligado a este uma seqüência de ácido nucléicoque codifica uma enzima capaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina.Preferivelmente o dito promotor é heterólogo em relação à dita seqüência quecodifica a enzima. O promotor ativo em plantas de soja e a enzima quemetaboliza D-alanina e/ou D-serina são definidos abaixo em detalhes.

1.1.1 A enzima capaz de metabolizar D-alanina ou D-serina

As pessoas habilitadas na técnica estão cientes de numerosasseqüências adequadas para metabolizar D-alanina e/ou D-serina. O termo"enzima capaz de metabolizar D-alanina ou D-serina" significapreferivelmente uma enzima, que converte e/ou metaboliza D-alanina e/ou D-serina com uma atividade que é pelo menos duas vezes (pelo menos 100%mais alta), preferivelmente pelo menos três vezes, mais preferivelmente pelomenos cinco vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10 vezes, o maispreferivelmente pelo menos 50 vezes ou 100 vezes a atividade para aconversão do L-aminoácido correspondente (isto é, D-alanina e/ou D-serina) e- mais preferivelmente - também de qualquer outro aminoácido D e/ou L ou aquiral.

Preferivelmente, a enzima capaz de metabolizar D-alanina ouD-serina é selecionada do grupo que consiste de D-serina amônia-liase (D-Serina desidratases; EC 4.3.1.18; anteriormente EC 4.2.1.14). D-Aminoácidooxidases (EC 1.4.3.3) e D-Alanina transaminases (EC 2.6.1.21). Maispreferivelmente, a enzima capaz de metabolizar D-alanina ou D-serina éselecionada do grupo que consiste de D-serina amônia-liase (D-Serinadesidratases; EC 4.3.1.18; anteriormente EC 4.2.1.14) e D-Aminoácidooxidases (EC 1.4.3.3). O termo "D-serina amônia-liase" (D-Serinadesidratases; EC 4.3.1.18; anteriormente EC 4.2.1.14) significa enzimas quecatalisam a conversão de D-serina a piruvato e amônia. A reação catalisadaprovavelmente envolve a eliminação inicial de água (por este motivo aclassificação original da enzima como EC 4.2.1.14), seguida pelaisomerização e hidrólise do produto com ruptura da ligação C-N. Paraexemplos de enzima adequados ver http://www.expasy.Org/enzima/4.3.l.18.O termo "D-Alanina transaminases" (EC 2.6.1.21) significa enzimas quecatalisam a reação de D-Alanina com 2-oxoglutarato a piruvato e D-glutamato. D-glutamato é muito menos tóxico para as plantas do que a D-Alanina. http://vvww.expasy.Org/enzima/2.6.1.21.

O termo D-aminoácido oxidase (EC 1.4.3.3; abreviado DAAO,DAMOX ou DAO) está se referindo à enzima que converte um D-aminoácidoem um 2-oxo ácido, - preferivelmente - pela utilização de oxigênio (O2) comoum substrato e produzindo peróxido de hidrogênio (H2O2) como um co-produto (Dixon 1965a,b,c; Massey 1961; Meister 1963). DAAO pode serdescrito pelo Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology (IUBMB) com o número EC (EnzymeCommission) EC 1.4.3.3. No geral uma enzima DAAO da classe EC 1.4.3.3.é uma flavoenzima FAD que catalisa a oxidação de D-aminoácidos neutros ebásicos nos seus ceto ácidos correspondentes. DAAOs foram caracterizados eseqüenciados em fungos e vertebrados onde eles são conhecidos por estaremlocalizados nos peroxissomas. Em DAAO, uma histidina conservada foimostrada (Miyano 1991) ser importante para a atividade catalítica da enzima.Em uma forma de realização preferida da invenção um DAAO está sereferindo a uma proteína que compreende os seguintes motivos de consenso:[LIVM] - [LI VM] -H*- [NHA] - Y-G-x- [GS A] - [GS A] -X-G-X5-G-X-A.

em que os resíduos de aminoácido dados em colchetesrepresentam resíduos alternativos para a respectiva posição, χ representaqualquer resíduo de aminoácido e os números de índices indicam o respectivonúmero de resíduos de aminoácido consecutivos. A abreviação para osresíduos de aminoácido individuais têm o seu significado da IUPAC padrãocomo definido acima. A D-Aminoácido oxidase (EC-número 1.4.3.3) podeser isolada de vários organismos, incluindo mas não limitado a porco, serhumano, rato, levedura, bactérias ou fungos. Os organismos de exemplo sãoCandida tropicalis, Trigonopsis variabilis, Neurospora crassa, Chlorellavulgaris e Rhodotorula gracilis. Um polipeptídeo que metaboliza D-aminoácido adequado pode ser uma enzima eucariótica, por exemplo de umalevedura (por exemplo, Rhodotorula gracilis), fungo ou animal ou pode seruma enzima procariótica, por exemplo, de uma bactéria tal como Escherichiacoli. Para os exemplos de enzima adequados ver http://www.expasy.org/enzima/1.4.3.3.

Os exemplos de polipeptídeos adequados, que metabolizam D-aminoácidos são mostrados na Tabela 1. As seqüências de ácido nucléico quecodificam as ditos enzimas são disponíveis das bases de dados (por exemplo,sob Genbank Ac.-Ns U60066, A56901, AF003339, Z71657, AF003340,U63139, D00809, Z50019, NC_003421, AL939129, AB042032). Comodemonstrado acima, a DAAO de diversas espécies diferentes foi caracterizadae mostrou diferir levemente em afinidades de substrato (Gabler 2000), mas nogeral elas demonstram especificidade de substrato ampla, desaminandooxidativamente todos os D-aminoácidos.

Tabela 1: Enzimas adequadas para metabolizar D-serina e/ou

D-alanina. As enzimas especialmente preferidas são apresentadas em negrito

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Especialmente preferidos neste contexto são o gene daol (EC:

1.4.3.3: GenBank Ac. N2: U60066) da levedura Rhodotorula gracilis(.Rhodosporidium toruloides) e o gene dsda da E. coli (D-serina desidratase(D-serina desaminase) [EC: 4.3.1.18; GenBank Ac.-Ns: JO1603). O gene daolé de vantagem especial visto que ele pode ser utilizado como um marcador defunção dupla (ver o pedido de patente internacional PCT/EP 2005/002734;WO 2005/090581).

As enzimas que metabolizam D-aminoácido adequadastambém incluem fragmentos, mutantes, derivados, variantes e alelos dospolipeptídeos exemplificados acima. Os fragmentos, mutantes, derivados,variantes e alelos adequados são aqueles, que retêm as característicasfuncionais da enzima que metaboliza D-aminoácido como definido acima. Asmudanças para uma seqüência, produzindo um mutante, variante ou derivado,podem ser por uma ou mais de adição, inserção, deleção ou substituição deum ou mais nucleotídeos no ácido nucléico, levando à adição, inserção,deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos no polipeptídeocodificado. Naturalmente, as mudanças ao ácido nucléico que não fazemnenhuma diferença para a seqüência de aminoácido codificada são incluídas.

Mais preferivelmente para o método da invenção, a enzimacapaz de metabolizar D-serina é selecionada do grupo que consiste de

i) a D-serina amônia-liase de E. coli como codificada pelaSEQ ID NO: 2, e

ii) as enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade de pelo menos 60% (preferivelmente 70% ou 75%, maispreferivelmente 80% ou 85%, ainda mais preferivelmente 90% ou 95%, omais preferivelmente 98%) com a seqüência como codificada pela SEQ IDNO: 2 e

iii) as enzimas codificadas por uma seqüência de ácidonucléico capaz de hibridizar (preferivelmente sob condições equivalentes ouiguais à hibridização com uma solução tampão de 30 a (preferivelmente) 35%de formamida, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em IX a 2XSSC (preferivelmente Ix SSC) de 50 a (preferivelmente) 55°C), maispreferivelmente em 40 a (preferivelmente) 45% de formamida, 1,0 M deNaCl, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,5 X a 1 X SSC (preferivelmente0,5x SSC) de 55 a (preferivelmente) 60°C) e o mais preferivelmente em 50%de formamida, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1 χ SSCde 60 a (preferivelmente) 65 °C) ao complemento da seqüência descrita pelaSEQ ID NO: 1,

e em que a seleção é feita em um meio que compreenda D-serina em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 100 mM,preferivelmente de cerca de 1 mM a cerca de 70 mM, mais preferivelmente decerca de 2 mM a cerca de 50 mM, o mais preferivelmente de cerca de 3 mM acerca de 15 mM. O tempo de seleção total sob condições desdiferenciadoras épreferivelmente de cerca de 1 a 10 semanas, preferivelmente de 2 a 8semanas, mais preferivelmente de 3 a 4 semanas.

Conseqüentemente, em uma forma de realização, no métododa presente invenção a enzima capaz de metabolizar D-serina é selecionadodo grupo que consiste de

i) a D-serina amônia-liase como mostrada na Tabela 1,

ii) enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade de pelo menos 80% (preferivelmente pelo menos 85%, maispreferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos95%, o mais preferivelmente pelo menos 98%) com uma seqüência deaminoácido de uma D-serina amônia-liase como mostrada na Tabela I;

iii) enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade da seqüência de ácido nucléico codificadora de pelo menos 80%(preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%,ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, o mais preferivelmente pelomenos 98%) com uma seqüência de ácido nucléico de uma D-serina amônia-liase como mostrada na Tabela 1, e

iv) enzimas codificadas por uma seqüência de ácido nucléicocapaz de hibridizar ao complemento da seqüência que codifica a D-serinaamônia-liase como mostrada na Tabela 1,e em que a seleção é feita em um meio que compreenda D-serina em uma concentração de 3 mM a 100 mM; preferivelmente de 4 a 10mM;

ou em que a enzima capaz de metabolizar D-serina e D-alaninaé selecionada do grupo que consiste de

i) a D-aminoácido oxidase como mostrada na Tabela 1, e

ii) enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade de pelo menos 80% (preferivelmente pelo menos 85%, maispreferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos95%, o mais preferivelmente pelo menos 98%) com uma seqüência deaminoácido de uma D-aminoácido oxidase como mostrada na Tabela 1;

iii) enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade da seqüência de ácido nucléico codificadora de pelo menos 80%(preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%,ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, o mais preferivelmente pelomenos 98%) com uma seqüência de ácido nucléico de uma D-aminoácidooxidase como mostrada na Tabela 1, e

iv) enzimas codificadas por uma seqüência de ácido nucléicocapaz de hibridizar ao complemento da seqüência que codifica a D-aminoácido oxidase como mostrada na Tabela 1,

e em que seleção é feita em um meio que compreende D-alanina e/ou D-serina em uma concentração total de 3 mM a 100 mM;preferivelmente de 4 a 10 mM

"A mesma atividade" no contexto de uma D-serina amônia-liase significa a capacidade para metabolizar D-serina, preferivelmente comoo substrato mais preferido. A metabolização significa a reação de liaseespecificada acima.

Também mais preferivelmente para o método da invenção, aenzima capaz de metabolizar D-serina e D-alanina é selecionada do grupo queconsiste de

i) a D-aminoácido oxidase de Rhodotorula gracilis comocodificada pelas SEQ ID NOs: 4 ou 6 e

ii) enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade de pelo menos 60% (preferivelmente 70% ou 75%, maispreferivelmente 80% ou 85%, ainda mais preferivelmente 90% ou 95%, omais preferivelmente 98%) com a seqüência como codificada pelas SEQ IDNOs: 4 ou 6 e

iii) enzimas codificadas por uma seqüência de ácido nucléicocapaz de hibridizar (preferivelmente sob condições equivalentes ou iguais àhibridização com uma solução tampão de 30 a (preferivelmente) 35% deformamida, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em IX a 2X SSC(preferivelmente Ix S SC) de 50 a (preferivelmente) 5 5 °C), maispreferivelmente em 40 a (preferivelmente) 45% de formamida, 1,0 M deNaCl, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,5 X a 1 X SSC (preferivelmente0,5x SSC) de 55 a (preferivelmente) 60°C) e o mais preferivelmente em 50%de formamida, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1 χ SSCde 60 a (preferivelmente) 65°C) ao complemento da seqüência descrito pelasSEQ ID NOs: 3 ou 5,

e em que a seleção é feita em um meio que compreende D-alanina e/ou D-serina em uma concentração total de cerca de 0,5 mM a cercade 100 mM, preferivelmente de cerca de 1 mM a cerca de 70 mM, maispreferivelmente de cerca de 2 mM a cerca de 50 mM, o mais preferivelmentede cerca de 3 mM a cerca de 15 mM. Preferivelmente, D-alanina (porexemplo, se utilizada apenas como composto de seleção) é utilizada em umaconcentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 100 mM, preferivelmente decerca de 1 mM a cerca de 70 mM, mais preferivelmente de cerca de 2 mM acerca de 50 mM, o mais preferivelmente de cerca de 3 mM a cerca de 20 mM.

Preferivelmente, D-serina (por exemplo, se utilizada apenas como compostode seleção) é utilizada em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de100 mM, preferivelmente de cerca de 1 mM a cerca de 70 mM, maispreferivelmente de cerca de 2 mM a cerca de 50 mM, o mais preferivelmentede cerca de 3 mM a cerca de 15 mM. O tempo de seleção total sob condiçõesdesdiferenciadoras é preferivelmente de cerca de 1 a 10 semanas,preferivelmente de 2 a 8 semanas, mais preferivelmente de 3 a 4 semanas.

"A mesma atividade" no contexto de uma D-aminoácidooxidase significa a capacidade para metabolizar um espectro amplo de D-aminoácidos (preferivelmente pelo menos D-serina e/ou D-alanina).Metabolização significa a reação de oxidase especificada acima.

Mutantes e derivados das seqüências especificadas tambémpodem compreender enzimas, que são melhoradas em uma ou maiscaracterísticas (Ki, especificidade de substrato etc.) mas ainda compreendema atividade de metabolização com respeito à D-serina e ou D-alanina. Taisseqüências e proteínas também abrangem, seqüências e proteínas derivadas deum procedimento mutagênico e recombinogênicos tais como embaralhamentode DNA. Com um tal procedimento, uma ou mais seqüências codificadorasdiferentes podem ser manipuladas para criar um novo polipeptídeo possuindoas propriedades desejadas. Desta maneira, as bibliotecas de polinucleotídeosrecombinantes são geradas a partir de uma população de seqüênciaspolinucleotídeo relacionadas que compreendem regiões de seqüência que têmidentidade de seqüência substancial e podem ser homologamenterecombinadas in vitro ou in vivo. Os polinucleotídeos que codificam umaenzima candidata, por exemplo, podem ser modulados com protocolos deembaralhamento de DNA. O embaralhamento de DNA é um método paraintroduzir rápida, fácil e eficientemente introduzir mutações ou rearranjos,preferivelmente aleatoriamente, em uma molécula de DNA ou para gerarmudanças de seqüências de DNA entre duas ou mais moléculas de DNA,preferivelmente aleatoriamente. A molécula de DNA que resulta doembaralhamento de DNA é uma molécula de DNA embaralhada que é umamolécula de DNA que não ocorre naturalmente derivada de pelo menos umamolécula de DNA padrão. O DNA embaralhado codifica uma enzimamodificada com respeito à enzima codificada pelo DNA padrão epreferivelmente tem uma atividade biológica alterada com respeito à enzimacodificada pelo DNA padrão. O embaralhamento de DNA pode serfundamentado em um processo de recombinação e mutação recursivas,realizadas pela fragmentação aleatória de uma reunião de genes relacionados,seguida pela remontagem dos fragmentos por um processo equivalente àreação da cadeia da polimerase. Ver, por exemplo, Stemmer 1994 a,b;Crameri 1997; Moore 1997; Zhang 1997; Crameri 1998; US 5.605.793, US5.837.458, US 5.830.721 e US 5.811.238. A enzima equivalente a dsda oudao resultante codificada pelo DNA embaralhado pode possuir seqüências deaminoácido diferentes a partir da versão original de enzima. As faixasexemplares para a identidade de seqüência são especificadas acima.

A enzima que metaboliza D-aminoácido da invenção pode serexpressada no citossol, peroxissoma ou outro compartimento intracelular dacélula vegetal. A compartimentalização da enzima que metaboliza D-aminoácido pode ser obtida fundindo-se a seqüência de ácido nucléico quecodifica o polipeptídeo DAAO com uma seqüência que codifica um peptídeode trânsito para gerar uma proteína de fusão. Os produtos de gene expressadossem tais peptídeos de trânsito no geral acumulam no citossol.

1.1.2 Promotores para as plantas de soja

1.1.2.1 Promotor Geral

O termo "promotor" como aqui usado é intencionado asignificar uma seqüência de DNA que direciona a transcrição de umaseqüência de DNA (por exemplo, um gene estrutural). Tipicamente, umpromotor é localizado na região 5' de um gene, próximo ao sítio de iníciotranscricional de um gene estrutural. Se um promotor é um promotorindutível, então a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agenteindutor. Ao contrário, a taxa de transcrição não é regulada por um agenteindutor se o promotor é um promotor constitutivo. Também, o promotor podeser regulado em uma maneira específica de tecido ou preferida de tecido talque o mesmo seja ativo apenas na transcrição da região codificadoraassociada em um tipo(s) de tecido específico(s) tal(is) como folhas, raízes oumeristema.

O termo "promotor ativo em plantas de soja" significaqualquer promotor, seja derivado ou não de planta, que seja capaz de induzir atranscrição de uma seqüência de nucleotídeo operavelmente ligada em pelomenos uma célula, tecido, órgão ou planta de soja em pelo menos um pontode tempo no desenvolvimento ou sob condições desdiferenciadas. Talpromotor pode ser um promotor não vegetal (por exemplo, derivado de umvírus ou Agrobacteria vegetais) ou um promotor vegetal, preferivelmente umpromotor de planta dicotiledônea. A pessoa habilitada na técnica está cientede diversos promotores que, poderiam ser adequados para o uso em plantas desoja. Neste contexto, a expressão pode ser, por exemplo, constitutiva,indutível ou dependente de desenvolvimento. Os seguintes promotores sãopreferidos:

a) Promotores constitutivos

Promotores "constitutivos" refere-se àqueles promotores quegarantem a expressão em um grande número, preferivelmente todos, detecidos em um período substancial de desenvolvimento vegetal,preferivelmente em todas as vezes durante o desenvolvimento da planta. Osexemplos incluem o promotor 35S de CaMV (vírus mosaico da couve-flor)(Franck 1980; Shewmaker 1985; Gardner 1986; Odell 1985), o promotor 19Sde CaMV (US 5.352.605; WO 84/02913; Benfey 1989), o promotor dasubunidade pequena Rubisco (SSU) (US 4.962.028), o promotor da leguminaB (GenBank Ac. N- X03677), o promotor da nopalina sintase deAgrobacterium, ο promotor duplo TR5 ο promotor da OCS (octopina sintase)de Agrobaeterium, o promotor da álcool cinamílico desidrogenase (US5.683.439), os promotores das subunidades de ATPase vacuolares, opromotor pEMU (Last 1991); o promotor MAS (Velten 1984), o promotor dogene da nitrilase-l da Arabidopsis thaliana (GenBank Ac. N°: U38846,nucleotídeos 3862 a 5325 ou ainda 5342) e outros promotores de genes comexpressão constitutiva em plantas.

Outros promotores constitutivos adequados são os promotoresda actina. As seqüências para diversos promotores da actina de plantasdicotiledôneas estão disponíveis pelas seqüências genômicas divulgadas noGenbank (por exemplo: AY063089 (gene Actin8 da Arabidopsis thaliana)·,AY096381 (gene Actin2 da Arabidopsis thaliana·, AY305730: (gene Actin 8de Gossypium hirsutum); AY305724 (gene Actina 2 de Gossypium hirsutum);AFl 11812 (gene Actin de Brassiea napus)). O uso de seus promotores naexpressão heteróloga é descrita para o promotor de actina da banana(US20050102711). An et ai. [Plant J 1996 10(1): 107-121] relataram que omRNA de Act2 e Act8 foram fortemente expressados em folhas, raízes,hastes, flores, pólen e síliquas. As construções GUS quiméricas expressaram amaioria do tecidos vegetativos mas quase nenhuma expressão foi detectadaem revestimentos de semente, hipocotilos, ginoécias ou sacos de pólen.

b) Promotores específicos de tecido ou preferidos de tecidoAlém disso são preferidos promotores com especificidadesquanto a sementes, tais como, por exemplo, o promotor da faseolina (US5.504.200; Bustos 1989; Murai 1983; Sengupta-Gopalan 1985), o promotordo gene 2S da albumina (Joseffson 1987), o promotor da legumina (Shirsat1989), o promotor da USP (proteína de semente desconhecida) (Bãumlein1991a), o promotor de gene de napina (US 5.608.152; Stalberg 1996), opromotor das proteínas de ligação da sacarose (WO 00/26388) ou o promotorB4 da legumina (LeB4; Bãumlein 1991b; Becker 1992), o promotor daoleosina de Arabidopsis (WO 98/45461) e o promotor Bce4 de Brassica (WO91/13980). Mais preferidos são um promotor específico de folha e induzidopor luz tal como aquele de cab ou Rubisco (Simpson 1985; Timko 1985); umpromotor específico de antera tal como aquele de LAT52 (Twell 1989b); e umpromotor preferido de microsporo tal como aquele de apg (Twell 1983).

c) Promotores quimicamente indutíveis

Os cassetes de expressão também podem conter um promotorquimicamente indutíveis (artigo de revisão: Gatz 1997), por meio dos quais aexpressão do gene exógeno na planta pode ser controlada em um pontoparticular no tempo. Tais promotores tais como, por exemplo, o promotorPRPl (Ward 1993), um promotor indutível pelo ácido salicílico (WO95/19443), um promotor indutível por benzenossulfonamida (EP O 388 186),um promotor indutível por tetraciclina (Gatz 1991; Gatz 1992), um promotorindutível pelo ácido abscísico EP O 335 528) ou um promotor indutível pelaetanol-cicloexanona (WO 93/21334) do mesmo modo podem ser usados.Também adequado é o promotor do gene da glutationa-S transferase isoformaII (GST-II-27), que pode ser ativado pelos protetores exogenamente aplicadostais como, por exemplo, N,N-dialil-2,2-dicloroacetamida (WO 93/01294) eque é operável em um grande número de tecidos tanto de monocotiledôneasquanto de dicotiledôneas. Outros promotores indutíveis exemplares quepodem ser utilizados na presente invenção incluem aqueles do sistema ACElque responde ao cobre (Mett 1993); ou o promotor In2 do milho que respondeaos protetores do herbicida de benzenossulfonamida (Hershey 1991; Gatz1994). Um promotor que responde a um agente indutor ao qual as plantas nãorespondem normalmente pode ser utilizado. Um promotor indutível exemplaré o promotor indutível de um gene do hormônio esteróide, a atividadetranscricional do qual é induzida por um hormônio de glicocorticosteróide(Schena 1991).

Particularmente preferido são os promotores constitutivos.Além disso, os promotores podem ser ligados operavelmente com a seqüênciade ácido nucléico a ser expressada, promotores estes que tornam possível aexpressão em outros tecidos vegetais ou em outros organismos, tais como, porexemplo, nas bactérias E. coli. Os promotores vegetais adequados são, emprincípio, todos os promotores descritos acima.

1.1.2.2 Promotores de seqüência preferidos

Embora vários promotores sejam conhecidos ser funcionais nasoja e sejam adequados para realizar o método da invenção, foi descobertoque especialmente promotores da ubiquitina (especialmente o promotor daubiquitina da salsa) resultam em uma eficiência surpreendentemente alta deseleção. Assim em uma forma de realização preferida o promotor ativo nasoja é um promotor vegetal da ubiquitina. Mais preferivelmente, o promotorvegetal da ubiquitina é o promotor da ubiquitina da salsa (Petroselinumcrispum ou Lomatium foeniculacea) ou o promotor da ubiquitina da soja, maispreferivelmente o promotor da ubiquitina da salsa. Como mencionado acima,especialmente o promotor da ubiquitina da salsa tem sido mostrado seradventício e resultar em eficiência de transformação compativelmente alta. Asrazões para o desempenho superior destes promotores não são conhecidos.Entretanto, é conhecido que a seleção ótima necessita da expressão domarcador de seleção nas células relevantes do tecido alvo (que mais tardedesdiferencia e regenera nas plantas transgênicas), no tempo certo e naconcentração certa (alta o bastante para garantir a seleção eficiente mas nãotão alta para prevenir os efeitos negativos potenciais para as células). Afunção e a eficácia superiores dos promotores da ubiquitina (do promotor daubiquitina da salsa em particular), também podem indicar a necessidade paraas células de soja terem quantidade suficiente da enzima que metaboliza D-alanina e/ou D-serina (por exemplo, as proteínas DSDA ou DAO) que sãoexógenas (não nativa) para a soja, de modo a sobreviver a pressão de seleçãoimposta a elas. Estes efeitos podem ser dependentes de promotor e/oumarcador, de modo que certas combinações de promotores e marcadoressuperem outras. Os promotores da ubiquitina assim podem ser utilizadoscomo promotores padrão para direcionar a expressão da enzima quemetaboliza D-aminoácidos na soja.

As construções fornecidas abaixo são novas e especialmenteúteis para realizar a invenção. Além disso, elas podem fornecer uso tambémem outras espécies vegetais. Em conseqüência, uma outra forma de realizaçãoda invenção diz respeito a uma seqüência de nucleotídeo heteróloga quecompreende

a) um promotor da ubiquitina de uma espécie vegetaldicotiledônea e operavelmente ligada a esta

Diversos promotores da ubiquitina de plantas dicotiledôneassão descritos (Callis 1989, 1990). São descritos promotores de plantasdicotiledôneas, tais como para batata (Garbarino 1992), tabaco (Genschick1994), tomate (Hoffinan 1991), salsa (Kawalleck 1993; WO 03/102198, aquiincorporadas por referência), Arabidopsis (Callis 1990; Holtorf 1995; UBQ8,GenBank Ac. N-: NM_111814; UBQ1, GenBank Ac. Na: NM_115119;UBQ5, GenBank Ac. Na: NM_116090).

No geral, o termo "promotor da ubiquitina" como aqui usadosignifica a região de DNA genômico de até 5000 pares de base (pares de base)a montante do códon de partida ou um sítio de início transcricional mapeado,de um gene da ubiquitina ou equivalente à ubiquitina. Ubiquitina é umpolipeptídeo de 76 aminoácidos abundante encontrado em todas as célulaseucarióticas. Existem diversos genes diferentes que codificam a ubiquitina e asua homologia ao nível de aminoácido é bastante alta. Por exemplo, o serhumano e o camundongo têm muitos genes diferentes que codificam aubiquitina, cada um localizado em um local cromossômico diferente.Funcionalmente, todos os genes da ubiquitina são desempenhadores críticosno mecanismo proteolítico dependente da ubiquitina da célula. Cada gene daubiquitina está associado com um promotor que direciona a sua expressão.Um promotor da ubiquitina é a região de DNA genômico de até 5.000 paresde base a montante do códon de partida ou um sítio de início transcricionalmapeado, de um gene da ubiquitina ou equivalente à ubiquitina. O termo"sistema regulatório da ubiquitina vegetal" refere-se à seqüência denucleotídeo de aproximadamente 2 kb 5' em relação ao sítio de início detradução de um gene da ubiquitina vegetal (preferivelmente da salsa) ecompreende seqüências que direcionam o início de transcrição, regulagem detranscrição, controle do nível de expressão, indução de genes de estresse erealce da expressão em resposta ao estresse. O sistema regulatório, quecompreende as funções tanto promotora quanto reguladora, é a seqüência deDNA que fornece controle regulatório ou modulação da expressão de gene.Conseqüentemente o promotor da ubiquitina de uma dicotiledônea dainvenção é um fragmento de DNA (de modo preferível de aproximadamente0,5 a 2 kb no comprimento), o dito fragmento de DNA que compreende umsistema regulatório da ubiquitina vegetal, em que o dito sistema regulatóriocontém um promotor que compreende um sítio de início de transcrição e -preferivelmente - um ou mais elementos de choque térmico posicionados 5'em relação ao dito sítio de início de transcrição e - preferivelmente - umintron posicionado 3' em relação ao dito sítio de início de transcrição, em queo dito sistema regulatório é capaz de regular a expressão nas sojas.

Preferivelmente, o promotor da ubiquitina é o promotor daubiquitina da salsa ou o promotor da ubiquitina da soja (Glycine max). Asseqüências para a ubiquitina da salsa e da soja são fornecidas abaixo (SEQ IDNO: 5 e 6, respectivamente). As seqüências divulgadas são as quecompreendem a

E conhecido pela pessoa habilitada na técnica que asseqüências promotoras podem ser modificadas (por exemplo, truncado,fundido, mutado) a um grau maior sem significantemente modificar as suaspropriedades de transcrição. Em conseqüência uma outra forma de realizaçãoda invenção diz respeito a uma seqüência de nucleotídeo heteróloga quecompreende um derivado ou fragmento do promotor da ubiquitina da salsa ouda ubiquitina da soja. Estas podem ser seqüências sintéticas (isto é, tal comonão existindo na natureza) ou seqüências ortólogas de outras espéciesvegetais. Assim, uma outra forma de realização da invenção diz respeito auma seqüência de nucleotídeo heteróloga que compreende

a) um promotor selecionado do grupo que consiste de

i) seqüências que compreendem a seqüência como descritopelas SEQ ID NOs: 7 ou 8, e

ii) seqüências que compreendem pelo menos um fragmento depelo menos 50 (preferivelmente 100 ou 150, mais preferivelmente 200 ou250, ainda mais preferivelmente 300 ou 500) pares de base consecutivos daseqüência como descrita pelas SEQ ID NOs: 7 ou 8 e tendo atividadepromotora na soja,

iii) seqüências que compreendem uma seqüência tendo pelomenos 60% (preferivelmente 70% ou 75%, mais preferivelmente 80% ou85%, ainda mais preferivelmente 90% ou 95%, o mais preferivelmente 98%)de identidade com a seqüência como descrita pelas SEQ ID NOs: 7 ou 8 etendo atividade promotora na soja,

iv) seqüências que compreendem uma seqüência hibridizadora(preferivelmente sob condições equivalentes ou iguais à hibridização comuma solução tampão de 30 a (preferivelmente) 35% de formamida, NaCl a 1M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em IX a 2X SSC (preferivelmente IxSSC) de 50 a (preferivelmente) 55°C), mais preferivelmente em 40 a(preferivelmente) 45% de formamida, 1,0 M de NaCl5 SDS a 1% a 37°C euma lavagem em 0,5 X a 1 X SSC (preferivelmente 0,5x SSC) de 55 a(preferivelmente) 60°C) e o mais preferivelmente em 50% de formamida,NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1 χ SSC de 60 a(preferivelmente) 65°C) com a seqüência como descrito pelas SEQ ID NOs: 7ou 8 e tendo atividade promotora na soja,e

b) uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzimacapaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,em que o dito promotor é heterólogo com respeito à ditaseqüência de ácido nucléico.

"Atividade promotora" em plantas de soja significa acapacidade para realizar a transcrição de uma seqüência de ácido nucléicooperavelmente ligada em pelo menos uma célula ou tecido de uma planta desoja ou derivada de uma planta de soja. Preferivelmente isto significa umaatividade de transcrição constitutiva que permite a expressão na maioria dostecidos e na maioria dos estágios desenvolvimentais.

Conseqüentemente o promotor da ubiquitina utilizado dainvenção também pode ser um fragmento do promotor descrito pelas SEQ IDNOs: 7 ou 8 ou um derivado das mesmas. Fragmentos podem incluir versõestrancadas do promotor como descrito pelas SEQ ID NOs: 7 ou 8, em queseqüências não essenciais foram removidas. As seqüências promotorasencurtadas são de alta vantagem visto que elas são mais fáceis de manusear ealgumas vezes otimizadas em seu perfil de expressão de gene. Um meioeficiente, alvejado para preparar promotores encurtados ou trancados contamcom a identificação de elementos regulatórios putativos dentro da seqüênciapromotora. Isto pode ser iniciado pela comparação com as seqüênciaspromotoras conhecidas por serem expressadas em maneira específica detecido ou desenvolvimentalmente única similar. As seqüências, que sãocompartilhadas entre os promotores com padrões de expressão similares, sãocandidatos prováveis para a ligação de fatores de transcrição e são assimelementos prováveis que conferem padrões de expressão. A confirmaçãodestes elementos regulatórios putativos podem ser obtidos pela análise dedeleção de cada região regulatória putativa seguida pela análise funcional decada construção de deleção pelo ensaio de um gene repórter, que éfuncionalmente ligado a cada construção. Como tal, uma vez uma seqüênciapromotora de partida seja fornecida, qualquer um de vários mutantes dedeleção diferentes do promotor de partida pode ser facilmente preparado.Fragmentos funcionalmente equivalentes de um promotor da ubiquitina (porexemplo, como descrito pelas SEQ ID NOs: 7 ou 8) também podem serobtidos pela remoção ou deleção de seqüências não essenciais sem deletar asessenciais. A redução da seqüência de nucleotídeo que regula a transcriçãoaos seus elementos essenciais, que medeiam a transcrição pode ser realizadain vitro pelas mutações de deleção de trial-and-arrow ou in silico usandorotinas de pesquisa de elemento promotor. As regiões essenciais para aatividade promotora freqüentemente demonstram grupos de certos, elementospromotores conhecidos. Tais análises podem ser realizadas usando algoritmosde computador disponíveis tais como PLACE ("Plant Cis-acting RegulatoryDNA Elements"; Higo 1999), a base de dados BIOBASE "Transfac"(Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig; Wingender 2001) ou a basede dados PlantCARE (Lescot 2002). Preferivelmente, fragmentos funcionaisequivalentes de uma das seqüências de nucleotídeo que regulam a transcriçãoda invenção compreendem pelo menos 100 pares de base, preferivelmente,pelo menos 200 pares de base, mais preferivelmente pelo menos 500 pares debase de uma seqüência de nucleotídeo que regula a transcrição como descritopelas SEQ ID NOs: 7 ou 8. Mais preferivelmente este fragmento estácomeçando da extremidade 3' das seqüências indicadas.

Especialmente preferidos são fragmentos equivalentes deseqüências de nucleotídeo que regulam a transcrição, que são obtidos peladeleção da região que codifica a região 5' não traduzida do mRNA, assimapenas fornecendo a região promotora (não transcrita). A região 5' nãotraduzida pode ser facilmente determinada pelos métodos conhecidos natécnica (tais como a análise de 5'-RACE).

Além do promotor da ubiquitina outros promotores mostraramserem adequados para a obtenção de resistência ao D-aminoácido na soja,estes incluem o promotor Actina 2 da Arabidopsis e o promotor nos.Entretanto a eficiência de transformação é significantemente menos eficientedo que com o promotor da ubiquitina.

1.1.3 Elementos Adicionais

Os cassetes de expressão da invenção (ou os vetores em queestes são compreendidos) podem compreender outros elementos funcionais eseqüências de controle genético além do promotor ativo em plantas de soja(por exemplo, o promotor da ubiquitina). Os termos "elementos funcionais"ou "seqüências de controle genético" devem ser entendidos no sentido amploe refere-se a todas estas seqüências, que têm um efeito sobre a materializaçãoou a função do cassete de expressão de acordo com a invenção. Por exemplo,as seqüências de controle genético modificam a transcrição e tradução. Asseqüências de controle genético são descritas (por exemplo, Goeddel 1990;Gruber 1993 e as referências aí citadas).

Preferivelmente, os cassetes de expressão de acordo com ainvenção abrangem um promotor ativo em plantas de soja (por exemplo, opromotor da ubiquitina) 5' a montante da seqüência de ácido nucléico (porexemplo, que codifica a enzima que metaboliza D-aminoácido) e 3' a jusantede uma seqüência terminadora e sinais de poliadenilação e, se apropriado,outros elementos regulatórios habituais, em cada caso operavelmente ligadoscom a seqüência de ácido nucléico a ser expressada.

As seqüências de controle genético e elementos funcionaisalém disso também abrangem as regiões 5' não traduzidas, introns ou região3' não codificadora de genes, tais como, por exemplo, o intron actin-1 ou osintrons Adhl-S 1, 2 e 6 (referência geral: The Maize Handbook, Capítulo 116,Freeling e Walbot, Eds., Springer, Nova Iorque (1994)). Foi demonstrado queestes podem desempenhar um papel significante na regulagem da expressãode gene. Assim, foi demonstrado que as seqüências 5'não traduzidas podemrealçar a expressão transitória de genes heterólogos. Os exemplos derealçadores de tradução que podem ser mencionados são a seqüência líder 5'do vírus mosaico do tabaco (Gallie 1987) e outros. Além disso, estes podempromover a especificidade de tecido (Rouster 1998).

Os sinais de poliadenilação que são adequados comoseqüências de controle genético são sinais de poliadenilação vegetais,preferivelmente aqueles que correspondem essencialmente aos sinais depoliadenilação de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens. Os exemplos deseqüências terminadoras particularmente adequadas são o terminador da OCS(octopina sintase) e o terminador da NOS (nopalina sintase).

