CN110373423A - 调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因及应用 - Google Patents

调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110373423A
CN110373423A CN201910591380.3A CN201910591380A CN110373423A CN 110373423 A CN110373423 A CN 110373423A CN 201910591380 A CN201910591380 A CN 201910591380A CN 110373423 A CN110373423 A CN 110373423A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
ala
bnmed16
gene
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910591380.3A
Other languages
English (en)
Inventor
杜雪竹
胡慧贞
汤依唯
潘宣丞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hubei University
Original Assignee
Hubei University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hubei University filed Critical Hubei University
Priority to CN201910591380.3A priority Critical patent/CN110373423A/zh
Publication of CN110373423A publication Critical patent/CN110373423A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因及应用。本发明从甘蓝型油菜westar中分离克隆得到一种控制甘蓝型油菜菌核病的基因BnMEDIATOR16(BnMED16，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。本发明对BnMED16基因进行了功能验证。通过基因工程技术在甘蓝型油菜中提高BnMED16的表达量能够激活茉莉酸抗病信号路径，提高活性氧积累和抗病相关基因的表达，使转基因油菜叶片菌核病病斑面积减少了81.20％，植物表现为更抗菌核病，对增强甘蓝型油菜对菌核病抗性具有重要的应用前景。

Description

调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因及应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因及应用。分离克隆了甘蓝型油菜的一个中介体复合物-Mediator Complex成员的基因，对该基因进行了功能验证和初步转化应用。本发明根据模式植物拟南芥中已报道的对菌核病抗性最显著的中介体复合物亚基AtMED16序列，在同源性很高的十字花科甘蓝型油菜中进行序列比对，筛选出同源性最高的BnMED16序列，对该基因进行克隆及在甘蓝型油菜Westar中超量表达，并接种核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，快速鉴定其在油菜菌核病抗性中的功能。
背景技术
油菜是我国最重要的油料作物，是国产食用植物油的第一大来源。油菜的生长受到众多环境因素的影响，生物胁迫(包括病原菌、虫害等)和非生物胁迫(包括干旱、重金属、盐害、低温、高温等)均会对其产量和品质造成极大损失，因此，利用基因工程技术，将抗逆相关基因转入到油菜品种中，培育既高产又抗逆的优质新品种是应对食物，能源资源短缺有效途径之一。
核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病(Sclerotinia stemrot)是我国油菜主产区最主要的病害，尤其以长江流域和东南沿海地区最为普遍和严重，严重影响油菜产量(李方球等，油菜菌核病抗性鉴定、抗性机理及抗性遗传育种研究进展，作物研究[J]，2001年,15卷3期85-92页)、经济效益(刘胜毅，油菜对菌核病抗性反应分子网络解析，中国植物病理学会学术年会论文集[C]，2010年)及菜籽油品质(McCartney H,Doughty K,Noaon G.A study of the effect of disease on seed quality parametersof oilseed rape.In:10th International Rapeseed Congress,Canberra,Australia.1999)。