JP2002503487A - 茎頂端部を使用したトランスジェニック植物の作成方法 - Google Patents

茎頂端部を使用したトランスジェニック植物の作成方法

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JP2002503487A
JP2002503487A JP2000532003A JP2000532003A JP2002503487A JP 2002503487 A JP2002503487 A JP 2002503487A JP 2000532003 A JP2000532003 A JP 2000532003A JP 2000532003 A JP2000532003 A JP 2000532003A JP 2002503487 A JP2002503487 A JP 2002503487A
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トロリンダー，ノーマ・エル
クーンス，リンダ・ケイ
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コットン，インコーポレイテッド
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation

Abstract

(57)【要約】 本適用法は、植物組織の細胞を形質転換し、これらの細胞と組織を成熟トランスジェニック植物へ再生させるための方法を提供する。植物実生の頂端分裂組織領域は分離され、その後、分離組織の代謝活性を緩慢にするため処理される。その組織はその後、目的とする遺伝子をコードするＤＮＡを含むＤＮＡプラスミドまたはプラスミドベクターを運ぶアグロバクテリウムなどの形質転換剤に曝露される。適当なインキュベーション時間後、逆の処理を行い、その頂端分裂組織の代謝活性が正常に復帰することが可能になる。本方法は、形質転換剤に対する曝露用の受容細胞のより大きな集団を供給し、それにより、より高い確率で形質転換植物に再生することができる分離形質転換組織を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、所望される形質をコードする遺伝子を植物のゲノムの中に入れる、
有効かつ信頼できる新規な導入方法に関する。その方法には、形質転換される植
物の頂端分裂組織領域の分離ステップと切開ステップが含まれており、その後、
切開部位では目的の遺伝子をコードするDNAが導入される。DNAは、目的とする所
望の遺伝子をコードする外来DNAを植物ゲノムDNAの中に入れる挿入頻度を向上さ
せるような条件下で、導入される。
【０００２】発明の背景 植物分子生物学において現在行われている研究は、遺伝子工学を使用すること
により、改良植物品種の開発を目指している。歴史的には、改良植物品種は、所
望される形質を有する植物を同定し、保存し、また交雑育種するために、古典的
な遺伝子技術を使用して開発されてきた。しかし、古典的な育種者にとって入手
可能な遺伝子形質は、その育種者が改良を目指している特定の植物種の中で同定
できるものに限定される。
【０００３】 植物への分子生物学技術の適用における進歩により、現在、目的とする植物、
とくに、綿、トウモロコシ、モロコシ類、大豆、ムラサキウマゴヤシ、タバコな
どの主要な作物植物や菜種などのアブラナ属の中にまったく異なった種から分離
された新しい形質の導入が可能である。転移が成功した形質には、虫害抵抗性、
除草剤抵抗性、ストレス耐性、旱魃抵抗性、疾病抵抗性が含まれる。現在では、
組換えDNA技術により、植物が新しい種に形質転換されるときに植物の特性やそ の生産物に効果を及ぼす新しい遺伝子を同定することが可能になった。例えば、
綿の虫害抵抗性品種は、数多くの品種が育っている。機械によるトマトの収穫を
より容易に、かつ安価にしている、通常のトマトよりも長いつる上に実ってその
まま残ることできるトマトがあるのと同様、除草剤RoundupR、BuctrilR、Libert
yRLinkに対して抵抗性のある作物植物が現在入手可能である。
【０００４】 さまざまな技術が植物細胞の中に外来遺伝子を導入することに使用されてきた
。しかし、これらの技術のたいていのものは、植物全体に再生され、組織培養中
で一定期間を要求せねばならない植物組織を使用することに限定されている。細
