CN105255911A

CN105255911A - 枸杞谷胱甘肽合成酶基因与克隆方法及在耐逆性方面应用

Info

Publication number: CN105255911A
Application number: CN201510826702.XA
Authority: CN
Inventors: 季静; 王罡; 贾翠翠; 吴电云; 曹海燕
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2016-01-20

Abstract

本发明涉及一种枸杞谷胱甘肽合成酶基因与克隆方法及在耐逆性方面应用。通过提取新鲜枸杞叶片中的总RNA，利用3’RACE方法克隆枸杞中的谷胱甘肽合成酶基因<i>LcGS</i>，得到基因完整的序列为2081bp，包含一个1683bp的开放阅读框(ORF)，编码560个氨基酸，3’非编码区398bp，该基因的cDNA序列还包含24bp的polyA尾。利用ExPASy数据库ProtParam软件在线分析的结果显示，其蛋白分子量62.65kD，理论等电点为6.16。通过半定量PCR研究分析了枸杞在不同时间盐胁迫和重金属胁迫下的表达分析，进一步解明了枸杞在胁迫下的应答机制。

Description

枸杞谷胱甘肽合成酶基因与克隆方法及在耐逆性方面应用

技术领域

本发明涉及一种枸杞(LyCiumChinenseMiller)中谷胱甘肽合成酶基因及其在增强植物耐盐碱能力方面的应用，具体为枸杞中谷胱甘肽合成酶基因（LcGS）的克隆、重组及应用。

背景技术

植物在生长发育过程中不断遭受各种生物及非生物的胁迫。如干旱、盐碱、寒冷、高温及病原菌的侵染等，与能移动的动物不同，植物在长期进化过程中发展起一套完善和适合其自身需要的信号转导系统以适应环境变化，更好地生存。植物受到刺激后，会产生物理或化学信号，这些信号到达靶细胞后转换成胞内信号，并启动细胞内各种信号转导系统，继而对原初信号进行级联放大，使一些基因的表达受逆境调控，最终导致生理生化变化。

植物对干旱和高盐等逆境的抗性是受多基因控制的一个复杂的过程，而这些抗逆基因的表达多是受逆境环境调控的，当植物感受到外界的生物、非生物胁迫信号时，机体的逆境调控的抗逆相关基因才会表达。谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是广泛分布于植物和微生物细胞内最主要、含量最丰富的含巯基的低分子肽。1929年由Hopkins最早发现并对其予以命名，是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽(L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸)，分子式为C₁₀H₁₇O₆SN₃。GSH作为生物体内主要的还原态硫之一，在生物体抵抗各种胁迫(冷害、干旱、重金属、真菌等)的过程中起着重要的作用，其含量水平的高低与植物对各种环境胁迫的忍耐程度密切相关，同时也可能是生物体内其调节作用的信号分子之一。近些年来，它在高等植物代谢过程中的生理作用，尤其是在植物抵御活性氧伤害过程中的作用及其与植物抗逆性关系的研究进展很快。

Bloch等最早研究了GSH的生物合成，并证实了细胞内的GSH是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)与GSH合成酶(GS)在ATP存在下催化L-谷氨酸、L-精氨酸和甘氨酸的序贯反应在细胞内合成的。GSH通过细胞膜时与分布在细胞膜外侧的γ-谷氨酰转肽酶反应，GSH的γ-谷氨酰部分便转移到某些氨基酸上。由此生成的γ-谷氨酰氨基酸再被运进细胞并在γ-谷氨酰基环化转移酶的作用下裂解为相应的氨基酸和5-羟基脯氨酸。5-羟基脯氨酸再在5-羟基脯氨酸酶的催化下转化为L-谷氨酸。在γ-谷氨酰转肽酶的作用下生成的半胱氨酸甘氨酸部分则被半胱氨酸甘氨酸双肽酶作用，裂解为半胱氨酸和甘氨酸，分别作为γ-ECS和GS的底物。这6种酶催化的6个反应便组成了动物中GSH合成和降解的γ-谷氨酰循环。GS和γ-ECS两种酶都已在植物组织中发现和纯化，而且功能也已证实。两种酶在叶绿体和其他细胞器均有分布。