目前油菜菌核病的防治方法主要是化学防治技术和抗病品种的选育，但化学防治存在防效不高、病原难以根除、花期喷药困难以及农药残留、环境污染等诸多问题；常规育种因难以找到有效的抗性材料以及速度非常缓慢等缺点，也很难有效解决抗病问题。由此，对抗菌核病油菜品种进行分子改良，快速培育抗菌核病品种，是提高菜籽单位面积产量的重要策略。研究表明甘蓝型油菜菌核病抗性具有中等的遗传力，为数量性状，受多个微效的抗性位点控制，其广义遗传力在70％左右(吴健等，油菜与核盘菌互作分子机理研究进展，中国油料作物学报[J]，2018年，40卷5期721-729页)。目前在油菜、大豆、向日葵等作物中均未发现有效的抗源，所鉴定到的抗菌核病QTL效应较小并且定位区间还较大，且未找到油菜中抗菌核病的关键调控基因(Zhao XM,She XP,Yu W,et al.Effects ofoligochitosans on tobacco cells and role of endogenous nitric oxide burst inthe resistance of tobacco to Tobacco mosaic virus.The Plant PathologyJournal,2007,89(1):55-65)。因此虽然数量抗性的利用是油菜提高菌核病抗性的主要途径，目前的功能基因组学研究还只能为全面理解油菜-核盘菌互作机理提供一个大致的框架和方向，其中的基因资源和分子机理还有待深入挖掘。基因工程方法是按预先设计好的目标和计划，通过遗传操作，在分子水平上改良品种的技术。特别是像油菜菌核病这类在寄主植物种内难于找到抗原的病害，基因工程方法提供了一种解决问题的途径。
植物受到病原菌侵染时体内将会接受指令从正常的生长发育转向防御反应信号途径，生物体会发生剧烈的转录组重编程过程(Maleck K,Levine AT,Morgan A,et al.Thetranscriptome of Arabidopsis thaliana during systemic acquiredresistance.Nature Genetics,2000,26(4):403-410；Tao Y,Xie Z,Chen W,etal.Quantitative nature of Arabidopsis responses during compatible andincompatible interactions with the bacterial pathogen pseudomonassyringae.Plant Cell,2003,15(2):317-330；Katagiri F.A global view of defensegene expression regulation-a highly interconnected signaling network.CurrentOpinion in Plant Biology,2004,7(5):506-511)。中介因子复合体(Mediator Complex，MED)在这个过程中起着重要调控作用。MED复合体是RNA聚合酶II(RNA polymerase II,RNAP II)的辅助因子，是介于转录因子与RNAP II转录机器之间的连接桥梁，帮助RNAP II聚集在目的基因的启动子上，因此中介蛋白复合体在基因转录调控中起非常重要作用(Moore JW,Loake GJ,Spoel SH.Transcription dynamics in plant immunity.PlantCell,2011,23(8):2809-20；Kidd BN,Cahill DM,Manners JM,et al.Diverse roles ofthe Mediator complex in plants.Seminars in Cell&Developmental Biology,2011,22(7):741-748)。等最先在模式植物拟南芥中分离鉴定出植物MED蛋白(S,Elfving N,Nilsson R,et al.Purification of a plant mediator from Arabidopsisthaliana identifies PFT1 as the Med25 subunit.Molecular Cell,2007,26:717-729)，随后研究者在水稻等其它植物中也相继鉴定了一些MED复合体成员。研究表明，MED复合体参与了多种信号途径，包括生长发育、对生物和非生物逆境胁迫的响应以及多种细胞内的生命活动如非编码的加工、调节DNA和蛋白质的稳定性以及次级代谢等。