胞ないしは組織から植物全体を再生させる方法には、頂端分裂組織細胞と側生分
裂組織細胞の微小増殖、器官形成、体細胞胚形成のステップが含まれる。頂端分
裂組織細胞と側生分裂組織細胞の形質転換と器官形成は、キメラ植物、すなわち
、たった数個の細胞に新たに導入された形質をコードする遺伝子を有し、生殖系
列組織の遺伝子の中にその遺伝子がある場合もあるが、ない場合もある植物を生
み出す。体細胞胚形成により再生された植物は、稀にキメラ植物となる。体細胞
胚形成は通常単細胞に由来する。
【０００５】 植物細胞の中に外来遺伝子を導入するのに使用されている1つの普通の方法は 、比較的良性の天然植物病原体であるアグロバクテリウム(Agrobacterium)によ る形質転換である。アグロバクテリウムは、その細菌が植物細胞を感染させると
きにその細菌が利用する天然プロセスの一部として、活発に形質転換、すなわち
、所望される表現型の形質を供給する遺伝子の組込みを仲介する。植物細胞の中
に外来遺伝子を転移させ、続いて形質転換細胞から再生された植物において挿入
遺伝子を発現させるための諸方法は従来技術では周知である。これについては、
例えば、M. De Blockら、The EMBO Journal (1984) 3: 1681; Horschら、Scienc
e (1985) 227: 1229; C. L. Kado、Crit. Rev. Plant. Sci. (1991) 10: 1を参 照のこと。
【０００６】 単子葉植物科を構成する植物はとくにそうであるが、ある種の植物種は他のも
のよりもアグロバクテリウムによる形質転換がさらに難しいことが証明されてい
る。双子葉植物である綿の形質転換もまた、とくに難しいものであった。単子葉
植物は一般的にクラウンゴールを形成しないため、アグロバクテリウムの宿主範
囲は双子葉植物に限られていると基本的には考えられていた。しかし、Stephen
L. とGoldman Ann C. F. Gravesは、米国特許第5,177,010号と5,187,073号の中 で単子葉トウモロコシを含めた植物を形質転換するためのプロセスを説明してい
る。これらの方法には、急速に分裂する細胞を含む領域で実生に傷をつくるステ
ップと、その後、アグロバクテリウムによりその傷を接種するステップが含まれ
ている。
【０００７】 Roberta H. SmithとJean H. Gouldは、米国特許第5,164,310号に、植物組織の
茎頂により植物を形質転換させるための方法を開示している。発明者らは、説明
されている方法では形質転換される植物のユニークなクローンに関する特性と遺
伝的特性を永続化させながらも、植物の急速な増殖が可能になると教示している
。しかし、これらの方法もまた、実際に生成される所望の形質の原因となる遺伝
子を発現させる形質転換体の数が少ないことがあって、商業ベースに見合う規模
には適用することが難しいことが分かっている。
【０００８】 さらに、急速に細胞を分裂するステップを含めて、植物組織を接種するステッ
プにより植物を形質転換するための方法が、Paula P. Chee らに発行された米国
特許第5,169,770号に開示されている。Cheeらは、アグロバクテリウムをベース にしたベクターによりP. vulagrisを感染させる発芽後の期間が、分裂細胞を感 染させるアグロバクテリウムの能力にとっては非常に重要であることを示した。
Cheeらによると、発芽細胞における維管束組織の分量は、分化が進むにつれて急
速に増加していく。そのため、このマメ科植物でうまく形質転換を達成するため
には、接種ステップは発芽の16〜96時間以内に行われなければならない。Cheeら
はさらに、その形質転換が武装化された(armed)アグロバクテリウムベクター、 又は武装化されていない(disarmed)アグロバクテリウムベクターのいずれかによ
り実施することができることを開示している。
【０００９】 微粒子銃(microprojectile bombardment)として知られている技術は、綿、ト ウモロコシ、タバコ、ヒマワリ、大豆と、ある種の蔬菜類を含めた数々の作物植
物の中に新しい遺伝子形質をコードする遺伝子をうまく導入するのに使用されて
きた。これについては、例えば、Sanfordらに付与された米国特許第4,945,050号
、Sanfordら、Trends in Biotechnology (1988) 6:299、Sanfordら、Part. Sci.
