CN105734026A - 枸杞谷胱甘肽还原酶及编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枸杞谷胱甘肽还原酶及编码基因与应用，枸杞谷胱甘肽还原酶，是SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因，是SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸序列。本发明的枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因导入目的植物中，得到耐受镉离子能力高和耐盐能力高的转基因植物。

Description

枸杞谷胱甘肽还原酶及编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种枸杞(LyCiumChinenseMiller)中谷胱甘肽还原酶及其编码基因与应用。

背景技术

动植物在正常生长过程中，不仅会遭遇盐碱、重金属、干旱、冷、热等非生物胁迫，也会遇到创伤，虫害，病毒等生物胁迫。在这些胁迫条件下，体内会产生活性氧积累，导致细胞膜脂等损伤。植物进化出某些调节机制来应对这些逆境，例如产生大量的还原性物质和抗氧化酶。动植物通过调节谷胱甘肽(Glutathione)氧化还原状态的酶系例如GR(Glutathionereductase)的表达而增加还原性物质谷胱甘肽(GSH)的比例或者含量。

GSH是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽,它分为氧化型(GSSG)和还原型(GSH)。通常所说的谷胱甘肽是还原型的，它是动植物体内非常重要的抗氧化物质。GR是存在于所有物种中的黄素酶。它可以催化氧化型GSSG的还原同时氧化NAD(P)H，它是植物体内重要的消除活性氧系统的反应体系。并且GSSG的含量增加可以显著提高GR的活性(60％)，并不会引起GR的转录发生明显变化。在过表达GR或APX(抗坏血酸过氧化物酶)等转基因的植物中，参与调解多种环境胁迫的反应。

常规杂交育种技术，诱变技术，分子标记技术等可以选育抗逆境高产的作物。但存在育种周期长，育种工作繁重，筛选工作量大，辐射危害大，操作技术要求高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枸杞谷胱甘肽还原酶。

本发明的第二个目的是提供枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因。

本发明的第三个目的是提供含有枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因的重组载体、表达载体和重组菌。

本发明的第四个目的是提供枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因在制备转基因植物的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种枸杞谷胱甘肽还原酶，是SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。

枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因，是SEQIDNO.2所示的脱氧核苷酸序列。

含有枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因的重组载体、表达载体和重组菌。

枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因在制备转基因植物的应用，是将枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因导入目的植物中，得到耐高NaCl逆境胁迫的和耐受镉离子的转基因植物。

所述目的植物为玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、大麦、小麦、棉花、月季、洋桔梗、百合、安祖花、蝴蝶兰、大叶黄杨，胡杨或香花槐。

本发明的优点：本发明的枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因导入目的植物中，得到耐受镉离子能力高和耐盐能力高的转基因植物。

附图说明

图1.P1、P2和P3、P4引物分别以枸杞cDNA扩增LcGR尾部(a)和全长的PCR(b)产物电泳图。

图2.pMD18T-LcGR转化大肠杆菌PCR验证图。

图3.pMD18-T-LcGR载体示意图。

图4.pET-28a-LcGR载体转化大肠杆菌和pET-28a-LcGR质粒的PCR产物电泳图。

图5.pET28a-LcGR在大肠杆菌BL21中表达蛋白的电泳图。

图6.pCAMBIA2300-LcGR载体酶切验证电泳图。

图7.pCAMBIA2300-LcGR载体示意图。

图8.转LcGR基因烟草基因组和pCAMBIA2300-LcGR质粒的PCR产物电泳图。(质粒作为阳性对照，由“+”)表示

图9.转LcGR基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、大麦，小麦基因组和pCAMBIA2300-LcGR质粒的(添加的)PCR产物电泳图。(“+”是阳性对照)

图10.转LcGR基因月季、洋桔梗、百合、蝴蝶兰基因组和pCAMBIA2300-LcGR质粒的PCR产物电泳图。

图11.转LcGR基因大叶黄杨、香花槐基因组和pCAMBIA2300-LcGR质粒的PCR产物电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

枸杞中谷胱甘肽还原酶LcGR基因的克隆

利用Trizol试剂，从100mg的新鲜的枸杞(中华枸杞)叶片中提取总RNA，用采用Transgentransecriptone-stepgDNAremovalandcDNAsynthesissupermix试剂盒，以枸杞总RNA为模板，OligodT₁₈为引物，在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA第1链。

根据枸杞转录组数据库的Unigene序列设计

SEQIDNO.3所示的上游引物LcGRW-F:5’TGGAAAGCCTACTAAGCCTGAC3’和SEQIDNO.4所示的下游引物LcGRW-R:5’CAACATTTCTCTATCGGCCCTC3’，