在模式植物拟南芥中，很多MED成员是植物抗病过程中的重要调控因子。例如拟南芥AtMED14和AtMED15突变体抑制了体外NAD诱导的PR1表达，对丁香假单胞菌的抗性显著降低，同时该突变体对水杨酸(SA)的响应能力减弱，基本丧失了生物诱导的系统性获得型抗性(Systemic acquired resistance,SAR)反应(Canet JV,Dobón A,Tornero P.Non-recognition-of-BTH4,an Arabidopsis mediator subunit homolog,is necessary fordevelopment and response to salicylic acid.Plant Cell,2012,24(10):4220-4235；Zhang X,Yao J,Zhang Y,et al.The Arabidopsis Mediator complex subunits MED14/SWP and MED16/SFR6/IEN1 differentially regulate defense gene expression inplant immune responses.Plant Journal,2013,75(3):484-497)。而在活体营养真菌霜霉侵染过程中，霜霉分泌的HaRxL44蛋白因子进入植物细胞，与AtMED19a结合，导致AtMED19a的降解，从而显著降低了植物的抗性响应(Caillaud MC,Asai S,Rallapalli G,et al.Adowny mildew effector attenuates salicylic acid-triggered immunity inArabidopsis by interacting with the host mediator complex.PLoS Biology,2013,11(12):415-420)。此外，AtMED8、12、13、16、21、25及CDK8主要调控腐生真菌侵染的抗病反应，同时启动茉莉酸/乙烯(JA/ET)信号途径。AtMED21与AtHUB1互作，介导了对腐生真菌A.brassicicola和B.cinerea的抗性。Atmed25突变体降低了乙烯茉莉酸诱导的抗性响应，易感腐生真菌A.brassicicola和B.cinerea(Dhawan R,Luo H,Foerster AM,etal.HISTONE ONOUBIQUITINATION1 interacts with a subunit of the mediatorcomplex and regulates defense against necrotrophic fungal pathogens inArabidopsis.Plant Cell,2009,21(3):1000-1019；Kidd BN,Edgar CI,Kumar KK,AitkenEA,Schenk PM,et al.The mediator complex subunit PFT1is a key regulator ofjasmonate-dependent defense in Arabidopsis.Plant Cell,2009,21(8):2237-2252；Zhang X,Wang C,Zhang Y,Sun Y,Mou Z.The Arabidopsis mediatorcomplex subunit16positively regulates salicylate-mediated systemic acquired resistance andjasmonate/ethylene-induced defense pathways.Plant Cell,2012,24(10):4294-4309；Zhu Y,Schluttenhoffer CM,Wang P,et al.CYCLIN-DEPENDENT KINASE8differentiallyregulates plant immunity to fungal pathogens through kinase-dependent and-independent functions in Arabidopsis.Plant Cell,2014,26:4149-4170；Zhai Q,LiC.The plant Mediator complex and its role in jasmonate signaling.Journal ofExperimental Botany,2019)。在这些MED复合体成员中，AtMED16(SFR6)突变体对核盘菌敏感度最高，比已发现的菌核病敏感突变体ein2-1和coil-1更易感病，表明AtMED16是抵抗核盘菌侵染的重要因子(Wang C,Yao J,Du X,et al.The Arabidopsis mediator complexsubunit16is a key component of basal resistance against the necrotrophicfungal pathogen sclerotinia sclerotiorum.Plant Physiology,2015,169(1):856-872)。