Technol. (1988) 5:27、J. J. FinerとM. D. McMullen、Plant Cell Reports (
1990) 8:586〜589、Gordon-Kamm、The Plant Cell (1990) 2:603を参照のこと。
微粒子銃による形質転換は、アグロバクテリウムによる形質転換よりも、より種
特異的ではなく、また遺伝子型特異的でもないが、しかし、植物のゲノムDNAの 中に所望される表現型形質の原因となるDNA分子ないしは遺伝子の組込みを仲介 するための天然のメカニズムがないという理由もあって、衝撃後に達成された安
定的な形質転換の頻度は非常に低い。例えば、綿の遺伝子銃による形質転換では
、形質転換のために標的とされた100〜500分裂組織当たりわずか1つのクローン 性トランスジェニック植物しか作成されないことが報告されている。これら形質
転換細胞のたった0.1〜1％のみが子孫に外来DNAを伝達することができた。これ については、国際出願WO 92/15675を参照のこと。遺伝子銃により処理された細 胞は、植物全体にわたって再生されなければならず、それには、労働集約的、滅
菌組織培養手順が必要となり、またとくに綿ではそうだが、たいていの作物植物
では一般に遺伝子型依存性になる。同様の低い形質転換頻度が他の植物種でも報
告されている。
【００１０】 従来技術の諸方法は植物の数多くのタイプで、トランスジェニック植物を供給
していくことであろう。しかし現在入手可能な諸方法はすべて、従来技術の形質
転換諸方法により作成される形質転換細胞の数が少ないため商業ベースに見合う
規模でトランスジェニック植物生体の開発に適用することは難しかった。
【００１１】 したがって、これらの組織の細胞ゲノムDNAへ外来DNAの効率的な組込みを行う
といった方法で、生殖系列組織に所望される形質をコードする外来DNAを運ぶア グロバクテリウムなどの形質転換剤のデリバリーを可能にする手順に対する需要
がまだ存在している。本適用方法では、形質転換植物を作成することができる頻
度を大幅に改善させる、植物ゲノムDNAへの外来DNA組込み率を向上させるといっ
た方法で頂端分裂組織を標的とする。
【００１２】発明の概要 本発明は、植物組織の細胞の形質転換を行い、また成熟したトランスジェニッ
ク植物にまでこれらの細胞と組織を再生させるための1つの新たな方法を提供す る。植物実生の頂端分裂組織領域を含む組織が分離され、その組織の代謝活性を
緩慢にするために処理される。この処理により、有糸分裂の単一ステージで蓄積
される細胞集団が供給される。また、新しい細胞分裂が起こらないことも確かめ
られている。組織はその後、目的とする遺伝子をコードするDNAを含むDNAプラス
ミド、ないしはプラスミドベクターを運ぶアグロバクテリウムなどの形質転換剤
に曝される。適当な時点で、通常は約24時間後に、その処理を逆転し、そのため
、組織の代謝活性が正常に戻り、その分裂細胞が同調し、かつ急速に有糸分裂に
入っていくことを可能になる。目的とする所望の形質をコードする外来DNA分子 の組込みは、有糸分裂の間にたいてい効果的に起こるため、本発明の本方法は目
的とする遺伝子を運ぶアグロバクテリウムなどの形質転換剤に曝露させるための
受容細胞のさらに大きな集団を提供する。
【００１３】発明の詳細な説明 本発明は、トランスジェニック植物細胞と組織を作成する方法及びそれから作
成される成熟した植物に関する。本方法は、ゲノムDNAの中にアグロバクテリウ ム形質転換ベクターないしはプラスミド上に存在する目的遺伝子を効果的かつ効
率的に組み込むことができる植物組織を提供する。
【００１４】 本方法は、 １）若い実生から茎頂端組織を分離するステップと、 ２）細胞の代謝活性を緩慢にするために十分な時間、分離された茎頂端組織を
低温処理し、細胞分裂ないしは有糸分裂の単一ステージにその細胞を蓄積させる
ステップと、 ３）茎端が低温で保たれている間に子葉領域全体にその茎端を切開するステッ
プと、 ４）目的とする外来遺伝子を運ぶ形質転換剤を切開された分裂茎頂端組織の中
に導入するステップと、 ５）選択薬剤を含む培地において形質転換した分裂茎端組織から苗木を再生さ
せるステップと を含む。
【００１５】 本発明の本方法は、単子葉と双子葉を含む植物の任意の種を形質転換するのに
使用することができる。本方法では、さらに高度の形質転換頻度が達成され、ス
クリーニングを可能にするのに十分な形質転換植物の数の獲得に関する難しさが