PCR扩增枸杞中谷胱甘肽还原酶LcGR基因的尾部片段，PCR产物电泳图，见图1(a)测序验证后。设计尾部引物P2。根据枸杞转录组数据库的Unigene序列设计上游引物

P1:5’ATGGCTAGGAAGATGTTGATTG3’(SEQIDNO.5)和

引物P2:5’ACTCTCGTCACTCCATTTTCGT3’(SEQIDNO.6)

进行PCR扩增，PCR产物如图1(b)。反应后利用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒对PCR反应产物进行纯化，按照试剂盒说明书操作，得到纯化的LcGRPCR片段。

对PCR产物序列测序验证，获得长度为1609bp序列。与其它物种的GR脱氧核苷酸序列比对，发现是LcGR的ORF(openreadingframe)序列。在NCBI的ORFFinder网站预测到其蛋白序列，如SEQIDNO.1所示。其脱氧核苷酸序列如SEQIDNO.2所示

实施例2

重组载体pMD18-T-LcGR的构建过程

将序列表所示的LcGR基因与pMD18-T载体连接，

反应条件:16℃，30min。连接产物转化E.ColiTop10。挑选白色菌落，菌落PCR法确认T载体中插入片段的长度大小，如图2，与预期一致，将该载体送往华大基因公司测序，我们得到了1609bp的该基因脱氧核苷酸序列，在NCBI进行blast，与番茄，马铃薯等同源性高，表明为该基因克隆成功。将LcGR脱氧核苷酸序列与pMD18-T序列拼接组装成克隆载体pMD18-T-LcGR，如图3所示

实施例3

大肠杆菌原核重组表达载体pET28a-LcGR的构建过程

首先以pMD18-T-LcGR质粒为模板，

SEQIDNO.7所示的P3(P3:CGCGGATCCATGGCTAGGAAGATGTTGATTG)，

SEQIDNO.8所示的P4(P4:ACGCGTCGACACTCTCGTCACTCCATTTTCGT)为分别为上下游引物，扩增LcGR基因。其反应条件为：94℃，4min；(94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，lmin50Sec)32cycles；72℃，8min。

在P3中有BamHI酶切位点(GGATCC)，在P4中有SalI酶切位点(GTCGAC)，然后PCR产物和pET28a空载体质粒分别用BamHI和SalI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接产物转化E.ColiDH5α，涂布于含200mg/Lkana抗性的LB平板上，37℃培养。12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，如图4，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pET28a-LcGR构建正确。

将构建好的原核表达载体pET28a-LcGR转化大肠杆菌BL21。进行蛋白表达验证，得到预期大小(53.7KD)的LcGR表达蛋白，如图5。从左向右依次为pET28a空载体菌未诱导菌体蛋白、pET28a空载体菌诱导后菌体蛋白、pET28a-LcGR表达载体菌未诱导菌体蛋白、pET28a-LcGR表达载体菌诱导菌体蛋白，纯化的LcGR菌体蛋白

实施例4

微生物、植物真核重组表达载体pCAMBIA2300-LcGR的构建

首先以pMD18-T-LcGR质粒为模板，P3，P4分别为上下游引物，扩增LcGR基因，其反应条件为：94℃，4min；(94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，lmin50Sec)32cycles；72℃，8min。在P3中有BamHI酶切位点(GGATCC)，在P4中有SalI酶切位点(GTCGAC)，然后PCR产物和pCAMBIA2300空载体质粒分别用BamHI和SalI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接产物转化E.ColiDH5α，涂布于含100mg/L浓度kana抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，如图6(从左向右依次为pCAMBIA2300-LcGR载体，pCAMBIA2300-LcGR酶切产物)，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pCAMBIA2300-LcGR构建正确。如图7所示

实施例5

用于植物转基因的农杆菌工程菌种C58:pCAMBIA2300-LcGR的构建。

农杆菌感受态细胞制备

1.将农杆菌C58单菌落接种于5mLYEP液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养36h。

2.将上述菌液2ml转入l00mLYEP液体培养基中，28℃，180r/min，振荡培养至(OD₆₀₀值约为0.4-0.5)。

3.冰浴30min后，4℃，5000r/min离心l0min，收集菌体，重悬于20mL预冷的ddH₂O中。

4.4℃，5000r/min离心10min，收集菌体，重悬于预冷的15％甘油中，每管200μL液氮速冻后，立即存于-80℃备用。

植物表达载体的电击转化

1.将-80℃取出的C58感受态细胞置于冰上，使其缓慢融化；

2.加入2-5μLpCAMBIA2300-LcGR质粒，混匀，冰浴5min；

3.转移至预冷的电击杯中；

4.设置电击转化仪参数:1500V，5-6ms，电击转化；

5.室温静置2min后加入500μLYEP液体培养基，28℃，180r/min振荡培养3-4h；

6.室温4000r/min离心10min，吸出400μL上清液，将剩下的菌液混匀，涂布于含100mg/L卡那霉素和100mg/L利福平抗性的YEP平板上，倒置平板，28℃培养，36-48h，直至看到清晰的单菌落。