油菜与拟南芥同属十字花科芸苔属植物，二者基因组的同源性很高，序列比对分析表明，油菜和拟南芥MED16基因的核苷酸序列相似度91％，蛋白质序列相似度90％，且Sillito等发现拟南芥的基因通常在油菜中表现出相似的功能(Sillito D,Parkin IA,Mayerhofer R,et al.Arabidopsis thaliana:a source of candidate disease-resistance genes for Brassica napus.Genome.2000,43(3):452-60)；此外，MED16蛋白在酵母、人类及植物中均有较高的保守性(Deepthi LW,Shane AR,Heather K,etal.OsSFR6 is a functional rice orthologue of SENSITIVE TO FREEZING-6 and canact as a regulator of COR gene expression,osmotic stress and freezingtolerance in Arabidopsis.New Phytologist,2011,191:984-995)；因此进一步探索油菜BnMED16调控菌核病抗性的分子机理，将为油菜抗菌核病育种提供理论指导与新材料，而对于油菜BnMED16的作用，目前尚无相关文献和专利文献报道。在本发明中，申请人发现菌核病对甘蓝型油菜胁迫处理后，BnMED16的表达量显著提高，进而，甘蓝型油菜BnMED16转基因过表达植株对菌核病抗性显著增强，这一结果在增强菌核病抗性和提高菜籽油产量上具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，分离一种调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因，利用油菜中介因子基因BnMED16提高甘蓝型油菜菌核病抗性的方法，例如利用转基因对油菜进行遗传改良，提高油菜对菌核病菌的抗性，为油菜抗菌核病育种提供新的遗传资源。
本发明的技术方案如下所述：
申请人前期工作是对拟南芥因子复合体成员突变体的功能进行研究，发现AtMED16(SFR)突变体(Wang C,Yao J,Du X,et al.The Arabidopsis mediator complexsubunit16 is a key component of basal resistance against the necrotrophicfungal pathogen sclerotinia sclerotiorum.Plant Physiology,2015,169(1):856-872)对核盘菌敏感度最高，比已发现的菌核病敏感突变体ein2-1和coil-1更易感病，研究表明AtMED16是抵抗核盘菌侵染中至关重要的作用。油菜与拟南芥同属十字花科芸苔属植物，二者基因组的同源性很高，且MED16蛋白是很保守的。通过序列比对发现油菜和拟南芥MED16基因的核苷酸序列相似度为91％，蛋白质序列相似度为90％(图1)。从甘蓝型油菜westar中提取其叶片RNA(利用Super总RNA提取试剂盒，购自Promega公司，美国)，利用反转录酶【II Q RT SuperMix for qRNA(+gDNA wiper)试剂盒，购自Vazyme公司，中国】将其反转录合成cDNA，反应条件为：42℃2min，50℃15min，85℃5sec。利用甘蓝型油菜的基因组信息，合成TA克隆扩增引物BnMED16-F(5’TTGCTCTCTCGCTCGACAACGATCAG3’)和BnMED16-R(5’ATCCCACGCAATTTTGTCATCAAAC 3’)扩增出BnMED16基因的cDNA全长(3928bp)。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，57℃30sec，72℃2min 30sec，34个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pMD-18T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的基因ORF(3744bp)，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示，通过BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定ORF所对应的1247个氨基酸的蛋白质序列是与BnMED16蛋白一致的，该基因编码的蛋白质序列序列表SEQ ID NO：2所示。