高等植物体内谷胱甘肽的功能主要体现在以下几个方面：（1）维持细胞膜的完整性、清除体内自由基；（2）参与氨基酸的吸收和转运，促进细胞合成蛋白质；(3)参与了氨基酸的吸收，进而促进蛋白质的合成；（4）解毒作用；（5）GSH在重金属胁迫中起着重要的作用；（6）谷胱甘肽参与植物环境胁迫的应答；谷胱甘肽分为氧化型(GSSG)和还原型(GSH)。通常所说的谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽，其半胱氨酸上的巯基是其发挥生物学功能所必需的。还原型谷胱甘肽是植物中含量最丰富的含巯基的低分子肽，为植物机体内的重要活性物质，它参与二硫化物、硫醚和硫酯的形成，并能清除生物体内的自由基，是胞内代谢过程和植物遭受氧化胁迫时所产生的过氧化物的最有效的清除剂之一。植物机体内的氧化型谷胱甘肽可以转化为还原型谷胱甘肽，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽含量的比值是反映植物体内谷胱甘肽活性的重要指标之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枸杞谷胱甘肽合成酶基因(LcGS)。

本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质(LcGS)。

本发明的目的还在于提供含有该基因的重组载体(pMD18-T-LcGS)和宿主细胞（DH5α）。

本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。

本发明提供的一种枸杞谷胱甘肽合成酶基因（LcGS），如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列构成。

本发明提供的一种枸杞谷胱甘肽合成酶基因（LcGS）编码的蛋白质，如序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

本发明提供的一种枸杞谷胱甘肽合成酶基因（LcGS）的重组克隆载体pMD18-T-LcGS。

含有上述的枸杞谷胱甘肽合成酶基因（LcGS）的重组载体，这些重组载体包括质粒。

含有上述枸杞谷胱甘肽合成酶基因（LcGS）的完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体(pMD18-T-LcGS)的宿主细胞（DH5α）也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种含有LcGS基因的工程菌。

本发明的克隆方法由下述步骤组成：

从枸杞新鲜叶片中提取总RNA，根据转录组Unigene序列中枸杞谷胱甘肽合成酶基因的核苷酸序列设计上游引物LcGS-F1:5’-TCAAAGAGGTCAGGCACTGTTCC-3’（SEQIDNo.3），LcGSF-F2:5’-GAAGCCTGGATTGTATGTTATG-3’（SEQIDNo.4）然后利用3’RACE方法扩增得到谷胱甘肽合成酶基因的3’末端序列，将转录组Unigene中的序列与得到的3’末端序列拼接设计全长扩增引物GS-Full-F:ATGGGCAGTGGCTATTCCT（SEQIDNo.5）;GS-Full-R:TGTCTCTAGCAGAACAGTAAAGG（SEQIDNo.6）;PCR扩增获得枸杞LcGS的全长序列。

本发明构建含谷胱甘肽合成酶基因LcGS的大肠杆菌的中间载体pMD18-T-LcGS。由下述步骤组成：

以GS-Full-F/Full-R为引物，以枸杞cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得含有序列表中SEQIDNO.1所示的LcGS基因的中间载体pMD-18-T-LcGS。

本发明研究了枸杞在不同时间的盐碱胁迫下，枸杞谷胱甘肽合成酶的表达量的变化，由下述步骤组成：

提取不同时间盐胁迫下枸杞叶片的总RNA，测定RNA浓度，反转录合成cDNA，以LcGS-F2/GS-Full-R为引物，cDNA为模板，通过半定量PCR测定盐胁迫下枸杞谷胱甘肽合成酶的表达量。

本发明研究了枸杞在不同时间的重金属胁迫下，枸杞谷胱甘肽合成酶的表达量的变化，由下述步骤组成：

提取不同时间重金属胁迫下枸杞叶片的总RNA，测定RNA浓度，反转录合成cDNA，以LcGS-F2/GS-Full-R为引物，cDNA为模板，通过半定量PCR测定盐胁迫下枸杞谷胱甘肽合成酶的表达量。

本发明提供了一种枸杞谷胱甘肽合成酶及其在增强枸杞等植物耐逆性能力（例如耐盐、耐重金属）方面的应用。通过提取新鲜枸杞叶片中的总RNA，利用3’RACE方法克隆枸杞中的谷胱甘肽合成酶基因LcGS，得到基因完整的序列为2081bp，包含一个1683bp的开放阅读框(ORF)，编码560个氨基酸，3’非编码区398bp，该基因的cDNA序列还包含24bp的polyA尾。利用ExPASy数据库ProtParam软件在线分析的结果显示，其蛋白分子量62.65kD，理论等电点为6.16。通过半定量PCR研究分析了枸杞在不同时间盐胁迫和重金属胁迫下的表达分析，进一步解明了枸杞在胁迫下的应答机制。