克服されている。本発明の本方法により形質転換することができる代表的な双子
葉植物種には、綿、大豆、ムラサキウマゴヤシ、亜麻、タバコ、ヒマワリ、ピー
ナッツ、イチゴやトマトなどの果実、エンドウ、豆、カボチャ、コショウ類(pep
per)などの野菜が含まれる。本発明で使用することができる好適な双子葉植物に
は綿、ヒマワリ、コショウ類、とくにピーマンが挙げられる。本発明の好適な1 つの実施態様は、綿植物の形質転換方法を使用したものである。本方法を使用し
て形質転換を行うことができる単子葉種には、トウモロコシ、モロコシ類、大麦
、エンバク、ライ麦、小麦、米が含まれる。
【００１６】 本発明で使用されている形質転換剤は、形質転換された植物の中に所望される
形質を導入ないしは付与するために選択された外来遺伝子でありうる。植物分子
生物学の技術に熟練した者であれば、外来遺伝子はDNAを含み、ないしはある例 では、アンチセンスRNAなどのRNAを含んでもよいことを理解することであろう。
導入される形質は、その植物の成長を促進し、疾病抵抗性をもたらし、植物形態
学ないしは植物生産物の質において変化をもたらし、あるいはその植物ゲノムの
遺伝子操作により達成することができる何らかの他の変化をもたらす。その植物
の中に挿入される新しい形質をコードするDNAは、一般的には、プラスミドベク ターの形態のものであり、また植物分子生物学の技術に熟練した者には公知の方
法を使用して構築される。実施例の諸方法はF. Ausubelら編、Current Protocol
s In Molecular Biology、Wiley Interscience (1990)と、B. R. Glick J. E. T
hompson編、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology）、CRC P
ress社、Boca Raton (1993)に説明されている。
【００１７】 発現させるべきDNAは、OdellらによりNature (1985) 313：810で説明されてい
るカリフラワー・モザイクウイルス (CaMV) 由来の35Sプロモーター、ないしはV
ontlingら、Mol. Plant-MicrobeInteractions (1991) 4：370により、またM. de
Blockら、The EMBO Journal (1984) 3:1681により説明されているアグロバクテ
リウム由来のノパリンないしはオクトピン合成酵素プロモーター(NOS)などの植 物細胞で機能することが知られている適当なプロモーターに隣接している。誘導
的な、組織特異的、組織好適性プロモーターないしは構成プロモーターを含め、
植物において機能するいずれのプロモーターも、所望の形質をコードする遺伝子
を発現させるのに使用することができる。発現レベル向上をもたらす転写終結配
列、ポリアデニル化配列、介入配列、ないしはイントロンなどの他の調節配列は
また、形質転換のために使用されるDNA構築物ないしはプラスミドの中に含まれ ている。遺伝子の所望される機能により、発現されるべきDNAの分泌ないしは細 胞内区画化を指示するタンパク質配列を含むことが望ましいと考えられる。こう
した配列は植物分子生物学の技術分野に熟練した者には周知のものである。
【００１８】 そのプラスミドには、また、個々の形質転換された植物を同定するのに使用す
ることができる選択可能なマーカー遺伝子ないしはスクリーニング可能なマーカ
ー遺伝子をコードするDNA配列が含まれてもよい。ネガティブ選択法により、な いしは遺伝子マーカーによりコードされる生産物に関するスクリーニング法によ
り、形質転換された植物がそのマーカーによって同定されることが可能となる。
適当な選択可能なマーカーには、Fraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1
983) 80: 4803、van den Elzenら、Plant Mol. Biol. (1985) 5: 299に説明され
ているネオマイシン転移酵素遺伝子 (NPTII)、ないしは米国特許第5,561,236号 と第5,276,268号に説明されているホスフィノトリシンアセチル転移酵素遺伝子
(Patとbar) などの抗生物質ならびに除草剤抵抗性遺伝子が含まれる。形質転換 された植物に関して直接スクリーニングするのに使用することができるマーカー