进一步，申请人在BnMED16 TA克隆扩增引物两端分别加上EcoRI和SalI酶切位点及对应的保护碱基，将设计的引物分别命名为OE-BnMED16-F(5'CGGAATTCTTGCTCTCTCGCTCGACAACGATCAG 3')和OE-BnMED16-R(5'ACGCGTCGACATCCCACGCAATTTTGTCATCAAAC 3')，以BnMED16的TA阳性克隆菌落质粒为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物的长度为3946bp，通过双酶切连接构建到pCAMBIA2301-1300载体上，从而获得过表达载体pCAMBIA2301-1300-D35s-BnMED16-NOS(图2)。
利用农杆菌介导的植物转化，通过油菜下胚轴侵染法将构建好的过表达载体pCAMBIA2301-1300-D35s-BnMED16-NOS转化到甘蓝型油菜Westar的下胚轴中，直至得到分化成苗(图3)。通过2x CTAB法提取野生型甘蓝型油菜为对照与转基因油菜株系叶片基因组DNA，以载体上的GUS序列设计引物BnGUS-F(5’ACGACTCGTCCGTCCTGTAG 3’)和BnGUS-R(5’TTGCAAAGTCCCGCTAGTGC 3’)进行PCR扩增，筛选出OE-1、OE-3、OE-7、OE-10、OE-18、OE-19和OE-22等阳性株系(图4中的A图)。利用引物Q-BnMED16-F(5’CTTCTAAGCAGCCAAATCCG 3’)和Q-BnMED16-R(5’GCTAACCTTATACCTCTTTAATCCC 3’)分析上述阳性苗中BnMED16基因的转录水平，结果显示，与对照相比，除OE-7株系外，其它阳性苗中BnMED16基因的表达量均显著提高(图4中的B图)。
对野生型甘蓝型油菜对照(WT)和BnMED16基因超表达株系BnMED16(OE)分别进行苗期离体叶片菌丝块接种鉴定，一般接种后36小时(36hpi)发病最为显著，在发病显著时统计菌核病病情指数，具体方法参考吴健等的甘蓝型油菜菌核病抗性鉴定方法(Wu J,ZhaoQ,Yang Q,et al.Comparative transcriptomic analysis uncovers the complexgenetic network for resistance to Sclerotinia sclerotiorum in Brassicanapus.Scientific reports,2016,6:19007)。病指统计结果表明BnMED16(OE)的植株抗性明显高于WT，其病斑扩展面积显著减小(图5)，说明BnMED16基因正调控油菜叶片对菌核病的抗性反应。在发病差异显著时期，取WT和BnMED16(OE)病斑周围一致部位的叶片组织，提取二者的RNA并反转录成cDNA，对ROS相关基因、茉莉酸信号途径基因及抗性相关基因进行表达量分析，结果表明，BnMED16(OE)株系中这些基因的表达量均显著高于WT(图6)。因此BnMED16可能是通过植株积累了较多的过氧化氢增强天然免疫信号，并通过茉莉酸信号途径来调控甘蓝型油菜对核盘菌的抗性，上述成果对于培育油菜抗病品系具有重要的意义。
本发明的优点：
1.虽然拟南芥中已经克隆了多个中介因子复合体MED基因，研究者对其进行了相关的功能验证，但目前为止在油菜中还鲜有报道，本发明克隆的BnMED16基因丰富了油菜中对这类基因的研究。
2.本发明中克隆得到的BnMED16基因，为其它作物抗病育种提供了新的遗传资源，为提高其它作物对菌核病抗性具有指导和借鉴作用。
3.本发明构建的表达载体pCAMBIA2301-1300-D35s-BnMED16-NOS转化油菜后获得的BnMED16过量表达株系，从BnMED16的功能获得方面进行研究，为MED16的抗病功能研究提供了原材料，具有重要意义。
4.本发明通过对MED16过量表达株系在抗菌核病方面的一系列研究，充分证明了BnMED16参与到了植物对菌核病的抗性响应中，并扮演着重要的角色。通过调控BnMED6基因的表达能够调节植物体内抗性因子的积累，提高植物对菌核病的抗性。对阐BnMED16基因的生物学功能有重要意义。
5.BnMED16这一油菜菌核病抗性基因的发现，为发掘和鉴定作物抗菌核病基因，并深入探讨抗菌核病基因的分子作用机理，具有重要的理论指导意义。
6.选育抗菌核病的油菜材料一直为油菜育种家所重视，BnMED16的开发和利用将有助于解决生产上油菜抗菌核病问题。由于目前生产上菌核病造成的油菜产量和品质损失巨大，使得选育抗病品种显得尤其重要，BnMED16基因的克隆将有助于培育高抗油菜品种，也为MED16在主要油料作物(油菜)抗菌核病方面的应用提供了理论与实践依据；为进一步培育具有菌核病抗性的油菜品种提供了新的育种材料；在作物抗菌核病的育种实践、品种改良及品种推广均具有重要的实践指导价值。
附图说明