附图说明

图1.LcGS-F2引物扩增LcGS电泳图。

图2.LcGS全长扩增电泳图。

图3.pMD18-T-LcGS载体示意图。

图4.LcGS与其它植物GS多重序列比对。

图5.不同时间盐处理下LcGS的表达分析。

图6.不同时间重金属处理下LcGS的表达分析。

具体实施方式

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1

枸杞中谷胱甘肽合成酶LcGS基因的3’末端克隆

利用Trizol试剂,从100mg的新鲜的枸杞叶片中提取totalRNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物,枸杞中谷胱甘肽合成酶LcGS基因的上游引物为:LcGS-F1:5’-TCAAAGAGGTCAGGCACTGTTCC-3’,LcGSF-F2:5’-GAAGCCTGGATTGTATGTTATG-3’,利用3’FULLRACECoreSetVer.2.0(TaKaRa，Japan)试剂盒扩增得到LcGS基因的3’末端序列。具体步骤:①以totalRNA为模板，利用3’RACEAdaptor引物进行反转录反应，合成1stStrandcDNA，反应体系如下：

反应条件:42℃，60min；70℃，15min。

根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物3’RACEoutprimer:5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’，以1stStrandcDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

反应条件如下：94℃，4min；94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，90Sec；34cycle，72℃，10min。将上述PCR扩增产物稀释40倍取1.5uL作为模板，以LcGS-F2/3’RACEoutprimer为引物，其他反应液与上述条件一致，反应条件如下：94℃，4min；94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，70Sec；30cycle，72℃，10min；PCR扩增后取5μL电泳，如图1；将其余扩增产物利用天根公司普通DNA产物回收试剂盒对PCR反应产物进行回收，具体操作按照试剂盒说明书操作。

实施例2

枸杞中谷胱甘肽合成酶LcGS基因全长序列克隆

设计全长引物GS-Full-F：ATGGGCAGTGGCTATTCCT;GS-Full-R:TGTCTCTAGCAGAACAGTAAAGG，以cDNA为模板，扩增获得LcGS基因的全长序列。反应体系如下：

反应条件如下：94℃，4min；94℃，30Sec；55℃，30Sec；72℃，120Sec；34cycle，72℃，10min。取将上述PCR扩增产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳，如图2；其余PCR产物利用天根公司普通DNA产物回收试剂盒对PCR反应产物进行回收，具体操作按照试剂盒说明书操作。

实施例3

克隆载体pMD18-T-LcGS的构建过程

将序列表所示的LcGS基因与购自大连宝生物工程公司pMD18-T载体连接，反应体系如下:

LcGSPCR片段为实施例1中的纯化回收产物。

反应条件:16℃，6h。连接产物转化感受态E-Coli.DH5α，涂布在含有40ml25mg/ml的X-Gal、16ml50mg/ml的IPTG、100mg/LAmp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落，菌液PCR法验证是否转化成功。挑取8个菌落，分别加入到10μLddH2O中，混匀后，取2μL98℃反应10min，然后按照如下体系加样：

94℃，4min；94℃，30Sec；55℃，30Sec；72℃，120Sec；34cycle，72℃，10min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳观察结果，如图3，与预期一致，将该载体送往华大基因公司测序，对测序返回的序列，在NCBI进行blast比对，比对结果显示该序列与马铃薯（Solanumtuberosum；XM_006361818.1）、番茄（Solanumlycopersicum；NM_001247085.2）同源性分别为91%、90%，可以推测该基因是谷胱甘肽合成酶。通过对番茄、黄瓜、百脉根的氨基酸序列进行多重序列比对，如图4，利用NCBI数据库CDD软件对LcGS的结合位点和结构域分析表明，LcGS属于eu-GS超家族，活性位点是由（R²¹⁴S²³⁷G⁴⁵⁴R⁵³⁶）4个氨基酸残基构成；ATP结合位点由14（M²¹⁸I²²⁹K³⁹⁵V⁴⁴⁷K⁴⁴⁹G⁴⁴⁵N⁴⁴⁸Y⁴⁵⁰M⁴⁸⁵Q⁴⁸⁶R⁴⁸⁷I⁴⁸⁸E⁵¹¹K⁵³⁸）个氨基酸残基组成；镁离子结合位点由3（E²³⁰N²³²E⁴⁵³）个氨基酸残基组成；谷胱甘肽结合位点由11（R²¹⁴S²³⁵S²³⁷E³⁰²N³⁰⁴Q³⁰⁸R³⁵⁶Y³⁵⁹R⁵³⁶V⁵⁴⁷A⁵⁴⁸）个氨基酸残基组成；此外，LcGS含有二聚体单元（Dimerizationunit）由28个氨基酸残基组成，如图4。