7.挑取单菌落，菌落PCR验证。

实施例6

农杆菌介导的烟草遗传转化

烟草苗的无菌培养：选饱满、健康的烟草种子，用含25％NaOCl(有效氯≥10％)20ml，浓盐酸4ml的水溶液，熏蒸灭菌1.5h，将种子放在MS培养基中，16h/8h光/暗周期，25±1℃培养。

本实验用到的培养基如下表所示

烟草的农杆菌转化

侵染菌液的制备

1.挑取阳性农杆菌单菌落，接种到5ml含100mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的YEP液体培养基中，于28℃、200r/min的摇床上培养24h。

2.次日，取3ml菌液，接种到含100mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的50mlYEP液体培养基中，当菌液处于旺盛生长期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)时，将菌液倒入50ml离心管，在5000r/min，4℃下离心10min，弃上清液，收集菌体。用等量的MS液体培养基重悬，使OD₆₀₀＝0.9～1,加入终浓度为100μmol/L的AS(乙酰丁香酮)。。

外植体浸染

1.将烟草叶片去除主脉和叶边缘，然后将叶片切成0.5cm×0.5cm大小，浸入制备好的农杆菌菌液，浸泡15-20min，其间摇动2-3次，使叶片充分接触菌液，取出叶片，用含卡那霉素的无菌水清洗并用无菌滤纸吸净多余的液体，叶面朝下、叶背朝上接种于共培培养基中，25℃左右暗培养2-3天。

2.将叶片转移至筛选培养基中，20天左右更换一次培养基，诱导抗性芽产生，当抗性芽从愈伤组织上长到1cm左右，从愈伤上切取抗性芽，接种于抗性苗生根培养基中。

转基因苗移栽

将根系生长良好、生命力旺盛的烟草组培苗从组培瓶中取出，用自来水冲洗培养基(尽量减少根系损伤)，种植在珍珠岩，蛭石和腐殖土(1:2:2)的培养土中，覆盖薄膜保湿、透气，在25℃，培养7-10天，然后揭开薄膜，定期浇水、施肥，并转移至温室中。

实施例7

转基因烟草分子检测和抗盐性检测

转基因烟草基因组DNA的PCR检测:1.CTAB法提取T1代烟草总DNA；2.以基因组DNA为模板行PCR检测，引物为P3、P4。

取上述PCR产物5μl进行电泳检测，图8，说明LcGR基因已成功转入烟草。

在温室正常生长的，5-7cm转基因烟草苗和野生型对照苗，分别浇上含200mmol/L及400mmol/L浓度的NaCl的水，在温室中保持85％的湿度。检测发现，在200mmol/LNaCI的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢，生物量相对较少，叶片偏黄，而转基因烟草能够正常生长，生物量大，叶片较绿，能够开花结实，400mmol/L浓度的NaCI的条件下，生长一周以后，野生型烟草叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基因烟草的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型烟草那样明显，基本能正常生长。

在温室正常生长的，选取4周大、生长一致的转基因烟草苗和野生型对照苗，分别培养在含300μmol/L及500μmol/L浓度的CdCl₂的1/10hoagland营养液中，在温室中保持85％的湿度。4周后检测发现：300μmol/L处理组转基因烟草十字期真叶变黄，但顶叶鲜绿，根系较正常植株短粗，但可以生长，但非转基因烟草叶片和茎均变黄，根系很短，植株矮化严重，枯死；500μmol/L处理组，转基因组烟草生长受到抑制，叶片发黄，根系短粗，颜色发褐黄。

实施例8

本实验室通过种子胚生长点基因刷微创侵染法(荣非,王罡,季静,等.利用“微创刷”法获得抗草甘膦转基因大豆[J].大豆科学,2015,34(2).)对玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、大麦、小麦、棉花等农作物成熟胚转基因(LcGR)，成功获得转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、大麦、小麦、棉花植株，基因组PCR电泳图，如图9，自左向右依次为玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、大麦、小麦的基因组和质粒pCAMBIA2300-LcGR的PCR产物。(“+”表示：质粒pCAMBIA2300-LcGR的PCR产物)