图1：测序后的油菜BnMED16基因与已知的拟南芥AtMED16基因的氨基酸序列比对结果。附图标记说明：Bn(Brassica napus L.)：甘蓝型油菜；At(Arabidopsis thaliana)：拟南芥。
图2：植物转化载体(即转化载体)pCAMBIA2301-1300-D35s-BnMED16-NOS的构建过程示意图。附图标记说明：LB：T-DNA左边界；35S：花椰菜病毒35S启动子；MCS：多克隆位点；NOS：终止子；RB：T-DNA右边界。
图3：农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化体系。附图标记说明：图3中的A图为经0.1％升汞消毒后的甘蓝型油菜westar种子播于1/2MS培养基上发芽；图3中的B图为置于24℃暗培养5d左右长出的黄化下胚轴；图3中的C图为黄化下胚轴在无菌条件下切成0.8cm左右小段，置于含有转化载体的农杆菌GV3101中侵染；图3中的D图为侵染后下胚轴转入M1培养基中暗培养48h；图3中的E图为共培养后的外植体置于M2培养基中经16h光照/8h暗培养周期选择培养15-20d；图3中的F图为选择培养后的外植体置于M3培养基中经16h光照/8h暗培养周期选分化培养15d以上直至出芽；图3中的G图为分化培养出芽后的外植体置于新鲜M3培养基中经16h光照/8h暗培养周期选择分化培养15d以上直至分化成幼苗；图3中的H图为幼苗置于M4培养基上生根。
图4：油菜BnMED16过表达转基因株系阳性苗的鉴定和表达量分析。附图标记说明：图4中的A图为BnMED16过表达转基因株系阳性苗鉴定。PCR扩增载体上的GUS基因片段，目标大小为750bp；图4中的B图为qPCR检测转基因过表达株系与非转基因野生型株系中BnMED16表达水平；WT为野生型对照；OE-1、OE-3、OE-7、OE-10、OE-18、O-19和OE-22均为独立的过表达转基因株系。
图5：BnMED16过表达转基因株系对菌核病的抗性鉴定。附图标记说明：图5中的A图为WT与BnMED16(OE)植株苗期叶片离体接菌36小时后的发病表型；图5中的B图对应于图5中的A图中WT与BnMED16(OE)叶片经核盘菌侵染36h后的病斑大小。36hpi,接菌36小时后；WT+S.sclerotiorum和BnMED16(OE)+S.sclerotiorum分别表示用野生型和BnMED16过表达株系接种核盘菌。结果显示：BnMED16(OE)株系叶片的菌丝扩展面积明显小于对照，说明BnMED16过表达后，植株对菌核病的抗性增强。
图6：野生型(WT)和转基因BnMED16(OE)的植株苗期叶片离体接种核盘菌36小时后抗病性相关基因的表达量分析。附图标记说明：图6中的A图为以图5的材料为模板，检测ROS相关的关键基因的表达量；图6中的B图为检测茉莉酸信号途径的关键基因的表达量；图6中的C图为检测抗病相关的关键基因的表达量。结果显示：BnMED6过表达后，上述关键基因均被激活，说明BnMED16可以通过植株积累较多的过氧化氢增强天然免疫信号，并通过茉莉酸信号途径来调控甘蓝型油菜对核盘菌的抗性。
具体实施方式
对序列表的说明
SEQ ID NO:1是本发明分离、克隆的油菜BnMED16基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是BnMED16基因编码的蛋白质序列。
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有BnMED16基因完整编码区段的cDNA片段，以及验证BnMED16基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。
实施例1：BnMED16基因分离克隆
(1)BnMED16基因的分离和克隆
以甘蓝型油菜westar品种(华中农业大学油菜研究室提供)作为实验材料，采用Super总RNA提取试剂盒(购自Promega公司，美国)提取甘蓝型油菜westar品种油菜叶片总RNA，RNA提取完成后后用DNaseI(购自Promega公司试剂盒)处理，RNA完整性通过1.2％(w/v)琼脂糖胶(EtBr)电泳检测(5V/cm)。核酸浓度的测定在IMPLENNanoPhotometer-N50系列超微量紫外分光光度计(德国)上进行。RNA 260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0，浓度大于500ng/μL的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是利用IIQ RT SuperMix for qRNA(+gDNA wiper)试剂盒(购自Vazyme公司，中国)进行的，以1μg总RNA为模版，与4μL 4×gDNA wiper Mix，DEPC-water混匀，总体积16μL，42℃2min，放于冰上骤冷2-3min；再加入5×Hiscript II qRT Super Mix II 4μL混匀，总体积为20μL；然后50℃15min，85℃5sec，每份cDNA稀释到200μL后-20℃保存待用。