O componente genético e/ou cassete de expressão da invençãopodem compreender outros elementos funcionais. Elementos funcionaispodem incluir por exemplo (mas não devem ser limitados a) marcadores degene selecionáveis ou triáveis (além das enzimas que metabolizam D-alaninaou D-serina). Os marcadores selecionáveis e triáveis podem incluir

a) marcadores de seleção negativos; isto é, marcadores queconferem uma resistência a um composto biocida tal como um inibidormetabólico (por exemplo, 2-desoxiglicose-6-fosfato, WO 98/45456),antibióticos (por exemplo, canamicina, G418, bleomicina ou higromicina) ouherbicidas (por exemplo, fosfinotricina ou glifosato). Os marcadores deseleção negativos especialmente preferidos são aqueles que conferemresistência aos herbicidas (ver abaixo na seção Co-transformação paradetalhes).b) os marcadores de seleção positivos; isto é, marcadores queconferem uma vantagem de crescimento a uma planta transformada emcomparação com uma não transformada tal como os genes e métodosdescritos por Ebinuma et ai. 2000a,b e na EP-A 0 601 092.

c) Contra marcadores de seleção; isto é, marcadores adequadospara selecionar organismos com seqüências deletadas definidas quecompreendem o dito marcador (Koprek 1999). Os exemplos compreendem acitosina desaminase codA (Schlaman 1997).

d) Genes repórteres; isto é, marcadores que codificamproteínas facilmente quantificáveis (por intermédio de cor ou atividade deenzima; Schenborn 1999). Preferidas são a proteína fluorescente verde (GFP)(Sheen 1995; Haseloff 1997; Reichel 1996; Tian 1997; WO 97/41228; Chui1996; Leffel 1997) e β-glicuronidase (GUS) sendo muito especialmentepreferido (Jefferson 1987a,b).

Os elementos funcionais que podem ser compreendidos em umvetor da invenção incluem

i) Origens de replicação que garantem a replicação doscassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, por exemplo, naE. coli. Os exemplos que podem ser mencionados são ORI (origem dereplicação de DNA), a pBR322 ori ou a P15A ori (Maniatis, 1989),

ii) Sítios de clonagem múltipla (MCS) para permitir e facilitara inserção de uma ou mais seqüências de ácido nucléico,

iii) Seqüências que tornam possível a recombinação homóloga,deleção ou inserção de marcador no genoma de um organismo hospedeiro. Osmétodos fundamentados no cre/lox (Sauer 1998; Odell 1990; Dale 1991),FLP/FRT (Lysnik 1993) ou sistema Ac/Ds (Wader 1987; US 5.225.341;Baker 1987; Lawson 1994) permitem - se apropriado específico e/ou indutívelde tecido - uma remoção de uma seqüência de DNA específica do genoma doorganismo hospedeiro. As seqüências de controle podem neste contextosignificar as seqüências flanqueadoras específicas (por exemplo, seqüênciaslox), que mais tarde permitem a remoção (por exemplo, por meio da crerecombinase) (ver também pedido de patente internacional PCT/EP2005/002734; WO 2005/090581)),

iv) Elementos, por exemplo seqüências de borda, que tornampossível a transferência mediada por Agrobacterium em células vegetais paraa transferência e integração no genoma vegetal, tal como, por exemplo, aborda direita ou esquerda do T-DNA ou da região vir.

1.2. O segundo cassete de expressão

Preferivelmente, a construção de DNA inserido no genoma daplanta alvo compreende pelo menos um segundo cassete de expressão, queconfere à planta de soja um traço agronomicamente relevante. Isto pode serobtido pela expressão de marcadores de seleção, genes de traço, RNA anti-sentido ou RNA de filamento duplo. A pessoa habilitada na técnica está cientede numerosas seqüências que podem ser utilizadas neste contexto, porexemplo, para aumentar a qualidade de alimento e ração, produtos químicos,produtos químicos finos ou produtos farmacêuticos (por exemplo, vitaminas,óleos, carboidratos; Dunwell 2000), que confere resistência aos herbicidas ouque confere esterilidade masculina. Além disso, os fatores de crescimento,rendimento e resistência contra estresse abiótico e biótico (como por exemplo,fungos, vírus ou insetos) podem ser realçados. As propriedades vantajosaspodem ser conferidas pelas proteínas de supra-expressão ou diminuindo-se aexpressão de proteínas endógenas por exemplo, expressando-se um anti-sentido correspondente (Sheehy 1988; US 4.801.340; Mol 1990) ou RNA defilamento duplo (Matzke 2000; Fire 1998; Waterhouse 1998; WO 99/32619;WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035;WO 00/63364).

Para a expressão destas seqüências todos os promotoresadequados para a expressão de genes na soja podem ser utilizados.Preferivelmente, a dita segunda construção de expressão não estácompreendendo um promotor que seja idêntico ao promotor usado paraexpressar a enzima que metaboliza D-aminoácido. A expressão pode ser, porexemplo, constitutiva, indutível ou dependente de desenvolvimento. Váriospromotores são conhecidos para a expressão em dicotiledôneas tais como asoja são conhecidos na técnica (ver acima para os detalhes).

2. O método de transformação e seleção da invenção

2.1 Fonte e preparação do material vegetal

Vários materiais vegetais podem ser utilizados para oprocedimento de transformação aqui divulgados. Tal material vegetal podeincluir mas não é limitado por exemplo a folha, raiz, embriões imaturos emaduros, pólen, tecidos meristemáticos, inflorescências, calo, protoplastos oususpensões de células vegetais.

O material de planta para a transformação pode ser obtido ouisolado virtualmente a partir de qualquer variedade de soja ou planta.Especialmente preferidas são as plantas de soja selecionadas do grupo queconsiste de Jack, Resnik, Williams 82, Corsoy, Crawford, Hutcheson, Kunitze Champ. As variedades de soja adequadas adicionais estão disponíveis deinstituições tanto acadêmicas quanto comerciais, tais como - por exemplo - aUniversity of Guelph (Ontario Agricultural College; por exemplo, variedadesde soja RCAT Staples, Westag 97, RCAT Bobcat, OAC Prudence, OACWoodstock, OAC 9908) ou variedades de soja da Dariland ou Soygenetics.As variedades adequadas adicionais são PI548402 (Peking), PI437654 (Er-hejjan), PI438489 (Chiquita), PI507354 (Tokei 421), PI548655 (Forrest),PI548988 (Pickett), PI88788, PI404198 (Sun Huan Do), PI404166(Krasnoaarmejkaja), Hartwig, Manokin, Doles, Dyer e Custer.

Embora diversos métodos de transformação e regeneraçãofundamentados nos diferentes explantes de soja sejam descritos na técnica(por exemplo, com base nos nós cotiledonário), que são todos bemconhecidos pela pessoa habilitada na técnica, o método da invenção épreferivelmente fundamentado no tecido meristemático axilar, que maispreferivelmente é derivado do primeiro nó de folha ou no mais alto de umaplanta de soja. O tecido meristemático axilar do nodo primário ou superiorpode ser fornecido por um meristema axilar da muda e utilizado na etapa detransformação subseqüente (por exemplo, co-cultivo de Agrobacterium).

Preferivelmente, o método da invenção compreende asseguintes etapas

(a) fornecer um tecido meristemático axilar de um nodo defolha primário ou mais alto de uma muda de soja e

(b) co-cultivar o dito tecido meristemático axilar com umabactéria Rhizobiaceae que compreende um T-DNA transgênico, o dito T-DNA transgênico compreendendo uma construção de DNA que compreendapelo menos uma primeira construção de expressão que compreende umpromotor ativo na dita planta de soja e operavelmente ligada a esta umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capaz para metabolizarD-alanina e/ou D-serina

(ii) D-alanina e/ou D-serina e/ou um derivado das mesmas emuma concentração total de cerca de 3 mM a cerca de 100 mM, e

(iii) opcionalmente um ou mais antibióticos adequados parainibir o crescimento das bactéria Rhizobiaceae,e cultivar o dito tecido meristemático axilar co-cultivado porum período de pelo menos 5 dias no dito meio até que os brotos sejaminduzidos e desenvolvidos a partir destes e isolar os ditos brotos, e(d) transferir os ditos brotos isolados para um meio deenraizamento e cultivar os ditos brotos no dito meio de enraizamento até queos ditos brotos tenham formado raízes e ainda regenerar as mudas assimderivadas em plantas maduras, que compreende inserir no seu genoma o ditoT-DNA transgênico.

O método com base no tecido meristemático axilar podeutilizar tecido e/ou células de explante de várias fontes, preferivelmente denodos de folha primária ou superior. Um nodo de folha primária é o nodo(isto é, o ponto em uma haste onde uma folha é ligada ou foi ligada)diretamente seguinte ao nodo cotiledonário (isto é, o ponto em uma hasteonde uma folha cotiledonária é ligada ou foi ligada) quando do movimento nadireção da raiz para as folhas. Os nodos de folha mais alta são todos os nodosde folha seguintes ao nodo de folha primária tais como por exemplo os nodosde folhas secundárias, terciárias, quaternárias etc.. Preferido é o tecidomeristemático axilar do nodo de folha primária.

Preferivelmente, o tecido meristemático axilar do nodoprimário ou superior é fornecido em uma forma selecionado do grupo queconsiste de:

i) o meristema axilar da muda como fornecidosubstancialmente pela muda inteira e

ii) o meristema axilar da folha como fornecido dissecando-seas folhas primárias ou superiores em um modo que o tecido meristemáticoaxilar permaneça ligado aos pecíolos das folhas, e

iii) meristemas axilares propagados.

O tecido meristemático axilar do nodo primário ou superiorpode ser fornecido e utilizado em várias formas na etapa de co-cultivo comAgrobacterium subseqüente:

a) Método A: Meristema axilar da muda: A muda inteira ouuma parte substancial desta (tal como as mudas menos as raízes ou a mudasem um ou ambos os cotilédones) podem ser utilizados, inoculados comAgrobacterium e colocados em meio de indução de broto (SIM).Preferivelmente a muda substancialmente inteira é selecionada do grupo dematerial que consiste de

i) uma muda inteira, e

ii) uma muda tendo as raízes removidas e

iii) uma muda tendo um ou ambos os cotilédones removidos, e

iv) uma muda tendo as raízes e um ou ambos os cotilédonesremovidos, e

v) um muda tendo as raízes, ambos os cotilédones e parte doepicótilo removido deixando os meristemas axilares ligados à parte doepicótilo.

b) Método B: Meristema axilar da folha: As folhas primáriasou superiores são dissecadas em um modo que o tecido meristemático axilarpermaneça ligado aos pecíolos das folhas, imerso em (inoculado com) soluçãode Agrobaeterium, co-cultivado no meio de co-cultivo e colocado no meio deindução de broto (SIM). O tamanho pequeno do explante e o crescimentovigoroso de brotos devem ser favoráveis para a seleção de célulastransformadas, que é problemática em metodologias de transformaçãocorrentes.

c) Método C: Meristemas axilares Propagados: A partir deuma muda de 7 dias de idade germinada (preferivelmente em torno disso) ohipocótilo e um e meio ou parte de ambos os cotilédones são removidos decada muda. As mudas são depois colocadas no meio de propagação por 2 a 4semanas. As mudas produzem diversos brotos ramificados para obterexplantes. Os nodos axilares do primeiro até o quarto nodo de folha podemser excisados. Uma média de três a quatro explantes podem ser obtidos decada muda.

Além das fontes salientadas acima, outras fontes podem seradequadas para o tecido meristemático axilar. Estas fontes por exemplopodem ser explantes mais restritos derivados de um muda de soja tal comoapenas o epicótilo e o nodo de folha primária. Obviamente tais explantesrestritos (isto é, pequenos) podem ser obtidos do nodo primário mas tambémde nodos superiores (por exemplo, nodos secundários e superiores).

O período de tempo requerido para este método éenormemente reduzido comparado com outros protocolos de transformaçãomediados por Agrobacterium. Os brotos de soja fenotipicamente positivosviáveis podem ser coletados 4 a 6 semanas do início do procedimento. Alémdisso, o método da invenção é altamente independente do genótipo e cultivar.

O material de partida para o processo de transformação énormalmente uma semente de soja. A semente é primeiro esterilizada -opcionalmente - embebida para amaciar. As sementes são depois colocadasno meio de germinação e germinadas por um período de tempo de cerca de 4a 10 dias, preferivelmente por cerca de 5 a 8 dias e o mais preferivelmente porcerca de 7 dias. O epicótilo é preferivelmente de cerca de 0,5 cm nestemomento para meristema axilar propagado e métodos de meristema axilar dafolha e no geral de 0,5 a 2 cm para o método de meristema axilar da muda.Preferivelmente a germinação é realizada sob condição de luz alta (>100 μΜmV) a 25°C.

2.2 Procedimentos de Transformação

2.2.1 Técnicas Gerais

Uma construção de DNA de acordo com a invenção pode servantajosamente introduzida em células usando vetores nos quais a ditaconstrução de DNA é inserida. Os exemplos de vetores podem ser deplasmídeos, de cosmídeos, de fagos, de vírus, retro vírus ou Agrobaeteria. Emuma forma de realização vantajosa, o cassete de expressão é introduzido pormeio de vetores plasmídicos. Os vetores preferidos são aqueles, quepossibilitam a integração estável do cassete de expressão no genomahospedeiro.

A construção de DNA pode ser introduzida nas célulasvegetais e/ou organismos alvo por qualquer um dos diversos meiosconhecidos por aqueles de habilidade na técnica, um procedimento que échamado de transformação. Vários procedimentos de transformaçãoadequados para a soja foram descritos.

Por exemplo, as construções de DNA podem ser introduzidasdiretamente nas células vegetais usando métodos balísticos, tais como obombardeamento de partícula de DNA ou a construção de DNA pode serintroduzida usando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de umacélula. As técnicas de transformação mediadas por partícula (tambémconhecidas como "biolísticas") são descritas, por exemplo, na EP-Al270.356; US 5.100.792, EP-A-444 882, EP-A-434 616; Klein 1987; Vasil1993; e Becker 1994). Estes métodos envolvem a penetração das células pelaspartículas pequenas com o ácido nucléico dentro da matriz de pérolas oupartículas pequenas ou na superfície. A Pistola de Gene PDS-1000 biolística(Biorad, Hercules, CA) usa pressão de hélio para acelerar micro-carregadoresde ouro ou tungstênio revestidos de DNA na direção das células alvo. Oprocesso é aplicável a uma ampla faixa de tecidos e células de organismos,incluindo plantas. Os outros métodos de transformação também sãoconhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Outras técnicas incluem microinjeção (WO 92/09696, WO94/00583, EP-A 331 083, EP-A 175 966, Green 1987), transformaçãomediada por polietileno glicol (PEG) (Paszkowski 1984; Lazzeri 1995),liberação de gene com base em lipossoma (WO 93/24640; Freeman 1984),eletroporação (EP-A 290 395, WO 87/06614; Fromm 1985; Shimamoto1992).

No caso de injeção ou eletroporação de DNA em célulasvegetais, a construção de DNA a ser transformada não precisa atingirnenhuma exigência particular (de fato os cassetes de expressão "nus" podemser utilizados). Os plasmídeos simples tais como aqueles da série pUC podemser usados.

2.2.2 Transformação mediada por bactéria transportada pelosolo (co-cultivo)

Além disso e preferido para estas técnicas de transformação"direta", a transformação também pode ser realizada pela infecção bacterianapor meio de bactérias transportadas pelo solo tais como Agrobacteriumtumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes.

2.2.2.1 Escolha de cepas, vetores e condições de co-cultivo

As bactérias transportadas pelo solo utilizadas para atransferência de um DNA (por exemplo, T-DNA) no genoma da soja pode serqualquer espécie da família Rhizobiaeeae. A família Rhizobiaeeaecompreende os gêneros Agrobaeterium, Rhizobium, Sinorhizobium eAllorhizobium são gêneros dentro da família bacteriana e foram incluídos nasubclasse alfa-2 de Proteobactérias com base nas características ribossômicas.

Os membros desta família são aeróbicos, Gram-negativos. As células sãonormalmente na forma de bastão (0,6 a 1,0 μηι por 1,5 a 3,0 μιη), ocorremisoladamente ou aos pares, sem endosporo e são capazes de moverem-se porum a seis flagelos peritríquios. Muco polissacarídeo extracelular considerávelé usualmente produzido durante o crescimento no meio contendo carboidrato.Especialmente preferido são Rhizobiaeeae tais como Sinorhizobium meliloti,Sinorhizobium medieae, Sinorhizobium fredii, Rhizobium sp. NGR234,Rhizobium sp. BR816, Rhizobium sp. N33, Rhizobium sp. GRH2,Sinorhizobium saheli, Sinorhizobium terangae, Rhizobium leguminosarumbiovar trifolii, Rhizobium leguminosarum biovar vieiae, Rhizobiumleguminosarum biovar phaseoli, Rhizobium tropiei, Rhizobium etli,Rhizobium galegae, Rhizobium gallieum, Rhizobium giardinii, Rhizobiumhainanense, Rhizobium mongolense, Rhizobium lupini, Mesorhizobium loti,Mesorhizobium huakuii, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobiummediterraneium, Mesorhizobium tianshanense, Bradyrhizobium elkanni,Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium liaoningense, Azorhizobiumcaulinodans, Allobactéria undicola, Phillobactéria myrsinacearum,Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Agrobacteriumrhizogenes, Agrobacterium vitis e Agrobaeterium rubi. Preferidas também sãoas cepas e método descritos em Broothaerts (2005).

A natureza monofilética da Agrobacterium, Allorhizobium eRhizobium e sua circunscrição genérica fenotípica comum sustentam a suaamalgamação em um único gênero, Rhizobia. A classificação e caracterizaçãodas cepas de Agrobaeterium incluindo a diferenciação de Agrobacteriumtumefaciens e Agrobaeterium rhizogenes e suas várias classes tipo opina éuma prática bem conhecida na técnica (ver por exemplo Laboratory guide foridentification of plant patogenic bactéria, 3a edição. (2001) Schaad, Jones eChun (eds.) ISBN 0890542635; por exemplo o artigo de Moore et ai. aípublicado). Análises recentes demonstram que a classificação pelas suaspropriedades patogênicas vegetais podem não ser justificadas.Conseqüentemente métodos mais avançados fundamentados na análise ecomparação do genoma (tal como o seqüenciamento do 16S rRNA; RFLP,Rep-PCR, etc.) são utilizados para elucidar as relações das várias cepas (verpor exemplo Young 2003, Farrand 2003, de Bruijn 1996, Vinuesa 1998). Asrelações filogenéticos de membros do gênero Agrobacterium por doismétodos demonstrando que as relações das cepas K599 de Agrobaeterium sãoapresentadas em Llob 2003.

E conhecido na técnica que não apenas a Agrobaeterium mastambém outras bactérias transportadas pelo solo são capazes de mediar atransferência de T-DNA contanto que eles os elementos funcionais relevantespara a transferência de T-DNA de um plasmídeo Ti ou Ri (Klein & Klein1953; Hooykaas 1977; van Veen 1988).Preferivelmente, a bactéria transportada pelo solo é do gêneroAgrobacteria. O termo iiAgrobacterium" como aqui usado refere-se a umabactéria fitopatogênica transportada pelo solo, Gram-negativa, na forma debastão. As espécies de Agrobacterium, Agrobacterium tumefaciens (syn.Agrobacterium radiobacter), Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubie Agrobacterium vitis, junto com Allorhizobium undicola, formam um grupomonofilético com todas as espécies de Rhizobium, com base na análise de 16SrDNA comparativa (Sawada 1993, Young 2003). A Agrobacterium é umgênero artificial que compreende espécies patogênicas vegetais.

O termo plasmídeo Ti como aqui usado está se referindo a umplasmídeo, que é replicável em Agrobacterium e está na sua forma natural,"armada" que medeia a galha da copa em plantas infectadas comAgrobacterium. A infecção de um célula vegetal com uma forma natural,"armada" de um plasmídeo Ti de Agrobacterium no geral resulta na produçãode opinas (por exemplo, nopalina, agropina, octopina etc.) pela célulainfectada. Assim, as cepas de Agrobacterium que causam a produção denopalina (por exemplo, cepa LBA4301, C58, A208) são aludidas comoAgrobacteria tipo "nopalina"; as cepas de Agrobacterium que causam aprodução de octopina (por exemplo, cepa LBA4404, Ach5, B6) são aludidascomo Agrobacteria "tipo octopina"; e as cepas de Agrobacterium que causama produção de agropina (por exemplo, cepa EHA105, EHA101, A281) sãoaludidas como Agrobacteria "tipo agropina". Um plasmídeo Ti desarmado éentendido como um plasmídeo Ti que carece das suas propriedades de mediara galha da copa mas de outro modo fornecendo as funções para a infecção deplanta. Preferivelmente, a região de T-DNA do dito plasmídeo "desarmado"foi modificada em um modo, que além das seqüências de borda nenhuma dasseqüências Ti funcionais internas podem ser transferidas no genoma vegetal.Em uma forma de realização preferida - quando usada com um sistema devetor binário - a região de T-DNA inteira (incluindo as bordas de T-DNA) édeletada.

O termo plasmídeo Ri como aqui usado está se referindo a umplasmídeo, que é replicável na Agrobacterium e está na sua forma natural,"armada" que medeia a doença da raiz pilosa nas plantas infectadas porAgrobaeterium. A infecção de uma célula vegetal com uma forma natural,"armada" de um plasmídeo Ri de Agrobaeterium no geral resulta na produçãode opinas (derivados de amino açúcar específicos produzidos nas célulasvegetais transformadas tais como por exemplo, agropina, cucumopina,octopina, miquimopina etc.) pela célula infectada. As cepas de Agrobaeteriumrhizogenes são tradicionalmente distinguidas em subclasses do mesmo modoque as cepas de A. tumefaeiens são. As cepas mais comuns são as cepas dotipo agropina (por exemplo, caracterizadas pelo plasmídeo Ri pRi-A4), ascepas do tipo manopina (por exemplo, caracterizadas pelo plasmídeo RipRi8196) e as cepas do tipo cucumopina (por exemplo, caracterizadas peloplasmídeo Ri pRi2659). Algumas outras cepas são do tipo miquimopina (porexemplo, caracterizadas pelo plasmídeo Ri pRil723). Miquimopina ecucumopina são estéreo isômeros mas nenhuma homologia foi encontradaentre os plasmídeos pRi ao nível de nucleotídeo (Suzuki 2001). Umplasmídeo Ri desarmado é entendido como um plasmídeo Ri que carece dassuas propriedades de mediar a doença da raiz pilosa mas de outro modofornecendo as funções para a infecção da planta. Preferivelmente, a região deT-DNA do dito plasmídeo Ri "desarmado" foi modificado em um modo, quealém das seqüências de borda nenhuma seqüência Ri interna funcional podeser transferida no genoma da planta. Em uma forma de realização preferida -quando usada com um sistema de vetor binário - a região de T-DNA inteira(incluindo as bordas T-DNA) é deletada.

Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaeiens e A. rhizogenes,respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética daplanta (Kado 1991). Os vetores são fundamentados nos plasmídeos Ti ou Ride Agrobacterium e utilizam um sistema natural de transferência de DNA nogenoma vegetal. Como parte deste parasitismo altamente desenvolvido aAgrobaeterium transfere uma parte definida da sua informação genômica (oT-DNA; flanqueado por repetições de cerca de 25 pares de base, chamadas deborda esquerda e direita) no DNA cromossômico da célula vegetal (Zupan2000). Pela ação combinada dos chamados genes vir (parte dos plasmídeos Tioriginais) a dita transferência de DNA é mediada. Para a utilização destesistema natural, plasmídeos Ti foram desenvolvidos que carecem dos genesque induzem o tumor original ("vetores desarmados"). Em um outromelhoramento, os chamados "sistemas de vetor binário", o T-DNA foifisicamente separado dos outros elementos funcionais do plasmídeo Ti (porexemplo, os genes vir), por estarem incorporados em um vetor transportador,que permitiu o manuseio mais fácil (EP-A 120 516; US 4.940.838). Estesvetores binários compreendem (além do T-DNA desarmado com as suasseqüências de borda), seqüências procarióticas para a replicação tanto naAgrobaeterium quanto na E. eoli. E uma vantagem da transformação mediadapela Agrobaeterium que no geral apenas o DNA flanqueado pelas bordas étransferido no genoma e que preferencialmente apenas uma cópia é inserida.Descrições de sistemas de vetor de Agrobaeterium e métodos para atransferência de gene mediada por Agrobaeterium são conhecidos na técnica(Miki 1993; Gruber 1993; Moloney 1989).

Por este motivo, para a transformação mediada porAgrobaeteria a composição genética (por exemplo, que compreende umcassete de expressão) é integrada em plasmídeos específicos, em um vetortransportador ou intermediário ou em um vetor binário. Se um plasmídeo Tiou Ri deve ser usado para a transformação, pelo menos a borda direita, mas namaioria dos casos as bordas direita e esquerda, do T-DNA do plasmídeo Ti ouRi é ligada ao cassete de expressão a ser introduzido na forma de uma regiãoflanqueadora. Vetores binários são preferivelmente usados. Os vetoresbinários são capazes de replicação tanto na E. coli quanto na Agrobacteria.Estes podem compreender um gene marcador de seleção e um ligador oupoliligador (para a inserção por exemplo, do cassete de expressão a sertransferido) flanqueado pelas seqüências de borda de T-DNA direita eesquerda. Estas podem ser transferidas diretamente em Agrobacterium(Holsters 1978). O gene marcador de seleção permite a seleção deAgrobacteria transformadas e é, por exemplo, o gene nptll, que confereresistência à canamicina. A Agrobacterium que atua como o organismohospedeiro neste caso já deve conter um plasmídeo com a região vir. A últimaé requerida para transferir o T-DNA para a célula vegetal. UmaAgrobacterium transformada deste modo pode ser usado para transformarcélulas vegetais. O uso de T-DNA para transformar células vegetais foiestudado e descrito intensivamente (EP 120 516; Hoekema 1985).

Os vetores binários comuns são fundamentados em plasmídeosda "faixa de hospedeiros ampla" como pRK252 (Bevan 1984) ou pTJS75(Watson 1985) derivados do plasmídeo tipo P RK2. A maioria destes vetoressão derivados de pBIN19 (Bevan 1984). Vários vetores binários sãoconhecidos, alguns dos quais são comercialmente disponíveis tais como, porexemplo, pBI101.2 ou pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA). Os vetoresadicionais foram melhorados com respeito ao tamanho e manuseio (porexemplo, pPZP; Hajdukiewicz 1994). Sistemas de vetor melhorados sãodescritos também na WO 02/00900.

Preferivelmente a bactéria transportada pelo solo é umabactéria pertencente à família Agrobacterium, mais preferivelmente uma cepade Agrobacterium tumefaeiens ou rhizogenes desarmada. Em uma forma derealização preferida, as cepas de Agrobaeterium para o uso na prática dainvenção incluem cepas de octopina, por exemplo, LBA4404 ou cepas deagropina, por exemplo, EHAlOl ou EHA105. As cepas adequadas de A.tumefaeiens para a transferência de DNA são por exemploEHAlOl [ρΕΗΑΙΟΙ] (Hood 1986), EHA105[pEHA105] (Li 1992),LBA4404[pAL4404] (Hoekema 1983), C58Cl[pMP90] (Koncz & Schell1986) e C58Cl[pGV2260] (Deblaere 1985). Outras cepas adequadas sãoAgrobacterium tumefaciens C58, uma cepa de nopalina. Outras cepasadequadas são A. tumefaciens C58C1 (Van Larebeke 1974), Al36 (Watson1975) ou LBA4011 (Klapwijk 1980). Em uma outra forma de realizaçãopreferida a bactéria transportada pelo solo é uma variante de cepa desarmadade Agrobacterium rhizogenes cepa K599 (NCPPB 2659). Tais cepas sãodescritas no Pedido provisório US Pedido N2 60/606.789, depositado em 2 deSetembro de 2004 e pedido internacional PCT/EP2005/009366 por meio destetotalmente incorporadas por referência.

Um vetor binário ou qualquer outro vetor pode ser modificadopelas técnicas de recombinação de DNA comuns, multiplicado na E. coli eintroduzido em Agrobaeterium por exemplo, pela eletroporação ou outrastécnicas de transformação (Mozo 1991).

Agrobaeteria são cultivadas e usadas em uma maneira comoconhecida na técnica. O vetor que compreende a cepa de Agrobaeterium, porexemplo, pode ser cultivada por 3 dias em meio YEP (5 g/l de extrato delevedura, 10 g/l de peptona, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de ágar, pH 6,8; ver oExemplo 2) suplementada com o antibiótico apropriado (por exemplo, 50mg/l de espectinomicina). As bactérias são coletadas com uma alça do meiosólido e recolocadas em suspensão. Em uma forma de realização preferida dainvenção, as culturas de Agrobaeterium são iniciadas pelo uso de alíquotascongeladas a -80°C. Para o tratamento por Agrobaeterium dos vários tecidosde explantes de meristema axilar da soja, as bactérias são preferivelmenterecolocadas em suspensão no meio de co-cultivo (CCM). A concentração deAgrobaeterium usada para a infecção, tempo de contato direto e co-cultivopodem necessitar ser variados. Assim, no geral uma faixa de concentrações deAgrobaeterium de OD60Q 0,1 a 3,0. Preferivelmente para os vários explantesde tecido meristemático axilar as seguintes concentrações de suspensões deAgrobacterium são utilizadas:

a) Método A (meristema axilar da muda): De cerca de OD600 =0,5 a cerca de 3, preferivelmente de cerca de OD600 = 1 a 2.

b) Método B (meristema axilar da folha): De cerca de OD600 =0,1 a cerca de 1, preferivelmente de cerca de OD600 = 0,125 a 0,5.

c) Método C (meristemas axilares propagados): De cerca deOD60O = 0,2 a cerca de 1,5, preferivelmente de cerca de OD600 = 0,5 a 0.8.

Os explante.s são depois inoculados com a cultura deAgrobaeterium por uns poucos minutos a umas poucas horas, tipicamentecerca de 10 minutos a 3 horas, preferivelmente de cerca de 0,5 horas a 1 hora.O meio em excesso é drenado e a Agrobaeterium é permitida co-cultivar como tecido de meristema por cerca de 1 a cerca de 6 dias, preferivelmente decerca de 3 a cerca de 5 dias para as cepas de Agrobaeterium tumefaeiens e decerca de 2 a cerca de 3 dias para as cepas de Agrobaeterium rhizogenes,preferivelmente no escuro. Durante esta etapa, a Agrobaeterium transfere aconstrução genética estranha em algumas células nos meristemas axilares dasoja. Normalmente nenhum composto de seleção está presente durante estaetapa.

2.2.2.2 Modificações para realçar a eficiência detransformação

A suplementação do meio de co-cultura com inibidores deetileno (por exemplo, nitrato de prata), compostos que absorvem fenol (comopolivinilpirrolidona, Perl 1996) ou antioxidantes (tais como compostos de tiol,por exemplo, ditiotreitol, L-cisteína, Olhofl 2001) que podem diminuir anecrose de tecido devido às respostas de defesa da planta (como a oxidaçãofenólica) podem melhorar ainda mais a eficiência da transformação mediadapela Agrobaeterium.

A suplementação do meio de co-cultivo com antioxidantes(por exemplo, ditiotreitol) ou compostos de tiol (por exemplo, L-cisteína,Olhofl 2001; US2001034888) que pode diminuir a necrose de tecido devidoàs respostas de defesa da planta (como a oxidação fenólica) pode melhorarainda mais a eficiência da transformação mediada pela Agrobacterium. Emuma outra forma de realização preferida, o meio de co-cultivo compreendepelo um composto de tiol, preferivelmente selecionado do grupo que consistede tiolsulfato de sódio, ditiotrietol (DTT) e cisteína. Preferivelmente aconcentração está entre cerca de 1 mM e 10 mM de L-Cisteína, 0,1 mM a 5mM de DTT, e/ou 0,1 mM a 5 mM de tiolsulfato de sódio.

O tecido alvo e/ou as Agrobacteria podem ser tratados comum composto fenólico antes ou durante o co-cultivo com Agrobacterium. Os"compostos fenólicos vegetais" ou "fenólicos vegetais" adequados dentro doescopo da invenção são aquelas moléculas fenólicas substituídas isoladas quesão capazes de induzir uma resposta quimiotática positiva, particularmenteaquelas que são capazes de induzir a expressão de gene vir aumentada emuma Agrobaeterium sp. contendo plasmídeo Ti, particularmente umaAgrobaeterium tumefaeiens contendo plasmídeo Ti. Um composto fenólicovegetal preferido é a acetosseringona (3,5-dimetóxi-4-hidroxiacetofenona).Certos compostos, tais como osmoprotetores (por exemplo, L-prolinapreferivelmente a uma concentração de cerca de 200 a 1000 mg/L ou betaína),fito-hormônios (inter alia NAA), opinas ou açúcares, atuam sinergisticamentequando adicionados em combinação com compostos fenólicos vegetais.

Condições de indução particularmente adaptadas paraAgrobacterium tumefaeiens foram descritas (Vernade 1988). A eficiência detransformação com Agrobaeterium pode ser realçada por numerosos outrosmétodos conhecidos na técnica como por exemplo infiltração a vácuo (WO00/58484), de choque térmico e/ou centrifugação, adição de nitrato de prata,sonificação etc.

Preferivelmente o método da invenção compreende uma oumais etapas adicionais selecionadas do grupo de:

(al) danificar o explante antes, durante ou imediatamentedepois do co-cultivo, e

(bl) transferir o dito tecido meristemático axilar co-cultivadodepois da etapa (b) a um meio que compreende pelo menos um antibióticoadequado para inibir o crescimento de Agrobacterium e - opcionalmente -pelo menos um fator de crescimento vegetal, em que o dito meiopreferivelmente está carecendo de D-alanina e/ou D-serina ou um derivadodas mesmas em uma concentração fitotóxica, e,

(b2) incubar ainda o dito tecido axilar, meristemático depoisda etapa (b) e - opcionalmente (bl) - em um meio de indução de broto (SIM)que compreende pelo menos um fator de crescimento vegetal, em que o ditomeio de indução de broto preferivelmente está carecendo de D-alanina e/ouD-serina ou um derivado das mesmas em uma concentração fitotóxica, e

(cl) transferir os ditos brotos depois da etapa (c ou b2) paraum meio de alongamento de broto que compreende

(i) pelo menos um fator de crescimento vegetal em umaconcentração adequada para permitir o alongamento de broto e

(ii) opcionalmente D-alanina e/ou D-serina ou um derivadodas mesmas em uma concentração total de cerca de 3 a cerca de 100 mM,e cultivar os ditos brotos transferidos no dito meio dealongamento de broto até que os ditos brotos tenham se alongado a umcomprimento de pelo menos cerca de 2 cm.

Em uma forma de realização preferida da invenção, o tecidomeristemático axilar é ferido (etapa (al). O ferimento parece ter pelo menosdois efeitos realçadores sobre o método da invenção:

(i) o ferimento facilita a infecção pela Agrobacterium e aeficiência de transferência de gene,

(ii) o ferimento realça a eficiência da indução de broto de novopresumivelmente pelo rompimento da conexão do tecido meristemáticoaumentando significantemente o número de brotos que se desenvolvem apartir do tecido do explante.

O ferimento pode ser antes da inoculação (co-cultivo), durantea inoculação ou depois da inoculação com Agrobaeteria. Para se obter ambosos efeitos benéficos o ferimento é preferivelmente feito antes ou durante o co-cultivo, mais preferivelmente antes do co-cultivo. Muitos métodos deferimento podem ser usados, incluindo, por exemplo, corte, abrasão,perfuração, bateção, penetração com partículas finas ou fluidos pressurizados,ferimento com plasma, aplicação de pressão hiperbárica ou sonificação. Oferimento pode ser realizado usando objetos tais como, mas não limitados a,bisturis, tesouras, agulhas, objetos abrasivos, aerógrafo, partículas, pistolas degene elétricas ou ondas sonoras. Uma outra alternativa para realçar aeficiência da etapa de co-cultivo é a infiltração a vácuo (Bechtold 1998; Trieu 2000).

2.3 Tratamento após o co-cultivo

Depois do co-cultivo é preferido remover as bactériastransportadas pelo solo pela lavagem e/ou tratamento com antibióticosapropriados. Em conseqüência, o meio utilizado depois da etapa de co-cultivopor exemplo, o meio utilizado na etapa (bl), (b2) e/ou (cl) preferivelmentecontém um bacteriocida (antibiótico). Esta etapa é intencionada a terminar oupelo menos retardar o crescimento das células não transformadas e matar ascélulas de Agrobacterium remanescentes. Conseqüentemente, o método dainvenção compreende preferivelmente a etapa de:

(bl) transferir o dito tecido meristemático axilar co-cultivadodepois da etapa (b) a um meio que compreende pelo menos um antibióticoadequado para inibir o crescimento de Agrobaeterium e - opcionalmente -pelo menos um fator de crescimento vegetal, em que o dito meiopreferivelmente está carecendo de D-alanina e/ou D-serina ou um derivadodas mesmas em uma concentração fitotóxica, e,

Os antibióticos preferidos a serem utilizados são por exemplo,carbenicilina (500 mg/L ou - preferivelmente - 100 mg/L) ou Timentin®(GlaxoSmithKline; usado preferivelmente a uma concentração de cerca de250 a 500 mg/L; Timentin® é uma mistura de ticarcilina dissódica eclavulanato potássico; 0,8 g de Timentin® contém 50 mg de ácido clavulânicocom 750 mg de ticarcilina. Quimicamente, a ticarcilina dissódica é o sal dedissódio do ácido N-(2-carbóxi-3,3-dimetil-7-oxo-4-tia-l-azabiciclo[3.2.0]hept-6-il)-3-tio-fenemalonâmico. Quimicamente, oclavulanato potássico é o (Z)-(2R, 5R)-3-(2-hidróxi-etilideno)-7-oxo-4-oxa-l-azabiciclo [3.2.0] heptano-2-carboxilato de potássio).