以枸杞GS氨基酸序列为参照，从NCBI中查找同源序列，选取3个同源序列进行多重序列比对，如图4，分别为Solanumlycopersicum（ACV72061.1）、Cucumissativus（XP_004157260.1）、Lotusjaponicus（AF279703_1）。通过比对不同物种的GS序列，结果显示LcGS与这三种植物的同源性分别为88%、67%、65%，通过比对不同物种的GS序列，可知GS存在2个高度保守区域：甘氨酸富集域和丙氨酸富集域(图4)。

实施例4

枸杞谷胱甘肽合成酶在不同时间盐胁迫下的表达分析

分别取长势一致的枸杞幼苗进行不同时间的盐处理，研究LcGS在盐胁迫中的应答机制。盐处理将其置于含有300mMNaCl的霍格兰培养液中培养3h、6h、9h、12h、24h、48h；利用Trizol法提取对照组和处理组的总RNA，测定RNA的质量和浓度，以等量的ＲＮＡ反转录cDNA，取等量cDNA进行RT-PCR反应，再取等量的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，实验经过3次重复，通过比较目的条带的灰度判定基因表达的强弱，如图5，研究结果表明，叶片LcGS基因从3h开始逐渐上调表达，但变化不明显，24h达到最大，48h较24h表达量有所下降（图5），呈现先升高后降低的变化趋势。说明枸杞叶片在盐胁迫的处理下，通过上调GS的表达量适应环境的不良环境。

实施例5

枸杞谷胱甘肽合成酶在不同时间重金属胁迫下的表达分析

分别取长势一致的枸杞幼苗进行不同时间的盐和重金属胁迫处理，研究LcGS在重金属胁迫中的应答机制。重金属胁迫将枸杞植株至于含有500μMCdCl2的营养液中分别处理3h、6h、9h、12h、24h。利用Trizol法提取对照组和处理组的总RNA，测定RNA的质量和浓度，以等量的ＲＮＡ反转录cDNA，取等量cDNA进行RT-PCR反应，再取等量的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，实验经过3次重复，通过比较目的条带的灰度判定基因表达的强弱，如图5，研究结果表明LcGS在0h、3h表达量没有明显的变化，6h开始逐渐上调表达LcGS，但表达量变化不大，9h表达量达到最大，12h、24h表达量维持在较高水平。总之，LcGS基因在盐胁迫和重金属胁迫下，表达丰度发生变化，不同时间的处理下表达量也有所不同，该基因可能参与多种逆境应答机制。

序列表

<110>天津大学

<120>枸杞谷胱甘肽合成酶基因与克隆方法及在耐逆性方面应用

<130>20140411

<160>6

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>2081

<212>DNA

<213>人工系列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2081)