使用TA克隆引物BnMED16-F(5’TTGCTCTCTCGCTCGACAACGA TCAG 3’)和BnMED16-R(5’ATCCCACGCAATTTTGTCATCAAAC 3’)来扩增目的条带，利用TransTaq HiFi DNAPolymerase(北京全式金生物公司)扩增，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，57℃30sec，72℃2min 30sec，34个循环；72℃延伸5min。然后将PCR产物克隆进pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)。目的片段的回收、连接与转化参照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行操作。目的片段与T载体的连接体系为：4.5μL目的片段，0.5μL pMD-18T载体，5μL SolutionⅠ(宝生物工程(大连)有限公司)在16℃下连接过夜。通过热激发将连接产物转化DH5α感受态，菌液涂于含100mg/L Amp抗生素的LB固体平板上，约生长10-12h小时后，挑选单菌落做菌落进行PCR，引物为通用引物M13F/R。将阳性菌落送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
(2)BnMED16基因序列分析
经测序，发现这个基因扩增出的核苷酸序列长为3928bp，含有一个全长为3744bp的开放阅读框，使用ClustalX(Thompson JD,Gibson TJ,Plewniak F,et al.The ClustalXwindows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aidedby quality analysis tools.Nucleic Acids Research,1997,25:4876-82)程序进行氨基酸序列的比对发现，这个目的条带与拟南芥的MED16在氨基酸水平上高度同源(相似性大于90％)，与在NCBI上比对的结果一致(图1)。
实施例2:过表达BnMED16转基因油菜植株的获得
(1)植物过表达载体的构建
根据NCBI上公布的CaMV 35S序列(Gene ID:AJ007626)信息，使用Primer Premier5.0软件设计如下的引物：
5′-GAATTCTTAATTAAGAGCTCGCATGCC-3′和
5′-GGTACCGTCCCCGTGTTCTCTCCAA-3′，采用PCR方法从pCAMBIA1300s载体(购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)中扩增得到Double CaMV 35S片段，然后将其连接到pCAMBIA2301载体(华中农业大学王晶老师惠赠)的EcoRI/HidIII酶切位点，最终得到终载体pCAMBIA2301-1300s(11634bp)。
在BnMED16TA克隆扩增引物两端分别加上EcoRI和SalI酶切位点及对应的保护碱基，分别将该引物命名为OE-BnMED16-F(5'CGGAATTCTTGCTCTCTCGCTCGACAACGATCAG 3')和OE-BnMED16-R(5'ACGCGTCGACATCCCACGCAATTTTGTCATCAAAC 3')，以BnMED16的TA阳性克隆菌落质粒为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物为3946bp，进行EcoRI/SalI双酶切，同时对pCAMBIA2301-1300s载体也进行双酶切。反应体系为：基因片段或载体10μg；EcoRI 2.5μL；SalI 2.5μL；10*H buffer 15μL；ddH20加至总体积150μL，混匀，将其置于37℃静置8-12h，分别回收双酶切基因片段和pCAMBIA2301-1300s质粒片段。用T4连接酶将BnMED16双酶切基因片段连接并构建到pCAMBIA2301-1300s载体的EcoRI/SalI酶切位点上，从而获得甘蓝型油菜BnMED16转基因过量表达载体pCAMBIA2301-1300s-D35s-BnMED16-NOS，在其T-DNA区内含有抗卡那霉素的基因序列，BnMED16过量表达的启动子为D35s启动子(结构见图2)。
(2)油菜的遗传转化
通过常规的下胚轴侵染法将重组质粒(即过量表达载体)pCAMBIA2301-1300s-D35s-BnMED16-NOS转入农杆菌GV3101,筛选并分化成苗，具体步骤如下(图3)：