2.4 Seleção

As técnicas mediadas pela Agrobacterium tipicamenteresultam na liberação de gene em um número muito limitado de células notecido alvejado. Especialmente para a sojas, as eficiências de transformação(sem seleção) são no geral muito baixas. Este problema é superado peloprotocolo de seleção com base nas enzimas que metabolizam D-alanina e/ouD-serina aqui fornecidas. Assim, depois do co-cultivo e - opcionalmente -uma etapa de recuperação (ver abaixo) o tecido alvo (por exemplo, o tecidomeristemático axilar) é transferido para e incubado em um meio de seleção.

E preferido que explantes recém transformados (co-cultivados)sejam incubados por um certo tempo de cerca de 1 hora a cerca de 10 dias,preferivelmente de 1 dia a 8 dias, mais preferivelmente de cerca de 4 a cercade 7 dias depois do co-cultivo (etapa (b) ou (bl)) em um meio que carece docomposto de seleção (D-alanina e/ou D-serina ou um derivado destes em umaconcentração fitotóxica). O estabelecimento de um nível de resistênciaconfiável contra o dito composto de seleção precisa algumas vezes prevenir odano não intencional pelo composto de seleção mesmo às células e tecidotransformados. Conseqüentemente, o método da invenção pode compreenderuma etapa entre o co-cultivo e a seleção, que é realizada sem um composto deseleção. Durante este período de recuperação a indução de broto (ver abaixo)já pode ser iniciada.

O meio de seleção compreende D-alanina e/ou D-serina ou umderivado das mesmas em uma concentração fitotóxica (isto é, em umaconcentração que termina ou pelo menos retarda o crescimento das célulasnão transformadas). O termo "fitotóxico", "fitotoxicidade" ou "efeitofitotóxico" como aqui usado é intencionado a significar qualquer efeitomensurável, negativo sobre a fisiologia de uma planta ou célula vegetalresultando em sintomas incluindo (mas não limitados a) por exemplocrescimento reduzido ou prejudicado, fotossíntese reduzida ou prejudicada,divisão celular reduzida ou prejudicada, regeneração reduzida ou prejudicada(por exemplo, de uma planta madura de uma cultura de célula, calo ou brotoetc.), fertilidade reduzida ou prejudicada etc. A fitotoxicidade pode incluirainda efeitos como por exemplo, necrose ou apoptose. Em uma forma derealização preferida, os resultados em uma redução de crescimento ouregenerabilidade de pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 80%, maispreferivelmente pelo menos 90% em comparação com uma planta que não foitratada com o dito composto fitotóxico.

O composto específico utilizado para a seleção é escolhidodependendo de qual proteína marcadora é expressada. Por exemplo em casosonde a D-serina amônia-liase da E. coli é utilizada, a seleção é feita em ummeio que compreende D-serina. Em casos onde a D-aminoácido oxidase deRhodotorula gracilis é utilizada, a seleção é feita em um meio quecompreende D-alanina e/ou D-serina.

O fato de que os D-aminoácidos são utilizados não impede apresença de estruturas de L-aminoácido ou L-aminoácidos. Para algumasaplicações pode ser preferido (por exemplo, por razões de custo) aplicar umamistura racêmica de D- e L-aminoácidos (ou uma mistura com teorenriquecido de D-aminoácidos). Preferivelmente, a razão do D-aminoácidopara o enantiômero L correspondente é de pelo menos 1:1, preferivelmente2:1, mais preferivelmente 5:1, o mais preferivelmente 10:1 ou 100:1. O uso deD-alanina tem a vantagem de que as misturas racêmicas de D- e L-alaninapodem ser aplicadas sem efeitos perturbadores ou nocivos do enantiômero L.Portanto, em uma forma de realização melhorada uma mistura racêmica deD/L-alanina é utilizada como o composto.

O termo "derivado" com respeito à D-alanina ou D-serinasignifica composto químico, que compreende a respectiva estrutura de D-aminoácido da D-alanina ou D-serina, mas são quimicamente modificados.Como aqui usado o termo uma "estrutura de D-aminoácido" (tal como uma"estrutura de D-serina") é intencionado a incluir o D-aminoácido, assim comoanálogos, derivados e miméticos do D-aminoácido que mantém a atividadefuncional do composto. Como aqui usado, um "derivado" também refere-se auma forma de D-serina ou D-alanina em que um ou mais grupos de reação nocomposto foram derivatizados com um grupo substituinte. O D-aminoácidoutilizado pode ser modificado por um grupo modificador de terminal aminoou um de terminal carbóxi ou pela modificação da cadeia lateral. O grupomodificador de terminal amino pode ser - por exemplo - selecionado dogrupo que consiste de fenilacetila, difenilacetila, trifenilacetila, butanoíla,isobutanoil hexanoíla, propionila, 3-hidroxibutanoíla, 4-hidroxibutanoíla, 3-hidroxipropionoíla, 2,4-diidroxibutiroíla, 1-adamantanocarbonila, 4-metilvalerila, 2-hidroxifenilacetila, 3-hidroxifenilacetila, 4-hidroxifenilacetila,3,5-diidróxi-2-naftoíla, 3,7-diidróxi-2-naftoíla, 2-hidroxicinamoíla, 3-hidroxicinamoíla, 4-hidróxi-cinamoíla, hidrocinamoíla, 4-formilcinamoíla, 3-hidróxi-4-metóxi-cinamoíla, 4-hidróxi-3-metoxicinamoíla, 2-carboxicinamoíla, 3,4,-diidróxi-hidrocinamoíla, 3,4-diidroxicinamoíla, trans-Cinamoíla, (±)-mandelila, (±)-mandelil-(±)-mandelila, glicolila, 3-formilbenzoíla, 4-formilbenzoíla, 2-formilfenoxiacetila, 8-formil-l-naftoíla,4-(hidróxi-metil)benzoíla, 3-hidroxibenzoíla, 4-hidroxibenzoíla, 5-hidantoinacetila, L-hidroorotila, 2,4-diidroxibenzoíla, 3-benzoilpropanoíla,(±)-2,4-diidróxi-3,3 -dimetilbutanoíla, DL-3 -(4-hidroxifenil)lactila, 3 -(2-hidróxi-fenil)propionila, 4-(2-hidroxifenil)propionila, D-3-fenillactila, 3-(4-hidroxifenil)propionila, L-3-fenillactila, 3-piridilacetila, 4-piridilacetila,isonicotinoíla, 4-quinolinocarboxila, 1-isoquinolinocarboxila e 3-isoquinolinocarboxila. O grupo modificador do terminal carbóxi pode ser -por exemplo - selecionado do grupo que consiste de um grupo amida, umgrupo alquil amida, um grupo aril amida e um grupo hidróxi. O "derivado"como aqui usado é intencionado a incluir moléculas que, imitam a estruturaquímica de uma respectiva estrutura de D-aminoácido e retém as propriedadesfuncionais da estrutura de D-aminoácido. Os métodos para planejaraminoácido ou análogos derivados e miméticos de peptídeo, são conhecidosna técnica (por exemplo, ver Farmer 1980; Ball 1990; Morgan 1989;Freidinger 1989; Sawyer 1995; Smith 1995; Smith 1994; Hirschman 1993).Outras modificações possíveis incluem substituições N-alquila (ou arila) oureticulação da cadeia principal para a construção de lactamas e outrasestruturas cíclicas. Outros derivados incluem derivados de hidroximetila determinal C, derivados modificados por O (por exemplo, éter hidroximetilbenzílico de terminal C), derivados modificados no terminal N incluindoamidas substituídas tais como alquilamidas e hidrazidas. Além disso, aestrutura de D-aminoácido que compreende compostos herbicidas pode serutilizada. Tais compostos são por exemplo descritos na US 5.059.239 epodem incluir (mas não devem ser limitados a) N-benzoil-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-DL-alanina, éster meti Iico de N-benzoil-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-DL-alanina, éster etílico de N-benzoil-N-(3-cloro-4-fluoro-fenil)-DL-alanina, N-benzoil-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-D-alanina, éster metílico deN-benzoil-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-D-alanina ou éster isopropílico de N-benzoil-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-D-alanina.O composto de seleção (D-alanina e/ou D-serina ou umderivado das mesmas em uma concentração fitotóxica) pode ser usado emcombinação com outras substâncias. Para o propósito de aplicação, ocomposto de seleção também pode ser usado junto com os adjuvantesconvencionalmente utilizados na técnica da formulação e são portantoformulados na maneira conhecida, por exemplo, em concentradosemulsificáveis, pastas revestíveis, soluções diretamente pulverizáveis oudiluíveis, emulsões diluídas, pós umectáveis, pós solúveis, poeiras,granulados e também encapsulações por exemplo, em substânciaspoliméricas. Como com a natureza das composições a serem usadas, osmétodos de aplicação, tais como pulverização, atomização, empoamento,dispersão, revestimento ou derramamento, são escolhidos de acordo com osobjetivos intencionados e as circunstâncias prevalescentes. Entretanto, maispreferivelmente o composto de seleção é diretamente aplicado ao meio. Éuma vantagem que as soluções de estoque do composto de seleção possam serfabricadas e armazenadas na temperatura ambiente por um períodoprolongado sem uma perda de eficiência de seleção.

A concentração ótima do composto de seleção (isto é, D-alanina, D-serina, derivados das mesmas ou qualquer combinação destas)podem variar dependendo do tecido alvo utilizado para a transformação masno geral (e preferivelmente para a transformação de tecido meristemáticoaxilar) a concentração total (isto é, a soma no caso de uma mistura) de D-alanina, D-serina ou derivados das mesmas está na faixa de cerca de 0,5 mM acerca de 100 mM. Por exemplo em casos onde a D-serina amônia-liase de E.coli é utilizada, a seleção é feita em um meio que compreende D-serina (porexemplo, incorporada em placas de meio MS solidificadas em ágar),preferivelmente em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 100mM, preferivelmente de cerca de 1 mM a cerca de 70 mM, maispreferivelmente de cerca de 2 mM a cerca de 50 mM, o mais preferivelmentede cerca de 3 mM a cerca de 15 mM. Em casos onde a D-aminoácido oxidasede Rhodotorula gracilis é utilizada, a seleção é feita em um meio quecompreende D-alanina e/ou D-serina (por exemplo, incorporada em placas demeio MS solidificada em ágar), preferivelmente em uma concentração totalde cerca de 0,5 mM a cerca de 100 mM, preferivelmente de cerca de 1 mM acerca de 70 mM, mais preferivelmente de cerca de 2 mM a cerca de 50 mM, omais preferivelmente de cerca de 3 mM a cerca de 15 mM. Preferivelmente,D-alanina (por exemplo, se utilizada apenas como composto de seleção) éutilizada em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 100 mM,preferivelmente de cerca de 1 mM a cerca de 70 mM, mais preferivelmente decerca de 2 mM a cerca de 50 mM, o mais preferivelmente de cerca de 3 mM acerca de 20 mM. Preferivelmente, D-serina (por exemplo, se utilizada apenascomo composto de seleção) é utilizada em uma concentração de cerca de 0,5mM a cerca de 100 mM, preferivelmente de cerca de 1 mM a cerca de 70mM, mais preferivelmente de cerca de 2 mM a cerca de 50 mM, o maispreferivelmente de cerca de 3 mM a cerca de 15 mM.

Também o tempo de seleção pode variar dependendo do tecidoalvo usado e do protocolo de regeneração utilizado. A pressão de seleção(pela presença do composto de seleção) sendo mantida durante todo oprocesso de regeneração incluindo a indução de broto, alongamento de broto eenraizamento.

No geral um tempo de seleção é de pelo menos cerca de 5 dias,preferivelmente pelo menos cerca de 14 dias. Mais especificamente o tempode seleção total sob condições desdiferenciadoras (isto é, indução de calo oubroto) é de cerca de 1 a cerca de 10 semanas, preferivelmente, cerca de 3 a 7semanas, mais preferivelmente de cerca de 3 a 4 semanas. Entretanto, épreferido que a seleção sob as condições desdiferenciadoras seja utilizada pornão mais do que 70 dias. Preferivelmente, em que a seleção é feita usandocerca de 3 a cerca de 20 mM de D-alanina e/ou D-serina por cerca de 3 a 4semanas sob condições desdiferenciadoras. No meio do período de seleção osexplantes podem ser transferidos para o meio de seleção fresco uma ou maisvezes, para o protocolo específico aqui fornecido é preferido que duas etapasde meio de seleção (por exemplo, uma transferência para novo meio deseleção) sejam utilizadas. Preferivelmente, a seleção de etapa é feita em duasetapas, usando uma primeira etapa de seleção por cerca de 14 a 20 dias,depois transferindo as células ou tecido sobreviventes para um segundo meiode seleção com essencialmente a mesma composição do que o primeiro meiode seleção por mais 14 a 20 dias. Entretanto, também é possível aplicar umaúnica seleção de etapa. A presença das enzimas que metabolizam D-aminoácido não exclui que marcadores adicionais sejam utilizados.2.5 Regeneração de plantas de soja férteisDepois da etapa de co-cultivo (e uma etapa de recuperaçãoadicional) os explantes co-cultivados são incubados em um meio de induçãode broto que compreende pelo menos um fator de crescimento vegetal. A ditaincubação em meio de indução de broto pode ser iniciada imediatamentedepois da etapa de co-cultivo (isto é, em paralelo com a etapa (bl) para inibiro crescimento das Agrobacteria) ou depois de outras etapas intermediáriastais como (bl) (inibir o crescimento da Agrobacterid) e/ou (b2) (regeneraçãosem composto de seleção; ver abaixo).

O meio utilizado para a indução de broto (e/ou alongamento debroto) é preferivelmente suplementado com um ou mais reguladores docrescimento vegetal, como por exemplo, compostos de citocinina (porexemplo, 6-benzilaminopurina) e/ou compostos de auxina (por exemplo, 2,4-D). O termo "reguladores do crescimento vegetal" (PGR) como aqui usadosignifica compostos que ocorrem naturalmente ou sintéticos (que não ocorremnaturalmente) que podem regular o crescimento e desenvolvimento vegetais.PGRs podem atuar unicamente ou em associação um com o outro ou comoutros compostos (por exemplo, açúcares, aminoácidos). O termo "auxina" ou"compostos de auxina" compreende compostos, que estimulam oalongamento e divisão celulares, diferenciação de tecido vascular,desenvolvimento de fruta, formação de raízes adventícias, produção de etilenoe - em concentrações altas - induzir a desdiferenciação (formação de calo). Aauxina mais comum que ocorre naturalmente é o ácido indolacético (IAA),que é transportado polarmente nas raízes e hastes. As auxinas sintéticas sãousadas extensivamente na agricultura moderna. Os compostos de auxinasintéticos compreendem o ácido indol-3-butírico (DBA), o ácido naftilacético(NAA) e o ácido 2,4-diclorfenoxiacético (2,4-D). Compostos que induzem aformação de broto incluem, mas não são limitados a, IAA, NAA, IBA,citocininas, auxinas, cinetinas, glifosato e tiadiazuron. O termo "citocinina"ou "composto de citocinina" compreende compostos, que estimulam a divisãocelular, expansão de cotilédones e crescimento de brotos laterais. Estesretardam a senescência de folhas destacadas e, em combinação com asauxinas (por exemplo, IAA), podem influenciar a formação de raízes e brotos.Os compostos de citocinina compreendem, por exemplo, 6-isopentenil-adenina (IPA) e 6-benziladenina/6-benzilaminopurina (BAP).

Em uma forma de realização da invenção (especialmente parao método fundamentado no tecido meristemático axilar) o meio de pelomenos um da etapa (b) (co-cultivo), e/ou (c) (indução e seleção de broto),compreende uma citocinina (como por exemplo, 6-benzilaminopurina (BAP),preferivelmente em uma concentração equivalente a uma concentração decerca de 1 μΜ a cerca de 10 μΜ de 6-benzilaminopurina. Para o meio deindução de broto uma concentração de BAP de cerca de 1 a cerca de 3 μΜ épreferida. Preferivelmente, a concentração de BAP não é mais alta do que 5μΜ.

Conseqüentemente, em uma forma de realização, um ou maisfito-hormônios ou citocininas são adicionados ao meio durante o co-cultivo.Preferivelmente, a concentração do fito-hormônio ou citocininas está entre 0,1e 20 microMolares, a mais preferida está entre 1 e 10 microMolares.Entretanto, a pessoa habilitada na técnica sabe, partindo dos dados fornecidos,como adaptar as concentrações às condições específicas dos experimentosrealizados, por exemplo, ao meio usado, ao tempo de incubação, àtemperatura, à natureza dos explantes, etc. Em uma forma de realização, BAPtem uma concentração, por exemplo, na faixa de em torno de 1 a em torno demicroMolar, por exemplo em torno de 7,5 microMolar. Em uma forma derealização Cinetina é usada, preferivelmente na faixa de em torno de 1microMolar a 10 microMolares, por exemplo, em torno de, 1, 3, 5 ou 7,5microMolares. Preferido são entre 1 e 8 microMolares de Cinetina, porexemplo, 7,5 microMolares.

Em uma outra forma de realização preferida, o meio de pelomenos uma das etapas (b), (bl), (b2), e/ou (c), compreende uma citocinina.

É além disso especialmente preferido, que o meio de pelomenos um da etapa (b), (bl), (b2), (c) e/ou (cl), preferivelmente pelo menos(b) e (cl), compreende entre cerca de 0,1 μΜ e cerca de 2 μΜ de ácidoGiberélico (GA3).

Em uma outra forma de realização preferida, o meio de pelomenos uma das etapas (b), (bl), (b2) e (c) compreende pelo menos umcomposto de tiol, preferivelmente selecionado do grupo que consiste detiolsulfato de sódio, ditiotrietol (DTT) e cisteína. Preferivelmente aconcentração está entre cerca de 1 mM e 10 mM de L-Cisteína, 0,1 mM a 5mM de DTT, e/ou 0,1 mM a 5 mM de tiolsulfato de sódio.

Os explantes são incubados no dito meio de indução de brotoaté que os brotos tenham sido desenvolvidos. Os brotos primórdios queusualmente se formam não são mais longos do que 0,3 cm no tamanho. Aformação de brotos primórdios começa em torno de 1 semana em meio deindução de broto e, em média, tal início de broto continua por cerca de 3 a 4semanas para atingir o tamanho máximo. Conseqüentemente, os explantes co-cultivados são incubados no dito meio de indução de broto por cerca de 2 a 6semanas, preferivelmente de cerca de 3 a 4 semanas.

Como descrito acima a indução de broto e as etapassubseqüentes de regeneração são preferivelmente realizadas sob condiçõesseletivas (por exemplo, suplementando o meio de indução de broto, o meio dealongamento de broto, o meio de enraizamento com D-serina ou D-alanina auma concentração de cerca de 3 a 100 mM).

O tecido é cultivado neste meio por um período de cerca de 1 acerca de 4 semanas, preferivelmente de cerca de 7 dias até que os brotostenham se desenvolvido. A formação de broto começa em cerca de 1 a cercade 2 semanas dependendo das condições de tratamento e co-cultivo.

Em uma forma de realização preferida todos os brotosprimórdios formados antes da transformação serão removidos até cerca de 1semana depois do co-cultivo para estimular novo crescimento dos meristemas.Isto ajuda a reduzir quimerismo nos transformantes primários e aumenta aamplificação de células meristemáticas transgênicas. Durante este tempo oexplante pode ser cortado ou não em pedaços menores (isto é, destacando onodo do explante cortando-se o epicótilo).

Depois de 2 a 4 semanas (ou até que uma massa de brotostenha se formado) no meio SIM (preferivelmente com seleção), os explantesserão transferidos para o meio de alongamento de broto (SEM) que estimularáo alongamento de broto (dos brotos primórdios). Este meio pode conter ounão um composto de seleção, mas preferivelmente contém um composto deseleção (por exemplo, D-serina em uma concentração de cerca de 3 a cerca de20 mM). O tecido é cultivado neste meio por um período de cerca de 1 a cercade 8 semanas. A freqüência e o comprimento dos brotos alongados sãoinfluenciados pelos níveis hormonais, em particular GA, no SEM.

Em uma outra forma de realização preferida da invenção, omeio de pelo menos uma das etapas (cl) e/ou (d) compreendem entre cerca de0,01 mg/l (0,057 Μ) e cerca de 1 mg/l (5,7 μΜ) de ácido indol acético (IAA),e/ou entre cerca de 0,1 μΜ e cerca de 4 μΜ de ácido Giberélico (GA3), e/ouentre cerca de 0,5 μΜ e cerca de 6 μΜ de ácido trans-zeatin ribosídeo.

Preferivelmente, depois de cada 2 a 3 semanas os explantessão transferidos para meio SEM novo (preferivelmente contendo o compostode seleção) depois cuidadosamente removendo o tecido morto. Os explantesdevem se manter juntos e não fragmentar em pedaços e permanecer um tantosaudáveis. Preferivelmente, os explantes continuarão a serem transferidos atéque o explante morra ou os brotos se alonguem.

Os brotos alongados são fáceis de colher em cerca de 4 a 8semanas depois da transferência para o meio de alongamento de broto. Osbrotos são avaliados quanto à regularidade fenotípica e saúde e apenas brotoscom hastes alongadas (aproximadamente 1 polegada ou 2 cm) e formação defolhas trifoliadas completas são colhidas.

Os brotos coletados são colocados em um meio deenraizamento para induzir a formação de raiz. A formação de raiz ocorreaproximadamente de 1 a 4 semanas, a seguir do que as plantas podem sertransferidas para o solo e cultivadas até a maturidade completa. O meio deenraizamento (também não explicitamente preferido) também podem conter ocomposto de seleção. Preferivelmente, brotos alongados (comprimento maiordo que 3 cm) são removidos e colocados no meio de enraizamento (RM) porcerca de 1 semana (Método B) ou cerca de 2 a 4 semanas dependendo docultivar (Método C) tempo no qual as raízes começam a se formar. No casode explantes com raízes, estes são diretamente transferidos para o solo. Osbrotos enraizados são transferidos para o solo e fortificados em uma câmarade cultivo por 2 a 3 semanas antes de transferir para a estufa. As plantasregeneradas obtidas usando este método são férteis e produziram em média500 sementes por planta.

As plantas T0 criadas por esta técnica são plantas transgênicase são regularmente recuperadas com rendimentos bastante razoáveis. Para oMétodo C, o tempo de regeneração médio de uma muda de soja usando oprotocolo de meristemas axilares propagados é de 14 semanas a partir dainoculação do explante. Portanto, este método tem um tempo de regeneraçãorápido que leva às plantas de soja férteis, saudáveis.

O material vegetal transformado (por exemplo, células, tecidosou plantinhas), que expressa genes marcadores, são capazes de desenvolver napresença de concentrações de um composto de seleção correspondente quesuprime o crescimento de um tecido do tipo selvagem não transformado. Asplantas resultantes podem ser cruzadas e hibridizadas na maneira habitual.

Duas ou mais gerações devem ser cultivadas de modo a garantir que aintegração genômica seja estável e hereditária. Outros aspectos importantes dainvenção incluem a progênie das plantas transgênicas preparadas pelosmétodos divulgados, assim como as células derivadas de tal progênie e assementes obtidas de tais progênie.

Uma outra forma de realização da invenção diz respeito àscélulas e plantas de soja fabricadas pelo método fornecido abaixo. Assim,uma outra forma de realização diz respeito a uma planta ou célula da soja quecompreendem uma construção de DNA que compreende um promotor ativonas ditas plantas ou células da soja e operavelmente ligada a esta umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capaz de metabolizarD-alanina ou D-serina, em que o dito promotor é heterólogo em relação à ditaseqüência que codifica a enzima. Preferivelmente, o promotor e/ou a enzimacapaz de metabolizar D-alanina ou D-serina são definidos como acima. Maispreferivelmente, a dita planta ou célula da soja compreende ainda pelo menosuma segunda construção de expressão que confere à dita planta de soja umtraço agronomicamente valioso. Outras formas de realização da invenção dizrespeito às partes da dita planta de soja incluindo mas não limitadas àssementes de soja (sojas) e seu uso para propósitos alimentícios, de ração eindustriais.

Em uma forma de realização preferida a planta de sojaselecionada do grupo que consiste de Jack, Resnik, Williams 82, Corsoy,Crawford, Hutcheson, Kunitz e Champ. As variedades de soja adequadasadicionais são disponíveis de instituições tanto acadêmicas quanto comerciais,tais como - por exemplo - a University of Guelph (Ontario AgriculturalCollege; por exemplo, as variedades de soja RCAT Staples, Westag 97,RCAT Bobcat, OAC Prudence, OAC Woodstock, OAC 9908) ou variedadesde soja da Dariland ou Soygenetics. As variedades adequadas adicionais sãoPI548402 (Peking), PI437654 (Er-hejjan), PI438489 (Chiquita), PI507354(Tokei 421), PI548655 (Forrest), PI548988 (Pickett), PI88788, PI404198(Sun Huan Do), PI404166 (Krasnoaarmejkaja), Hartwig, Manokin, Doles,Dyer e Custer.

Outras formas de realização da invenção dizem respeito àspartes, órgãos, células, frutas e outro material de reprodução de uma planta desoja da invenção. As partes preferidas são selecionadas do grupo que consistede tecido, células, pólen, óvulo, raízes, folhas, sementes, microesporos epartes vegetativas

As plantas transgênicas resultantes podem ser autopolinizadas ou cruzadas com outras plantas de soja. As sementes Tl sãocolhidas, secadas e armazenadas adequadamente com rótulo adequado nossacos de semente. Duas ou mais gerações devem ser cultivadas de modo agarantir que a integração genômica é estável e hereditária. Por exemploeventos transgênicos nas gerações Tl ou T2 podem estar envolvidos noprograma de hibridização no pré cruzamento para combinar transgenesdiferentes (empilhamento de gene). Outros aspectos importantes dainvenção incluem a progênie das plantas transgênicas preparadas pelosmétodos divulgados, assim como as células derivadas de tal progênie e assementes obtidas de tal progênie.2.6 Geração de descendentes

Depois da transformação, seleção e regeneração de uma plantatransgênica (que compreende a construção de DNA da invenção)descendentes são gerados, que - por causa da atividade do promotor deexcisão - sofreram excisão e não compreendem a(s) seqüência(s)marcadora(s) e o cassete de expressão para a endonuclease.

Os descendentes podem ser gerados pela propagação sexual ounão sexual. A propagação não sexual pode ser realizada pela introdução daembriogênese somática pelas técnicas bem conhecidas no ramo.

Preferivelmente, os descendentes são gerados pela propagação/fertilizaçãosexuais. A fertilização pode ser realizada por auto-polinização ou cruzamentocom outras plantas transgênicas ou não transgênicas. A planta transgênica dainvenção pode aqui funcionar como planta materna ou paterna. Depois doprocesso de fertilização, as sementes são colhidas, germinadas e cultivadasem plantas maduras. A isolação e identificação de descendentes, que sofreramo processo de excisão podem ser feitas em qualquer estágio dodesenvolvimento da planta. Os métodos para a dita identificação são bemconhecidos na técnica e podem compreender - por exemplo - a análise dePCR, Northern blot, Southern blot ou triagem fenotípica (por exemplo, paraum marcador de seleção negativo).

Os descendentes podem compreender uma ou mais cópias dogene de traço agronomicamente valioso. Preferivelmente, os descendentes sãoisolados que apenas compreendem uma cópia do dito gene de traço.

Também de acordo com a invenção são as células, culturas decélula, partes - tais como, por exemplo, no caso de organismos vegetaistransgênicos, raízes, folhas e outros - derivados dos organismos transgênicosdescritos acima e material de propagação transgênico (tal como sementes oufrutas).

As plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção, que podem ser consumidas pelos seres humanos ou animaistambém podem ser usadas como alimentos ou gêneros alimentícios, porexemplo diretamente ou a seguir de processamento conhecido por si. Aqui, adeleção, por exemplo, de resistências a antibióticos e/ou herbicidas, como sãofreqüentemente introduzidas quando da geração de plantas transgênicas, fazsentido por razões de aceitação do cliente, mas também por segurança doproduto.

Uma outra matéria objeto da invenção diz respeito ao uso dosorganismos transgênicos descritos acima de acordo com a invenção e ascélulas, culturas de célula, partes - tais como, por exemplo, no caso deorganismos vegetais transgênicos, raízes, folhas e outros — derivadas delas e omaterial de propagação transgênico tais como sementes ou frutas, para aprodução de alimento ou produtos alimentícios, produtos farmacêuticos ouprodutos químicos finos. Os produtos químicos finos é entendido comosignificando enzimas, vitaminas, aminoácidos, açúcares, ácidos graxos,sabores naturais e sintéticos, aromas e corantes. Especialmente preferida é aprodução de tocoferóis e tocotrienóis e de carotenóides. O cultivo dosorganismos hospedeiros transformados e a isolação dos organismoshospedeiros ou do meio de cultura, é realizada pelos métodos conhecidos pelotrabalhador habilitado. A produção de produtos farmacêuticos tais como, porexemplo, anticorpos ou vacinas, é descrita (por exemplo, por Hood 1999; Ma1999).

3. Outras modificações

3.1 Contra seleção e deleção de marcador subseqüente

A primeira construção de expressão para a enzima quemetaboliza D-aminoácido pode ser preferivelmente construída em um modopara permitir a deleção de marcador subseqüente, especialmente quando a ditaenzima é uma D-aminoácido oxidase, que pode ser utilizada tanto para aseleção negativa quanto para a contra seleção (isto é, como um marcador defunção dupla). Quando fundamentado nas D-aminoácido oxidases o métododa invenção pode ser usado como um esquema de seleção/deleção demarcador combinado. Com base no D-aminoácido utilizado, as D-aminoácidooxidases podem atuar como marcador negativo ou de seleção contrária. Taismétodos são descritos em detalhes na PCT/EP 2005/002734 (WO2005/090581), por meio deste incorporada totalmente por referência.

Para este propósito o primeiro cassete de expressão épreferivelmente flanqueado pelas seqüências, que permitem a deleçãoespecífica do dito primeiro cassete de expressão. Esta forma de realização dainvenção faz uso da propriedade de D-amino oxidase (DAAO) para funcionarcomo marcadores de função dupla, isto é, como marcadores que permitem(dependendo do substrato usado) tanto como marcador de seleção negativoquanto marcador de seleção contrária. Ao contrário dos D-aminoácidos comoD-serina e D-alanina (que são altamente fitotóxicos para as plantas e são"destoxificados" pela D-aminoácido oxidase), D-valina e D-isoleucina nãosão tóxicos para as plantas do tipo selvagem mas são convertidos emcompostos tóxicos pelas plantas que expressa a D-aminoácido oxidaseDAAO. As descobertas de que a expressão de DAAO mitigou a toxicidade deD-serina e D-alanina, mas induziu mudanças metabólicas que fazem da D-isoleucina e D-valina tóxicos, demonstram que a enzima pode fornecer ummarcador selecionável dependente de substrato, de função dupla, em plantas.

Conseqüentemente, uma outra forma de realização dainvenção diz respeito a um método para fornecer células e plantas de soja(que são preferivelmente isentas de marcador), o dito método compreende asetapas de:

i) transformar uma célula de planta de soja com uma primeiraconstrução de DNA que compreende

a) pelo menos uma primeira construção de expressão quecompreenda um promotor ativo na dita planta de soja e operavelmente ligadaa esta uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima de D-aminoácido oxidase, em que o dito primeiro cassete de expressão éflanqueado pelas seqüências que permitem a deleção específica do ditoprimeiro cassete de expressão, e

ii) tratar as ditas células de planta de soja transformadas daetapa i) com um primeiro composto selecionado do grupo que consiste de D-alanina, D-serina ou derivados das mesmas em uma concentração fitotóxica eselecionar células vegetais que compreendem no seu genoma a dita primeiraconstrução de DNA, que confere resistência às ditas células vegetaistransformadas contra o dito primeiro composto pela expressão da dita D-aminoácido oxidase, e

iii) induzir a deleção do dito primeiro cassete de expressão apartir do genoma das ditas células vegetais transformadas e tratar as ditascélulas vegetais com um segundo composto selecionado do grupo queconsiste de D-isoleucina, D-valina e derivados das mesmas em umaconcentração tóxica para as células vegetais que ainda compreendem o ditoprimeiro cassete de expressão, selecionando deste modo células vegetais quecompreendem o dito segundo cassete de expressão mas que carecem do ditoprimeiro cassete de expressão.

Os promotores e as seqüências da D-aminoácido oxidasepreferidas são descritas acima.

Preferivelmente, a deleção do primeiro cassete de expressãopode ser realizada por vários meios conhecidos na técnica, incluindo mas nãolimitados a um ou mais dos seguintes métodos:

a) recombinação induzida por uma recombinase específica deseqüência, em que o dito primeiro cassete de expressão é flanqueado pelossítios de recombinação correspondentes em um modo que a recombinaçãoentre os ditos sítios de recombinação flanqueadores resulta em deleção dasseqüências no meio do genoma,

b) recombinação homóloga entre seqüências de homologia A eA' que flanqueiam o dito primeiro cassete de expressão, preferivelmenteinduzido por uma ruptura do filamento duplo específico de seqüência entre asditas seqüências de homologia causada por uma endonuclease específica deseqüência, em que as ditas seqüências de homologia AeA' têm comprimentoe homologia suficientes de modo a garantir a recombinação homóloga entre Ae A' e tendo uma orientação que - na recombinação entre AeA'- levará àexcisão do dito primeiro cassete de expressão do genoma da dita planta.

Vários meios estão disponíveis para a pessoa habilitada natécnica para combinar o mecanismo indutor da deleção/excisão com aconstrução de DNA da invenção que compreende o marcador de seleção defunção dupla da D-aminoácido oxidase. Preferivelmente, uma recombinase ouendonuclease utilizável no método da invenção pode ser expressada por ummétodo selecionado do grupo que consiste de:

a) incorporação de um segundo cassete de expressão para aexpressão da recombinase ou endonuclease específica de seqüênciaoperavelmente ligada a um promotor vegetal na dita construção de DNA,preferivelmente junto com o dito primeiro cassete de expressão flanqueadopelas ditas seqüências que permitem a deleção específica,

b) incorporação de um segundo cassete de expressão para aexpressão da recombinase ou endonuclease específicas de seqüênciaoperavelmente ligadas a um promotor vegetal nas células vegetais ou plantasusadas como material alvo para a transformação gerando por meio destelinhagens de célula mestra ou células,

c) incorporação de um segundo cassete de expressão para aexpressão da recombinase ou endonuclease específica de seqüênciaoperavelmente ligadas a um promotor vegetal em uma construção de DNAseparada, que é transformada por intermédio da co-transformação com a ditaprimeira construção de DNA nas ditas células vegetais,

d) incorporação de um segundo cassete de expressão para aexpressão da recombinase ou endonuclease específica de seqüênciaoperavelmente ligada a um promotor vegetal nas células vegetais ou plantasque são subseqüentemente cruzaram com plantas que compreendem aconstrução de DNA da invenção.

Em uma outra forma de realização preferida o mecanismo dedeleção/excisão pode ser induzido ou ativado em um modo para prevenir adeleção/excisão prematura do marcador de função dupla. Preferivelmente,assim a expressão e/ou atividade de uma recombinase ou endonucleaseespecíficas de seqüência preferivelmente utilizadas podem ser induzidas e/ouativadas, preferivelmente por um método selecionado do grupo que consistede

a) expressão indutível ligando-se operavelmente a seqüênciaque codifica a dita recombinase ou endonuclease a um promotor indutível,

b) ativação indutível, pela utilização de uma recombinase ouendonuclease modificadas que compreendem um domínio de ligação deligando, em que a atividade da dita recombinase ou endonuclease modificadaspode ser modificada pelo tratamento de um composto tendo atividade deligação ao dito domínio de ligação de ligando.

Preferivelmente, assim o método da invenção resulta em umacélula vegetal ou planta que são isentas de marcador de seleção.

Uma outra questão objeto da invenção diz respeito àconstrução de DNAs, que sejam adequados para utilizar no método dainvenção. Uma construção de DNA adequada para o uso dentro da presenteinvenção está preferivelmente compreendendoa) um primeiro cassete de expressão que compreende umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma D-aminoácido oxidaseoperavelmente ligada com um promotor ativo em plantas de soja (comodefinido acima; preferivelmente um promotor da ubiquitina), em que o ditoprimeiro cassete de expressão é flanqueado pelas seqüências que permitem adeleção específica do dito primeiro cassete de expressão, e

b) pelo menos um segundo cassete de expressão adequado paraconferir à dita planta um traço agronomicamente valioso, em que o ditosegundo cassete de expressão não é localizado entre as ditas seqüências quepermitem a deleção específica do dito primeiro cassete de expressão.