には、β‐グルクロニダーゼ遺伝子 (GUS)、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍
光タンパク質遺伝子、クロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子が含まれる
。これについては、R. G. Jefferson、Plant Molecular Biology Reporter (198
7) 5: 387、C. Konczら、Proc. Natl. Acad. Sci. (1987) 84: 131、Teriら、EM
BO J. (1989) 8: 343、De Blockら、EMBO J. (1984) 3: 1681を参照のこと。植 物細胞ないしは植物組織で機能することが知られている選択可能な、ないしはス
クリーニングが可能なマーカーをコードするいずれの遺伝子も本方法において使
用することができる。
【００１９】 植物は、病原体、疾病ないしは害虫に対する抵抗性を付与するDNAないしはRNA
によりコードされる遺伝子により形質転換される、ないしは植物成長特性ないし
は植物生産物の品質を変更するおよび／または改良する遺伝子により形質転換さ
れる。例えば、Bacillus thuringiensis結晶エンドトキシンタンパク質をコード
する遺伝子が、害虫に対する抵抗性をもたらすために、植物に導入されてもよい
。植物細胞におけるこのエンドトキシンの発現は、ある種の害虫により摂取され
るとき、その植物組織が毒性化され、有害な害虫に対して抵抗性のある形質転換
植物がもたらされる。公知のBtエンドトキシン遺伝子の総説に関しては、Meyers
編、Mol. Biol. And Biotech、Kellyら執筆部分、Pesticide-Producing Bacteri
a、668頁、VCH Publishers、New York、(1995) を参照のこと。Btエンドトキシ ンをコードする遺伝子はまた、K. F. Chakら、Applied and Environmental Micr
obiology (1994) 60: 2415、R. S. Boraら、Applied and Environmental Microb
iology (1994) 60: 214に開示されている。
【００２０】 移行される遺伝子は、形質転換植物に対して除草剤抵抗性をもたらすことがで
きる。例えば、植物細胞における細菌遺伝子エノールピルビルシキミ酸3‐リン 酸合成酵素の発現は、形質転換植物に除草剤グリホセイトに対する抵抗性を付与
する。グリホセイトに対する耐性を付与するのに使用することができる突然変異
体AroA遺伝子については、Nature (1985) 317: 714〜744にComaiらにより説明さ
れている。ストレプトマイセス属(Streptomyces)から分離されたbarないしはpat
遺伝子の挿入は、形質転換植物へ除草剤glufosinateに対する抵抗性を付与する 。本方法の1つの好適な実施態様には、C. Bayleyら、Theoretical and Applied
Genetics (1992) 83: 645〜649に説明されているように、Alcaligenes eutrophu
s由来のモノオキシゲナーゼ遺伝子tfdAによりコードされた2,4-D抵抗性形質によ
る植物の形質転換が含まれる。
【００２１】 1つの実施態様では、本発明は米国特許第5,597,718号に開示されているような
繊維特異的遺伝子をコードするDNA分子により植物を形質転換するのに使用する ことができる。こうした遺伝子ないしはその等価なものは、綿植物の繊維特性を
変更するのに使用することができる。1つの好適な実施態様は、繊維特異的遺伝 子をコードするDNA分子を含む形質転換剤による綿植物の形質転換である。所望 される植物生産物の生産量を向上させる遺伝子はまた、植物を形質転換するのに
使用することができる。こうした生産量向上遺伝子は当該技術に熟練した者には
公知のものである。
【００２２】 所望される遺伝子は、植物形質転換のためにその後に使用されるアグロバクテ
リウム属の種の中に形質転換されて入れられる。ベクターとして有用であるアグ
ロバクテリウムの都合のよい菌株は、バイナリーTiプラスミドシステムに宿る。
これらの菌株は、ビルレント領域を有する第一のTiプラスミドと、目的とする外
来遺伝子を含むキメラ遺伝子構築物を取り囲んでいる野生型TiプラスミドのT‐D