在温室正常生长的，5-7个真叶转基因幼苗和野生型对照苗，分别浇上含200mmol/L及400mmol/L浓度的NaCI的水，在温室中保持85％的湿度。检测发现，在200mmol/LNaCI的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢，生物量相对较少，叶片偏黄，而转基因幼苗能够正常生长，生物量大，叶片较绿，能够开花结实，400mmol/L浓度的NaCI的条件下，生长一周以后，野生型幼苗叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基因幼苗的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型幼苗那样明显，基本能正常生长。

在温室正常生长的，选取4周大、生长一致的转基因植物和野生型对照苗，分别培养在含300μmol/L及500μmol/L浓度的CdCl₂的1/10hoagland营养液中，在温室中保持85％的湿度。4周后检测发现：300μmol/L处理组转基因植物十字期真叶变黄，但顶叶鲜绿，根系较正常植株短粗，但可以生长，但非转基因植物叶片和茎均变黄，根系很短，植株矮化严重，枯死；500μmol/L处理组，转基因组植物生长受到抑制，叶片发黄，根系短粗，颜色发褐黄。

实施例9

本实验室利用农杆菌侵染法对月季、洋桔梗、百合、蝴蝶兰等花卉进行腋芽或茎鳞片微创法转基因(LcGR)，获得转基因月季、洋桔梗、蝴蝶兰植株，基因组PCR电泳图如图10，自左向右依次为月季、洋桔梗、百合、蝴蝶兰的基因组和和质粒pCAMBIA2300-LcPCS的PCR产物。

在温室正常生长的，5-7cm转基因幼苗和野生型对照苗，分别浇上含200mmol/L及400mmol/L浓度的NaCI的水，在温室中保持85％的湿度。检测发现，在200mmol/LNaCI的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢，叶片偏黄，不能正常开花，而转基因幼苗能够正常生长，叶片较绿，能够开花，400mmol/L浓度的NaCI的条件下，生长一周以后，野生型幼苗叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基因幼苗的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型幼苗那样明显，基本能正常生长开花。

在温室正常生长的，选取4周大、生长一致的转基因苗和野生型对照苗，分别培养在含300μmol/L及500μmol/L浓度的CdCl₂的1/10hoagland营养液中，在温室中保持85％的湿度。4周后检测发现：300μmol/L处理组转基因苗十字期真叶变黄，但顶叶鲜绿，根系较正常植株短粗，但可以生长，但非转基因苗叶片和茎均变黄，根系很短，植株矮化严重，枯死；500μmol/L处理组，转基因组苗生长受到抑制，叶片发黄，根系短粗，颜色发褐黄。

实施例10

本实验室利用农杆菌侵染法对大叶黄杨、香花槐等乔木类树木进行转基因(LcGR)，获得转基因大叶黄杨、香花槐植株，基因组PCR电泳图如图11,自左向右依次为大叶黄杨、香花槐的基因组和和质粒pCAMBIA2300-LcPCS的PCR产物。

在温室正常生长的转基因树苗和野生型对照苗，分别浇上含200mmol/L及400mmol/L浓度的NaCl的水，在温室中保持85％的湿度。检测发现，在200mmol/LNaCl的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢，叶片偏黄。而转基因树苗能够正常生长，叶片较绿。400mmol/L浓度的NaCl的条件下，生长一周以后，野生型苗叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基因树苗的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型幼苗那样明显，基本能正常生长。

在温室正常生长的，选取4周大、生长一致的转基因树苗和野生型对照苗，分别培养在含300μmol/L及500μmol/L浓度的CdCl₂的1/10hoagland营养液中，在温室中保持85％的湿度。4周后检测发现：300μmol/L处理组转基因树苗十字期真叶变黄，但顶叶鲜绿，根系较正常植株短粗，但可以生长，但非转基因树苗叶片和茎均变黄，根系很短，植株矮化严重，枯死；500μmol/L处理组，转基因树苗生长受到抑制，叶片发黄，根系短粗，颜色发褐黄。

Claims (5)

1.一种枸杞谷胱甘肽还原酶，其特征是SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。

2.枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因，其特征是SEQIDNO.2所示的脱氧核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述基因的重组载体、表达载体和重组菌。

4.枸杞谷胱甘肽还原酶编码基因在制备转基因植物的应用，其特征是将权利要求2所述基因导入目的植物中，得到耐高NaCl逆境胁迫的和耐受镉离子的转基因植物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述目的植物为玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、大麦、小麦、棉花、月季、洋桔梗、百合、安祖花、蝴蝶兰、大叶黄杨，胡杨或香花槐。