Os promotores e seqüências de D-aminoácido oxidasepreferidos são descritos acima.

Para garantir a deleção/excisão de marcador o cassete deexpressão para a D-aminoácido oxidase (a primeira construção de expressão)compreendido na construção de DNA da invenção é flanqueado por sítios derecombinação para uma recombinase específica de seqüência em um modoque a recombinação induzida entre os ditos sítios de recombinaçãoflanquedores resulta na deleção do dito primeiro cassete de expressão dogenoma. Preferivelmente as ditas seqüências que permitem a deleçãoespecífica do dito primeiro cassete de expressão são selecionadas do grupo deseqüências que consiste de

a) sítios de recombinação para uma recombinase específica deseqüência dispostos em um modo que a recombinação entre os ditos sítios derecombinação flanqueadores resulta na deleção das seqüências no meio dogenoma, e

b) seqüências de homologia AeA' tendo um comprimento ehomologia suficientes de modo a garantir a recombinação homóloga entre A eA' e tendo uma orientação que - na recombinação entre AeA'- resulta emdeleção das seqüências no meio do genoma.Preferivelmente, a construção compreende pelo menos umsítio de reconhecimento para uma nuclease específica de seqüência localizadaentre as ditas seqüências, que permite a deleção específica do dito primeirocassete de expressão (especialmente para a variante b acima).

Existem vários sítios de recombinação e recombinasesespecíficas de seqüência correspondentes conhecidos na técnica, que podemser utilizados para o propósito da invenção. A pessoa habilitada na técnicaestá familiarizada com uma variedade de sistemas para a remoção direcionadaao sítio de seqüências de ácido nucléico recombinantemente introduzido.Estes são principalmente fundamentados no uso de recombinases específicasde seqüência. Vários sistemas de recombinação específica de seqüência sãodescritos, tais como o sistema Cre/lox do bacteriófago Pl (Dalel991; Russell1992; Osborne 1995), o sistema FLP/FRT de levedura (Kilby 1995; Lyznik1996), a recombinase Gin do fago Mu, a recombinase Pin da E. coli ou osistema R/RS do plasmídeo pSRl (Onouchi 1995; Sugita 2000). Também umsistema fundamentado nos sítios attP e na recombinase de bacteriófagoLambda pode ser utilizado (Zubko 2000). Outros métodos adequados para acombinação com os métodos aqui descritos são descritos na WO 97/037012 eWO 02/10415.

Em uma forma de realização preferida, a deleção/excisão daseqüência de marcador duplo é deletada pela recombinação homólogainduzida por uma ruptura do filamento duplo específico de seqüência. Osprincípios básicos são divulgados na WO 03/004659, por meio desteincorporada por referência. Para este propósito a primeira construção deexpressão (que codifica o marcador de função dupla) é flanqueado pelasseqüências de homologia AeA', em que as ditas seqüências de homologiatêm comprimento e homologia suficientes de modo a garantir a recombinaçãohomóloga entre A e A' e tendo uma orientação que — na recombinação entreAeA'- levará a uma excisão do primeiro cassete de expressão do genoma.Além disso, a seqüência flanqueada pelas ditas seqüências de homologiacompreende ainda pelo menos uma seqüência de reconhecimento de pelomenos 10 pares de base para a indução direcionada ao sítio de rupturas dofilamento duplo do DNA por uma enzima específica de seqüência que induz aruptura do filamento duplo do DNA, preferivelmente uma endonuclease deDNA específica de seqüência, mais preferivelmente uma endonucleaseautodirecional, o mais preferivelmente uma endonuclease selecionada dogrupo que consiste de I-SceI, I-CeuI, I-CpaI, I-CpaII, I-CreI e I-ChuI ouquimeras destas com domínios de ligação de ligando.

O cassete de expressão para a endonuclease ou recombinase(que compreendem uma recombinase ou endonuclease específicas deseqüência operavelmente ligadas a um promotor vegetal) pode ser incluído naconstrução de DNA da invenção. Preferivelmente, o dito segundo cassete deexpressão está junto com o dito primeiro cassete de expressão flanqueadopelas ditas seqüências que permitem a deleção específica.

Em uma outra forma de realização preferida, a expressão e/ouatividade da dita recombinase ou endonuclease específicas de seqüênciapodem ser induzidas e/ou ativadas para evitar a deleção/excisão prematurasdo marcador de função dupla durante um período onde a sua ação como ummarcador de seleção negativo é ainda requerida. Preferivelmente aindução/ativação podem ser realizadas por um método selecionado do grupoque consiste de

b) ativação indutível, utilizando-se uma recombinase ouendonuclease modificadas que compreendam um domínio de ligação deligando, em que a atividade da dita recombinase ou endonuclease modificadaspode ser modificada pelo tratamento de um composto tendo atividade deligação ao dito domínio de ligação de ligando.Outras formas de realização da invenções estão relacionadascom vetores transgênicos que compreendem uma construção de DNA dainvenção. As células ou organismos não humanos transgênicos quecompreendem uma construção de DNA ou vetor da invenção. Preferivelmenteas ditas células ou organismos não humanos são células vegetais ou plantas,preferivelmente plantas, que são de uso agronômico.

A presente invenção permite a geração de células e organismostransgênicos isentos de marcador, preferivelmente plantas, uma maneiraacuradamente prognosticável com alta eficiência.

As preferências para a etapa de contra seleção (ii) com respeitoà escolha do composto, concentração, modo de aplicação para D-alanina, D-serina ou derivados das mesmas são descritos acima no contexto do esquemade seleção geral.

Para a etapa de contra seleção (iii) o composto é selecionadodo grupo de compostos que compreendem uma estrutura de D-isoleucina ouD-valina. Mais preferivelmente o composto é selecionado do grupo queconsiste de D-isoleucina e D-valina. O mais preferivelmente o composto oucomposição usados para a contra seleção compreende D-isoleucina. Quandoaplicada por intermédio do meio de cultura de célula (por exemplo,incorporada nas placas de meio ágar solidificado), a D-isoleucina pode serutilizada em concentrações de cerca de 0,5 mM a cerca de 100 mM,preferivelmente de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, mais preferivelmente decerca de 10 mM a cerca de 30 mM. Quando aplicada por intermédio do meiode cultura de célula (por exemplo, incorporada em placas de meio de ágarsolidificado), a D-valina pode ser utilizada em concentrações de cerca de 1 acerca de 100 mM, preferivelmente de cerca de 5 a 50 mM, maispreferivelmente de cerca de 15 mM a cerca de 30 mM.

Assim, usando o método descrito acima torna-se possível criaruma planta de soja, que é isenta de marcador. Os termos "isento de marcador"ou "isento de marcador de seleção" como aqui usados com respeito a umacélula ou um organismo são intencionados a significar uma célula ou umorganismo que não é capaz de expressar uma proteína de marcador de seleçãofuncional (codificada pelo cassete de expressão b; como definido acima) quefoi inserido na dita célula ou organismo em combinação com o gene quecodifica o traço agronomicamente valioso. A seqüência que codifica a ditoproteína de marcador de seleção pode estar ausente em parte ou -preferivelmente - totalmente. Além disso o promotor operavelmente ligado aesta pode ser disfuncional por estar ausente em parte ou totalmente. A plantaresultante entretanto pode compreender outras seqüências que podemfuncionar como um marcador de seleção. Por exemplo a planta podecompreender como um traço agronomicamente valioso um gene que confereresistência a herbicida. Entretanto, é mais preferido que a planta resultantenão compreenda nenhum marcador de seleção.

Vários outros aspectos e formas de realização da presenteinvenção estarão evidentes àqueles habilitados na técnica em vista da presentedivulgação. Todos os documentos mencionados neste relatório descritivo sãoaqui incorporados em sua totalidade por referência. Certos aspectos e formasde realização da invenção serão agora ilustrados por via de exemplo e comreferência às figuras descritas abaixo.

3.2 Empilhamento de Gene

Existe uma falta de sistemas de transformação eficientes eespecialmente marcadores de seleção para a soja. Esta falta refere-seespecialmente aos métodos, que contam com a transformação múltiplasubseqüente. Um modo de superar este problema é um método de seleção edeleção de marcador combinadas fornecido acima. Um outro método estáfundamentado na combinação de sistemas de seleção diferentes. Os métodos ecomposições da invenção permitem a transformação subseqüente. As enzimasque metabolizam D-serina e/ou D-alanina são compatíveis e não interferemcom outro marcador de seleção e sistemas de seleção. É portanto possíveltransformar plantas transgênicas existentes que compreendem um outromarcador de seleção com as construções da invenção ou parasubseqüentemente transformar as plantas obtidas pelo método da invenção (eque compreendem as construções de expressão para a enzima que metabolizaD-serina e/ou D-alanina) com um outro marcador. Em conseqüência, umaoutra forma de realização da invenção diz respeito a um método para atransformação subseqüente de pelo menos duas construções de DNA em umaplanta de soja que compreende as etapas de:

a) uma transformação com uma primeira construção a ditaconstrução compreendendo pelo menos uma construção de expressão quecompreenda um promotor ativo nas ditas plantas de soja (preferivelmente umpromotor da ubiquitina como definido acima) e operavelmente ligada a estauma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capaz demetabolizar D-alanina ou D-serina, e

b) uma transformação com uma segunda construção a ditaconstrução compreendendo um segundo gene marcador de seleção, que nãoestá conferindo resistência contra D-alanina ou D-serina.

Preferivelmente o dito segundo gene marcador é um marcadorde seleção negativo que confere uma resistência a um composto biocida talcomo um inibidor metabólico (não D-aminoácido) (por exemplo, 2-desoxiglicose-6-fosfato, WO 98/45456), antibióticos (por exemplo,canamicina, G 418, bleomicina ou higromicina) ou herbicidas (por exemplo,fosfinotricina, herbicidas do tipo sulfoniluréia e imidazolinona ou glifosato).Os exemplos são:

- Fosfinotricina acetiltransferases (PAT; também chamada deresistência ao Bialophos®; bar; de Block 1987; Vasil 1992, 1993; Weeks1993; Becker 1994; Nehra 1994; Wan & Lemaux 1994; EP O 333 033; US4.975.374)- 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) queconfere resistência ao Glifosato® (N-(fosfonometil)glicina) (Shah 1986;Della-Cioppa 1987a,b)

- Glifosato® que degrada enzimas (Glifosato® oxidorredutase;gox),

- Dalapon® inativador de desalogenases (deh)

- acetolactato sintases que inativam sulfoniluréia e/ouimidazolinona (ahas ou ALS; por exemplo variantes ahas/ALS mutadas com,por exemplo, as mutações S4, XI12, XA17 e/ou Hra

- Bromoxinil® que degrada nitrilases (bxn)

- Genes de resistência à canamicina ou geneticina (G418)(NPTII; NPTI) que codificam por exemplo, neomicina fosfotransferases(Fraley 1983; Nehra 1994)

- higromicina fosfotransferase (HPT), que medeia a resistênciaà higromicina (Vanden Elzen 1985).

- diidrofoliato redutase (Eichholtz 1987)

Vários esquemas de tempo podem ser utilizados para os váriosmarcadores de seleção de gene negativos. No caso de genes de resistência(por exemplo, contra herbicidas) a seleção é preferivelmente aplicada por todaa fase de indução de calo por cerca de 4 semanas e além de pelo menos 4semanas na regeneração. Um tal esquema de seleção pode ser aplicado paratodos os regimes de seleção. E além disso possível (embora nãoexplicitamente preferido) permanecer a seleção também por todo o esquemade regeneração inteiro incluindo o enraizamento. Por exemplo, com o gene deresistência à fosfinotricina (bar, PAT) como o marcador selecionável,fosfinotricina ou bialafos a uma concentração de cerca de 1 a 50 mg/l podemser incluídos no meio.

Preferivelmente o dito segundo marcador está conferindoresistência contra pelo menos um composto selecionado do grupo queconsiste de fosfinotricina, dicamba, glifosato, herbicidas do tipo sulfoniluréiae imidazolinona.

Também os produtos do dito método como tal são novos einventivos na técnica. Assim uma outra forma de realização da invenção dizrespeito a uma planta de soja que compreende

a) uma primeira construção de expressão que compreende umpromotor ativo nas ditas plantas de soja (preferivelmente um promotor daubiquitina como definido acima) e operavelmente ligada a esta uma seqüênciade ácido nucléico que codifica uma enzima capaz de metabolizar D-alaninaou D-serina, e

Preferivelmente, o dito segundo gene marcador é definidocomo acima e o mais preferivelmente está conferindo resistência contra pelomenos um composto selecionado do grupo que consiste de fosfinotricina,dicamba, glifosato, herbicidas do tipo sulfoniluréia e imidazolinona.

As seguintes combinações são especialmente preferidas:

- Uma primeira transformação com um marcador de seleçãoque confere resistência contra fosfinotricina seguida por uma segundatransformação com um gene marcador de seleção dsda;

- Uma primeira transformação com um marcador de seleçãoque confere resistência contra fosfinotricina seguida por uma segundatransformação com um gene marcador de seleção daol;

- Uma primeira transformação com um gene marcador deseleção dsda seguida por uma segunda transformação com um marcador deseleção que confere resistência contra fosfinotricina;

- Uma primeira transformação com um daol seguida por umasegunda transformação com um marcador de seleção que confere resistênciacontra fosfinotricina;

Além de empilhar com uma segunda construção de expressãopara um gene marcador de seleção, que não está conferindo resistência contraD-alanina ou D-serina, também os genes dsda e daol podem ser empilhada.Por exemplo uma primeira seleção pode ser feita usando o gene dsda e D-serina como um agente de seleção e uma segunda seleção pode sersubseqüentemente feita usando-se gene daol e D-alanina como agente deseleção. Conseqüentemente uma outra forma de realização da invenção dizrespeito a um método para a transformação subseqüente de pelo menos duasconstruções de DNA em uma planta de soja que compreende as etapas de:

a) uma transformação com uma primeira construção a ditaconstrução compreendendo uma construção de expressão que compreende umpromotor ativo nas ditas plantas de soja e operavelmente ligada a esta umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima dsda e selecionar comD-serina, e

b) uma transformação com uma segunda construção a ditaconstrução compreendendo uma construção de expressão que compreendepromotor ativo nas ditas plantas de soja e operavelmente ligada a esta umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima dao e selecionar comD-alanina.

Também os produtos do dito método são considerados seremnovos e inventivos na técnica. Assim, uma outra forma de realização dainvenção diz respeito a uma planta de soja que compreende

a) uma primeira construção a dita construção compreendendouma construção de expressão que compreende um promotor ativo nas ditasplantas de soja (preferivelmente um promotor da ubiquitina como definidoacima) e operavelmente ligada a esta uma seqüência de ácido nucléico quecodifica uma enzima dsda, e

b) uma segunda construção a dita construção compreendendouma construção de expressão que compreende promotor ativo nas ditasplantas de soja (preferivelmente um promotor da ubiquitina como definidoacima) e operavelmente ligada a esta uma seqüência de ácido nucléico quecodifica uma enzima dao.

Mais preferivelmente, o promotor para a dita primeira e a ditasegunda construção de expressão não são idênticas ou a mesma. Nasconstruções mencionadas acima que compreendem dois cassetes de expressãoé preferido que os dois promotores ativos em plantas de soja não sejamidênticos. Preferivelmente um promotor (por exemplo, o promotor para aexpressão da enzima que metaboliza D-alanina e/ou D-serina) é um promotorda ubiquitina como definido acima), enquanto o outro promotor é o promotorda actina.

Todas as composições e métodos aqui divulgados ereivindicados podem ser fabricados e executados sem a experimentaçãoindevida considerando-se a presente divulgação. Embora as composições emétodos desta invenção tenham sido descritas em termos de formas derealização preferidas, estará evidente para aqueles de habilidade na técnicaque variações podem ser aplicadas à composição, métodos e nas etapas ou naseqüência das etapas do método aqui descrito sem divergir do conceito,espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, estará evidente quecertos agentes que são tanto química quanto fisiologicamente relacionadospodem ser substituídos no lugar dos agentes aqui descritos embora os mesmosou resultados similares possam ser obtidos. Todos de tais substitutos similarese modificações evidentes àqueles habilitados na técnica são julgados comoestando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelasreivindicações anexas. Todas as publicações e pedidos de patentemencionados neste relatório descritivo são indicativos do nível de habilidadedaqueles habilitados na técnica à qual esta invenção diz respeito. Todas aspublicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência nomesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente individuaisfossem específica e individualmente indicados como estando incorporadospor referência.

Além disso, a presente invenção diz respeito a umacomposição para a seleção, regeneração, crescimento, cultivo ou manutençãode uma célula vegetal de feijão soja transgênico, um tecido vegetal de feijãosoja transgênico, um órgão vegetal de feijão soja transgênico ou uma plantade feijão soja transgênico ou uma parte destes que compreendem umaquantidade eficaz de D-alanina, D-serina ou um derivado das mesmas quepermitem a seleção de células vegetais de feijão soja, tecido vegetal de feijãosoja, órgãos vegetais de feijão soja ou plantas de feijão soja transgênicos ouuma parte destes e um organismo transgênico de feijão soja, uma célulatransgênica de feijão soja, uma cultura de célula transgênica, uma planta defeijão soja transgênica e/ou uma parte destes assim como a uma cultura decélula que compreenda um ou mais calos embrionários derivados do nodolocalizado no primeiro conjunto de folhas e D-alanina e/ou D-serina em umaconcentração total em tomo de 5 a 10 mM.

A presente invenção também diz respeito a meio de seleçãoque compreenda um tecido alvo de feijão soja e D-alanina e/ou D-serina ouum derivado das mesmas em uma concentração fitotóxica.

Os dados de promotor aqui mostrados indicam que aUbiquitina da Salsa funcionou bem (2% TE) e tanto ScBV quanto ScBV comum intron (isto é, p-ScBV-iSuc UDP) funcionaram com eficiência similar,1,4%. A Ubiquitina de Glycine max também mostrou boa eficiência(construção RLM434; 5% de eficiência de transformação; apenas 60explantes). Assim, por exemplo, um promotor constitutivo forte é usado emcombinação com dsda ou daol. Os promotores constitutivos fortes são porexemplo, o promotor da Actin2, o promotor 35S ou o 19S assim como opromotor da Ubiquitina como descrito acima, por exemplo, o promotor PcUbiou GmUbi ou os promotores p-ScBV ou p-ScBV-iSuc UDP. O nos ou o"superpromotor" também podem ser adequados, em particular para algumaexpressão específica de tecido. Assim, em uma forma de realização, apresente invenção diz respeito a uma construção que compreende o promotorda PcUbi operavelmente ligada aos genes dsda ou daol e/ou quecompreendem os promotores p-ScBV ou p-ScBV-iSuc UDP operavelmenteligados aos genes dsda ou daol.

Seqüências

1. SEQ ID NO: 1 Seqüência de nucleotídeo que codificaa D-serina desidratase de Escherichia coli [dsda]

2. SEQ ID NO: 2 Seqüência de aminoácido que codificaa D-serina desidratase de Eseheriehia coli [dsda]

3. SEQ ID NO: 3 Seqüência de nucleotídeo que codificaa D-aminoácido oxidase de Rhodotorula graeilis (Rhodosporidiumtoruloides)

4. SEQ ID NO: 4 Seqüência de aminoácido que codificaa D-aminoácido oxidase de Rhodotorula graeilis (Rhodosporidiumtoruloides)

5. SEQ ID NO. 5 Seqüência de nucleotídeo que codificauma D-aminoácido oxidase otimizada no códon de Rhodotorula graeilis(.Rhodosporidium toruloides)

6. SEQ ID NO. 6 Seqüência de aminoácido que codificauma D-aminoácido oxidase de Rhodotorula graeilis (Rhodosporidiumtoruloides)

7. SEQID NO: 7 Promotor UB14-2 da Salsa(Petroselinum erispa) que compreende parte da região 5' não traduzida comintron interno (406 - 993); comprimento total 996 pares de base.

8. SEQID NO: 8 Promotor da ubiquitina da Soja(Glyeine max) que compreende parte da região 5' não traduzida com introninterno (1519 - 2031); comprimento total 2031 pares de base.

9. SEQ ID NO: 9 Construção Artificial: Vetor BinárioBar-Selda RLM407: LB> <p-NOS::c-BAR::t-NOS p-PcUBI4-2::c-dsda/na::t-NOS> RB>.

10. SEQID NO: 10 Construção Artificial: inserto de T-DNA de RLM274, um Vetor Binário Bar-GUS tipo RLM407: LB> <p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>.

11. SEQ ID NO: 11 Construção Artificial: inserto de T-DNA de RLM254, um Vetor Binário Selda-GUS tipo RLM407: LB> <p-sTPT::c-dsda/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT: :t-NOS> RB>.

12. SEQ ID NO: 12 Construção Artificial: inserto de T-DNA de REW008, um Vetor Binário Bar-GUS: LB> <p-NOS::c-bar::t-NOSp-PcUBI: :c-gusINT: :t-NOS> RB>.

13. SEQ ID NO: 13 Construção Artificial: inserto de Τ-DNA de RET063, um Vetor Binário Selda-GUS tipo RLM407: LB> <p-AtAct2i::c-dsda/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>.

14. SEQ ID NO: 14 Construção Artificial: inserto de T-DNA de RETO 19, um Vetor Binário Selda-GUS tipo RLM407: LB> <p-AtAct2i::c-Jao7/pa: :t-NOS p-PcUBI: :c-gusINT::t-NOS> RB>.

15. SEQID NO: 15 Construção Artificial: inserto de T-DNA de RETO 17, um Vetor Binário Selda-GUS tipo RLM407: LB> <p-NOS:c-d«fo/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>.

16. SEQ ID NO: 16 Construção Artificial: inserto de T-DNA de RETO 15, um Vetor Binário Selda-GUS tipo RLM407: LB> <p-NOS:c-Jao7/ko::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>.

17. SEQID NO: 17 Região promotora da Actina 2 deArabidopsis thaliana com primeiro intron (955 - 1397); comprimento total:1408 nucleotídeos.

Exemplos:A menos que de outro modo especificado, todos os produtosquímicos foram da Mallinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA),Phytotechnology Laboratories (Shawnee Mission, KS5 USA), EMDChemicals, Inc. (Gibbstown, NJ, USA), Alfa Aesar e Sigma (St. Louis, MO,USA).

A. Estoques usados no meio:

1. Sais maiores B5 (10X estoque)

a. 0,25 M de KNO3 (Nitrato de potássio)

b. 0,01 M de CaCl2*2H20 (Cloreto de cálcio)

c. 0,01 M de MgSO4*7H20 (Sulfato de magnésio)

d. 0,01 M de (NH4)2SO4 (Sulfato de amônio)

e. 0,01 M de NaH2P04*H20 (Fosfato de sódio)

2. Sais menores B5 (100X estoque)

a. 5 mM de H3BO3 (Ácido bórico)

b. 10 mM de MnS04*H20 (Sulfato de manganês)

c. 0,7 mM de ZnSO4* 7H20 (Sulfato de zinco)

d. 0,45 mM de KI (Iodeto de potássio)

e. 0,1 mM de Na2Mo04*2H20 (Ácido molíbdico)

f. 0,01 mM de CuSO4* 5H20 (Sulfato cúprico)

g. 0,01 mM de CoCl2*6H20 (Cloreto de cobalto)

3. Vitaminas B5 (100X estoque)

a. 0,055 M de Mio-inositol

r

b. 0,8 mM de Acido nicotínico

c. 0,5 mM de Piridoxina-HCl

d. 3 mM de Tiamina-HCl

4. Sais maiores MS (10X estoque)

a. 0,2 M de NH4NO3 (Nitrato de amônio)

b. 0,2 M de KNO3 (Nitrato de potássio)

c. 30 mM de CaCl2*2H20 (Cloreto de cálcio)d. 15 mM de MgSO4* 7H20 (Sulfato de magnésio)

e. 12,5 mM de KH2PO4 (Fosfato de potássio)

5. Sais menores MS (100X estoque)

a. 10 mM de H3BO3 (Ácido bórico)

b. 13 mM de MnS04*H20 (Sulfato de manganês)

c. 3 mM de ZnSO4*7H20 (Sulfato de zinco)

d. 0,5 mM de KI (Iodeto de potássio)

e. 0,1 mM de Na2Mo04*2H20 (Ácido molíbdico)

f. 0,01 mM de CuSO4* 5H20 (Sulfato cúprico)

g. 0,01 mM de CoCl2*6H20 (Cloreto de cobalto)

6. Ferro MSIII (100X estoque)

a. 10 mM de FeS04*7H20 (Sulfato ferroso)

b. 10 mM de Ci0H14O8Na2N2*2H2O (NaEDTA)B. Composição do meio

A menos que de outro modo indicado abaixo o meio pode serutilizado para todos os três dos tecidos de explante preferidos para os métodosda invenção.

1. Meio de germinação GM (sólido) em Placa de Petri de 25 χ100 mm ou caixas de cultura Plantcon® (Sigma):

a. IX Sais maiores B5,

b. IX Sais menores B5,

c. IX Ferro MSIII,

d. 2% de Sacarose,

e. IX Vitaminas B5,

f. 5 uM de BAP (opcional),

g. 0,8% de Ágar Purificado (Sigma);

h. pH 5,8.

2. Meio YEP (sólido e líquido) em frasco de Erlenmeyer ouPlacas de Petri de 15 χ 100 mm:a. 10 g/L de Bacto-peptona (Difco; Becton Dickinson & Co.,Cockeysville, MD, USA),

b. 5 g/L de Extrato de levedura (Difco),

c. 5 g/L de NaCl,

d. Antibióticos apropriados para a seleção,

e. 1,2% de ágar granulado (Difco) sólido apenas;

f. pH 7,0.

3. Meio de Propagação MODPROP (sólido) em Placa de Petride 25 χ 100 mm: (MÉTODO C)

a. IX Sais maiores MS,

b. IX Sais menores MS,

c. IX Ferro MSIII,

d. IX Vitaminas B5,

e. 3% de Sacarose

f. 0,22 a 1,12 mg/L (1 μΜ a 5 μΜ) de BAP (preferivelmentede cerca de 1 μΜ)

g. 0,8% de Agar Purificado (Sigma)

g. pH 5,8

4. Meio de co-cultivo CCM (líquido):

a. 1/10 X Sais maiores B5,

b. 1/10 X Sais menores B5,

c. 1/10 X Ferro MSIII,

d. 1 X Vitaminas B 5

e. 3% de Sacarose,

f. 20 mM de ácido 2-[N-morfolino]etanossulfônico(MES; Pm = 213,26 g/Mol),

g. 200 μΜ de acetosseringona (AS),

h. 0,72 μΜ a 1,44 μΜ de GA3 (Ácido Giberélico; Pm = 346,38g/Mol)i. BAP (6-benzilaminopurina; Pm = 225,25 g/mol): 7,5 μΜ.

j. Método C apenas: 400 mg/L de L-cisteína (3,3 mM)(Sigma)

k. pH 5,4.

5. Meio de co-cultivo CCM (sólido) em Placas de Petri de 15 χ100 mM:

a. 1/1OX Sais maiores B5,

b. 1/1OX Sais menores B5,

c. 1/1OX Ferro MSIII,

d. IX Vitaminas B5,

e. 3% de Sacarose,

f. 20 mM de Ácido 2-[N-morfol!no]etanossulfônico (MES)

g. 200 μΜ de acetosseringona AS,

h. 0,72 μΜ a 1,44 μΜ de GA3 (Ácido giberélico; Pm = 346,38g/Mol)

i. BAP (6-benzilaminopurina; Pm = 225,25 g/mol): 7,5 μΜ.

j. Compostos de tiol,

(i). 100 a 1000 g/L de L-cisteína (Pm = 121,16 g/Mol;Sigma); preferivelmente: Método B e C: 400 mg/L de L-cisteína (3,3 mM); Método A: 1 g/l (8,25 mM) de L-cisteína

(ii). 0 a 1 mM ou 154,2 mg/L de DTT (Fisher Scientific,Fair Lawn, NJ, USA),

(iii). Oal mM de tiolsulfato de sódio anidro (158,1 mg/L)ou tiolsulfato de sódio pentaidratado 245 mg/L(Mallinckrodt, Paris, KY, USA), Método A: 1 mM deditiotreitol, 1 mM de tiossulfato de sódio

k. 0,5% de Ágar Purificado;

1. pH 5,4.

6. Meio de lavagem Modwash (líquido):a. IX Sais maiores B5,

b. IX Sais menores B5,

c. IX Ferro MSIII,

d. 3% de Sacarose,e. IX Vitaminas B5

f. 30 mM de MES5

g. 350 mg/L Timentina®

h. pH 5,6

6. Meio de indução de broto SIM (líquido):a. IX Sais maiores B5,

b. IX Sais menores B5,

c. IX Ferro MSIII,

d. IX Vitaminas B5,

e. 3% de Sacarose,f. 3mMdeMES,

g. 1 μΜ a 7,5 μΜ (preferivelmente 1 μΜ) BAP

h. 250 mg/L de Timentina®

i. 0,8% de Agar Purificado;j. pH 5,6.

5. Meio de indução de broto SIM (sólido) em Placas de Petri

de 20 χ 100 mM:

a. IX Sais maiores B5,

b. IX Sais menores B5,

c. IX Ferro MSIII,d. IX Vitaminas B5,

e. 3% de Sacarose,

f. 3 mM de MES,

g. 1 μΜ a 7,5 μΜ (preferivelmente de cerca de 1 μΜ) BAP.

h. 5 μΜ de Cinetinai. 250 mg/L de Timentina®

j. Composto de seleção quando apropriado,

k. 0,8% de Ágar Purificado;

l. pH 5,6.

7. Meio de alongamento de broto SEM (sólido) em Placas de

Petri de 20

χ 100 mM:

a. IX Sais maiores MS,

b. IX Sais menores MS,

c. IX Ferro MSIII,

d. IX Vitaminas B5,

e. 3% de Sacarose,

f. 3 mM de MES,

g. 50 mg/L de L-asparagina (0,378 mM),

h. 100 mg/L de Acido L-piroglutâmico (0,775 mM),

i. 0,1 mg/L de IAA (0,57 μΜ),

j. 0,5 mg/L de GA3 (1,44 μΜ),

k. 1 mg/L de trans-zeatin ribosídeo (2,85 μΜ),

l. 250 mg/L de Timentina®

m. Composto de seleção quando apropriado,

n. 0,8% de Agar Purificado;o. pH 5,6.

7. Meio de enraizamento RM (sólido) em Placa de Petri de 25χ 100 mm ou caixas de cultura Plantcon® (Sigma):

a. 1A X Sais maiores B5,

b. 1A X Sais menores B5,

c. IX Ferro MSIII,

d. 2% de sacarose,

e. 3 mM de MES,f. 1 mg/L (5 μΜ) de ácido indol-butírico (IBA, Pm = 203,24g/Mol)

g. 0,8% de Agar Purificado; Método C apenas: 250 mg/L deTimentina®

h. pH 5,6.

Exemplo 1: Esterilização e germinação de sementes de soja

Virtualmente qualquer semente de qualquer variedade de sojapode ser utilizada no método da invenção. Uma variedade de cultivares desoja (incluindo Jack, Williams 82 e Resnik) são apropriadas para atransformação da soja. As sementes de soja são esterilizadas em uma câmaracom um gás cloro produzido pela adição de 3,5 ml de HCl 12 N às gotas em100 ml de alvejante (Hipoclorito de Sódio a 5,25%) em um dessecador comuma tampa firmemente ajustada. Depois de 24 a 48 horas na câmara, assementes são removidas e aproximadamente 18 a 20 sementes são plaqueadasem meio GM sólido com ou sem 5 μΜ de 6-benzil-aminopurina (BAP) emPlacas de Petri de 25 χ 100 mm. As mudas sem BAP são mais alongadas e asraízes se desenvolvem, especialmente a formação de raiz secundária e lateral.BAP fortalece a muda pela formação de uma muda mais curta e maiscorpulenta.

As mudas de sete dias de idade cultivadas na luz (>100μΜ/πι28) a 250C são usadas para material de explante para os três tipos deexplante. Neste momento, o revestimento da semente rompeu e o epicótilocom as folhas unifoliadas cresceu, no mínimo, até o tamanho dos cotilédones.O epicótilo deve ter pelo menos 0,5 cm para evitar o tecido de nócotiledonário (visto que os cultivares de soja e os lotes de semente podemvariar no momento do desenvolvimento uma descrição do estágio degerminação é mais preciso do que um tempo de germinação específico).

Exemplo 2: Cultivo e preparação de Cultura de Agrobacterium

As culturas de Agrobacterium são preparadas riscando-se aAgrobacterium (por exemplo, A. tumefaciens ou A. rhizogenes) carregando ovetor binário desejado sobre meio de cultivo de YEP sólido e incubando a25°C até que as colônias apareçam (cerca de 2 dias). Dependendo dos genesmarcadores selecionáveis presentes no plasmídeo Ti ou Ri, o vetor binário eos cromossomas bacterianos, compostos de seleção diferentes serão usadospara a seleção de A. tumefaciens e rhizogenes no meio YEP sólido e líquido.Várias cepas de Agrobacterium podem ser usadas para o método detransformação

Depois de aproximadamente dois dias, uma única colônia(com um palito de dente estéril) é selecionada e 50 ml de YEP líquido sãoinoculados com antibióticos e agitados a 175 rpm (25°C) até que uma OD600entre 0,8 a 1,0 é atingida (aproximadamente 2 d). Estoques de trabalho deglicerol (15%) para a transformação são preparados e um ml de estoque deAgrobacterium aliquotado em tubos de Eppendorf de 1,5 ml depoisarmazenados a -80°C.

No dia anterior à inoculação de explante, 200 ml de YEP sãoinoculados com 5 μL a 3 ml de estoque de trabalho de Agrobaeterium em umfrasco de Erlenmeyer de 500 ml. Agitar o frasco durante a noite a 25°C atéque a OD600 esteja entre 0,8 e 1,0. Antes de preparar os explantes de soja,pelotizar a Agrobaeteria pela centrifugação por 10 min a 5.500xg a 20°C.Recolocar a pelota em suspensão em CCM líquido até a densidade desejada(OD60O 0,5 a 2,0) e colocar na temperatura ambiente pelo menos 30 min antesdo uso.

Exemplo 3: Preparação de explante e co-cultivo (inoculação)As mudas neste momento têm epicótilos alongados de pelomenos 0,5 cm mas no geral entre 0,5 e 2 cm. Os epicótilos alongados até 4 cmno comprimento foram utilizados com sucesso. Os explantes são depoispreparados com:

i) com ou sem algumas raízes,ii) com um parcial, um ou ambos os cotilédones, todas asfolhas pré-formadas são removidas incluindo o meristema apical e o nodolocalizado no primeiro conjunto de folhas é machucado com diversos cortesusando um bisturi afiado.

Estes cortes no nodo não apenas induz a infecção pelaAgrobacterium mas também distribui as células de meristemas axilares edanifica os brotos pré-formados. Depois do ferimento e preparação, osexplantes são colocados em um Placa de Petri e subseqüentemente co-cultivados com a mistura de CCMJAgrobaeterium líquida por 30 minutos. Osexplantes são depois removidos do meio líquido e plaqueados no topo de umpapel de filtro estéril em 15 χ 100 mM de placas de Petri com meio de co-cultivo sólido. Os tecidos alvo feridos são colocados tal que eles estejam emcontato direto com o meio.

Exemplo 4: Indução de broto

Depois de 3 a 5 dias de co-cultivo no escuro a 25°C, osexplantes são enxaguados em meio SIM líquido (para remover a Agrobacteriaem excesso) antes de colocar no meio SIM sólido. Aproximadamente 5explantes são colocados tal que o tecido alvo esteja em contato direto com omeio. Durante as 2 primeiras semanas, os explantes podem ser cultivados comou sem meio seletivo. Preferivelmente, os explantes são transferidos em SIMsem seleção por um semana.

Enrolar as placas com fita micropore 3M (3M, St. Paul,Minnesota, USA) e colocar em uma câmara de cultivo por duas semanas comuma temperatura em média de 25°C sob ciclo de 18 h de luz/6 h escuro a 70-100 μΕ/m s. Várias intensidades de luz e comprimentos de onda, regimes deseleção e o SIM foi testado para este explante. Os explantes permanecerão nomeio SIM com ou sem seleção até que o crescimento de broto de novo ocorrana área alvo (por exemplo, meristemas axilares no primeiro nodo acima doepicótilo). As transferências para meio fresco podem ocorrer durante estetempo. Os explantes são transferidos do SIM com ou sem seleção para SIMcom seleção depois de cerca de uma semana. Neste momento, existedesenvolvimento de broto de novo considerável nos nodos primários para osexplantes de muda.

Preferivelmente, todos os brotos formados antes datransformação serão removidos até 2 semanas depois do co-cultivo paraestimular novo crescimento dos meristemas. Isto ajuda a reduzir quimerismosnos transformantes primários e aumentar a amplificação de célulasmeristemáticas transgênicas. Durante este tempo o explante pode ser cortadoou não em pedaços menores (isto é, destacar o nodo do explante cortando-se oepicótilo).