NA領域の境界領域を含む第二のキメラプラスミドとを有している。共組込(coint
egrage)型Tiプラスミドに宿るアグロバクテリウム菌株もまた、本発明の植物形 質転換諸方法におけるベクターとして有用である。適当なバイナリーと共組み込
み型Tiプラスミドは、植物形質転換の技術に熟練した者には周知のものである。
バイナリーシステムは、T‐DNA境界を含むより小さなプラスミドをE.coliなどの
代替的な宿主において構築、操作することができ、その後にアグロバクテリウム
に再導入することができるため、好適なものである。本発明の本方法において使
用するのに好適な種には、Agrobacterium tumefaciens菌株LB4404、EHA101、EHA
105が含まれる。
【００２３】 3日齢実生の茎頂端部は、その組織の代謝活性を緩慢にするために約2〜8℃の 温度に低温処理され、分離される。この処理により、結果的には有糸分裂の単一
ステージに茎頂細胞が蓄積される。このステップは、少なくとも1つの細胞周期 と細胞分裂を完了させるのに細胞に十分な時間、研究室の冷蔵庫に実生の茎頂端
部を貯蔵することにより実施することができる。約2〜8℃にておよそ24時間の貯
蔵であれば、細胞周期における単一ポイントで細胞を同調分裂させるには一般的
には十分である。こうした条件下では、すでに分裂を始めたいずれの細胞も有糸
分裂まで継続していくであろうが、しかし、その後有糸分裂に突入する付加的な
細胞はない。
【００２４】 茎頂は冷蔵庫から取り出され、茎頂が子葉領域全体をその長さに沿って切開さ
れる間は冷水中に保存しておく。切開の間低温を保つことは、その切開の間に産
生される有害な組織浸出液の分量を効果的に減らすためには、必要なことである
。達成形質転換頻度を減少させる組織浸出液の産生を可能な限り防ぐことは重要
なことである。茎頂は、複数の生殖系列部位を形質転換剤に曝露させるために、
子葉軸全体にその長さに沿って裂かれる。トランスジェニック子孫を得るために
形質転換されなければならないL2生殖系列層は表皮下に6つの細胞層が横たわっ ており、いずれの形質転換剤、遺伝子銃、アグロバクテリウム、電気穿孔法、炭
化ケイ素ウィスカー法、真空浸透法ないしは音波処理法によっても、無処理の状
態の茎頂に到達するのはきわめて難しい。
【００２５】 茎頂を裂くことにより、最小限10箇所の潜在的な部位が直接、形質転換剤に曝
露される。未処理の状態の分裂組織の回復率に匹敵する分断された(split)分裂 組織ないしは茎頂回復の諸方法が考案されてきた。分断された分裂細胞の中にあ
る細胞は、新しい完全な分裂細胞を供給するために再組織化される。さらに、完
全な分裂組織を再組織化することができる10箇所の標的部位のそれぞれから苗条
を得るために諸方法が考案されてきた。この適用方法は、生殖系列形質転換が形
質転換剤にその標的部位を直接曝露することにより起こる確率を有意に増加させ
る。すなわち、有用な標的部位数を増加させ、標的部位における受容細胞の数を
増加させ、形質転換される組織に存在する阻害因子の数と分量を減少させる。
【００２６】 切開された組織の温度が正常に戻ったら、分裂組織の細胞は同調的かつ急速に
有糸分裂ステージに入る。目的とする遺伝子の組込みは、たいていの場合有糸分
裂の間に効果的に起こるため、この手順によりアグロバクテリウムに曝露される
間に受容細胞のより大きな集団が確保される。
【００２７】 分離、低温処理、切開の後、その分裂組織はノパリンで処理され、それからア
セトシリンギノンの存在下で一夜増殖させた目的とする遺伝子を含むアグロバク
テリウムにより接種される。頂端分裂組織から形成される苗条はキメラであると
予想される。基底子葉領域から形成される苗条は非キメラ的になる高い確率を有
する。
【００２８】 本適用に開示された本方法のステップは、生殖系列形質転換細胞を得る確率を
増加させる。これらのステップが綿ないしは他の種の効率的な分裂組織形質転換
の達成の中心を成す。これらステップは、組換えアグロバクテリウムを利用する
形質転換の諸方法により使用することができるばかりでなく、これらステップは
また、遺伝子銃、電気穿孔法、炭化ケイ素ウィスカー法、真空浸透法、音波処理
法を含むその他のすべての形質転換方法を使用した形質転換の効率を増加させる
。
【００２９】例1 茎頂端部は3日齢の綿実生から分離され、24時間の間冷蔵庫で約2〜8℃にて低温 処理される。低温処理直後に、その茎頂端部は子葉領域全体をその長さに沿って