<400>1

atgggcagtggctattcctctccatcaatcttacaaagcagcagcacttgcttaccatcc60

tattgttctactacctctccttttctatcccaagaatcacaaacaaactctttaaatttc120

tgctcacctactagattcttggaaacccatctcagaaaaccttccaagattttaatacca180

agatccccattttcagcaatctcaccattgaagtgtgctaaagtgcacaaaatggagacc240

caagtggaagattctgtgaaacccattgttgatcctcatgatatagacccaaagttggtg300

cagaaacttgcttatgatgcccttgtttggtgttctctgaatggtcttcttgttggtgac360

agaaattcaaagaggtcaggcactgttcctggtgttgatatggttcatgctccagttgct420

ttgttaccaatgtcatttcctgaaagtcactggaagcaagcttgtgaagttgctcctatt480

ttcaatgaacttgttgatcgtgtgagtcaggatggagaatttctgcagcaatcactctct540

aggacaaaaaaagttgatcctttcacctccagactactagaaatccactccaagatgtta600

gaaatcaacaagatagaggaaatacgcttggggttgcatcgctcagactatatgctggat660

gagcaaactaaattgcttctgcaaatagagcttaacacaatttcatcatcatttgcaggg720

ctaggttgtctagtcagcgagcttcacaggagcttgcttcaacaatacagagaaggcatt780

gcattagatcctaacagaattcccacaaacaattctgcaaatcaatttgctgaagcattg840

gctaaagcttggaatgaatatggtgatccaagggctgtaattatgtttgtggttcaagct900

gaagaacgcaacatgtatgaccagcattggctttctgcttcattgagagaaagacatcaa960

gttacaactatcagaaagacactggctgagattgatgcacttggcgagcttcaacaagat1020

ggtacccttgttgtagatggtcaagctgtggcagtcatttattttagagctggctatgca1080

ccaagtgactatcactcagaatctgagtggggagctaggcttctgatggagcagtcacgt1140

gcagtcaagtgtccttcaatttcctatcatttaactggcaccaaaaagattcagcaagag1200

cttgctaagcccaatgtacttgaaaggtttctggaaaacaaagatgacattgccaaacta1260

cggaaatgctttgcagggttgtggagcttggatgaatccgatactttcaaggatgcaatt1320

gagaagcctggattgtatgttatgaaaccacaacgagaaggaggaggaaacaatatctac1380

ggcgaggacgtgagagaagctcttctgaaactgcaaaaggaaggtactggaagtgatgca1440

gcatacatactaatgcagaggatttttcccaacatttcaaactcgatactaatgcgagaa1500

ggcatccctcataaagaacaaaccatatcagaacttggggtatatggttcctatttaagg1560

aataaaaatgaaattctaatcaaccaacaggttggttacttgatgcgaacaaaggtctct1620

tcatcgaatgagggtggagttgcagccggttttgcagttttggacagcatatacttggtt1680

tgatggaattggcttgcactttcacgttgtaacaaaggttgaatgcggaagctggacagg1740

tcgtatcctacattatgttggaacaccatggttttgacttgtttcaccttccttgtttca1800

cattgtatttttcttgtttaacatcttaaataaatagaggtccatatttttttgtgaagg1860

aagtggacacaataatgatagttagttcaaagttcttgcttctaaattaaacccaattca1920

gtgtttgaactctttgttaccctaagcctttactgttctgctagagacattaccaaattt1980

gagcatatgatctgttgctcatcagtcatcactcctgtaattcacatttgttggtactac2040

caaggttgctcatctgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2081

<210>2

<211>560

<212>PRT

<213>人工系列

<220>

<221>MUTAGEN

<222>(1)..(560)