Exemplo 5: Alongamento de broto

Depois de 2 a 4 semanas (ou até que uma massa de brotostenha se formado) no meio SIM (preferivelmente com seleção), os explantesserão transferidos para meio SEM que estimulará o alongamento de broto dosbrotos primórdios. Este meio pode conter ou não um composto de seleção.

Depois de cada 2 a 3 semanas, transferir os explantes parameio SEM fresco (preferivelmente contendo seleção) depois cuidadosamenteremover o tecido morto. Os explantes devem ser mantidos juntos e nãofragmentados em pedaços e manter-se um tanto saudável. Os explantescontinuarão a ser transferidos até que o explante morra ou os brotos sealonguem. Os brotos alongados >3 cm são removidos e colocados em meioRM por cerca de 1 semana tempo no qual as raízes começam a se formar. Nocaso de explantes com raízes, eles são transferidos diretamente para o solo. Osbrotos enraizados são transferidos para o solo e fortificados em uma câmarade cultivo por 2 a 3 semanas antes de transferir para a estufa. As plantasregeneradas obtidas usando este método são férteis e produziram em média500 sementes por planta.

A expressão de GUS transitória depois de 5 dias de co-cultivo com Agrobacterium tumefaciens é muito difundida nos explantesde meristema axilar da muda especialmente nas regiões de ferimentodurante a preparação de explante. Os explantes foram colocados em meiode indução de broto sem seleção para observar como o nodo primário responde à indução e regeneração de broto. Até aqui, mais do que 70%dos explantes formaram novos brotos nesta região. A expressão do geneGUS é estável depois de 14 dias em SIM, implicando a integração do T-DNA no genoma da soja. Além disso, experimentos preliminaresresultaram na formação de brotos positivos em GUS que se formamdepois de 3 semanas em SIM.

Exemplo 6: Curva de morte sobre explante de meristema axilarda muda não inoculada.

As curvas de morte para a toxicidade de D-serina sobre tecidosde soja não infectados com Agrobacterium foram realizadas nos explantes de meristema axilar. Trinta explantes foram preparados como descrito acima noexemplo 1 e cultivados em SIM contendo 0 mM, 3 μΜ, 30 μΜ, 300 μΜ, 3mM, 30 mM ou 60 mM de D-serina por um total de 4 semanas. Depois destetempo, a porcentagem de explantes com novos brotos primórdios, isto é, oaparecimento de brotos múltiplos, foram contados. Neste experimento, uma redução na regeneração ocorreu entre 3 e 30 mM e apenas 30% deregeneração nos explantes expostos a 60 mM de D-serina foram observados(Figura 1).

Exemplo 7: Curva de morte para D-Serina em explantes demeristema axilar da muda inoculada com Agrobacterium.

As curvas de morte para seleção de meristema axilar da mudaem D-serina (SAM) para 3 cultivares de soja foram realizadas com e seminfecção por Agrobaeterium no nível de indução de broto. Para cada cultivar,explantes foram cortados e inoculados com A. tumefaciens cepaAGLl/pREW008 (nenhum controle de gene dsdA), 10 explantes inoculadoscom AGLl/pRET017 (nosP-úfrda-nosT) e 5 explantes não foram inoculados.Depois do co-cultivo, os explantes em SAM foram transferidos no meio deindução de broto com 0, 10, 30, 50 ou 70 mM de D-serina. A sobrevivênciados explantes depois de 4 semanas na indução de broto foi observada e osníveis de seleção apropriados de D-serina foram descobertos estar entre 30 e50 mM (Figura 2).

Exemplo 8a: Estabelecimento da curva de morte com D-Serinanos explantes de meristema axilar inoculados

De modo. a estabelecer um nível eficaz de seleção durante aindução e alongamento de broto, uma ampla faixa de concentrações de D-Serina foi inicialmente explorada. Os explantes de meristema axilar de sojaforam preparados a partir de mudas de 7 dias de idade do Dairiland cultivar98043, como descrito acima nos Exemplos 1 e 3.

Agrobacterium rhizogenes cepa SHAO17 com o plasmídeoSuper Vir pSBl e contendo os plasmídeos binários pRETO 17 ou pREW008foram preparados como descrito no Exemplo 2. pRETO 17 contém nosP-c-dlsda/na-nosT e pPcUBI-gusINT-nosT (Exemplo 9). pREW008 contém nosP-bar-nosT e pPcUBI-gusINT-nosT e foi usado como um vetor de controle(Exemplo 9).

Os explantes foram manuseados como descrito acima noExemplo 4. Depois de um semana em meio de indução de broto (SIM) semnenhuma seleção, os explantes foram transferidos para o meio SIM contendovárias concentrações de D-serina variando de 0 a 15 a 30 a 45 mM. Todos osexplantes de regeneração (almofadas de broto) foram transferidos para o meiode alongamento de broto (SEM) contendo 3 mM de D-serina depois de três eseis semanas de incubação. Os brotos alongados foram transferidos para omeio de enraizamento (RM) e triados pela expressão de GUS e análise deTaqman.Tabela 1. Porcentagem de explantes por construçãoregenerando em várias concentrações de D-serina depois de 3 semanas nomeio de indução de broto (SIM).

D-Ser em SIM: OmM 15 mM 30 mM 45 mMREWOO 8 79,0 76.9 55,3 21,9RETO 17 74,4 78,1 61,2 25,5

Tabela 2. Porcentagem de explantes por construção quesobrevivem depois de três semanas no meio de alongamento de broto (SEM)

+ 3 mM de D-serina.

D-Ser em SIM: OmM 15 mM 30 mM 45 mMREW008 94,7 72,1 34,5 2,6RETO 17 82,8 74,1 33,6 4,9

Os níveis crescentes de D-serina em meio de indução de brotodiminuiu a porcentagem de explantes que regeneraram e formaram almofadasde broto (Figura 3). O tamanho das almofadas de broto que formaramdiminuíram conforme os níveis de D-serina aumentaram. Adicionalmente, aformação de um calo friável marrom aumentou com as concentrações de D-serina crescentes. Pouca diferença foi observada na morfologia da almofadade broto entre as construções contendo dsda (RETO 17) e de controle(REW008) durante a indução de broto (Figura 3). Não houve nenhumalongamento de broto em 3 mM de D-Ser nestes explantes vindo de 30 ou 45mM de D-Ser durante a indução de broto. Poucos brotos alongaram destesexplantes que foram expostos a 15 mM de D-Ser durante a indução de broto(dados não mostrados). Os ensaios de GUS conduzidos por todo osexperimentos mostraram setores positivos ao GUS nas almofadas de brotoproduzidas depois de 3 semanas em meio de indução de broto tanto depRETO 17 quanto de pREW008. Os ensaios de GUS e a análise de Taqman(uidA è dsda) foram todos negativos nos poucos brotos alongados queformaram a 15 mM de D-Serina durante a indução de broto e foramtransferidos para 3 mM de D-Serina no alongamento de broto. Nenhum brotoalongado foi observado depois da incubação em concentrações mais altas doque 15 mM de D-Serina durante a indução de broto.Exemplo 8b: Curvas de morte de D-alanina e D-alanina/D-serina usando Explantes de nodo primário

As curvas de morte para a seleção de D-alanina com e sem D-serina a 7,5 mM foram conduzidas para experimentos futuros usando daolcomo um marcador de gene selecionável. A combinação de usar D-alanina eD-serina também foi realizada para o gene daol que pode metabolizar tantoD-alanina quanto D-serina. Os plasmídeos binários RETO 19 (Pactin-ífao/,Pubi-gus) e REW008 (Pnos-bar, Pubi-gus) foram usados como um controlepositivo e um negativo, respectivamente e o T-DNA mobilizado na sojausando Agrobacterium rhizogenes cepa SHA017pSBl.

Os explantes foram inoculados com Agrobacterium, co-cultivados por 5 dias, depois movidos em meio de indução de broto com ousem seleção por uma semana. Depois deste tempo, os explantes foramtransferidos sobre novo SIM com seleção.

No experimento 1, D-alanina foi adicionada ao meio SIM nasseguintes concentrações: O, 3, 7,5, 10, 20, 30 e 50 mM.

No experimento 2, D-alanina foi adicionado nas mesmasconcentrações com D-serina a 7,5 mM.

O planejamento experimental foi como segue: T(tratamento)l:7 explantes inoculados com REW008 com 1 semana de recuperação; T2: 7explantes inoculados com REW008 sem nenhuma recuperação;

Os resultados do experimento são mostrados na Tabela 2b. Afreqüência de regeneração não cai abaixo de 70% até que os explantes foramexpostos a 30 mM de D-alanina imediatamente depois do co-cultivo. Estaqueda não foi observada nos explantes com recuperação até 20 mM de D-alanina. Quando em combinação com D-serina, os explantes tiveramregeneração reduzida nas concentrações mais baixas, entre 7,5 e 10 mM.

Tabela 2b. Resultados da curva de morte de D-alanina combase na regeneração depois de 3 semanas em SIM com tratamentocorrespondente.

Experimento 1: Curva de Morte de D-alanina - regeneração(%) depois de 3 semanas em SIM

<table>table see original document page 134</column></row><table>

Exemplo 9: Vetores de transformação usado para avaliar genes dsda e daol

Diversos vetores de transformação foram feitos contendo ogene dsda ou daol. Uma construção que compreende o marcador de seleçãobar foi usado como um controle nos experimentos de transformação (Tabela3). A maioria do vetores foram desenvolvidos usando o vetor binário pSUN3como fundo com a excepção de pLM407 e pLM274 que tiveram um fundoGateway (Tabela 3). A proteína DSDA usa a D-Serina apenas como osubstrato, ao contrário da proteína DAOl que enzimaticamente oxida umafaixa mais ampla de D-Aminoácidos, por exemplo, D-Ser e D-Ala.

Tabela 3 Descrição de vetores de transformação usados para osexperimentos no estabelecimento da transformação com genes dsda e daolcomo o marcador de seleção. EcdsdA = E. coli dsda·, daol = gene da D-Aminoácido oxidase; bar = fosfinotricina acetiltransferase; p-PcUbi4-2 =promotor ubi da salsa; STPT = translocador de triose fosfato de Arabidopsis;pNos = promotor da nopalina sintase; p-AtACT = promotor da actina de

Arabidopsis thaliana; t-OCS3' = terminador OCS3'; t-NOS = terminador nos.

<table>table see original document page 134</column></row><table>controle de pRLM274 para pRLM407 (fundo de passagem) econtrole de pREW008 para todas as construções remanescentes (fundo pSUN 3)

Exemplo 10a: Efeito da seleção de D-Serina quando do usodos genes dsda ou daol sob promotores diferentes.

Os explantes de meristema axilar de soja foram preparados apartir de mudas de 7 dias de idade a partir da Dairiland cultivar 93061, comodescrito acima nos Exemplos 1 e 3.

Agrobacterium rhizogenes cepa SHAO17 com o plasmídeoSuper Vir pSBl e contendo os plasmídeos binários descritos na Tabela 3foram preparados como descrito no Exemplo 2.

Os explantes foram manuseados como descrito no Exemplo 4.Depois de um semana em meio de indução de broto (SIM) sem nenhumaseleção, os explantes foram transferidos para SIM contendo D-serina a 7,5mM. Todos os explantes de regeneração (almofadas de broto) foramtransferidos para o meio de alongamento de broto (SEM) contendo 5 mM deD-serina depois de três e seis semanas de incubação. Os brotos dealongamento foram transferidos para o meio de enraizamento (RM) e triadospela expressão de GUS e/ou análise de Taqman.

Como descrito na Tabela 4 o promotor da ubiquitina da salsafunciona mais eficazmente para direcionar a expressão do gene dsda. Éconhecido que o promotor da ubiquitina da salsa é um promotor altamenteconstitutivo nas mudas axilares da soja com base na análise de expressão degene do gene repórter uidA. O promotor da actina da Arabidopsis também foicapaz de conferir os níveis resistentes de expressão para células de sojaquando do uso do gene dsda mas em uma eficiência significantemente maisbaixa do que o promotor da ubiquitina da salsa (Tabela 4). Nenhum brototransgênico foi obtido quando do uso do gene dsda sob o controle dospromotores NOS ou STPT. Os promotores da actina e NOS de Arabidopsisforam capazes de conferir os níveis resistentes para células de soja quando douso do gene daolfko. Neste caso a combinação de promotor e do genedaol/ko parece ter eficiência duas vezes maior quando comparado comAtActin: :daolfko.

Tabela 4 Resumo de experimentos de transformaçãoconduzidos em construções de avaliação com promotores diferentes quedirecionam genes dsda e daol sob seleção de D-Serina.

<table>table see original document page 136</column></row><table>

* Brotos positivos com base em GUS ou análise Taqman de dsda.

Controle RLM274 para RLM407 (fundo de passagem) econtrole REW008 para todas as construções remanescentes (fundo pSUN 3)

Parece que a soja requer um promotor altamente constitutivopara as plantas transgênicas selecionadas cóm o sistema de seleção de dsda. Ouso do promotor da ubiquitina da salsa resulta em uma eficiência detransformação compativelmente mais alta do que os outros promotoresnormalmente usados em plantas dicotiledôneas, tais como os promotores daActina ou o STP da Arabidopsis thaliana. Em comparação com estespromotores, a eficiência de transformação com o promotor da ubiquitina dasalsa foi significantemente mais alta. É conhecido que a seleção ótimanecessita da expressão do marcador de seleção nas células relevantes dotecido alvo (que mais tarde desdiferenciam e regeneram nas plantastransgênicas), no tempo certo e na concentração certa.

Exemplo 10b: Seleção SELDA e combinações de promotor-dsda

O efeito do promotor que direciona o gene dsda na eficiênciade transformação foi testado no protocolo de transformação. Um experimentocom 6 repetições com o tempo (experimentos de corte com 2 pesquisadores)foi completado com 4 combinações de promotor-dsda (tratamentos),RLM407, RLM431, RLM432, RLM433 e um mínimo de 50 explantes portratamento (Tabela 4a). Em 2 das repetições, RLM254 foi incluído e em umarepetição, RLM434 foi incluído. Os explantes foram preparados ealeatoriamente divididos em um dos 6 tratamentos (plasmídeos carregados emA. rhizogenes cepa SHAO17/ pSBl) por 30 minutos. Depois da inoculação, osexplantes foram co-cultivados por 5 dias no escuro em meio de co-cultivosólido contendo 5 μΜ de cinetina. O protocolo foi seguido como estabelecidoacima com o regime de seleção de D-serina: uma semana na indução de brotosem seleção, 3 semanas em meio de indução de broto com D-serina a 7,5 mM,depois 5 mM de D-serina por todo o alongamento de broto. Apenas um brotopor explante foi removido para eliminar a regeneração de clones. Ostransformantes putativos foram confirmados quanto a presença do gene dsdausando a PCR quantitativa (TaqMan) e a eficiência de transformação (TE) foicalculada usando a fórmula: [(número de eventos independentes confirmadosde TaqMan positivo em dsda/mimero total de explantes inoculados (n))*100].combinações de promotor -dsda testadas (Tabela 4b). As construçõescontendo as combinações de ubiquitina-úfcúfo, RLM407 e RLM434, deram aseficiências de transformação mais altas neste estudo.

Os eventos transgênicos foram recuperados de todas as

Tabela 4a. Promotores usados para direcionar o gene dsda em6 construções.

<table>table see original document page 137</column></row><table>Tabela 4b. Eflciências de transformação para explantesinoculados com combinações de promotor-dsda diferentes e seleção de D-serina.

<table>table see original document page 138</column></row><table>

Exemplo 11: Comparação de dois marcadores selecionáveis:

dsda e bar

Os experimentos de transformação foram conduzidos paracomparar as eficiências de transformação com dois sistemas de seleção, isto é,dsda/D-Serina, bar/fosfinotricina (Tabela 5). O veto binário LM407 carregaambos os marcadores selecionáveis, dsda e bar sob os promotores pPcUbi epNos respectivamente. O vetor LM274 abriga o gene bar sob o controle dopromotor pNos e foi usado com êxito com o método de transformação axilarda soja em conjunção com a seleção com fosfinotricina.

Os explantes de meristema axilar de soja foram preparados apartir de mudas com 7 dias de idade da Dairiland cultivar 93061, comodescrito acima nos Exemplos 1 e 3.

A Agrobacterium rhizogenes cepa SHAO17 com o plasmídeoSuper Vir pSBl e contendo os plasmídeos binários descritos na Tabela 3foram preparados como descrito no Exemplo 2.

Os explantes foram manuseados como descrito no Exemplo 4.Depois de um semana em meia de indução de broto (SIM) sem nenhumaseleção, os explantes foram transferidos para SIM contendo D-serina a 7,5mM ou 3 mg/l de fosfinotricina. Todos os explantes de regeneração(almofadas de broto) foram transferidos para o meio de alongamento de broto(SEM) contendo 5 mM de D-serina ou 5 mg/l de fosfinotricina depois de trêssemanas de incubação em SIM. Os brotos do alongamento foram transferidospara o meio de enraizamento (RM) e triados pela análise de Taqman.

Tabela 5. Comparação na avaliação de duas construções e doissistemas de seleção.

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Um aumento de duas vezes na eficiência de transformação foiobtido quando do uso da mesma construção pRLM407 com seleção de D-Serina. Entretanto, vale a pena mencionar que isto representa um número detamanho pequeno de explantes que foram usados para a transformação.

Exemplo 11: Seleção SELDA e hormônios de co-cultivo

No primeiro experimento, o planejamento experimental incluiurepetições com o tempo (experimentos de corte por 3 pesquisadores) com4 meios de co-cultivo diferentes (tratamentos) por repetição e um mínimo de50 explantes por tratamento. O co-cultivo sólido foi preparado comoestabelecido no início exceto o hormônio, BAP, foi substituído com um dos 4hormônios seguintes: 7,5 μΜ de BAP, 1,0 μΜ de cinetina, 5,0 μΜ de cinetinaou 7,5 μΜ de cinetina.

No segundo experimento, o planejamento experimental incluiu3 repetições com o tempo (experimentos de corte por 1 pesquisador) com 5meios de co-cultivo diferentes (tratamentos) por repetição e um mínimo de 50explantes por tratamento. O co-cultivo sólido foi preparado substituindo-seBAP com um dos 5 hormônios seguintes: 7,5 μΜ de BAP, 1,0 μΜ decinetina, 3 μΜ de cinetina, 5 μΜ de cinetina ou 7 μΜ de cinetina.

Para ambos os experimentos, os explantes foram preparados,inoculados com 50 ml de meio de co-cultivo líquido contendo vetor quecarrega SHA017/pSBl RLM407 por 30 minutos e depois aleatoriamentecolocado em 1 de 4 ou 5 tratamentos de meio de co-cultivo sólido,respectivamente. O protocolo foi seguido como estabelecido acima com oregime de seleção de D-serina: uma semana na indução de broto sem seleção,3 semanas em meio de indução de broto com D-serina a 7,5 mM, depois 5mM de D-serina por todo o alongamento de broto. Apenas um broto porexplante foi removido para eliminar a regeneração de clones. Ostransformantes putativos foram confirmados quanto a presença do gene dsdausando a PCR quantitativa (TaqMan) e a eficiência de transformação (TE) foicalculada usando a fórmula: [(número de eventos independentes confirmadosde TaqMan positivo em dsda/rmmero total de explantes inoculados (n))*100].

Em ambos os experimentos, os eventos transgênicos foramrecuperados de todos os tratamentos testados (Tabela 6 e 7). Além disso, apresença de cinetina no meio de co-cultivo resultou em eficiências detransformação médias mais altas do que quando os explantes foram co-cultivados na presença de BAP.

Tabela 6. Eficiência de transformação de explantes co-cultivados no meio de co-cultivo contendo 4 regimes de hormônio diferentes.

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<110> BASF Plant Science GmbH<120> SELEÇÃO DE D-AMINOÁCIDO PARA A SOJA<130> AE 20051280/PF 57689<160> 17

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1<211> 1329<212> DNA

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1329)

<223> D-serina desidratase da E. coli gene [dsdA] /CDS<400> 1

atg gaa aac gct aaa atg aac tcg ctc ate gcc cag tat ccg ttg gta 48

Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val1 5 10 15

aag gat ctg gtt gct ctt aaa gaa acc acc tgg ttt aat cct ggc acg 96

Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr

20 25 30

acc tca ttg gct gaa gat tta cct tat gtt ggc ctg acc gaa cag gat 144

Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp

35 40 45

gtt cag gac gcc cat gcg cgc tta tcc cgt ttt gea ccc tat ctg gea 192

Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala

50 SS 60

aaa gea ttt cct gaa act gct gcc act ggg ggg att att gaa tca gaa 240

Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Giy Gly lie lie Glu ser Glu65 70 75 80

ctg gtt gcc att cca gct atg caa aaa cgg ctg gaa aaa gaa tat cag 288Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln

85 90 95

caa ccg ate age ggg caa ctg tta ctg aaa aaa gat age cat ttg ccc 336

Glrt Pro lle Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp ser His Leu Pro

100 105 110

att tcc ggc tcc ata aaa gea cgc ggc ggg att tat gaa gtc ctg gea 384

Ile ser Gly ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu vai Leu Ala

115 120 125

cac gea gaa aaa ctg gct ctg gaa gcg ggg ttg ctg acg ctt gat gat 432ms Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp

130 135 140

gac tac age aaa ctg ctt tet ccg gag ttt aaa cag ttc ttt age caa 480Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln145 ISO 155 160

tac age att gct gta ggc tca acc gga aat ctg ggg tta tca ate ggc 528Tyr ser ile Ala vai Gly ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu ser ile Gly

165 170 175

att atg age gcc cgc att ggc ttt aag gtg aca gtt cat atg tet gct 576

Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Vai Thr Val His Met Ser Ala

180 185 190

gat gcc cgg gea tgg aaa aaa gcg aaa ctg cgc age cat ggc gtt acg 624

Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Giy Val Thr

195 200 205

gtc gtg gaa tat gag caa gat tat ggt gtt gcc gtc gag gaa gga cgt 672

Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg210 215 220aaa gea gcg cag tet gac ccg aac tgt ttc ttt att gat gac gaa aat 720

Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn225 230 235 240

tcc cgc acg ttg ttc ctt ggg tat tcc gtc gct ggc cag cgt ctt aaa 768

Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr ser vai Ala Gly Gln Arg Leu Lys

245 250 255

geg caa ttt gcc cag caa ggc cgt ate gtc gat gct gat aac cct ctg 816Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg ile vai Asp Ala Asp Asn Pro Leu260 265 270

ttt gtc tat ctg ccg tgt ggt gtt ggc ggt ggt cct ggt ggc gtc gca 864

Phe vai Tyr Leu pro Cys Gly vai Giy Giy Gly Pro Giy Giy vai Ala

275 280 285

ttc ggg ctt aaa ctg gcg ttt ggc gat cat gtt cac tgc ttt ttt gcc 912

Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala

290 295 300

gaa cca acg cac tcc cct tgt atg ttg tta ggc gtc cat aca gga tta 960

Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu

305 310 315 320

cac gat cag att tct gtt cag gat att ggt ate gac aac ctt acc gca 1008

His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala

325 330 335

gcg gat ggc ctt gca gtt ggt cgc gca tca ggc ttt gtc ggg cgg gca 1056

Ala Asp Giy Leu Ala vai Gly Arg Ala ser Gly Phe vai Giy Arg Ala

340 345 350

atg gag cgt ctg ctg gat ggc ttc tat acc ctt age gat caa acc atg 1104

Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu ser Asp Gln Thr Met

355 360 36S

tat gac atg ctt ggc tgg ctg gcg cag gaa gaa ggt att cgt ctt gaa 1152

Tyr Asp Ket Leu Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu

370 375 380

cct tcg gca ctg gcg ggt atg gcc gga cct cag cgc gtg tgt gca tca 1200

Pro ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly pro Gln Arg vai Cys Ala ser

385 390 395 400

gta agt tac caa cag atg cac ggt ttc age gca gaa caa ctg cgt aat 1248

Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn

405 410 415

acc act cat ctg gtg tgg gcg acg gga ggt gga atg gtg ccg gaa gaa 1296

Ala Thp G-r G-r

Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met vai Pro Glu Glu

420 425 430

gag atg aat caa tat ctg gca aaa ggc cgt taa 1329

Glu Met asη Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Arg435 440

<210> 2<211> 442<212> PRT

<213> Escherichia coli<400> 2

Met Glu Asn Ala Lys Met Asn ser Leu lie Ala Gln Tyr Pro Leu vai1 5 XO 15

Lys Asp Leu vai Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe aso Pro Gly Thr20 25 30

Thr ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Glrt Asp35 40 45

Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg í»he Ala Pro Tyr Leu Ala50 55 60

Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly lie lie Glu ser Glu65 70 75 80

Leu vai Ala lie Pro Ala Het Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln85 90 95

Gln Pro Ile ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp ser His Leu pro100 105 J

Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala

IlS 120 125

His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp

130 135 140

Asp Tyr ser Lys Leu Leu ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe ser Gln145 150 155 160

Tyr Ser lie Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly

165 170 175

lie Niet ser Ala Arg lie Gly Phe Lys vai Thr vai Met ser Ala

180 185 190

Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg ser His Gly Val Thr

195 200 205

Val vai Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly vai Ala Val Glu Glu Gly Arg

215

Lys Ala Ala Gln ser Asp Pro Asn cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn

ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr ser vai Ala Gly Gln Arg Leu Lys

245 250 255

Ala Gln Phe Ala Glri Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu260 265 270

Phe vai Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala275 280 285

Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala290 295 300

Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu305 310 315 320

His Asp Gln lie ser vai Gln Asp lie Gly lie Asp Asn Leu Thr Ala325 330 335

Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala Ser Gly Phe vai Gly Arg Ala340 345

Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu ser Asp Gln Thr Met355 360 365

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Pro ser Ala Leu Ala Gly Net Ala Gly Pro Gln Arg vai Cys Ala Ser385 390 395 400

Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn405 410 415

Thr Thr His Leu vai Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met vai Pro Glu Glu420 425 430

Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Arg435 440

<210> 3<211> 1107<212> DNA

<213> Rhodosporidium toruloides

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1107)

<223> D-aminoácido oxidase de Rhodosporidium toruloides CDS-

<400> 3

atg cac tcg cag aag cgc gtc gtt gtc ctc gqa tca ggc gtt ate ggt 48

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1 5 10 15

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Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser vai His Ile

20 25 30

ctc gcg cgc gac ttg ccg gag gac gtc tcg age cag act ttc gct tca 144Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser

BS 40 45

cca tgg gct ggc gcg aat tgg acg cct ttc atg acg ctt aca gac ggt 192Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Giy

50 55 60

cct cga caa gea aaa tgg gaa gaa tcg act ttc aag aag tgg gtc gag 240pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu ser Thr Phe Lys Lys Trp vai Glu65 70 75 80

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85 90 95

gcg cag aac gaa gac ggc ttg ctc ggg cac tgg tac aag gac ate acg B36Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Giy His Trp Tyr Lys Asp He Thr

100 105 110

cca aat tac cgc ccc ctc cca tet tcc gaa tgt cca cct ggc gct ate 384Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu cys Pro Pro Gly Ala Ile

115 120 125

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130 135 140

tac ctt gea aga gag ctg cag aag ctc ggc gcg acg ttt gag aga cgg 480Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg145 150 155 160

acc gtt acg tcg ctt gag cag gcg ttc gac ggt gcg gat ttg gtg gtc 528

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

aag cga tgc acg atg gac tcg tcc gac ccc gct tet ccc gcc tac ate 672

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210 215 220

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gga gac tgg gac ttg tet gtc aac cca gag acg gtc cag cgg ate ctc 768Giy Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr vai Gln Arg Ile Leu

245 250 255

aag cac tgc ttg cgc ctc gac ccg acc ate tcg age gac gqa acg ate 816

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260 265 270

gaa ggc ate gag gtc ctc cgc cac aac gtc ggc ttg cga cct gea cga 864Glu Gly lie Glu Val Leu Arg His Asn vai Gly Leu Arg Pro Ala Arg

275 280 285

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290 295 300

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Arg Thr Lys ser Pro Leu ser Leu Gly Arg Gly ser Ala Arg Ala Ala305 310 315 320

aag gag aag gag gtc acg ctt gtg cat gcg tat ggc ttc tcg agt gcg 1008Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu vai His Ala Tyr Giy Phe Ser ser Ala

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

tag 1107<210> 4<211> 368<212> PRT

<213> Rhodosporidium toruloides <400> 4 HlS ser Gln Lys 5 Arg vai vai vai Leu Gly 10 Ser Gly vai lie 15 GlyLeu Ser Ser Ala 20 Leu Ile Leu Ala Arg 25 Lys Gly Tyr Ser Val 30 His IleLeu Ala Arg 35 Asp Leu Pro Glu ASp 40 Val ser ser Gln Thr 45 Phe Ala SerPro Trp 50 Ala Gly Ala Asn Trp 55 Thr Pro Phe Met Thr 60 Leu Thr Asp GlyPro 6S Arg Gln Ala Lys Trp 70 Glu Glu ser Thr Phe 75 Lys Lys Trp vai Glu 80Leu Val Pro Thr Gly 85 HlS Ala Met Trp Leu Lys 90 Gly Thr Arg Arg 95 PheAla Gln ASfl Glu 100 ASp Gly Leu Leu Gly 105 Hls Trp Tyr Lys ASp 110 Ile ThrPro Asn Tyr 115 Arg Pro Leu Pro Ser 120 Ser Glu Cys Pro Pro 125 Gly Ala IleGly Val 130 Thr Tyr Asp Thr Leu 135 Ser vai His Ala Pro 140 Lys Tyr Cys GlnTyr 145 Leu Ala Arg Glu Leu 150 Gln Lys Leu Gly Ala 155 Thr Phe Glu Arg Arg 160Thr Val Thr Ser Leu 165 Glu Gln Ala Phe Asp Gly 170 Ala Asp Leu Val 175 ValAsn Ala Thr Gly 180 Leu Gly Ala Lys ser 185 Ile Ala Gly Ile ASp 190 ASp GlnAla Ala Glu 195 Pro Ile Arg Gly Gln 200 Thr Val Leu vai Lys 205 ser Pro CysLys Arg 210 Cys Thr Met Asp ser Ser Asp pro Ala 220 Pro Ala Tyr IleIle 225 Pro Arg Pro Gly Gly 230 Glu Val Ile Cys Gly Thr Tyr Gly Val 240Gly ASp Trp Asp Leu 245 ser vai Asn Pro Glu Thr 250 vai Gln Arg lie 255 LeuLys His Cys Leu 260 Arg Leu Asp Pro Thr 265 Ile Ser Ser Asp Gly 270 Thr IleGlu Gly Ile 275 Glu Val Leu Arg His 230 Asn Val Gly Leu Arg 285 Pro Ala ArgArg Gly 290 Gly Pro Arg Val Glu Ala 295 Glu Arg Ile Val 300 Leu Pro Leu AspArg 305 Thr Lys Ser Pro Leu 310 Ser Leu Gly Arg Gly 315 Ser Ala Arg Ala Ala 320Lys Glu Lys Glu vai 325 Thr Leu vai HiS Ala Tyr 330 Gly Phe ser ser 335 AlaGly Tyr Gln Gln ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp vai Ala Gln Leu vai340 345 350

Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu355 360 365

<210> 5<211> 1104<212> DNA

<213> Rhodosporidium toruloides

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1104)

<223> D-aminoácido oxidase de Rhodosporidium toruloides [daol] cds,[Genbank #U60066]. Otimizado no códon

<400> 5

atg cac tct caa aaa cgc gtt gta gta ttg ggt tcg gga gtc ata ggt 48

Met His Ser Gln Lys Arg vai vai vai Leu Gly Ser Giy vai Ile Giy1 S 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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275 280 285

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290 295 300

aga acc aaa age ccc ctt tcg ctt gga aga gga age gea cgt gea gct 960Arg Thr Lys ser Pro Leu ser Leu Gly Arg Giy ser Ala Arg Ala Ala305 310 315 320

aag gaa aaa gaa gtc aca ctg gta cat gea tat ggt ttt agt agt gcc 1008Lys Glu Lys Glu vai Thr Leu vai His Ala Tyr Gly Phe Ser ser Ala

325 330 335

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340 345 350

gac gag gea ttc caa aga tac cac gat gea gcg aga gag tca aaa ctt 1104Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Giy Ala Ala Arg Glu ser Lys Leu355 360 365

<210> 6<211> 368<212> PRT

<213> Rhodosporidium toruloides<400> 6

Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile GlyIS 10 15

Leu ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile20 25 30

Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala ser35 40 45

Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly50 55 60

Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu65 70 75 80

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Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr100 105 110

Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro ser ser Glu cys Pro Pro Gly Ala Ile115 120 125

Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu ser Val His Ala Pro Lys Tyr cys Gln130 135 140

Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg145 150 155 160

Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val165 170 175

Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln180 185 190

Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys195 200 205

Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile210 215 220

Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile cys Gly Gly Thr Tyr Gly vai225 230 235 240Gly Asp Trp Asp Leu ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu245 250 255

Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile260 265 270

Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg275 2SO 285

Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp290 295 300

Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala305 310 315 320

Lys Glu Lys Glu vai Thr Leu vai His Ala Tyr Gly Phe ser ser Ala325 330 335

Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp VaT Ala Gln Leu Val340 345 350

Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu355 360 365

<210> 7<211> 996<212> DNA

<213> Petroselinum crispum<220>

<221> promotor<222> (1)..(996)

<223> MTX Promotor UBI4-2 da salsa com intron interno; 99% de

homologia com o #PCCUBI42 gene Pcubi4-2 de P. crispum parapoliubiquitina.

<220>

<221> Intron<222> (406)..(993)

<223> MTX intron interno do promotor UBI4-2 da salsa; 99% de

homologia com #PCCUBI42 gene Pcubi4-2 de P. crispum parapoliubiquitina.

<400> 7

cttgactaga gaattcgaat ccaaaaatta cggatatgaa tataggcata tccgtatccg 60

aattatccgt ttgacagcta gcaacgattg tacaattgct tttttaaaaa aggaagaaag 120

aaagaaagaa aagaatcaac atcagcgtta acaaacggcc ccgttacggc ccaaacggtc 130

atatagagta acggcgttaa gcgttgaaag actcctatcg aaatacgtaa ccgcaaacgt 240

gtcatagtca gatcccctct tccttcaccg cctcaaacac aaaaataatc ttctacagcc 300

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acccccaatt ttaagaaatc ctctcttctc ctcttcattt tcaaggtaaa tctctctctc 420

tctctctctc tctgttattc cttgttttaa ttaggtatgt attattgcta gtttgttaat 480

ctgcttatct tatgtatgcc ttatgtgaat atctttatct tgttcatctc atccgtttag 540

aagctataaa tttgttgatt tgactgtgta tctacacgtg gttatgttta tatctaatca 600

gatatgaatt tcttcatatt gttgcgtttg tgtgtaccaa tccgaaatcg ttgatttttt 660

tcatttaatc gtgtagctaa ttgtacgtat acatatggat ctacgtatca attgttcatc 720

tgtttgtgtt tgtatgtata cagatctgaa aacatcactt ctctcatctg attgtgttgt 780

tacatacata gatatagatc tgttatatca ttttttttat taattgtgta tatatatatg 840

tgcatagatc tggattacat gattgtgatt atttacatga ttttgttatt tacgtatgta 900

tatatgtaga tctggacttt ttggagttgt tgacttgatt gtatttgtgt gtgtatatgt 960

gtgttctgat cttgatatgt tatgtatgtg cagccc 996

<210> 8<211> 2031<212> DNA<213> Glycine max

<220>

<221> promotor<222> (1)..(999)

<223> região promotora putativa do gene da ubiquitina da sojaCaixa TATA: 950-964

<220>

<221> TATA_sinal

<222> (950)..(964)

<223> caixa TATA putativa

<220>

<221> Intron<222> (1519)..(2031)

<223> primeiro intron localizado na 5' UTR<400> 8

aaatgaaaga aaaaggtatt cacgctctta aaataaatta gtaagcagaa attccaaaat 60

tttcagttag tccttactaa ttattaaatt atagtattaa tccaatgtga ttgcggttac 120

atcatgtacg gaaaaataat tctaatcctt gatttaaatt tgatcttgac tatttattta 1S0

ttctttattt cattttgtaa atcattttat gtatctcctg gcaagcaatt ttatccacct 240

tgcaccaaca ccttcgggtt ccataatcaa accaccttaa cttcacacca tgctgtaact 300

cacaccgccc agcatctcca atgtgaaaga agctaaaatt taataaacaa tcatacgaag 360

cagtgacaaa ataccagatg gtattaatgc tttgataaaa ttaattggaa agtataaaat 420

ggtagaaaat aataaattat aattaattta aataagataa aaaataatta aaaactaaaa 480

tgttaaaatt ttaaaaaaat tattttaaat aatatttaaa aacattaaaa atcattttaa 540

aaaatttatt tatagaacaa ttaaataaat atttcagcta ataaaaaaca aaagcttacc 600

tagccttaga agacaacttg tccaacaatt agatgatacc cattgccctt acgttttctt 660

taacatcaat tattgttttt gtcaacaagc tatcttttag ttttatttta ttggtaaaaa 720

atatgtcgcc ttcaagttgc atcatttaac acatctcgtc attagaaaaa taaaactctt 780

ccctaaacga ttagtagaaa aaatcattcg ataataaata agaaagaaaa attagaaaaa 840

aataacttca ttttaaaaaa atcattaagg ctatattttt taaatgacta attttatata 900

gactgtaact aaaagtatac aatttattat gctatgtatc ttagagaatt acttataaaa 960

atctacggaa gaatatctta caaagtgaaa aacaaatgag aaagaattta gtgggatgat 1020

tatgatttta tttgaaaatt gaaaaaataa ttattaaaga ctttagtgga gtaagaaagc 1080

tttcctatta gtcttttctt atccataaaa aaaaaaaaaa aaatctagcg tgacagcttt 1140

tccatagatt ttaataatgt aaaatactgg tagcagccga ccgttcaggt aatggacact 1200

gtggtcctaa cttgcaacgg gtgcgggccc aatttaataa cgccgtggta acagataaag 1260

ccaagcgtga agcggtgaag gtacatctct gactcegtca agattacgaa accgtcaact 1320

acgaaggact ccccgaaata tcatctgtgt cataaacacc aagtcacacc atacatgggc 1380

acgcgtcaca atatgattgg agaacggttc caccgcatat gctataaaat gcccccacac 1440

ccctcgaccc taatcgcact tcaattgcaa tcaaattagt tcattctctt tgcgcagttc 1500

cctacctctc ctttcaaggt tcgtagattt cttctgtttt tttttcttct tctttattgt 1560

ttgttctaca tcagcatgat gttgatttga ttgtgttttc tatcgtttca tcgattataa 1620

attttcataa tcagaagatt cagcttttat taatgcaaga acgtccttaa ttgatgattt 1680

tataaccgta aattaggtct aattagagtt tttttcataa agattttcag atccgtttac 1740

agcaagcctt aattgttgat tctgtagtcg tagattaagg tttttttcat gaactacttc 1800

agatccgtta aacaacagcc ttatttgttg atacttcagt cgtttttcaa gaaattgttc 1860

agatccgttg ataaaagcct tattcgttga ttctgtatgg tatttcaaga gatattgctc 1920

aggtccttta gcaactacct tatttgttga ttctgtggcc atagattagg attttttttc 1980

acgaaattgc ttcttgaaat tacgtgatgg attttgattc tgatttatct t 2031

<210> 9<211> 10096<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Vetor Binário Bar-Selda RLM407: LB> <p-NOS::c-BAR::t-NOSp-PcUBI4-2::c-dsdA/na::t-NOS> RB>.<220>

<221> misc_feature<222> (1) . . (215)

<223> Borda de T-DNA esquerda (completa) similar ao plasmídeo Ti#TIP37TD1 (de A. tumefaciens, nopalina cepa T37).