その端部を切ることにより切開される。それら端部は、低温処理水槽の中に置か
れることにより、切開の間約2〜8℃に保たれる。
【００３０】 切開後、その分裂組織茎頂は、目的とする所望される形質をコードする遺伝子
を導入するのに使用されるアグロバクテリウムの結合を支えるため、30mMの濃度
にてノパリンで処理される。分断された分裂組織はそれからアセトシリンギノン
の存在下で一夜増殖させたアグロバクテリウムにより接種される。分断された茎
頂は、thisdurazonを含むMurashige & Skoog培地で湿らされた滅菌フィルター紙
上に分断された部位を下向きにして置かれ、48時間アグロバクテリウムとともに
培養される。その組織はそれから、ブドウ糖、キネチン、酢酸ナフタレンを含み
、そのアグロバクテリウム除去用の適当な抗生物質を追加し、適当な選択剤を有
する新鮮なMurashige ＆ Skoog培地に移される。移されるとき、その切開された
組織はその基底端部を浸して上向きにして置く。
【００３１】 分裂組織は週毎に新鮮な選択培地に移される。その組織の根端部は、偽陽性苗
条の分離につながる基底にあるあらゆる形質転換組織を除去するため、摘み取ら
れる。新しい苗条は形成されると取り除かれ、新鮮な選択培地に別々に置かれる
。最初の初代苗条が取り除かれると、子葉の基底部にある芽がその後に突然発芽
し、また新しい苗条を形成する。新しい初代苗条がそれぞれ形成されると、取り
除かれて、選択培地上に直接置かれる。初代苗条の除去は、その芽が継続して発
芽することを可能にし、新しい苗条のより大きな集団を供給する。これらの苗条
は継続して成長し、形質転換されたものは成熟植物にまで成長する。アグロバク
テリウムによる形質転換後に作成された苗条集団は、キメラおよび非キメラ苗条
の両方から成ることであろう。頂端分裂組織から形成される苗条は一般的にはキ
メラであり、一方、基底子葉領域から形成されるものは一般的にキメラではない
。
【００３２】 6週間週毎に移して、基底部の刈り込みを行った後、その苗条は根培地に移さ れる。植物が少なくとも節を5つ形成後、各葉が選択薬剤によりスポット試験さ れる。陽性植物は後代検定分析を待つため、温室に移される。
【００３３】 細胞分裂周期における同じ場所にある組織の中で、形質転換剤に形質転換感受
性部位を曝露させることにより、形質転換の形質転換効率を有意に増加させる形
質転換植物を作成するための方法は、本明細書で詳細に説明され、また特定の実
施例によって説明されてきた。植物分子生物学の該当技術に熟練した者であれば
、説明されているとおりの本発明はさまざまな方法で変更され、またさまざまな
材料により使用されることが可能であり、また本出願で開示された実施態様の説
明はそれら実施態様の特定の方法ならびに材料に本発明を限定する意図がないこ
とは理解することであろう。本発明は、上述の請求項に定義されているように、
開示された本方法と組成物の精神と範囲内にあるすべての変更されたもの、同等
なもの、代替的なものを網羅する。
【００３４】 本方法に用いられている方法、技術、組成の詳細を補足し、説明し、または提
供するために引用され、また開示された本発明を理解するための背景を提供する
ために引用された参考文献は、引用することにより本明細書にそのまま組み込ま
れるものとする。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月６日（２０００．３．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ディヴァー，ジェイン・ケイ アメリカ合衆国テキサス州79414，ラボッ ク，フォーティーフォース・ストリート 5411 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB02 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD15 4B029 AA23 BB12 BB20 CC13 HA10 4B065 AA11X AA88X BA01 BA02 BA25 BB01 CA53

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １）３日齢の実生から茎頂端部を分離するステップと、 ２）分離した茎頂端部を低温処理するステップと、 ３）茎頂端部を切開して分裂組織の細胞を露出させるステップと、 ４）切開した茎頂端部の中に形質転換剤を導入するステップと、 ５）分裂組織の細胞上に形成される苗条から植物を再生させるステップと を含む形質転換植物を作成するための方法。