<400>2

MetGlySerGlyTyrSerSerProSerIleLeuGlnSerSerSerThr

151015

CysLeuProSerTyrCysSerThrThrSerProPheLeuSerGlnGlu

202530

SerGlnThrAsnSerLeuAsnPheCysSerProThrArgPheLeuGlu

354045

ThrHisLeuArgLysProSerLysIleLeuIleProArgSerProPhe

505560

SerAlaIleSerProLeuLysCysAlaLysValHisLysMetGluThr

65707580

GlnValGluAspSerValLysProIleValAspProHisAspIleAsp

859095

ProLysLeuValGlnLysLeuAlaTyrAspAlaLeuValTrpCysSer

100105110

LeuAsnGlyLeuLeuValGlyAspArgAsnSerLysArgSerGlyThr

115120125

ValProGlyValAspMetValHisAlaProValAlaLeuLeuProMet

130135140

SerPheProGluSerHisTrpLysGlnAlaCysGluValAlaProIle

145150155160

PheAsnGluLeuValAspArgValSerGlnAspGlyGluPheLeuGln

165170175

GlnSerLeuSerArgThrLysLysValAspProPheThrSerArgLeu

180185190

LeuGluIleHisSerLysMetLeuGluIleAsnLysIleGluGluIle

195200205

ArgLeuGlyLeuHisArgSerAspTyrMetLeuAspGluGlnThrLys

210215220

LeuLeuLeuGlnIleGluLeuAsnThrIleSerSerSerPheAlaGly

225230235240

LeuGlyCysLeuValSerGluLeuHisArgSerLeuLeuGlnGlnTyr

245250255

ArgGluGlyIleAlaLeuAspProAsnArgIleProThrAsnAsnSer

260265270

AlaAsnGlnPheAlaGluAlaLeuAlaLysAlaTrpAsnGluTyrGly

275280285

AspProArgAlaValIleMetPheValValGlnAlaGluGluArgAsn

290295300

MetTyrAspGlnHisTrpLeuSerAlaSerLeuArgGluArgHisGln

305310315320

ValThrThrIleArgLysThrLeuAlaGluIleAspAlaLeuGlyGlu

325330335

LeuGlnGlnAspGlyThrLeuValValAspGlyGlnAlaValAlaVal

340345350

IleTyrPheArgAlaGlyTyrAlaProSerAspTyrHisSerGluSer

355360365

GluTrpGlyAlaArgLeuLeuMetGluGlnSerArgAlaValLysCys

370375380

ProSerIleSerTyrHisLeuThrGlyThrLysLysIleGlnGlnGlu

385390395400

LeuAlaLysProAsnValLeuGluArgPheLeuGluAsnLysAspAsp

405410415

IleAlaLysLeuArgLysCysPheAlaGlyLeuTrpSerLeuAspGlu

420425430

SerAspThrPheLysAspAlaIleGluLysProGlyLeuTyrValMet

435440445

LysProGlnArgGluGlyGlyGlyAsnAsnIleTyrGlyGluAspVal

450455460

ArgGluAlaLeuLeuLysLeuGlnLysGluGlyThrGlySerAspAla

465470475480

AlaTyrIleLeuMetGlnArgIlePheProAsnIleSerAsnSerIle

485490495

LeuMetArgGluGlyIleProHisLysGluGlnThrIleSerGluLeu

500505510

GlyValTyrGlySerTyrLeuArgAsnLysAsnGluIleLeuIleAsn

515520525

GlnGlnValGlyTyrLeuMetArgThrLysValSerSerSerAsnGlu

530535540

GlyGlyValAlaAlaGlyPheAlaValLeuAspSerIleTyrLeuVal

545550555560

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工系列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(22)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(23)

<400>3

tcaaagaggtcaggcactgttcc23

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工系列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(22)

<400>4

gaagcctggattgtatgttatg22

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工系列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(19)

<400>5

atgggcagtggctattcct19

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工系列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(22)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(23)

<400>6

tgtctctagcagaacagtaaagg23。

Claims

1.一种枸杞谷胱甘肽合成酶基因在增强植物耐盐能力方面耐逆性的应用。

2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于该枸杞谷胱甘肽合成酶基因为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

3.按照权利要求1所述的应用，其特征在于该枸杞谷胱甘肽合成酶基因编码的蛋白质为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

4.按照权利要求1所述的应用，其特征在于含有所述的枸杞谷胱甘肽合成酶基因的全序列的重组载体为pMD18-T-LcGS。

5.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求2所述的枸杞谷胱甘肽合成酶基因全序列SEQIDNO.1。

6.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述的枸杞谷胱甘肽合成酶基因的克隆方法由下述步骤组成：

一、利用Trizol试剂,从100mg的新鲜的枸杞叶片中提取totalRNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物,枸杞中谷胱甘肽合成酶LcGS基因的上游引物为:LcGS-F1:5’-TCAAAGAGGTCAGGCACTGTTCC-3’,LcGSF-F2:5’-GAAGCCTGGATTGTATGTTATG-3’,利用3’FULLRACECoreSetVer.2.0试剂盒扩增得到LcGS基因的3’末端序列；具体步骤:①以totalRNA为模板，利用3’RACEAdaptor引物进行反转录反应，合成1stStrandcDNA，反应体系如下：

反应条件:42℃，60min；70℃，15min；

反应条件如下：94℃，4min；94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，90Sec；34cycle，72℃，10min；将上述PCR扩增产物稀释40倍取1.5uL作为模板，以LcGS-F2/3’RACEoutprimer为引物，其他反应液与上述条件一致，反应条件如下：94℃，4min；94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，70Sec；30cycle，72℃，10min；PCR扩增后取5μL电泳；将其余扩增产物利用天根公司普通DNA产物回收试剂盒对PCR反应产物进行回收，具体操作按照试剂盒说明书操作；

二、枸杞中谷胱甘肽合成酶LcGS基因全长序列克隆：

设计全长引物GS-Full-F：ATGGGCAGTGGCTATTCCT;GS-Full-R:TGTCTCTAGCAGAACAGTAAAGG，以cDNA为模板，扩增获得LcGS基因的全长序列。

7.反应体系如下：

反应条件如下：94℃，4min；94℃，30Sec；55℃，30Sec；72℃，120Sec；34cycle，72℃，10min。

8.取将上述PCR扩增产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳；其余PCR产物利用天根公司普通DNA产物回收试剂盒对PCR反应产物进行回收，具体操作按照试剂盒说明书操作。