<220>

<221> misc_feature<222> (47)7.(71)<223> Região de repetição da borda de T-DNA esquerda; similar aovetor bin #AF234316 de pCambia2301.

<220>

<221> terminador<222> (233)..(485)

<223> Complemento do terminador poli-A da Nopalina Sintase deAgrobacterium.

<220>

<221> misc_feature<222> (527)..(1078)

<223> Complemento de CDS para o gene BAR; 100% homólogo a

#SHBARPA gene bar de Streptomyces hygroscopicus para a fosfinotricinaacetil transferase.

<220>

<221> promotor

<222> (1092)..(1379)

<223> Complemento de promotor do gene da nopalina sintase (Depickeret al. 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1: 561-573) EMBL no: V00087.

<220>

<221> promotor

<222> (1746).. (2741)

<223> Promotor UBI4-2 da salsa com intron interno; 99% de homologiacom o #PCCUBI42 gene Pcubi4-2 de P. crispum para apoliubiquitina; de QC28-6/JB010.

<220>

<221> misc_feature

<222> (2826).. (4154)

<223> D-serina desaminase de E. coli gene [dsdA]/CDS; de QC78-6/SUH405. [GenBank J01603]

<220>

<221> terminador

<222> (4230).. (4482)

<223> Nopalina Sintase de Agrobacterium terminador poli-A.

<220>

<221> misc_feature

<222> (4564).. (4710)

<223> Borda de T-DNA Direita; similar ao plasmídeo Ti

genbank#TIP37TD2 (de A. tumefaciens, cepa T37 de nopalina) borda 3'(direita) de T-DNA.

<220>

<221> misc_feature<222> (4647).. (4670)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA Direita; similar ao#TIP37TD2; de pCambia2301.

<220>

<221> misc_feature<222> (4875).. (5669)

<223> gene nptll /CDS; confere Resistência à Canamicina; 99%

homóloga à construção sintética #AY181092 do cassete terminador dopromotor Sl-gene nptll -S3.

<220>

<221> rep_origem

<222> (5967)..(6648)

<223> Origem de replicação ColEI

<220><221> rep_origem

<222> (7057).. (9651)

<223> origem pVSl de replicação

<400> 9

gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60

gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacàc attgcggacg tctttaatgt 120

actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180

ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240

aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300

atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360

gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420

atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480

cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggtcaa atctcggtga 540

cgggcaggac cggacggggc ggtaecggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt 600

catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga 660

gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg aecatgctct 720

tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg 780

tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc 840

gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga 900

gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg 960

gctcggtacg gaagttgací: gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg 1020

ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggctcatgg 1080

cgcgccagat ctggattgag agtgaatatg agactctaat tggataccga ggggaattta 1140

tggaacgtca gtggagcatt tttgacaaga aatatttgct agctgatagt gaccttaggc 1200

gacttttgaa cgcgcaataa tggtttctga cgtatgtgct tagctcatta aactccagaa 1260

acccgcggct gagtggctcc ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc 1320

ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatct 1380

tgatcccctg cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg 1440

cttcccaacc ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa 1500

aaccgcccag tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc 1560

gcttgcgttt tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg 1620

tttctgcgga ctggctttct acgtgttccg cttcctttag cagcccttgc gccctgagtg 1680

cttgcggcag cgtgaagctt gctatcaact ttgtatcgaa aagttggctc cgaattcgcc 1740

cttagcttga ctagagaatt cgaatccaaa aattacggat atgaatatag gcatatccgt 1800

atccgaatta tccgtttgac agctagcaac gattgtacaa ttgcttcttt aaaaaaggaa 1860

gaaagaaaga aagaaaagaa tcaacatcag cgttaacaaa cggccccgtt acggcccaaa 1920

cggtcatata gagtaacggc gttaagcgtt gaaagactcc tatcgaaata cgtaaccgca 1980

aacgtgtcat agtcagatcc cctcttcctt caccgcctca aacacaaaaa taatcttcta 2040

cagcctatat atacaacccc cccttctatc tctcctttct cacaattcat catctttctt 2100

tctctacccc caattttaag aaatcctctc ttctcctctt cattttcaag gtaaatctct 2160

ctctctctct ctctctctgt tattccttgt tttaattagg tatgtattat tgctagtttg 2220

ttaatctgct tatcttatgt atgccttatg tgaatatctt tatcttgttc atctcatccg 2280

tttagaagct ataaatttgt tgatttgact gtgtatctac acgtggttat gtttatatct 2340

aatcagatat gaatttcttc atattgttgc gtttgtgtgt accaatccga aatcgttgat 2400

ttttttcatt taatcgtgta gctaattgta cgtatacata tggatctacg tatcaattgt 2460

tcatctgttt gtgtttgtat gtatacagat ctgaaaacat cacttctctc atctgattgt 2520

gttgttacat acatagatat agatctgtta tatcattttt tttattaatt gtgtatatat 2580

atatgtgcat agatctggat tacatgattg tgattattta catgattttg ttatttacgt 2640

atgtatatat gtagatctgg actttttgga gttgttgact tgattgtatt tgtgtgtgta 2700

tatgtgtgtt ctgatcttga tatgttatgt atgtgcagcc cggatcaagg gcgaattcga 2760

cccaagtttg tacaaaaaag caggctggcg cgccggatcc tcatctaagc gcaaagagac 2820

gtactatgga aaacgctaaa atgaactcgc tcatcgccca gtatccgttg gtaaaggatc 2880

tggttgctct taaagaaaec acctggttta atcctggcac gacctcattg gctgaaggtt 2940

taccttatgt tggcctgacc gaacaggatg ttcaggacgc ccatgcgcgc ttatcccgtt 3000

ttgcacccta tctggcaaaa gcatttcctg aaactgctgc cactgggggg attattgaat 3060

cagaactggt tgccattcca gctatgcaaa aacggctgga aaaagaatat cagcaaccga 3120

tcagcgggca actgttactg aaaaaagata gccatttgcc catttccggc tccataaaag 3180

cacgcggcgg gatttatgaa gtcctggcac acgcagaaaa actggctctg gaagcggggt 3240

tgctgacgct tgatgatgac tacagcaaac tgctttctcc ggagtttaaa cagttcttta 3300

gccaatacag cattgctgtg ggctcaaccg gaaatctggg gttatcaatc ggcattatga 3360

gcgcccgcat tggctttaag gtgacagttc atatgtctgc tgatgcccgg gcatggaaaa 3420

aagcgaaact gcgcagccat ggcgttacgg tcgtggaata tgagcaagat tatggtgttg 3480

ccgtcgagga aggacgtaaa gcagcgcagt ctgacccgaa ctgtttcttt attgatgacg 3540

aaaattcccg cacgttgttc cttgggtatt ccgtcgctgg ccagcgtctt aaagcgcaat 3600

ttgcccagca aggccgtatc gtcgatgctg ataaccctct gtttgtctat ctgccgtgtg 3660

gtgttggcgg tggtcctggt ggcgtcgcat tcgggcttaa actggcgttt ggcgatcatg 3720

ttcactgctt ttttgccgaa ccaacgcact ccccttgtat gttgttaggc gtccatacag 3780

gattacacga tcagatttct gttcaggata ttggtatcga caaccttacc gcagcggatg 3840

gccttgcagt tggtcgcgca tcaggctttg tcgggcgggc aatggagcgt ctgctggatg 3900

gcttctatac ccttagcgat caaaccatgt atgacatgct tggctggctg gcgcaggaag 3960

aaggtattcg tcttgaacct tcggcactgg cgggtatggc cggacctcag cgcgtgtgtg 4020

catcagtaag ttaccaacag atgcacggtt tcagcgcaga acaactgcgt aataccactc 4080

atctggtgtg ggcgacggga ggtggaatgg tgccggaaga agagatgaat caatatctgg 4140

caaaaaacca ttaataacat ttcaacacaa cataaatcat accaaoctcc tocaaaoaaa 4200-

acccagcttt cttgtacaaa gtggagctcgtaagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcgattaagcatgt aataattaac atgtaatgcattagagtccc gcaattatac atttaatacgaggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatctatacatagttg ataagcgatc gcagcttggcatctgattgt cgtttcccgc cttcagtttagggtaaacct aagagaaaag agcgtttattaaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtcaattgccagc tggggcgccc tctggtaaggctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgcagaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatgtggagaggct attcggctat gactgggcactgttccggct gtcagcgcag gggcgcccggccctgaatga actgcaggac gaggcagcgccttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactgaagtgccggg gcaggatctc ctgtcatccctggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgcaagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgtaatgatctgga cgaagagcat caggggctcgcgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcgtcatggtgga aaatggccgc ttttctggataccgctatca ggacatagcg ttggctacccgggctgaccg cttcctcgtg ctttacggtatctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaaccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcgtcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatcccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagagttcagcagag cgcagatacc aaatactgtcttcaagaact ctgtagcacc gcctacatacgctgccagtg gcgataagtc gtgtcttaccaaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggtaectacaccg aactgagata cctacagcgtgggagaaagg cggacaggta tccggtaagcgagcttccag ggggaaacgc ctggtatcttcttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtcaaacgcggcct ttttacggtt cctggcctttgcgttatccc ctgattctgt ggataaccgtcgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgagatgcggtatt ttctccttac gcatctgtgcagtacaatct gctctgatgc cgcatagttaactgggtcat ggctgcgccc cgacacccgcgtctgctccc ggcatccgct tacagacaagagaggttttc accgtcatca cegaaacgcgcggtcgagtg gcgacggcgc ggcttgtccggccatttttg agcggccagc ggccgcgatacgcagcgacc gaagggtagg cgctttttgctatgcacagg ccaggcgggt tttaagagttaaatcgcctt ttttctcttt tatatcagtcggctttgggt tcccaatgta cgggttccggtacgtgctat ccacaggaaa gagaccttttcctagcatct gctccgtaca ttaggaaccgtagcgcatga ctaggatcgg gccagcctgcaggtcatttg acccgatcag cttgcgcacgctgccactgc gttcgtagat cgtcttgaaccggcgtgcca ggcggtagag aaaacggccgtgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcctagctcgatct cgatgtactc cggccgcccgatcaaggctt caccctcgga taccgtcacctgcatggcaa cgtgcgtggt gtttaaccgatttccgccat cggctcgccg gcagaacttgcggccgggct tgtctccctt cccttcccggacegceatca gtaccaggtc gtaatcccacacctctacgt gcccgtctgg aagctcgtagttcgacagac ggaaaacggc cacgtccatgtagagcatcg gaacgaaaaa atctggttgcggcgcaccgg ctgccggcgg ttgccgggatcacgattcac cggggcgtgc ttctgcctcgttcaacttct ccaccaaatc atcacccaac

12

atcgttcaàa catttggcaa taaagtttct 4260

tgattatcat ataatttctg ttgaattacg 4320

tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga 4380

cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 4440

tgttactaga tcggccggcc aactttatta 4500

gtaatcatgg tcatagctgt ttcctactag 4560

aactatcagt gtttgacagg atatattggc 4620

agaataatcg gatatttaaa agggcgtgaa 4680

catgtgtttt atggacagca agcgaaccgg 4740

ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg 4800

ggggatcaag atctgatcaa gagacaggat 4860

gattgcacgc aggttctecg gccgcttggg 4920

aacagacaat cggctgctct gatgccgccg 4980

ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg 5040

ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc 5100

aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg 5160

accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca 5220

ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc 5280

ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg 5B40

cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg 5400

tgacccatgg cgatgcetgc ttgccgaata 5460

tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 5520

gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 5580

tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct 5640

ttgaaaaagg aagaatgcat gaccaaaatc 5700

tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5760

tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5820

ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5880

CttCtagtgt agccgtagtt aggccaccac 5940

ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 6000

gggttggact caagacgata gttaccggat 6060

tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 6120

gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 6180

ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 6240

tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 6300

ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 6360

tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 6420

attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 6480

tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg 6540

ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc 6600

agccagtata cactccgcta tcgctacgtg 6660

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 6720

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 6780

cgaggcaggg tgccttgatg tgggcgcegg 6840

cgccctggta gattgcctgg ccgtaggcca 6900

ggccgacgcg aagcggcggg gcgtagggag 6960

agctcttcgg ctgtgcgctg gccagacagt 7020

ttaataagtt ttaaagagtt ttaggcggaa 7080

acttacatgt gtgaccggtt cccaatgtac 7140

ttcccaatgt acggctttgg gttcccaatg 7200

cgaccttttt cccctgctag ggcaatttgc 7260

gcggatgctt cgccctcgat caggttgcgg 7320

cccgcctcct ccttcaaatc gtactccggc 7380

gtgaaacaga acttcttgaa ctctccggcg 7440

aaccatctgg cttctgcctt gcctgcggcg 7500

atgccgggat cgatcaaaaa gtaatcgggg 7560

tctgtgatct cgcggtacat ccaatcagct 7620

gtttcgctct ttacgatctt gtagcggcta 7680

aggcggccgt tcttggcctt cttcgtacgc 7740

atgcaggttt ctaccaggtc gtctttctgc 7800

agtacgtccg caacgtgtgg acggaacacg 7860

tatcggttca tggattcggt tagatgggaa 7920

acactggcca tgccggccgg ccctgcggaa 7980

cggatcacct cgccagctcg tcggtcacgc 8040

atgctgcgac tatcgcgggt gcccacgtca 8100

tcgtcgccct tgggcggctt cctaatcgac 8160

tctttgcgga ttcgatcagc ggccgcttgc 8220

atgcgttgcc gctgggcggc ctgcgcggcc 8280

accacaccaa tttataccaa accaaataat 8340ttgegaccgc tcacgccgat tcctcgggct tgggggttcc agtgccattg cagggccggc 8400

agacaaccca gccgcttacg cctggccaac cgcccgttcc tccacacatg gggcattcca 8460

cggcgtcggt gcctggttgt tcttgatttt ccatgccgcc tcctttagcc gctaaaattc 8520

atctactcat ttattcattt gctcatttac tctggtagct gcgcgatgta ttcagatagc 8580

agctcggtaa tggtcttgcc ttggcgtacc gcgtacatct tcagcttggt gtgatcctcc 8640

gccggcaact gaaagttgac ccgcttcatg gctggcgtgt ctgccaggct ggccaacgtt 8700

gcagccttgc tgctgcgtgc gctcggacgg ccggcactta gcgtgtttgt gcttttgctc 8760

attttctctt tacctcatta actcaaatga gttttgattt aatttcagcg gccagcgcct 8820

ggacctcgcg ggcagcgtcg ccctcgggtt ctgattcaag aacggttgtg ccggcggcgg 8880

cagtgcctgg gtagctcacg cgctgcgtga tacgggactc aagaatgggc agctcgtacc 8940

cggccagcgc ctcggcaacc tcaccgccga tgcgcgtgcc tttgatcgcc cgcgacacga 9000

caaaggccgc ttgtagcctt ccatecgtga cctcaatgcg ctgcttaacc agctccaeca 9060

ggtcggcggt ggcecatatg tcgtaagggc ttggctgcac cggaateagc acgaagtcgg 9120

ctgccttgat cgcggacaca gccaagtccg ccgcctgggg cgctccgtcg atcactacga 9180

agtcgcgccg gccgatggcc ttcacgtcgc ggtcaatcgt cgggcggtcg atgccgacaa 9240

cggttagcgg ttgatcttcc cgcacggccg cccaatcgcg ggcactgccc tggggatcgg 9300

aatcgactaa cagaacatcg gccccggcga gttgcagggc gcgggctaga tgggttgcga 9360

tggtcgtctt gcctgacccg cctttctggt taagtacagc gataaccttc atgcgttccc 9420

cttgcgtatt tgtttattta ctcatcgcat catatacgca gcgaccgcat gacgcaagct 9480

gttttactca aatacacatc acctttttag acggcggcgc tcggtttctt cagcggccaa 9540

gctggccggc caggccgcca gcttggcatc agacaaaccg gccaggattt catgcagccg 9600

cacggttgag acgtgcgcgg gcggctcgaa cacgtacccg gccgcgatca tctccgcctc 9660

gatctcttcg gtaatgaaaa acggttcgtc ctggccgtcc tggtgcggtt tcatgcttgt 9720

tcctcttggc gttcattctc ggcggccgcc agggcgtcgg cctcggtcaa tgcgtcctca 9780

cggaaggcac cgcgccgcct ggcctcggtg ggcgtcactt cctcgctgcg ctcaagtgcg 9840

cggtacaggg tcgagcgatg cacgccaagc agtgcagccg cctctttcac ggtgcggcct 9900

tcctggtcga tcagctcgcg ggcgtgcgcg atctgtgccg gggtgagggt agggcggggg 9960

ecaaacttca cgcctcgggc cttggcggcc tcgcgcccgc tccgggtgcg gtcgatgatt 10020

agggaacgct cgaactcggc aatgccggcg aacacggtca acaccatgcg gccggccggc 10080

gtggtggtaa cgcgtg 10096

<210> 10<211> 6600<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> T-DNA de RLM274, um Vetor Binário Bar-GUS tipo RLM4 07:LB> <p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>.

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(215)

<223> Borda de T-DNA esquerda (completa) similar ao plasmideo Ti de#TIP37TD1 (de A. tumefacíens, cepa da nopalina T37).

<220>

<221> misc_feature<222> (47)..(71)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA esquerda; similar aovetor bin #AF234316 pCambia2301.

<220>

<221> terminador<222> (233)..(485)

<223> Complemento do terminador de poli-A da Nopalina Sintase deAgrobacterium.

<220>

<221> misc_feature<222> (527) . . (1078)

<223> Complemento do gene BAR /CDS; 99% homóloga à

#SHBARPA gene bar de Streptomyces hygroscopicus para afosfinotricina acetil transferase; de QC25-3/EW105.

<220>

<221> promotor<222> (1092)..(1379)

<220>

<221> promotor<222> (1822)..(2817)

<223> Promotor UBI4-2 da salsa com intron interno; 99% de homologiacom #PCCUBI42 gene de P. críspum Pcubi4-2 para apoliubiquitina; de QC28-6/JB010.

<220>

<221> misc_feature<222> (2843)..(4843)

<223> gusINT CDS compreendem da gusA CDS da E. coli contendo eintron PIV2 interno.

<220>

<221> terminador<222> (4914)..(5166)

<223> terminador poli-A da Nopalina Sintase de Agrobacterium.<220>

<221> misc_feature<222> (5252).. (5397)

<223> Borda de T-DNA Direita; similar ao plasmideo Ti

genbank#TIP37TD2 Ti (da cepa da nopalina de A. tumefaciens,T37) borda 3' (direita) do T-DNA.

<220>

<221> misc_feature<222> (5292).. (5315)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA Direita; similar a

#TIP37TD2; de pCambia2301.<400> 10

gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggaatc ccgccctaca S40acttcgactc ccgcgccgcg ccgtggtacc gctggaacgc ctcgtcgacg agctgcgcga 600catcctccgc cgcgccccaa ctctgctggt atcccgcact cgagaagcca tacgcatgca 660caagcgtgac ctccttctcc ttcgccgctc gtgcgctgcc cctgccgagc gagaggggcg 720actttgtccg gtcgagaggc aggacgatcc gttctgcctc aacgcggggt ccgcctcgtc 780gtgcaggtcg caagccgacg ttgtggcgga ggacctcgat gccttcgatc gttccgtcgc 840tcgagatggt cgggtcgagg cgcaagcagt gcttgaggat ccgctggacc gtctctgggt 900tgacagacaa gtcccagtct cccacgccgt acgtcccgcc gcagatgact tcgccacctg 960gtcggggaat gatgtaggcg ggagaagcgg ggtcggacga gtccatcgtg catcgcttgc 1020atggggactt gacgaggacg gtttgcccgc ggattggctc ggcggcttgg tcgtcgatgc 1080ccgcaatcga cttggcgcca agtcccgtag cgttgaccac caaatccgca ccgtcgaacg 1140cctgctcaag cgacgtaacg gtccgtctct caaacgtcgc gccgagcttc tgcagctctc 1200ttgcaaggta ctggcagtac tttggtgcgt ggacggagag ggtgtxgtag gttacgccga 1260tagcgccagg tggacattcg gaagatggga gggggcggta atttggcgtg atgtccttgt 1320accagtgecc gagcaagccg tcttcgttct gcgcgaaccg cctcgtcccc ttgagccaca 1380tggcatggcc cgtcgggacc aactcgaccc acttcttgaa agtcgattct tcccattttg 1440cttgtcgagg accgtctgta agcgtcatga aaggcgtcca attcgcgcca gcccatggtg 1500aagcgaaagt ctggctcgag acgtcctccg gcaagtcgcg cgcgagaata tgcacgctgt 1560agcccttccg agcgaggatg agggcgctgc tcagaccgat aacgcctgat ccgaggacaa 1620cgacgcgctt ctgcgagtgc atggtggccc gggatccggc gcgccttttt tttatgagct 1680gcaaacacac aaaaagagtt caatacagtc aaataaaccc tgattgaatc agaaatagct 1740ttctgttcaa cgtacgacac tacaaatcct aaagtttcga agaatctata cacaaacttc 1800atctaacctt aaacagtgtt cagattcaat ctaacattga cagtgttcag attcaatcta 1860acttcaacag ttcagatttc aattcacata tacaaatcat ttcccaggta acatgaacat 1920ggatctctcc atcaaggtca agccaaattc tggtagctat aatcgagcta actgatcggt 1980caacttagat cgattctagt aaaaccaaaa gatttagtgg aggttcacag atccaaatta 2040aacgaattcc agatctcaag gaaattgaga aaacaagatc gagatccagc aaataaagta 2100gatccagaaa gttcctatta ccttggaaag aaagagcgga agaagatgag attgaggaag 2160attcaaaaca aaaaataaat ctcctaaatt atctcttact ttctctctta atcttcttcc 2220ttgttcttct ctgtcaagtc gccggagatt caaaacggct gatgaaagtg aggaggacaa 2280

cgagacaatt caaagcggag aggaaaatat atgaatttat ataggcgggt ttatctctta 2340

caactttatt ttcggccttt caaaaaaata attaaaatcg acagacacga ateatttcga 2400

ccacaggtaa agataacgtg acctggctgt cagacagcct tttccctcgt gttaactaat 2460

ttttaaacta attaatcatc tcagcccttg gattagttct tttgctttga tggcttcatg 2520

actgtgacct gctcgatccg cgtgttacat gacagctccg tttttttagt ggttaactta 2580

aaccgagtca atccaggcaa cgttagtcgt cgtcgtggtt ggcttgttca attagatttc 2640

atacaattca acgtaattta attcgttttc tattagaatt gtateataat taattcagae 2700

cgtgaaagaa agtgtctttc atgatgtgtt tatggatatt tatacaataa gatacaatgt 2760

ttcatcatat tcactattca cgattagtat gtacattaaa taatggctac tactacatcc 2820

gaactcgtca aaacgattct gaatcaatta tacatatgct gactcttgca tacataaaaa 2880

atagttgttt aaattttgtc taactaatgt ttggtataag tataatgttg agttgagata 2940

ccaattacat cgagtctagc cattttgtcg tgccatattc gtcaaaactt tcttacataa 3000

tgataaccta gatctagatg agatatgtat caatgtattt gagatcataa ttaagttcgt 3060

tctaaatttt gtcgaaacca acgcaagctt gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg 3X20

atatgaatat aggcatatcc gtatccgaat tatccgtttg acagctagca acgattgtac 3180

aattgcttct ttaaaaaagg aagaaagaaa gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca 3240

aacggccccg ttacggccca aacggtcata tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact 3300

cctatcgaaa tacgtaaccg caaacgtgtc atagtcagat cccctcttcc ttcaccgcct 3360

caaacacaaa aataatcttc tacagcctat atatacaacc cccccttcta tctctccttt 3420

ctcacaattc atcatctttc tttctctacc cccaatttta agaaatcctc tcttctcctc 3480

ttcattttca aggtaaatct ctctctctct ctctctctct gttattcctt gttttaatta 3540

ggtatgtatt attgctagtt tgttaatctg cttatcttat gtatgcctta tgtgaatatc 3600

tttatcttgt tcatctcatc cgtttagaag ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct 3660

acacgtggtt atgtttatat ctaatcagat atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt 3720

gtactaatcc gaaatcgttg atttttttca tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca 3780

tatggatcta cgtatcaatt gttcatctgt ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac 3840

atcacttctc tcatctgatt gtgttgttac atacatagat atagatctgt tatatcattt 3900

tttttattaa ttgtgtatat atatatgtgc atagatctgg attacatgat tgtgattatt 3960

tacatgattt tgttatttac gtatgtatat atgtagatct ggactttttg gagttgttga 4020

cttgattgta tttgtgtgtg tatatgtgtg ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag 4080

cccggatctc cgggtaggtc agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga 4140

aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg 4200

tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt 4260

taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg 4320

cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt 4380

cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta 4440

tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt 4500

tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta atataatatt 4560

tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt ctgtagttta 4620

taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc 4680

aggtatcacc gtttgtgtga acaacgaact gaactggcag actatcccgc cgggaatggt 4740

gattaccgac gaaaacggca agaaaaagca gtcttacttc catgatttct ttaactatgc 4800

cggaatceat cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac 4860

cgtggtgacg catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc 4920

caatggtgat gtcagcgttg aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg caactggaca 4980

aggcactagc gggactttgc aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta 5040

tctctatgaa ctgtgcgtca cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg 5100

cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt 5160

ctactttact ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa 5220

cgtgctgatg gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac 5280

ctcgcattac ccttacgctg aagagatgct cgactgggca gatgaacatg gcatcgtggt 5340

gattgatgaa actgctgctg tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg 5400

caacaagccg aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca 5460

cttacaggcg attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg 5520

gagtattgcc aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt tcgcgccact 5580

ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca atgtaatgtt 5640

ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc tgaaccgtta 5700

ttacggatgg tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac tggaaaaaga 5760

acttctggcc tggcaggaga aactgcatca gccgattatc atcaccgaat acggcgtgga 5820

tacgttagcc gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt atcagtgtgc 5880

atggctggat atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg gtgaacaggt 5940

atggaatttc gccgattttg cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg gtaacaagaa 6000

agggatcttc actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc aaaaacgctg 6060

gactggcatg aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa tcaacaactc 6120

tcctggcgca ccatcgtcgg ctacagcctc gggaattgct accgagctcg aatttccccg 6180

atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga 6240

tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca 6300

tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg 6360

cgatagaaaa eaaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta 6420

tgttactaga tcgggaattg gcgatcgcag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 6480

tactagatct gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat 6540

attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg 6600

<210> 11<211> 6820<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> T-DNA de RLM254, um Vetor Binário Selda-GUS tipoRLM407: LB> <p-sTPT::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-N0S> RB>.

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(215)

<223> Borda de T-DNA esquerda (completa) similar ao plasmideo Ti#TIP37TD1 (de A. tumefaciens, cepa T37 da nopalina).

<220>

<221> misc_feature<222> (47)..(71)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA Esquerda; similar aovetor jbin #AF234316 de pCambia2301.

<220>

<221> terminador<222> (233)..(485)

<223> Complemento de Terminador poli-A da Nopalina Sintase deAgrobacterium.

<220>

<221> misc_feature<222> (561) .. (1329)

<223> Complemento de CDS para a D-serina desidratase de E. coli;GenBank Acc.-No.: J01603.

<220>

<221> promotor<222> (1913).. (3230)

<223> Complemento do promotor [sTPT] do Translocador da TrioseFosfato curto.

<220>

<221> promotor<222> (3273)..(4268)

<220>

<221> misc_feature<222> (4294)..(6294)

<223> gusINT CDS compreende do gusA CDS de E. coli contendo eintron PIV2 interno.

<220>

<221> terminador<222> (6365)..(6617)

<223> Terminador poli-A da Nopalina Sintase de Agrobacterium.<220>

<221> misc_feature<222> (6676)..(6820)

<223> Borda de T-DNA Direita; similar ao plasmideo Ti

genbank#TIP37TD2 (de A. tumefaciens, cepa T37 da nopalina)borda 3' (direita) de T-DNA.

<220>

<221> misc_feature<222> (6758)..(6781)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA Direita; similar ao

#TIP37TD2; de pCambia2301.<4 00> 11gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60

gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120

actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180

ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240

aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300

atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360

gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420

atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480

cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggagct cggtacgatc 540

catgctgcgt tgaaacgtta ttaacggcct tttgccagat attgattcat ctcttcttcc 600

ggcaccattc cacctcccgt cgcccacacc agatgagtgg tattacgcag ttgttctgcg 660

ctgaaaccgt gcatctgttg gtaacttact gatgcacaca cgcgctgagg tccggccata 720

cccgccagtg ccgaaggttc aagacgaata ccttcttcct gcgccagcca gccaagcatg 780

tcatacatgg tttgatcgct aagggtatag aagecatcca gcagacgctc cattgcccge 840

ccgacaaagc ctgatgcgcg accaactgca aggccatccg ctgcggtaag gttgtcgata 900

ccaatatcct gaacagaaat ctgatcgtgt aatcctgtat ggacgcctaa caacatacaa 960

ggggagtgcg ttggttcggc aaaaaagcag tgaacatgat cgccaaacgc cagtttaagc 1020

ccgaatgcga cgccaccagg accaccgcca acaccacacg gcagatagac aaacagaggg 1080

ttatcagcat cgacgatacg gccttgctgg gcaaattgcg ctitaagacg ctggccagcg 1140

acggaatacc caaggaacaa cgtgcgggaa ttttcgtcat caataaagaa acagttcggg 1200

tcagactgcg ctgctttacg tccttcctcg acggcaacac eataatettg ctcatattcc 1260

acgaccgtaa cgccatggct gcgcagtttc gcttttttcc atgcccgggc atcagcagac 1320

atatgaactg tcaccttaaa gccaatgcgg gcgctcataa tgccgattga taaccccaga 1380

tttccggttg agcccacagc aatgctgtat tggctaaaga actgtttaaa ctccggagaa 1440

agcagtttgc tgtagtcatc atcaagcgtc agcaaccccg cttccagagc cagtttttct 1500

gcgtgtgcca ggacttcata aatcccgccg cgtgctttta tggagccgga aatgggcaaa 1560

tggctatctt ttttcagtaa cagttgcccg ctgatcggtt gctgatattc tttttccagc 1620

cgtttttgca tagctggaat ggcaaccagt tctgattcaa taatcccccc agtggcagca 1680

gtttcaggaa atgcttttgc cagatagggt gcaaaacggg ataagcgcgc atgggcgtcc 1740

tgaacatcct gttcggtcag gccaacataa ggtaaacctt cagccaatga ggtcgtgcca 1800

ggattaaacc aggtggtttc tttaagagca accagatcct ttaccaacgg atactgggcg 1860

atgagcgagt tcattttagc gttttccatg gtacccagac gtcgactcta gatgaaatcg 1920

aaatteagag ttttgatagt gagagcaaag agggacggac ttatgaggat ttcgagtatt 1980

tcaagagatg gtacttgttg atcggacggc tacgatgatc tcgatttggt taatccagta 2040

tctcgcggtg tatggagtta tggtagggtt aatggtcaat ttcatctaac ggtagagaat 2100

gatgtaatta gataagaatc ttgagatact ggtttagatt ggatgagtgt agggtccatc 2160

ttatcttgat aagtggatgg tttttagaga cacagtgaat attagccaat cgaagttcca 2220

tatcaccatc atcatctgta taattttgtt tttttggaag ataataatga ttgaaatttt 2280

ggtagatttt atttttcatt atttaccttg tatgttgagt ggtcttcaaa ttattgaacg 2340

tgacagattc acaagaaagt agatttttta taaatgaaat tttacttatt ttaaaggtat 2400

ctctatttaa tttcttttgt ttatggttgt ctgteagcat ttgacttgca gtttcatgct 2460

catagtcata tacgttattc taggcttttt tgaatatctt attacttttt tcgtaataca 2520

attttataat tttatcaaag ttatacaact ataactaaaa ttagggtttt ctacaaaaca 2580

aaaaaatctt ctaatttttt ttgttgtagc cagtttactc gtaagttaca aaaaaataca 2640

aatgaaccca catgtattat gcgtttaact aggattacca tgtactttca tgtactcaat 2700

tcaccctata ctcttttttt ttttttttct agttccaccc aatctataaa attctgtcca 2760

tttgaccaaa ttcaattaat ttctgtaatt gcgatttaaa attaatatta catgttcact 2820

atttctcgat ttgagggaac ccgagtttaa atatgataaa aatgttgacc catcactaca 2880

aatatgttat agtttatact taatagtggt gtttttgggg ataattgatg aattaagtaa 2940

acatgattct tcttatgaag ttgattgagt gattattgta tgtaaaccta tgtgattgat 3000

gttattggtt gattgagtga ttattgtatt agtatgtaag caaagatgat tgttcttatg 3060

aggtaatttg ttactcattc atccttttgc atatgagaaa ttgtgttagc gtacgcaaaa 3120

caatagagaa cataaaagat atgtgtattt atttaaggtg acttttgtta atgatattgt 3180

agtatctata catttatata taacttgttg aatttgagta taagctatca ggatccgggg 3240

gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttgacta gagaattcga atccaaaaat 3300

tacggatatg aatataggca tatccgtatc cgaattatcc gtttgacagc tagcaacgat 3360

tgtacaattg cttctttaaa aaaggaagaa agaaagaaag aaaagaatca acatcagcgt 3420

taacaaacgg ccccgttacg gcccaaacgg tcatatagag taacggcgtt aagcgttgaa 3480

agactcctat cgaaatacgt aaccgcaaac gtgtcatagt cagatcccct cttccttcac 3540

cgcctcaaac acaaaaataa tcttctacag cctatatata caaccccccc ttctatctct 3600

cctttctcac aattcatcat ctttetttct ctacccccaa ttttaagaaa tcctctcttc 3660

tcctcttcat tttcaaggta aatctctctc tctctctctc tctctgttat tccttgtttt 3720

aattaggtat gtattattgc tagtttgtta atctgcttat cttatgtatg ccttatgtga 3780

atatctttat cttgttcatc tcatccgttt agaaqctata aatttgttga tttgactgtg 3840tatctacacg tggttatgtt tatatctaat cagatatgàa tttcttcata ttgttgcgtt 3900

tgtgtgtacc aatccgaaat cgttgatttt tttcatttaa tcgtgtagct aattgtacgt 3960

atacatatgg atctacgtat caattgttca tctgtttgtg tttgtatgta tacagatctg 4020

aaaacatcac ttctctcatc tgattgtgtt gttacataca tagatataga tctgttatat 4080

catttttttt attaattgtg tatatatata tgtgcataga tctggattac atgattgtga 4140

ttatttacat gattttgtta tttacgtatg tatatatgta gatctggaet ttttggagtt 4200

gttgacttga ttgtatttgt gtgtgtatat gtgtgttctg atcttgatat gttatgtatg 4260

tgcagcccgg atctccgggt aggtcagtcc cttatgttac gtcctgtaga aaccccaacc 4320

cgtgaaatca aaaaactcga cggcctgtgg gcattcagtc tggatcgcga aaactgtgga 4380

attggtcagc gttggtggga aagcgcgtta caagaaagcc gggcaattgc tgtgccaggc 4440

agttttaacg atcagttcgc cgatgcagat attcgtaatt atgcgggcaa cgtctggtat 4500

cagcgcgaag tctttatacc gaaaggttgg gcaggccagc gtatcgtgct gcgtttcgat 4560

gcggtcactc attacggcaa agtgtgggtc aataatcagg aagtgatgga gcatcagggc 4620

ggctatacgc catttgaagc cgatgtcacg ccgtatgtta ttgccgggaa aagtgtacgt 4680

aagtttctgc ttctaccttt gatatatata taataattat cattaattag tagtaatata 4740

atatttcaaa tatttttttc aaaataaaag aatgtagtat atagcaattg cttttctgta 4800

gtttataagt gtgtatattt taatttataa cttttctaat atatgaccaa aatttgttga 4860

tgtgcaggta tcaccgtttg tgtgaacaac gaactgaact ggcagactat cccgccggga 4920

atggtgatta ccgacgaaaa cggcaagaaa aagcagtctt acttccatga tttctttaac 4980

tatgccggaa tccatcgcag cgtaatgctc tacaccacgc cgaacacctg ggtggacgat 5040

atcaccgtgg tgacgcatgt cgcgcaagac tgtaaccacg cgtctgttga ctggcaggtg 5100

gtggccaatg gtgatgtcag cgttgaactg cgtgatgcgg atcaacaggt ggttgcaact 5160

ggacaaggca ctagcgggac tttgcaagtg gtgaatccgc acctctggca accgggtgaa 5220

ggttatctct atgaactgtg cgtcacagcc aaaagccaga cagagtgtga tatctacccg 5280

cttcgcgtcg gcatccggtc agtggcagtg aagggcgaac agttcctgat taaccacaaa 5340

ccgttctact ttactggctt tggtcgtcat gaagatgcgg acttgcgtgg caaaggattc 5400

gataacgtgc tgatggtgca cgaccacgca ttaatggact ggattggggc caactcctac 5460

cgtacctcgc attaccctta cgctgaagag atgctcgact gggcagatga acatggcatc 5520

gtggtgattg atgaaactgc tgctgtcggc tttaacctct ctttaggcat tggtttcgaa 5580

gcgggcaaca agccgaaaga actgtacagc gaagaggcag tcaacgggga aactcagcaa 5640

gcgcacttac aggcgattaa agagctgata gcgcgtgaca aaaaccaccc aagcgtggtg 5700

atgtggagta ttgccaacga accggatacc cgtccgcaag gtgcacggga atatttcgcg 5760

ccactggcgg aagcaacgcg taaactcgac ccgacgcgtc cgatcacctg cgtcaatgta 5820

atgttctgcg acgctcacac cgataccatc agcgatctct ttgatgtgct gtgcctgaac 5880

cgttattacg gatggtatgt ccaaagcggc gatttggaaa cggcagagaa ggtactggaa 5940

aaagaacttc tggcctggca ggagaaactg catcagccga ttatcatcac cgaatacggc 6000

gtggatacgt tagccgggct gcactcaatg tacaccgaca tgtggagtga agagtatcag 6060

tgtgcatggc tggatatgta tcaccgcgtc tttgatcgcg tcagcgccgt cgtcggtgaa 6120

caggtatgga atttcgccga ttttgcgacc tcgcaaggca tattgcgcgt tggcggtaac 6180

aagaaaggga tcttcactcg cgaccgcaaa ccgaagtcgg cggcttttct gctgcaaaaa 6240

cgctggactg gcatgaactt cggtgaaaaa ccgcagcagg gaggcaaaca atgaatcaac 6300

aactctcctg gcgcaccatc gtcggctaca gcctcgggaa ttgctaccga gctcgaattt 6360

ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 6420

tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 6480

atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 6540

atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 6600

atctatgtta ctagatcggg aattggcgat cgcagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 6660

tttcctacta gatctgattg tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag 6720

gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataatc ggatatttaa 6780

aagggcgtga aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt 6820

<210> 12

<211> 5246

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> T-DNA de REW8, um Vetor Binário de Bar-GUS tipo RLM4 07:LB> <p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>.