  2. 【請求項２】 茎頂端部が、綿、大豆、ムラサキウマゴヤシ、亜麻、タバコ
    、ヒマワリ、ピーナッツ、イチゴ、トマト、エンドウ、豆、カボチャ、コショウ
    類、トウモロコシ、モロコシ類、大麦、エンバク、ライ麦、小麦、米、アブラナ
    属の各種蔬菜、ジャガイモから成るグループから選択される植物から分離される
    請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 茎頂端部が、綿植物から分離される請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 形質転換剤が、その植物に所望の表現型形質を付与する遺伝
    子を含むＤＮＡ分子である請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 形質転換剤が、その植物に所望の表現型形質を付与する遺伝
    子を含む組換えアグロバクテリウムである請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 形質転換剤が、微粒子銃により導入される請求項１に記載の
    方法。
  7. 【請求項７】 茎頂端部が、約２〜８℃にて約２４時間低温処理される請求
    項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の方法により作成される形質転換植物。
  9. 【請求項９】 請求項４に記載の方法により作成される形質転換植物。
  10. 【請求項１０】 請求項５に記載の方法により作成される形質転換植物。
  11. 【請求項１１】 請求項６に記載の方法により作成される形質転換植物。
  12. 【請求項１２】 請求項７に記載の方法により作成される形質転換植物。
  13. 【請求項１３】 請求項８に記載の植物の種子。
  14. 【請求項１４】 請求項９に記載の植物の種子。
  15. 【請求項１５】 請求項１０に記載の植物の種子。
  16. 【請求項１６】 請求項１１に記載の植物の種子。
  17. 【請求項１７】 請求項１２に記載の植物の種子。
  18. 【請求項１８】 請求項８に記載の植物の子孫。
  19. 【請求項１９】 請求項９に記載の植物の子孫。
  20. 【請求項２０】 請求項１０に記載の植物の子孫。
  21. 【請求項２１】 請求項１１に記載の植物の子孫。
  22. 【請求項２２】 請求項１２に記載の植物の子孫。
  23. 【請求項２３】 １）３日齢の実生から茎頂端部を分離するステップと、 ２）分離した茎頂端部を低温処理するステップと、 ３）茎頂端部を切開して、分裂組織の細胞を露出するステップと、 ４）切開された茎頂端部の中に形質転換剤を導入するステップと、 ５）分裂組織の細胞上に形成する苗条から植物を再生させるステップと を含む形質転換綿植物を作成するための方法。
  24. 【請求項２４】 形質転換剤が、その植物に所望の表現型形質を付与する遺
    伝子を含むＤＮＡ分子である請求項１８に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 形質転換剤が、その植物に所望の表現型形質を付与する遺
    伝子を含む組換えアグロバクテリウムである請求項１８に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 形質転換剤が、微粒子銃により導入される請求項１８に記
    載の方法。
  27. 【請求項２７】 ａ）３日齢の綿実生から茎頂端部を分離するステップと、 ｂ）分離した茎頂端部を低温処理するステップと、 ｃ）茎頂端部を切開して、分裂組織の細胞を露出させるステップと、 ｄ）植物に所望の表現型形質を付与する遺伝子を含む組換えアグロバクテリウ
    ムに、切開された分裂組織の細胞を曝露させるステップと、 ｅ）分裂組織の細胞から形成される苗条からトランスジェニック綿植物を再生
    させるステップと によって作成される形質転換綿植物。
  28. 【請求項２８】 請求項２２に記載の植物の種子。
  29. 【請求項２９】 請求項２２に記載の植物の子孫。
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