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(215)

<220>

<221> misc_feature<222> (47)..(71)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA Esquerda; similar aovetor bin #AF234316 de pCambia2301.

<220><221> terminador<222> (233)..(485)

<223> Complemento de Terminador poli-A da Nopalina Sintase deAgrobacteri um.

<220>

<221> misc_feature<222> (527) .. (1078)

<223> Complemento de gene BAR /CDS; 100% de homóloga ao genebar #SHBARPA de Streptomyces hygroscopicus para afosfinotricina acetil transferase.

<220>

<221> promotor<222> (1092)..(1379)

<220>

<221> promotor<222> (1698)..(2693)

<223> Promotor UBI4-2 da salsa com intron interno; 99% de homologiaao #PCCUBI42 gene Pcubi4-2 de P. crispum para apoliubiquitina; de QC28-6/JB010.

<220>

<221> misc_feature<222> (2719)..(4719)

<223> gusINT CDS compreende da gusA CDS da E. coli contendo eintron PIV2 interno.

<220>

<221> terminador<222> (4790)..(5042)

<223> Terminador poli-A da Nopalina Sintase Agrobacterium.<220>

<221> misc_feature<222> (5101)..(5246)

<223> Borda de T-DNA Direita; similar ao plasmideo Ti do

genbank#TIP37TD2 (de A. tumefaciens, cepa T37 da nopalina)borda 3' (direita) T-DNA.

<220>

<221> misc_feature<222> (5183)..(5206)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA Direita; similar ao

#TIP37TD2; de pCambia2301.<400> 12

gtgattttgt gecgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggtcaa atctcggtga 540cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt 600catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga 660gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct 720tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg 780tccgetggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc 840gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga 900gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg 960gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg 1020ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggctcatgg 1080

cgcgccagat ctggattgag agtgaatatg agactctaat tggataccga ggggaattta 1140

tggaacgtca gtggagcatt tttgacaaga aatatttget agctgatagt gaccttaggc 1200

gacttttgaa cgcgcaataa tggtttctga cgtatgtgct tagctcatta aactccagaa 1260

acccgcggct gagtggctcc ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc 1320

ttgtcccgcg tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatct 1380

tgatcccctg cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg 1440

cttcccaacc ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa 1500

aaccgcccag tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc 1560

gcttgcgttt tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg 1620

tttctgcgga ctggctttct acgtgtttcg cttcctttag cagcecttgc gccctgagtg 1680

ettgcggcag cgtgaagctt gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg atatgaatat 1740

aggcatatcc gtatecgaat tatccgtttg acagctagca acgattgtac aattgcttct 1800

ttaaaaaagg aagaaagaaa gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca aacggccccg 1860

ttacggccca aacggtcata tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact cctatcgaaa 1920

tacgtaaccg caaacgtgtc atagtcagat cccctcttcc ttcacegcct caaacacaaa 1980

aataatcttc tacagcctat atatacaacc cccccttcta tctctccttt ctcacaattc 2040

atcatctttc tttctctacc cecaatttta agaaatcctc tcttctcctc ttcattttca 2100

aggtaaatct ctctctctct ctctctctct gttattcctt gttttaatta ggtatgtatt 2160

attgctagtt tgttaatctg cttatcttat gtatgectta tgtgaatatc tttatcttgt 2220

tcatctcatc cgtttagaag ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct acacgtggtt 2280

atgtttatat ctaatcagat atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt gtaccaatcc 2340

gaaatcgttg atttttttca tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca tatggatcta 2400

cgtatcaatt gttcatctgt ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac atcacttctc 2460

tcatctgatt gtgttgttac atacatagat atagatctgt tatatcattt tttttattaa 2520

ttgtgtatat atatatgtgc atagatctgg attacatgat tgtgattatt tacatgattt 2580

tgttatttac gtatgtatat atgtagatct ggactttttg gagttgttga cttgattgta 2640

tttgtgtgtg tatatgtgtg ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag cccggatctc 2700

cgggtaggtc agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga aatcaaaaaa 2760

ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg tcagcgttgg 2820

tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt taacgatcag 2880

ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg cgaagtcttt 2940

ataocgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt cactcattac 3000

ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta tacgccattt 3060

gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt tctgcttcta 3120

cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta atataatatt tcaaatattt 3180

ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt ctgtagttta taagtgtgta 3240

tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc aggtatcacc 3300

gtttgtgtga acaacgaact gaactggcag actatcccgc cgggaatggt gattaccgac 3360

gaaaacggca agaaaaagca gtcttacttc catgatttct ttaactatgc cggaatccat 3420

cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac cgtggtgacg 3480

catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc caatggtgat 3540

gtcagcgttg aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg caactggaca aggcactage 3600

gggactttgc aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta tctctatgaa 3660

ctgtgcgtca cagccaaaag ccagaeagag tgtgatatct acccgcttcg cgtcggcatc 3720

cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt ctactttact 3780

ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa cgtgctgatg 3840

gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac ctcgcattac 3900

ccttacgctg aagagatgct cgactgggca gatgaacatg gcatcgtggt gattgatgaa 3960

actgctgctg tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg caacaagccg 4020

aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca cttacaggcg 4080

attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg gagtattgcc 4140

aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt tcgcgccact ggcggaagca 4200

acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca atgtaatgtt ctgcgacgct 4260

cacaccgata ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc tgaaccgtta ttacggatgg 4320

tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac tggaaaaaga acttctggcc 4380

tggcaggaga aactgcatca gccgattatc atcaccgaat acggcgtgga tacgttagcc 4440

gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt atcagtgtgc atggctggat 4500

atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg gtgaacaggt atggaatttc 4560

gccgattttg cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg gtaacaagaa agggatcttc 4620

actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc aaaaacgctg gactggcatg 4680

aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa tcaacaactc tcctggcgca 4740

ccatcgtcgg ctacagcctc gggaattgct accgagctcg aatttccccg atcgttcaaa 4800

catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat 4860

ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt 4920

tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa 4980

caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga 5040

tcgggaattg gcgatcgcag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tactagatct 5100

gattgtcatt tcccgccttc agtttaaact atcaqtottt gacaggatat attggcgqgt 5160

<210> 13<211> 6887<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> T-DNA de RET63, um Vetor Binário de Selda-GUS tipo

RLM407: LB> <p-AtAct2i::c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS>RB>.

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(215)

<220>

<221> misc_feature<222> (47)..(71)

<220>

<221> terminador<222> (233)..(485)

<223> Complemento de Terminador poli-A da Nopalina Sintase deAgrobacterium.

<220>

<221> misc_feature<222> (561) .. (1889)

<223> Complemento de CDS para a D-serina desidratase de E. coli;GenBankAcc--No.: J01603.

<220>

<221> promotor<222> (1919)..(3326)

<223> Complemento de promotor do promotor da Actina-2 de

Arabidopsis thaliana com intron interno; 98% de homologia ao geneda actina 2 (ACT2) de Arabidopsis thaliana #ATU41998.

<220>

<221> promotor<222> (3339) .. (4334)

<223> Promotor UBI4-2 da salsa com intron interno; 99% de homologia

ao #PCCUBI42 gene Pcubi4-2 de P. crispum para a poliubiquitina; deQC28-6/JB010.

<220>

<221> misc_feature<222> (4360) .. (6360)

<220>

<221> terminador<222> (6431)..(6683)

<223> Terminador poli-A da Nopalina Sintase de Agrobacterium.<220>

<221> misc_feature<222> (6742)..(6887)

<223> Borda de T-DNA Direita; similar ao plasmideo Ti do

<220>

<221> misc_feature<222> (6824) .. (6847)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA Direita; similar ao

#TIP37TD2; de pCambia2301.<400> 13gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60

gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120

actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatxtatgc 180

ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240

aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300

atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360

gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420

atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480

cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggagct cggtacgatc 540

catgctgcgt tgaaacgtta ttaacggcct tttgccagat attgattcat ctcttcttcc 600

ggcaccattc cacctcccgt cgcccacacc agatgagtgg tattacgcag ttgttctgcg 660

ctgaaaccgt gcatctgttg gtaacttact gatgcacaca cgcgctgagg tccggccata 720

cccgccagtg ccgaaggttc aagacgaata ccttcttcct gcgccagcca gccaagcatg 780

tcatacatgg tttgatcgct aagggtatag aagccatcca gcagacgctc cattgcccgc 840

ccgacaaagc ctgatgcgcg accaactgca aggccatccg ctgcggtaag gttgtcgata 900

ccaatatcct gaacagaaat ctgatcgtgt aatcctgtat ggacgcctaa caacatacaa 960

ggggagtgcg ttggttcggc aaaaaagcag tgaacatgat cgccaaacgc cagtttaagc 1020

ccgaatgcga cgccaccagg accaccgcca acaccacacg gcagatagac aaacagaggg 1080

ttatcagcat cgacgatacg gccttgctgg gcaaattgcg ctttaagacg ctggccagcg 1140

acggaatacc caaggaacaa cgtgcgggaa ttttcgtcat caataaagaa acagttcggg 1200

tcagactgcg ctgctttacg tccttcctcg acggcaacac cataatcttg ctcatattcc 1260

acgaccgtaa cgccatggct gcgcagtttc gcttttttcc atgcccgggc atcagcagac 1320

atatgaactg tcaccttaaa gccaatgcgg gcgctcataa tgccgattga taaccccaga 1380

tttccggttg agcccacagc aatgctgtat tggctaaaga actgtttaaa ctccggagaa 1440

agcagtttgc tgtagtcatc atcaagcgtc agcaaecccg cttccagagc cagtttttct 1500

gcgtgtgcca ggacttcata aatcccgccg cgtgctttta tggagccgga aatgggcaaa 1560

tggctatctt ttttcagtaa cagttgcccg ctgatcggtt gctgatattc tttttccagc 1620

cgtttttgca tagctggaat ggcaaccagt tctgattcaa taatcccccc agtggcagca 1680

gtttcaggaa atgcttttgc cagatagggt gcaaaacggg ataagcgcgc atgggcgtcc 1740

tgaacatcct gttcggtcag gccaacataa ggtaaacctt cagccaatga ggtcgtgcca 1800

ggattaaacc aggtggtttc tttaagagca accagatcct ttaccaacgg atactgggcg 186Q

atgagcgagt tcattttagc gttttccata gtacgtctct ttggatccgg cgcgcctttt 1920

ttttatgagc tgcaaacaca caaaaagagt tcaatacagt caaataaacc ctgattgaat 1980

cagaaatagc tttctgttca acgtacgaca ctacaaatcc taaagtttcg aagaatctat 2040

acacaaactt catctaacct taaacagtgt tcagattcaa tctaacattg acagtgttca 2100

gattcaatct aacttcaaca gttcagattt caattcacat atacaaatca tttcccaggt 2160

aacatgaaca tggatctctc catcaaggtc aagccaaatt ctggtagcta taatcgagct 2220

aactgatcgg tcaacttaga tcgattctag taaaaccaaa agatttagtg gaggttcaca 2280

gatccaaatt aaacgaattc cagatctcaa ggaaattgag aaaacaagat cgagatccaa 2340

caaataaagt agatccagaa agttcctatt accttggaaa gaaagagcgg aagaagatgã 2400

gattgaggaa gattcaaaac ggagaatgaa tctcctggat tatctcttac tttctctctt 2460

agtcttcttc cttgttcttc tctgtcaagt cgccggagat tcaaaacggc tgatgaaagt 2520

gaggaggaca acgagacaat tcaaagcgga gaggaaaata tatgaattta tataggcggg 2580

tttatctctt acaactttat tttcggcctt tcaaaaaaat aattaaaatc gacagacacg 2640

aatcatttcg accacaggta aagataacgt gacctggctg tcagacagcc ttttccctcg 2700

tgttaactaa tttttaaact aattaatcat ctcagccctt ggattagttc ttttgctttg 2760

atggcttcat gactgtgacc tgctcgatcc gcgtgttaca tgacagctcc gtttttttag 2820

tggttaactt aaaccgagtc aatccaggca acgttagtcg tcgtcgtggt tggcttgttc 2880

aattagattt catacaattc aacgtaattt aattcgtttt ctattagaat tgtatcataa 2940

ttaattcaga ccgtgaaaga aagtgtcttt catgatgtgt ttatggatat ttatacaata 3000

agatacaatg tttcatcata ttcactattc acgattagta tgtacattaa ataatggcta 3060

ctactacatc cgaactcgtc aaaacgattc tgaatcaatt atacatatgc tgactcttgc 3120

atacataaaa aatagttgtt taaattttgt ctaactaatg tttggtataa gtataatgtt 3180

gagttgagat accaattaca tcgagtctag ccattttgtc gtgccatatt cgtcaaaact 3240

ttcttacata atgataacct agatctagat gagatatgta tcaatgtatt tgagatcata 3300

attaagttcg ttctaaattt tgtcgaaacc aacgcaagct tgactagaga attcgaatcc 3360

aaaaattacg gatatgaata taggcatatc cgtatccgaa ttatccgttt gacagctagc 3420

aacgattgta caattgcttc tttaaaaaag gaagaaagaa agaaagaaaa gaatcaacat 3480

cagcgttaac aaacggcccc gttacggccc aaaeggtcat atagagtaac ggcgttaagc 3540

gttgaaagac tcctatcgaa atacgtaacc gcaaacgtgt catagtcaga tcccctcttc 3600

cttcaccgcc tcaaacacaa aaataatctt ctacagccta tatatacaac ccccccttct 3660

atctctcctt tctcacaatt catcatcttt ctttctctac ccccaatttt aagaaatcct 3720

ctcttctcct cttcattttc aaggtaaatc tctctctctc tctctctctc tgttattcct 3780

tgttttaatt aggtatgtat tattgctagt ttgttaatct gcttatctta tgtatgcctt 3840

atgtgaatat ctttatcttg ttcatctcat ccgtttagaa gctataaatt tgttgattta 3900actgtgtatc tacacgtggt tatgtttata tctaatcaga tatgaatttc ttcatattgt Β960

tgcgtttgtg tgtaccaatc cgaaatcgtt gatttttttc atttaatcgt gtagctaatt 4020

gtacgtatac atatggatct acgtatcaat tgttcatctg tttgtgtttg tatgtataca 4080

gatctgaaaa catcacttct ctcatctgat tgtgttgtta catacataga tatagatctg 4140

ttatatcatt ttttttatta attgtgtata tatatatgtg catagatctg gattacatga 4200

ttgtgattat ttacatgatt ttgttattta cgtatgtata tatgtagatc tggacttttt 4260

ggagttgttg acttgattgt atttgtgtgt gtatatgtgt gttctgatct tgatatgtta 4320

tgtatgtgca gcccggatct ccgggtaggt cagtccctta tgttacgtcc tgtagaaacc 4380

ccaacccgtg aaatcaaaaa actcgacggc ctgtgggcat tcagtctgga tcgcgaaaac 4440

tgtggaattg gtcagcgttg gtgggaaagc gcgttacaag aaagccgggc aattgctgtg 4500

ccaggcagtt ttaacgatca gttcgccgat gcagatattc gtaattatge gggcaacgtc 4560

tggtatcagc gcgaagtctt tataccgaaa ggttgggcag gccagcgtat cgtgctgcgt 4620

ttcgatgcgg tcactcatta cggcaaagtg tgggtcaata atcaggaagt gatggagcat 4680

cagggcggct atacgccatt tgaagccgat gtcacgccgt atgttattgc cgggaaaagt 4740

gtacgtaagt ttctgcttct acctttgata tatatataat aattatcatt aattagtagt 4800

aatataatat ttcaaatatt tttttcaaaa taaaagaatg tagtatatag caattgcttt 4860

tctgtagttt ataagtgtgt atattttaat ttataacttt tctaatatat gaccaaaatt 4920

tgttgatgtg caggtatcac cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca gactatcccg 4980

ccgggaatgg tgattaccga cgaaaacggc aagaaaaagc agtcttactt ccatgatttc 5040

tttaactatg ccggaatcca tcgcagcgta atgctctaca ccacgccgaa cacctgggtg 5100

gacgatatca ccgtggtgac gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc tgttgactgg 5160

caggtggtgg ccaatggtga tgtcagcgtt gaactgcgtg atgcggatca acaggtggtt 5220

gcaactggac aaggcactag cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg 5280

ggtgaaggtt atctctatga actgtgcgtc acagccaaaa gccagacaga gtgtgatatc 5340

tacccgcttc gcgtcggcat ccggtcagtg gcagtgaagg gcgaacagtt cctgattaac 5400

cacaaaccgt tctactttac tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt gcgtggcaaa 5460

ggattcgata acgtgctgat ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac 5520

tcctaccgta cctcgcatta cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat 5580

ggcatcgtgg tgattgatga aactgctgct gtcggcttta acctctcttt aggcattggt 5640

ttcgaagcgg gcaacaagcc gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaact 5700

cagcaagcgc acttacaggc gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc 5760

gtggtgatgt ggagtattgc caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat 5820

ttcgcgccac tggcggaagc aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc 5880

aatgtaatgt tctgcgacgc tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc 5940

ctgaaccgtt attacggatg gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta 6000

ctggaaaaag aacttctggc ctggcaggag aaactgcatc agccgattat catcaccgaa 6060

tacggcgtgg atacgttagc cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag 6120

tatcagtgtg catggctgga tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag cgccgtcgtc 6180

ggtgaacagg tatggaattt cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt gcgcgttggc 6240

ggtaacaaga aagggatctt cactcgcgac cgcaaaccga agtcggcggc ttttctgctg 6300

caaaaacgct ggactggcat gaacttcggt gaaaaaccgc agcagggagg caaacaatga 6360

atcaacaact ctcctggcgc accatcgtcg gctacagcct cgggaattgc taccgagctc 6420

gaatttccec gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 6480

cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 6540

catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtce cgcaattata 6600

catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc 6660

ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt ggcgatcgca gcttggcgta atcatggtca 6720

tagctgtttc ctactagatc tgattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt 6780

tgacaggata tattggcggg taaacctaag agaaaagagc gtttattaga ataatcggat 6840

atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt gtatgtc 6887

<210> 14

<211> 6600

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> T-DNA de RETl9, um Vetor Binário de Selda-GUS tipo

RLM407: LB> <p-AtAct2i::c-daol/pa::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>.

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(215)

<223> Borda de T-DNA esquerda (completa) similar ao plasmideo Ti#TIP37TD1 (da A. tumefaciens, cepa T37 da nopalina).

<220>

<221> misc_feature

<222> (47)..(71)

<223> Região de. repetição da Borda de T-DNA Esquerda; similar aovetor bin #AF234316 de pCambia2301.

<220><221> terminador<222> (233)..(485)

<223> Complemento de Terminador poli-A da Nopalina Sintase deAgrobacterium.

<220>

<221> misc_feature<222> (536)..(1642)

<223> Complemento de CDS para a D-aminoácido oxidase deRhodosporidium toruloides; GenBank U60066 & Patente US5948660; de QC142-1/LM202.

<220>

<221> promotor<222> (1668)..(3075)

<223> Complemento de promotor do promotor da Actina-2 de

Arabidopsis thaliana com intron interno; 98% de homologia como gene da Actina 2 (ACT2) #ATU41998 de Arabidopsis thaliana.

<220>

<221> promotor<222> (3088)..(4083)

<220>

<221> misc_feature<222> (4109)..(6109)

<220>

<221> terminador<222> (6180)..(6432)

<223> Terminador poli-A da Nopalina Sintase de Agrobacterium.<220>

<221> misc_feature<222> (6491)..(6635)

<223> Borda de T-DNA Direita; similar ao plasmideo Ti do

<220>

<221> misc_feature<222> (6573)..(6596)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA Direita; similar ao

#TIP37TD2; de pCambia2301.<4 00> 14

gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacae attgeggacg tctttaatgt 120actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggaatc ccgccctaca 540acttcgactc ccgcgccgcg ccgtggtacc gctggaacgc ctcgtcgacg agctgcgcga 600catcctccgc cgcgccccaa ctctgctggt atcccgcact cgagaagcca tacgcatgca 660caagcgtgac ctccttctcc ttcgccgctc gtgcgctgcc cctgccgagc gagaggggcg 720actttgtccg gtcgagaggc aggacgatcc gttctgcctc aacgcggggt ccgcctcgtc 780gtgcaggtcg caagccgacg ttgtggcgga ggacctcgat gccttcgatc gttccgtcgc 840tcgagatggt cgggtcgagg cgcaagcagt gcttgaggat ccgctggacc gtctctgggt 900tgacagacaa gtcccagtct cccacgccgt acgtcccgcc gcagatgact tcgccacctg 960gtcggggaat gatgtaggcg ggagaagcgg ggtcggacga gtccatcgtg catcgcttgc 1020atggggactt gacgaggacg gtttgcccgcccgcaatcga cttggcgcca agtcccgtagcctgctcaag cgacgtaacg gtccgtctctttgcaaggta ctggcagtac tttggtgcgttagcgccagg tggacattcg gaagatgggaaecagtgccc gagcaagccg tcttcgttcttggcatggcc cgtcgggacc aactcgaccccttgtcgagg accgtctgta agcgtcatgaaagcgaaagt ctggctcgag acgtcctccgagcccttecg agcgaggatg agggcgctgccgacgcgctt ctgcgagtgc atggtggcccgcaaacacac aaaaagagtt caatacagtcttctgttcaa cgtacgacac taeaaatcctatctaacctt aaacagtgtt cagattcaatacttcaacag ttcagatttc aattcaeataggatctctcc atcaaggtca agccaaattccaacttagat cgattctagt aaaaccaaaaaacgaattcc agatcttaag gaaattgagagatccagaaa gttcctatta ccttggaaagatteaaaacg gagaatgaat ctcctggattttgttcttct ctgtcaagtc gccggagattcgagacaatt caaagcggag aggaaaatatcaactttatt ttcggccttt caaaaaaataccacaggtaa agataacgtg acctggctgtttttaaacta attaatcatc tcagcccttgactgtgacct gctcgatccg cgtgttacataaccgagtca atccaggcaa cgttagtcgtatacaattca acgtaattta attcgttttccgtgaaagaa agtgtctttc atgatgtgttttcatcatat tcactattca cgattagtatgaactcgtca aaacgattct gaatcaattaatagttgttt aaattttgtc taactaatgtccaattacat cgagtctagc cattttgtcgtgataaccta gatctagatg agatatgtattctaaatttt gtcgaaacca acgcaagcttatatgaatat aggcatatcc gtatccgaataattgcttct ttaaaaaagg aagaaagaaaaacggccccg ttacggccca aacggtcatacctatcgaaa tacgtaaccg caaacgtgtccaaacacaaa aataatcttc tacagcctatctcacaattc atcatctttc tttctctaccttcattttca aggtaaatct ctctxtctctggtatgtatt attgctagtt tgttaatctgtttatcttgt tcatctcatc cgtttagaagacacgtggtt atgtttatat ctaatcagatgtaccaatcc gaaatcgttg atttttttcatatggatcta cgtatcaatt gttcatctgtatcacttctc tcatctgatt gtgttgttactttttattaa ttgtgtatat atatatgtgctacatgattt tgttatttac gtatgtatatcttgattgta tttgtgtgtg tatatgtgtgcccggatctc cgggtaggtc agtcccttataatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatttcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaagataacgatcag ttcgccgatg cagatattcgcgaagtcttt ataccgaaag gttgggcaggcactcattac ggcaaagtgt gggtcaataatacgccattt gaagccgatg tcacgccgtatctgcttcta cctttgatat atatataatatcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgttaagtgtgta tattttaatt tataacttttaggtatcacc gtttgtgtga acaacgaactgattaccgac gaaaacggca agaaaaagcacggaatccat cgcagcgtaa tgctctacaccgtggtgacg catgtcgcgc aagactgtaacaatggtgat gtcagcgttg aactgcgtgaaggcactagc gggactttgc aagtggtgaatctctatgaa ctgtgcgtca cagccaaaagcgteggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg

ggattggctc ggcggcttgg tcgtcgatgc 1080

cgttgaccac caaatccgca ccgtcgaacg 1140

caaacgtcgc gccgagcttc tgcagctctc 1200

ggacggagag ggtgtcgtag gttacgccga 1260

gggggcggta atttggcgtg atgtccttgt 1320

gcgcgaaccg cctcgtcccc ttgagccaca 1380

acttcttgaa agtcgattct tcccattttg 1440

aaggcgtcca attcgcgcca gcccatggtg 1500

gcaagtcgcg cgcgagaata tgcacgctgt 1560

tcagaccgat aacgcctgat ccgaggacaa 1620

gggatccggc gcgccttttt tttatgagct 1680

aaataaaccc tgattgaatc agaaatagct 1740

aaagtttcga agaatctata cacaaacttc 1800

ctaacattga cagtgttcag attcaatcta 1860

tacaaatcat ttcceaggta acatgaacat 1920

tggtagctat aatcgagcta actgatcggt 1980

gatttagtgg aggttcacag atccaaatta 2040

aaacaagatc gagatccagc aaataaagta 2100

aaagagcgga agaagatgag attgaggaag 2160

atctcttact ttctctctta gtcttcttcc 2220

caaaacggct gatgaaagtg aggaggacaa 2280

atgaatttat ataggcgggt ttatctctta 2340

attaaaatcg acagacacga atcatttcga 2400

cagacagcct tttccctcgt gttaactaat 2460

gattagttct tttgctttga tggcttcatg 2520

gacagctccg tttttttagt ggttaactta 2580

cgtcgtggtt ggcttgttca attagatttc 2640

tattagaatt gtatcataat taattcagac 2700

tatggatatt tatacaataa gatacaatgt 2760

gtacattaaa taatggctac tactacatcc 2820

tacatatgct gactcttgca tacataaaaa 2880

ttggtataag tataatgttg agttgagata 2940

tgccatattc gtcaaaactt tcttacataa 3000

caatgtattt gagatcataa ttaagttcgt 3060

gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg 3120

tatccgtttg acagctagca acgattgtac 3180

gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca 3240

tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact 3300

atagtcagat cecctcttcc ttcaccgcct 3360

atatacaacc cccccttcta tctctccttt 3420

cccaatttta agaaatcctc tcttctcctc 3480

ctctctctct gttattcctt gttttaatta 3540

cttatcttat gtatgcctta tgtgaatatc 3600

ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct 3660

atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt 3720

tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca 3780

ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac 3840

atacatagat atagatctgt tatatcattt 3900

atagatctgg attacatgat tgtgattatt 3960

atgtagatct ggactttttg gagttgttga 4020

ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag 4080

gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga 4140

cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg 4200

aagccgggca attgctgtgc caggcagttt 4260

taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg 4320

ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt 4380

tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta 4440

tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt 4500

attatcatta attagtagta atataatatt 4560

agtatatagc aattgctttt ctgtagttta 4620

ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc 4680

gaactggcag actatcccgc cgggaatggt 4740

gtcttacttc catgatttct ttaactatgc 4800

cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac 4860

ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc 4920

tgcggatcaa caggtggttg caactggaca 4980

tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta 5040

ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg 5100

cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt 5160ctactttact ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg

cgtgctgatg gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt

ctcgcattac ccttacgctg aagagatgct cgactgggca

gattgatgaa actgctgctg tcggctttaa cctctcttta

caacaagccg aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac

cttacaggcg attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac

gagtattgcc aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca

ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc

ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga tctctttgat

ttacggatgg tatgtccaaa gcggcgattt ggaaaeggca

acttctggcc tggcaggaga aactgcatca gccgattatc

tacgttagcc gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg

atggctggat atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc

atggaatttc gccgattttg cgacetcgca aggcatattg

agggatcttc actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct

gactggcatg aaettcggtg aaaaaccgca gcagggaggc

tcctggcgca ccatcgtcgg ctacagcctc gggaattgct

atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa

tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt

tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc

cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt

tgttactaga tcgggaattg gegatcgcag cttggcgtaa

tactagatct gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact

attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa

<210> 15<211> 6076<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> T-DNA of RET17, um Vetor Binário S

RLM407: LB> <p-NOS:c-dsdA/na::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>.

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(215)

<223> Borda de T-DNA esquerda (completa) similar ao plasmídeo Ti#TIP37TD1 (de A. tumefaciens, cepa T37 da nopalina).

<220>

<221> misc_feature<222> (47)..(71)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA Esquerda; similar aovetor bín #AF234316 de pCambia2301.

<220>

<221> terminador<222> (233)..(485)

<223> Complemento de Terminador poli-A da Nopalina SintaseAgrobacterium.

<220>

<221> misc_feature<222> (561) .. (1889)

<220>

<221> promotor<222> (1922)..(2209)

<220>

<221> promotor<222> (2528)..(3523)

<223> Promotor UBI4-2 da salsa com intron interno; 99% de homologia

ao #PCCUBI42 gene Pcubi4-2 de P. crispum para a poliubiquitinaQC28-6/JBOlO.

<220>

cgtggcaaag gattcgataa 5220

ggggccaact cctaccgtac 5280

gatgaacatg gcatcgtggt 5B40

ggcattggtt tcgaagcggg 5400

ggggaaactc agcaagcgca 5460

cacccaagcg tggtgatgtg 5520

cgggaatatt tcgegccact 5580

acctgcgtca atgtaatgtt 5&40

gtgctgtgcc tgaaccgtta 5700

gagaaggtac tggaaaaaga 5760

atcaccgaat acggcgtgga 5820

agtgaagagt atcagtgtgc 5880

gccgtcgtcg gtgaacaggt 5940

cgcgttggcg gtaacaagaa 6000

tttctgctgc aaaaacgctg 6060

aaacaatgaa tcaacaactc 6120

accgagctcg aattteeccg 6180

tcctgttgcc ggtcttgcga 6240

aataattaac atgtaatgca 6300

gcaattatac atttaatacg 6360

atcgcgcgcg gtgtcatcta 6420

tcatggtcat agctgtttcc 6480

atcagtgttt gacaggatat 6540

taatcggata tttaaaaggg 6600

elda-GUS do tipo<221> misc_feature<222> (3549)..(5549)

<223> gusINT CDS compreende do gusA CDS da E. coli contendo eintron PIV2 interno.

<220>

<221> terminador<222> (5620) .. (5872)

<223> Terminador poli-A da Nopalina Sintase de Agrobacterium.<220>

<221> misc_feature<222> (5931)..(6076)

<223> Borda de T-DNA Direita; similar ao plasmideo Ti do

<220>

<221> misc_feature<222> (5971) .. (5994)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA Direita; similar ao

#TIP37TD2; de pCambia2301.<4 00> 15

gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60

gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120

actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180

ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ecgatctagt 240

aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300

atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360

gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420

atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480

cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggagct cggtacgatc 540

catgctgcgt tgaaacgtta ttaacggcct tttgccagat attgattcat ctcttcttcc 600

ggcaccattc cacctcccgt cgcccacacc agatgagtgg tattacgcag ttgttctgcg 660

etgaaaecgt gcatctgttg gtaacttact gatgcacaca cgcgctgagg tccggccata 720

cccgccagtg ccgaaggttc aagacgaata ccttcttcct gcgccagcca gccaagcatg 780

tcatacatgg tttgatcgct aagggtatag aagccatcca gcagacgctc cattgcccgc 840

ccgacaaagc ctgatgcgcg accaactgca aggccatccg ctgcggtaag gttgtcgata 900

ccaatatcct gaacagaaat ctgatcgtgt aatcctgtat ggacgcctaa caacatacaa 960

ggggagtgeg ttggttcggc aaaaaagcag tgaacatgat cgccaaacgc cagtttaagc 1020

ccgaatgcga cgccaccagg accaccgcca acaccacacg gcagatagac aaacagaggg 1080

ttatcagcat cgacgatacg gccttgctgg gcaaattgcg ctttaagacg ctggccagcg 1140

acggaatacc caaggaacaa cgtgcgggaa ttttcgtcat caataaagaa acagttcggg 1200

tcagactgcg ctgctttacg tccttcctcg acggcaacac cataatcttg ctcatattcc 1260

acgaccgtaa cgccatggct gcgcagtttc gcttttttcc atgcccgggc atcagcagac 1320

atatgaactg tcaccttaaa gccaatgcgg gcgctcataa tgccgattga taaccccaga 1380

tttccggttg agcccacagc aatgctgtat tggctaaaga actgtttaaa ctccggagaa 1440

agcagtttgc tgtagtcatc atcaagcgtc agcaaccccg cttccagagc cagtttttct 1500

gcgtgtgcca ggacttcata aatcccgccg cgtgctttta tggagccgga aatgggcaaa 1560

tggctatctt ttttcagtaa cagttgcccg ctgatcggtt gctgatattc tttttccagc 1620

cgtttttgca tagctggaat ggcaaccagt tctgattcaa taatcccccc agtggcagca 1680

gtttcaggaa atgcttttgc cagatagggt gcaaaacggg ataagcgcgc atgggcgtcc 1740

tgaacatcct gttcggtcag gccaacataa ggtaaacctt cagccaatga ggtcgtgcca 1800

ggattaaacc aggtggtttc tttaagagca accagatcct ttaccaacgg atactgggcg 1860

atgagcgagt tcattttagc gttttccata gtacgtctct ttggatccgg cgcgccagat 1920

ctggattgag agtgaatatg agactctaat tggataccga ggggaattta tggaacgtca 1980

gtggagcatt tttgacaaga aatatttgct agctgatagt gaccttaggc gacttttgaa 2040

cgcgcaataa tggtttctga cgtatgtgct tagctcatta aactccagaa acccgcggct 2100

gagtggctcc ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc ttgtcccgcg 2160

tcatcggcgg gggtcataac gtgactccct taattctccg ctcatgatct tgatcccctg 2220

cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg cttcccaacc 2280

ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa aaccgcccag 2340

tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc gcttgcgttt 2400

tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatccggg gtcagcaccg tttctgcgga 2460

ctggctttct acgtgttccg cttcctttag cagcccttgc gccctgagtg cttgcggcag 2520

cgtgaagctt gactagagaa ttcgaatcca aaaattacgg atatgaatat aggcatatcc 2580

gtatccgaat tatccgtttg acagctagca acgattgtac aattgcttct ttaaaaaagg 2640aagaaagaaa gaaagaaaag aatcaacatc agcgttaaca aacggccccg ttacggccca 2700

aacggtcata tagagtaacg gcgttaagcg ttgaaagact cctatcgaaa tacgtaaccg 2760

caaacgtgtc atagtcagat cccctcttcc ttcaccgcct caaacacaaa aataatcttc 2820

tacagcctat atatacaacc cccccttcta tctctccttt ctcacaattc atcatctttc 2880

tttctctacc cccaatttta agaaatcctc tcttctcctc ttcattttca aggtaaatct 2940

ctctctctct ctctctctct gttattcctt gttttaatta ggtatgtatt attgctagtt 3000

tgttaatctg cttatcttat gtatgcctta tgtgaatatc tttatcttgt tcatctcatc 3060

cgtttagaag ctataaattt gttgatttga ctgtgtatct acacgtggtt atgtttatat 3120

ctaatcagat atgaatttct tcatattgtt gcgtttgtgt gtaccaatcc gaaatcgttg 3180

atttttttca tttaatcgtg tagctaattg tacgtataca tatggatcta cgtatcaatt 3240

gttcatctgt ttgtgtttgt atgtatacag atctgaaaac atcacttctc tcatctgatt 3300

gtgttgttac atacatagat atagatctgt tatatcattt tttttattaa ttgtgtatat 3360

atatatgtgc atagatctgg attacatgat tgtgattatt tacatgattt tgttatttac 3420

gtatgtatat atgtagatct ggactttttg gagttgttga cttgattgta tttgtgtgtg 3480

tatatgtgtg ttctgatctt gatatgttat gtatgtgcag cccggatctc cgggtaggtc 3540

agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga aatcaaaaaa ctcgacggcc 3600

tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattgg tcagcgttgg tgggaaagcg 3660

cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt taacgatcag ttcgccgatg 3720

cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg cgaagtcttt ataccgaaag 3780

gttgggeagg ccagcgtatc gtgttgcgtt tcgatgcggt cactcattac ggcaaagtgt 3840

gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta tacgccattt gaagccgatg 3900

tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtaagtt tctgcttcta cctttgatat 3960

atatataata attatcatta attagtagta atataatatt tcaaatattt ttttcaaaat 4020

aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt ctgtagtttà taagtgtgta tattttaatt 4080

tataactttt ctaatatatg accaaaattt gttgatgtgc aggtatcacc gtttgtgtga 4140

acaacgaact gaactggcag actatcccgc cgggaatggt gattaccgac gaaaacggca 4200

agaaaaagca gtcttacttc catgatttct ttaactatgc cggaatccat cgcagcgtaa 4260

tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acgatatcac cgtggtgacg catgtcgcgc 4320

aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc aggtggtggc caatggtgat gtcagcgttg 4380

aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg caactggaca aggcactagc gggactttgc 4440

aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta tctctatgaa ctgtgcgtca 4500

cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg cgtcggcatc cggtcagtgg 4560

cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt ctactttact ggctttggtc 4620

gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa cgtgctgatg gtgcacgacc 4680

acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac ctcgcattac ccttacgctg 4740

aagagatgct cgactgggca gatgaacatg gcatcgtggt gattgatgaa actgctgctg 4800

tcggcírttaa cctctcttta ggcattggtt tcgaagcggg caacaagccg aaagaactgt 4860

acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc agcaagcgca cttacaggcg attaaagagc 4920

tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg tggtgatgtg gagtattgcc aacgaaccgg 4980

atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt tcgcgccact ggcggaagca acgcgtaaac 5040

tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca atgtaatgtt ctgcgacgct cacaccgata 5100

ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc tgaaccgtta ttacggatgg tatgtccaaa 5160

gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac tggaaaaaga acttctggcc tggcaggaga 5220

aactgcatca gccgattatc atcaccgaat acggcgtgga tacgttagcc gggctgcact 5280

caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt atcagtgtgc atggctggat atgtatcacc 5340

gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg gtgaacaggt atggaatttc gccgattttg 5400

cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg gtaacaagaa agggatctte actcgcgacc 5460

gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc aaaaacgctg gactggcatg aacttcggtg 5520

aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa tcaacaactc tcctggcgca ccatcgtcgg 5580

ctacagcctc gggaattgct accgagctcg aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa 5640

taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 5700

ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 5760

gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag 5820

cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcgggaattg 5880

gcgatcgcag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tactagatct gattgtcgtt 5940

tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga 6000

gaaaagagcg tttattagaa taatcggata tttaaaaggg cgtgaaaagg tttatccgtt 6060

cgtccatttg tatgtc 6076

<210> 16<211> 5819<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> T-DNA de RET15, um Vetor Binário Selda-GUS do tipo

RLM407: LB> <p-NOS:c-daol/ko::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS> RB>.

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(215)

<220>

<221> misc_feature<222> (47)..(71)

<220>

<221> terminador<222> (233)..(485)

<223> Complemento de Terminador poli-A da Nopalina SintaseAgrobacterium.

<220>

<221> misc_feature<222> (533)..(1636)

<223> Complemento de CDS para daol/ko.<220>

<221> promotor<222> (1665)..(1952)

<220>

<221> promotor<222> (2271) .. (3266)

<223> Promotor UBI4-2 da salsa com intron interno; 99% de homologiaao #PCCUBI42 gene Pcubi4-2 de P. crispum para apoliubiquitina; de QC28-6/JBOlO.

<220>

<221> misc_feature<222> (3292) .. (5292)

<223> gusINT CDS compreende de gusA CDS da E. coli contendo eintron PIV2 interno.

<220>

<221> terminador<222> (5365)..(5615)

<223> Terminador poli-A da Nopalina Sintase de Agrobacterium.<220>

<221> misc_feature<222> (5674).. (5819)

<223> Borda de T-DNA Direita; similar ao plasmideo Ti do

<220>

<221> misc_feature<222> (5756) .. (5779)

<223> Região de repetição da Borda de T-DNA Direita; similar ao

#TIP37TD2; de pCambia2301.<4 00> 16

gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt 60gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tctttaatgt 120actgaattaa catccgtttg atacttgtct aaaattggct gatttcgagt gcatctatgc 180ataaaaacaa tctaatgaca attattacca agcaggatcc tctagaattc ccgatctagt 240aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 300atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 360gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 420atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 480cgatcgggga aattcgagct cgccggcgtc gacgatatcc tgcaggtcac taaagttttg 540actctctcgc tgcaccgtgg tatctttgga atgcctcgtc caccaactga gcaacatctt 600ctgcagcacc ccatgattgc tgatatccgg cactactaaa accatatgca tgtaccagtg 660tgacttctttttctatcgaggectaagacctggttgggtctaagatcccagtataatataattttaccagtgctctttgcctagtgaggtgatactgacactggtggacagtccaagcaagtccggtaggtagggccgtcaagtttggcttgcgtgcaaggtttttgagaatgagactctagaaatattttgacgtatgtttgcggttctaacgtgactccggcaagaaaagctggcaataagcccactgccagtagctgcegcttcettgaattcgaatttgaeagctaaagaatcaacacggcgttaagatcccctctacccccccttttaagaaatctctgttattctatgtatgcctttgttgatttcttcatattgtgtagctaatgtâtgtatagatatagatctggattacattctggactttcttgatatgtcctgtagaaagatcgcgaaagcaattgctggcgggcaacgatcgtgctgcgtgatggagcgccgggaaaattaattagtaagcaattgctatgaccaaaacagactatccttccatgattaacacctgggtctgttgactcaacaggtggctctggcaacgagtgtgatattcctgattattgcgtggcaattggggccagcagatgaacttaggcattgaacggggaaaaaccacccaagcacgggaat

ttccttagctgggcaatacaaacattatgcaaggcggaggatcacccactagctggactccacggtctggtcccagtcctaaccgtccgtatatttaggattcagacgaggccgtcttcagaccaactcaagtcaatgtcagatacgtcctataagagcagtgcatggtgaattggatacgctagctgatgcttagctcagtcagttccaccttaattctgccatccagttccggttcgccaagctacctaeatttatectagcagccctccaaaaattagcaacgattgatcagcgttagegttgaaagtccttcaccgctatctctccctctcttctccttgttttaattatgtgaattgactgtgtagttgcgtttgttgtacgtatcagatctgaatgttatatcagattgtgattttggagttgttatgtatgtgccccaacccgactgtggaattgccaggcagtctggtatcagtttcgatgcatcagggcgggtgtacgtaagtaatataattttctgtagttttgttgatgcgccgggaattctttaactatggacgatatggcaggtggtttgcaactggcgggtgaaggtctacccgctaccacaaaccaaggattcgaactcctaccgatggcatcgtgtttcgaagcctcagcaagcgcgtggtgatatttcgcgcc

gcacgtgcgcattctctcagctaagtacttcaatgcttcaccgtaagttcgctgggtcaccctctaattggttgcattcactttcaaaaggcgtgtacagggaagggggcttctgtgcaaacccatttttataaatggtgtctgggagatgaagaaagacgcccgggatccgaggggaatagtgaccttattaaactccaaacgtaaaacccgctcatgattactttgcattgctgtccagctttctcttggggtcagcatgcgccctgacggatatgaatacaattgctacaaacggccactcctatcgcctcaaacactttctcacaactcttcatttttaggtatgtatctttatcttctacacgtgtgtgtaccaaacatatggataacatcacttttttttttatatttacatgatgacttgattcagcccggattgaaatcaaatggtcagcgtttttaacgatgcgcgaagtcggtcactcatctatacgccagtttctgcttatttcaaatattataagtgttgcaggtatcggtgattacctgccggaatccaccgtggtgggccaatggtacaaggcactttatctctattcgcgtcggcgttctacttttaacgtgctgtacctcgcatggtgattgatgggcaacaaggcacttacaggtggagtattactggcggaa

ttcctcttcccttctacacgcgattccctcgaatccgttgctccgcatattactatccatgctccgcagcccacgaggtcttgcaccgagagagtgtgtcggtaattcggagcgacgagttaaaggtacttccaattcgccgcgtgccaactatgactcccggcgcgccattatggaacgggcgacttttgaaacecgegggcttgtccctcttgatcccgggcttcccataaaaccgcctgcgcttgcgccgtttctgcgtgcttgcggtataggeatatctttaaaaaccgttacggcaaatacgtaaaaaaataatcttcatcatcttcaaggtaaaattattgctatgttcatctcgttatgtttatccgaaatcgctacgtatcactctcatctgtaattgtgtattttgttattgtatttgtgtctccgggtagaaactcgacgtggtgggaaacagttcgccgtttataccgatacggcaaagtttgaagccgctacctttgatttttttcaagtatattttaaccgtttgtggacgaaaacgcatcgcagcgacgcatgtcggatgtcagcgagcgggacttgaactgtgcgatccggtcagactggctttgatggtgcacgtaccettacggaaaetgctgccgaaagaacgcgattaaaggccaacgaacgcaacgcgta

aagcgaaaggtggtcctcctaatggttccggactgtttcgaacttcgccacgtacatcttttgatcatcttgcaccgtcgtttctgaagtataagtcacgggttatatcttcccttcagcctcttcccataccagcccagaatatgaacacgaacccaatgatetggatttcagtggagcgaacgcgcaagctgagtggcgcgtcatcggctgcgccatcaccttaccagcagtctagcttttteccttgggactggcttcagcgtgaagtecgtatccgaggaagaaagccaaacggtcccgcaaacgtttctacagccttctttctcttctctctctcgtttgttaatatccgtttagtatctaatcattgattttttattgttcatcattgtgttgttatatatatgtacgtatgtagtgtatatgtgtcagtccctgcctgtgggcgcgcgttacaatgcagatataaggttgggctgtgggtcaaatgtcacgcctatatatataaataaaagaaatttataacttgaacaacgagcaagaaaaataatgctctacgcaagactgttgaactgcgtgcaagtggttcacagccaatggcagtgaagtcgtcatgaaccacgcattctgaagagatctgtcggctttgtacagcgaagctgatagccggatacccgaactcgaccc

gggcttttgqctacgagcggtcagatgatagggttaacgccceggtctcgttgcatggtgatgcctgctaaatgcctgtttctctggcaaccaattgcgcttgtaccaatcacatagcattttgcctgtcggggaagcgagaatagccctactacaacgcgagagtgaatatttttgacataatggtttctccttcaacgcgggggtcatagatccttggagggcgccccatcgccatgttccagatagctctacgtgttcttgactagaaattatccgtaaagaaagaaatatagagtagtcatagtcatatatatacaacccccaatttctctctctcctgcttatctaagctataaagatatgaatttcatttaatctgtttgtgtttacatacatatgcatagatctatatgtagagtgttetgattatgttacgtattcagtctgagaaagccggtcgtaattataggccagcgttaatcaggaagtatgttattataattatcatgtagtatattttctaatatactgaactgggcagtcttaccaccacgccgtaaccaegcgtgatgcggatgaatccgcacaagccagacagggcgaacagagatgcggacaatggactgggctcgactggtaacctctctagaggcagtcgcgtgacaaatccgcaaggtgacgcgtccg

720780840900960102010801140120012601320138014401S0015601620168017401800186019201980204021002160222022802340240024602S2025802640270027602820288029403000306031203180324033003360342034803540360036603720378038403900396040204080414042004260432043804440450045604620468047404800atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt 4860

gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg 4920

gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggeagg agaaactgca tcagccgatt 4980

atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 5040

tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc 5100

agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata 5160

ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg 5220

gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 5280

ggcaaacaat gaatcaacaa ctctcctggc gcaccatcgt cggctacagc ctcgggaatt 5340

gctaccgagc tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt 5400

gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 5460

tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 5520

cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 5580

attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttggcgatcg cagcttggcg 5640

taatcatggt catagctgtt tcctactaga tctgattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa 5700

actatcagtg tttgacagga tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta 5760

gaataatcgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtc 5819

<210> 17<211> 1408<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana<220>

<221> promotor<222> (1)..(1408)

<223> região do promotor Actina 2 de Arabidopsis thaliana com oprimeiro intron.

<220>

<221> Intron<222> (955)..(1397)

<223> primeiro intron da Actina 2 de Arabidopsis thaliana<400> 17

tcgacaaaat ttagaacgaa cttaattatg atctcaaata cattgataca tatctcatct 60agatctaggt tatcattatg taagaaagtt ttgacgaata tggcacgaca aaatggctag 120actcgatgta attggtatct caactcaaca ttatacttat accaaacatt agttagacaa 180aatttaaaca actatttttt atgtatgcaa gagtcagcat atgtataatt gattcagaat 240cgttttgacg agttcggatg tagtagtagc cattatttaa tgtacatact aatcgtgaat 300agtgaatatg atgaaacatt gtatcttatt gtataaatat ccataaacac atcatgaaag 360acactttctt tcacggtctg aattaattat gatacaattc taatagaaaa cgaattaaat 420tacgttgaat tgtatgaaat ctaattgaac aagccaacca cgacgacgac taacgttgcc 480tggattgact cggtttaagt taaccactaa aaaaacggag ctgtcatgta acacgcggat 540cgagcaggtc acagtcatga agccatcaaa gcaaaagaac taatccaagg gctgagatga 600ttaattagtt taaaaattag ttaaeacgag ggaaaaggct gtctgacagc caggtcacgt 660tatctttacc tgtggtcgaa atgattcgtg tctgtcgatt ttaattattt ttttgaaagg 720ccgaaaataa agttgtaaga gataaacccg cctatataaa ttcatatatt ttcctctccg 780ctttgaattg tctcgttgtc ctcctcactt tcatcagccg ttttgaatct ccggcgactt 840gacagagaag aacaaggaag aagactaaga gagaaagtaa gagataatcc aggagattca 900ttctccgttt tgaatcttcc tcaatctcat cttcttccgc tctttctttc caaggtaata 960ggaactttct ggatctactt tatttgctgg atctcgatct tgttttctca atttccttga 1020gatctggaat tcgtttaatt tggatctgtg aacctccact aaatcttttg gttttactag 1080aatcgatcta agttgaccga tcagttagct cgattatagc taccagaatt tggcttgacc 1140ttgatggaga gatccatgtt catgttacct gggaaatgat ttgtatatgt gaattgaaat 1200ctgaactgtt gaagttagat tgaatctgaa cactgtcaat gttagattga atctgaacac 1260tgtttaaggt tagatgaagt ttgtgtatag attcttcgaa actttaggat ttgtagtgtc 1320gtacgttgaa cagaaagcta tttctgattc aatcagggtt tatttgactg tattgaactc 1380tttttgtgtg tttgcagctc ataaaaaa 1408

Claims

1. Método para gerar uma planta de soja transgênica,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas dea. introduzir em uma célula ou tecido da soja uma construçãode DNA que compreenda pelo menos uma primeira construção de expressãoque compreende um promotor ativo na dita planta de soja e operavelmenteligada a esta uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capazde metabolizar D-alanina e/ou D-serina, eb. incubar a dita célula ou tecido da soja da etapa a) em ummeio de seleção que compreenda D-alanina e/ou D-serina e/ou um derivadodas mesmas em uma concentração total de cerca de 0,5 raM a cerca de 100mM por um período de tempo de pelo menos 5 dias, ec. transferir a dita célula ou tecido da soja da etapa b) para ummeio de regeneração e regenerar e selecionar plantas de soja quecompreendem a dita construção de DNA.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o dito promotor ativo na soja é um promotor da ubiquitina ou umpromotor Actin2 de uma espécie vegetal dicotiledônea ou um promotor p-ScBV ou p-ScBV-iSuc UDP.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o promotor vegetal da ubiquitina é a em que a pressão de seleção éaplicada depois do co-cultivo que compreende uma ou mais das seguintesetapas:a. primeiro sem seleção na indução de broto;b. selecionar durante a indução de broto,c. selecionar por todo alongamento de broto.

4. Método de acordo com as reivindicações 2 ou 3,caracterizado pelo fato de que o promotor ativo na soja é selecionado dogrupo que consiste dea) seqüências que compreendem a seqüência como descritaspelas SEQ ID NOs: 7 ou 8, eb) seqüências que compreendem pelo menos um fragmento depelo menos 50 pares de base consecutivas das seqüências como descritaspelas SEQ ID NOs: 7 ou 8 e tendo atividade promotora na soja,c) seqüências que compreendem uma seqüência tendo pelomenos 60% de identidade com as seqüências como descritas pelas SEQ IDNOs: 7 ou 8 e tendo atividade promotora na soja,d) seqüências que compreendem uma hibridização deseqüência sob condições equivalentes ou iguais à hibridização em formamidaa 30%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 2X SSC a 50°Ccom as seqüências como descritas pelas SEQ ID NOs: 7 ou 8 e tendoatividade promotora na soja.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) fornecer um tecido meristemático axilar de um nodo defolha primária ou superior de uma muda de soja e(b) co-cultivar o dito tecido meristemático axilar com umabactéria Rhizobiaceae que compreende um T-DNA transgênico, o dito T-DNA transgênico compreendendo uma construção de DNA que compreendepelo menos uma primeira construção de expressão que compreende umpromotor ativo na dita planta de soja e operavelmente ligada a esta umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capaz de metabolizarD-alanina e/ou D-serina(c) transferir o dito tecido meristemático axilar co-cultivadoem um meio de indução e seleção de broto que compreende(i) pelo menos um fator de crescimento vegetal em umaconcentração adequada para induzir a indução de broto de novo a partir dodito tecido meristemático axilar e(ii) D-alanina e/ou D-serina e/ou um derivado das mesmas emuma concentração total de cerca de 3 mM a cerca de 100 mM, e(iii) opcionalmente um ou mais antibióticos adequados parainibir o crescimento da bactéria Rhizobiaceae,e cultivar o dito tecido meristemático axilar co-cultivado porum período de pelo menos 5 dias no dito meio até que os brotos sejaminduzidos e desenvolvidos a partir destes e isolar os ditos brotos, e(d) transferir os ditos brotos isolados a um meio deenraizamento e cultivar os ditos brotos sobre o dito meio de enraizamento atéque os ditos brotos tenham formado raízes e ainda regenerar as plantinhasassim derivadas em plantas maduras, que compreendem inseridos no seugenoma o dito T-DNA transgênico.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 5, caracterizado pelo fato de que a enzima capaz de metabolizar D-serina éselecionada do grupo que consiste dei) a D-serina amônia-liase como mostrada na Tabela 1,ii) enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade de pelo menos 80% com uma seqüência de aminoácido de uma D-serina amônia-liase como mostrada na Tabela 1;iii) enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade de seqüência de ácido nucléico codificadora de pelo menos 80%com uma seqüência de ácido nucléico de uma D-serina amônia-liase comomostrada na Tabela 1, eiv) enzimas codificadas por uma seqüência de ácido nucléicocapaz de hibridizar ao complemento da seqüência que codifica a D-serinaamônia-liase como mostrada na Tabela 1,e em que seleção é feita em um meio que compreende D-serinaem uma concentração de 3 mM a 100 mM;ou em que a enzima capaz de metabolizar D-serina e D-alaninaé selecionada do grupo que consiste dei) a D-aminoácido oxidase como mostrada na Tabela 1, eii) enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade de pelo menos 80% com uma seqüência de aminoácido de uma D-aminoácido oxidase como mostrada na Tabela 1;iii) enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade da seqüência de ácido nucléico codificadora de pelo menos 80%com uma seqüência de ácido nucléico de uma D-aminoácido oxidase comomostrada na Tabela 1, eiv) enzimas codificadas por uma seqüência de ácido nucléicocapaz de hibridizar ao complemento da seqüência que codifica a D-aminoácido oxidase como mostrada na Tabela 1,e em que a seleção é feita em um meio que compreende D-alanina e/ou D-serina em uma concentração total de 3 mM a 100 mM.

7. Método de acordo com as reivindicações 5 ou 6,caracterizado pelo fato de que o tecido meristemático axilar do nodo primárioou superior é fornecido em uma forma selecionada do grupo que consiste de:i) o meristema axilar da muda como fornecidosubstancialmente pela muda inteira, eii) o meristema axilar da folha como fornecido pela dissecaçãodas folhas primárias ou superiores em um modo que o tecido meristemáticoaxilar permaneça ligado aos pecíolos das folhas, eiii) meristema axilar propagado.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-5 a 7, caracterizado pelo fato de que o meio da etapa (b), e/ou (c), compreendea) uma citocinina em uma concentração equivalente a umaconcentração de cerca de 1 μΜ a cerca de 10 μΜ de 6-benzilaminopurinae/oub) entre cerca de 0,1 μΜ e cerca de 2 μΜ de ácido Giberélico(GA3), e ouc) pelo menos um Composto de tiol.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-5 a 8, caracterizado pelo fato de que a citocinina é cinetina a umaconcentração de 1 μΜ a 10 μΜ

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 8, caracterizado pelo fato de que a enzima capaz de metabolizar D-alaninaou D-serina é selecionada do grupo que consiste de D-serina amônia-liases(EC 4.3.1.18), D-Aminoácido oxidases (EC 1,4.3.3) e D-Alaninatransaminases (EC 2,6.1.21).

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 9, caracterizado pelo fato de que a enzima capaz de metabolizar D-serina éselecionada do grupo que consiste dei) a D-serina amônia-liase da E. coli como codificada pelaSEQ ID NO: 2, eii) enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade de pelo menos 60% com a seqüência como codificada pela SEQ IDNO: 2 eii) enzimas codificadas por uma seqüência de ácido nucléicocapazes de hibridizar sob condições equivalentes ou iguais à hibridização emformamida a 30%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 2X SSCa 50°C ao complemento da seqüência descrito pela SEQ ID NO: 1,e em que a seleção é feita em um meio que compreende D-serina em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 100 mM.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 9, caracterizado pelo fato de que a enzima capaz de metabolizar D-serina eD-alanina é selecionada do grupo que consiste dei) a D-aminoácido oxidase de Rhodotorula gracilis comocodificada pelas SEQ ID NOs: 4 ou 6, eii) enzimas tendo a mesma atividade enzimática e umaidentidade de pelo menos 60% com a seqüência como codificada pelas SEQID NOs: 4 ou 6, eiii) enzimas codificadas por uma seqüência de ácido nucléicocapazes de hibridizar sob condições equivalentes ou iguais à hibridização emformamida a 30%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 2X SSCa 50°C ao complemento da seqüência descrito pela SEQ ID NO: 3 ou 5,e em que a seleção é feita em um meio que compreende D-alanina e/ou D-serina em uma concentração total de cerca de 0,5 mM a cercade 100 mM.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 11, caracterizado pelo fato de que a seleção é feitai) usando cerca de 3 a cerca de 30 mM de D-alaninaii) usando cerca de 30 a 50 mM de D-serina, e/ouiii) usando cerca de 1 a 10 mM de D-serina em combinaçãocom 30 mM de D-alanina ou menos, preferivelmente em torno de 5 a 7 mMde D-serina, por exemplo, 7,5 mM e 10 mM a 20 mM de D-alaninapor cerca de 3 a 4 semanas sob condições desdiferenciadoras.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 12, caracterizado pelo fato de que a seleção depois da transformação comum gene dsda compreende as seguintes etapas:a. 5 a 10 dias na indução de broto sem seleção,b. de 2 a 4 semanas em meio de indução de broto com 5 mM a-10 mM, por exemplo, D-serina a 7,5 mM;c. de D-serina a 2 mM a 7 mM por todo alongamento de broto.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 12, caracterizado pelo fato de que a seleção depois da transformação comum gene daol compreende as seguintes etapas:a. 5 a 10 dias na indução de broto sem seleção,b. 2 a 4 semanas em meio de indução de broto com 5 mM a 10mM, por exemplo, 7,5 mM de D-alanina;c. de 2 mM a 7 mM de D-alanina por todo alongamento debroto.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 12, caracterizado pelo fato de que a seleção depois da transformação comum gene daol compreende as seguintes etapas:a. 5 a 10 dias, por exemplo, 5 a 7 dias na indução de broto semseleção,b. de 2 a 4 semanas, por exemplo, 3 semanas em meio deindução de broto com 5 mM a 10 mM, por exemplo, 7,5 mM de D-alanina ecom 5 mM a 10 mM, por exemplo, D-serina a 7,5 mM;c. de 2 mM a 7 mM, por exemplo, 5 mM de D-serina e de 2mM a 7 mM, por exemplo, 5 mM de D-alanina por todo alongamento debroto.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 15, caracterizado pelo fato de que a introdução da dita construção de DNAé mediada pela transformação mediada pela bactéria Rhizobiaceae.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de- 16, caracterizado pelo fato de que a bactéria Rhizobiaceae é uma bactériaAgrobaeterium tumefaeiens ou Agrobaeterium rhizogenes desarmada.

19. Método de acordo com as reivindicações 16 ou 17,caracterizado pelo fato de que a cepa de Agrobaeterium é uma cepa K599 deAgrobaeterium rhizogenes desarmada.

20. Método para gerar uma célula ou planta de soja,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:i) transformar uma célula de soja com uma primeiraconstrução de DNA que compreendea) pelo menos uma primeira construção de expressão quecompreende um promotor ativo na dita planta de soja e operavelmente ligadaa esta uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima de D-aminoácido oxidase, em que o dito primeiro cassete de expressão éflanqueado pelas seqüências que permitem a deleção específica do ditoprimeiro cassete de expressão, eb) pelo menos um segundo cassete de expressão adequado paraconferir à dita planta um traço agronomicamente valioso, em que o ditosegundo cassete de expressão não é localizado entre as ditas seqüências quepermitem a deleção específica do dito primeiro cassete de expressão, eii) tratar a dita célula de planta de soja transformada da etapa i)com um primeiro composto selecionado do grupo que consiste de D-alanina,D-serina ou derivados das mesmas em uma concentração fitotóxica eselecionar células vegetais que compreendam no seu genoma a dita primeiraconstrução de DNA, que confere resistência às ditas células vegetaistransformadas contra o dito primeiro composto pela expressão da dita D-aminoácido oxidase, eiii) induzir a deleção do dito primeiro cassete de expressão dogenoma das ditas células vegetais transformadas e tratar as ditas célulasvegetais com um segundo composto selecionado do grupo que consiste de D-isoleucina, D-valina e derivados das mesmas em uma concentração tóxicapara as células vegetais que ainda compreendem o dito primeiro cassete deexpressão, selecionando deste modo as células vegetais que compreendem odito segundo cassete de expressão mas que carecem do dito primeiro cassetede expressão.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que:a) o promotor é como definido em qualquer uma dasreivindicações de 2 a 4, e/oub) as D-amino oxidases são como definidas na reivindicação

22. Seqüência de nucleotídeo heteróloga, caracterizada pelofato de que compreendea) um promotor selecionado do grupo que consiste de umpromotor da ubiquitina da soja; o promotor Actin2 de uma espécie vegetaldicotiledônea e um promotor p-ScBV ou p-ScBV-iSuc UDP e operavelmenteligada a estab) uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzimacapaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina,em que o dito promotor é heterólogo com respeito à ditaseqüência de ácido nucléico.

23. Seqüência de nucleotídeo heteróloga, caracterizada pelofato de que compreendea) um promotor selecionado do grupo que consiste dei) seqüências que compreendem a seqüência como descritapelas SEQ ID NOs: 7 ou 8, eii) seqüências que compreendem pelo menos um fragmento depelo menos 50 pares de base consecutivos da seqüência como descrita pelasSEQ ID NOs: 7 ou 8 e tendo atividade promotora na soja, eiii) seqüências que compreendem uma seqüência tendo pelomenos 60% de identidade com a seqüência como descrita pelas SEQ ID NOs:-7 ou 8 e tendo atividade promotora na soja, eiv) seqüências que compreendem uma seqüência que hibridizasob condições equivalentes ou iguais à hibridização em formamida a 30%,NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 2X SSC a 50°C com aseqüência como descrita pelas SEQ ID NOs: 7 ou 8 e tendo atividadepromotora na soja, eb) uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzimacapaz de metabolizar D-alanina e/ou D-serina de acordo com a Tabela 1,em que o dito promotor é heterólogo com respeito à ditaseqüência de ácido nucléico.

24. Planta ou célula da soja, caracterizada pelo fato de quecompreende uma construção de DNA que compreende um promotor ativo nasditas plantas ou células da soja e operavelmente ligada a esta uma seqüênciade ácido nucléico que codifica uma enzima capaz de metabolizar D-alaninaou D-serina, em que o dito promotor é heterólogo em relação à dita seqüênciaque codifica a enzima.

25. Planta ou célula da soja, caracterizada pelo fato de quecompreendem uma seqüência de nucleotídeo heteróloga como definida emqualquer uma das reivindicações de DNA 18 a 20.

26. Parte ou semente de um planta de soja, caracterizada pelofato de que são como definida em qualquer uma das reivindicações de 21 a-24.

27. Método para a transformação subseqüente de pelo menosduas construções de DNA em uma planta de soja, caracterizado pelo fato deque compreende as etapas de:a) uma transformação com uma primeira construção a ditaconstrução compreendendo pelo menos uma construção de expressão quecompreende um promotor ativo nas ditas plantas de soja e operavelmenteligada a esta uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capazde metabolizar D-alanina ou D-serina, eb) uma transformação com uma segunda construção a ditaconstrução compreendendo um segundo gene marcador de seleção, que nãoestá conferindo resistência contra D-alanina ou D-serina.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que o dito segundo gene marcador é que confere resistênciacontra pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste defosfinotricina, dicamba, glifosato, herbicidas tipo sulfoniluréia eimidazolinona ou um antibiótico.

29. Planta de soja, caracterizada pelo fato de que compreendea) uma primeira construção de expressão que compreende umpromotor ativo nas ditas plantas de soja e operavelmente ligada a esta umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima capaz de metabolizarD-alanina ou D-serina, eb) uma segunda construção de expressão para um genemarcador de seleção, que não está conferindo resistência contra D-alanina ouD-serina.

30. Método para a transformação subseqüente de pelo menosduas construções de DNA em uma planta de soja, caracterizado pelo fato deque compreende as etapas de:a) uma transformação com uma primeira construção a ditaconstrução compreendendo uma construção de expressão que compreende umpromotor ativo nas ditas plantas de soja e operavelmente ligada a esta umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima dsda e selecionar comD-serina, eb) uma transformação com uma segunda construção a ditaconstrução compreendendo uma construção de expressão que compreende opromotor ativo nas ditas plantas de soja e operavelmente ligada a esta umaseqüência de ácido nucléico que codifica uma enzima dao e selecionar comD-alanina.

31. Planta de soja, caracterizada pelo fato de que compreendea) uma primeira construção a dita construção compreendendouma construção de expressão que compreende um promotor ativo nas ditasplantas de soja e operavelmente ligada a esta uma seqüência de ácido nucléicoque codifica uma enzima dsda, eb) uma segunda construção a dita construção compreendendouma construção de expressão que compreende o promotor ativo nas ditasplantas de soja e operavelmente ligada a esta uma seqüência de ácido nucléicoque codifica uma enzima dao.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais, por exemplo,todas, das seguintes etapas:a. Esterilizar as mudas;b. Cultivar as mudas por 3 a 10 dias, preferivelmente por 5 a 8dias, por exemplo, por 7 dias na luz;c. Cultivar o epicótilo com as folhas unifoliadas até ocomprimento dos cotilédones ou mais longo;d. Cultivar o epicótilo entre 0,5 cm e 4 cm; por exemplo, 0,7cm ou mais, 1,0 cm ou mais ou 2 cm ou menos.e. Remover todas as folhas pré formadas incluindo omeristema apicalf. Lesionar o nodo localizado no primeiro conjunto de folhascom diversos cortesg. Co-cultivar o nodo ferido com mistura de Agrobacteriumpor O5Ial hora, por exemplo, 0,5 hora em meio líquido.h. Co-cultivar o nodo com Agrobacterium por 3 a 5 dias noescuro em meio de co-cultivo sólido;i. Colocar os explantes para seleção sob um ciclo de 18 horasde luz/6 horas de escuro de 70 a 100 microE/m2s até os meristemas axilarescrescerem até o primeiro nodo acima do epicótilo;j. Remover os brotos formados antes da transformação até 2semanas depois do co-cultivo e opcionalmente cortar durante este tempo oexplante em pedaços menores;k. Transferir os explantes para o meio de alongamento debrotos primórdios depois de 2 a 4 semanas depois do co-cultivo e transferir osexplantes a cada 2 a 3 semanas para meio fresco com agente de seleção depoisremover o tecido morto até os brotos se alongarem;-1. Remover os brotos 3 cm ou maior do explante e colocar emmeio indutor de raiz por uma semana até que as raízes comecem a se formar;m. Transferir os brotos enraizados para o solo e fortificá-losem uma câmara de cultivo por 2 a 3 semanas antes de transferir os brotosenraizados para a estufa.

33. Composição para seleção, regeneração, crescimento,cultivo ou manutenção de uma célula vegetal transgênica de feijão soja, umtecido vegetal transgênico de feijão soja, um órgão vegetal transgênico defeijão soja ou uma planta transgênica de feijão soja ou uma parte da mesma,caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de D-alanina, D-serina ou um derivado das mesmas que permitem a seleção decélulas vegetais transgênicas de feijão soja, tecido vegetal de feijão soja,órgão vegetal de feijão soja ou plantas de feijão soja ou uma parte da mesmase um organismo transgênico de feijão soja, uma célula transgênica de feijãosoja, uma cultura de célula transgênica, uma planta transgênica de feijão sojae/ou uma parte da mesma.

34. Cultura de célula, caracterizada pelo fato de quecompreende um ou mais calos embrionários derivados do nodo localizado noprimeiro conjunto de folhas e D-alanina e/ou D-serina em uma concentraçãototal em torno de 5 a 10 mM.

35. Meio de seleção, caracterizado pelo fato de quecompreende um tecido alvo de feijão soja e D-alanina e/ou D-serina ou umderivado das mesmas em uma concentração fitotóxica.