a.播种：用75％的酒精清洗甘蓝型油菜westar种子1min，再用0.1％的升汞溶液清洗种子5min，最后用无菌水清洗种子5次；用灭过菌的镊子把种子放入M0固体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素4.404g/L,调pH至5.8-5.9，加琼脂7g/L，按照常规高压蒸汽灭菌法进行灭菌)中，将接种的种子在24℃下，暗培养5天。
b.农杆菌的活化：播种3天后，取-80℃保存的农杆菌菌种GV3101在含有利福平(50mg/mL)、庆大霉素(50mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)的LB固体培养基上划线，28℃培养16h。挑单菌落于5mL含有利福平(50mg/mL)、庆大霉素(50mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养20-24h，使农杆菌生长至对数期。取500uL培养好的菌液于50mL的LB液体培养基(含三种抗生素)扩大培养约12h。
c.侵染菌液制备：把活化好的农杆菌液倒入2个50mL无菌离心管中，3500rpm离心15min，去上清，置于冰上，用1mL的DM液体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素4.404g/L,蔗糖30g/L,调培养基的pH至5.8-5.9,121℃灭菌20min，灭菌完成无菌操作台内加入2,4-D 1mg/L,AS 100mmol/L,KT 0.3mg/L)清洗菌液，离心，去上清，加入2-3mL的DM液体培养基重悬菌体，使侵染菌液OD600约为0.6左右。
d.侵染外植体：把步骤c中的侵染菌液置于冰上，同时，用解剖刀切好步骤a中暗培养甘蓝型油菜幼苗的下胚轴(每段下胚轴的长度为0.8-1.0cm为宜)，用无菌镊子把切好的下胚轴转入装有侵染菌液的平皿，视菌液浓度侵染15-30min(每隔3min摇晃一下)。
e.共培养：将侵染完成的外植体转至装有滤纸的平皿(应提前灭菌处理)中，吸干外植体表面可见的侵染液，然后转入M1固体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素4.404g/L,甘露醇18g/L,蔗糖30g/L,2,4-D 2mg/L,KT 0.3mg/L,调培养基的pH至5.8-5.9，加琼脂7g/L，灭菌后加入100mmol/L AS)中，24℃暗培养40-48h。
f.筛选：将共培养完成的外植体转至M2固体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素4.404g/L,甘露醇18g/L,蔗糖30g/L,2,4-D 2mg/L,KT 0.3mg/L,调培养基的pH至5.8-5.9，加琼脂7g/L)上，进行20天的筛选培养，条件为：24℃，16h光照/8h暗培养。
g.分化培养：将筛选后的外植体转至M3固体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素4.404g/L,葡萄糖10g/L,木糖0.25g/L,酵母浸出(液)膏(MES)0.6g/L,调培养基的pH至5.8-5.9，加琼脂7g/L，灭菌后加入玉米素(ZT)2mg/L,IAA 0.1mg/L,(中文名称)TMT250mg/L,Kan 25mg/L)上，开始分化培养，每隔15-20天继代一次，直到分化出芽(培养条件与步骤f中筛选条件一致)。
h.生根培养：等到分化出芽的幼苗上能发现明显生长点后，用解剖刀贴着愈伤组织和芽相接的位置，小心翼翼地把幼苗切下(操作过程中一定要小心不能伤害到生长点)，然后把幼苗转移至M4固体培养基(1962年配方的MS无机盐和微量元素2.202g，sucrose10g/L,IBA 0.5mg/L,调培养基的pH至5.8-5.9，加琼脂7g/L，灭菌后加入TMT 250mg/L,Kan25mg/L)中生根。
(3)转基因植株的鉴定
a.甘蓝型油菜叶片基因组DNA的提取
采用常规CTAB法进行DNA的提取。具体步骤为：取长度为1～2cm的幼嫩甘蓝型油菜叶片，放置于提前预冷的研钵中，途中加2～3次液氮研磨至细微的浆状后，转移到1.5mL离心管中，加入700μL 2x CTAB溶液。70℃温育30min，间隔6min轻柔摇晃一次，70℃温育30min间隔10min轻柔摇晃一次。冷却至室温，再加入700μL体积比为25:24:1的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇，反复颠倒混匀后轻轻摇动40次左右。在3100rpm，室温离心15min。吸取上清约500μL，加入等体积的24:1的氯仿：异戊醇。摇匀后在3100rpm，室温离心15min。弃上清加入冰冻的-20℃无水乙醇1mL在-20℃冰浴30min后，12000rpm，室温离心10min。用75％的酒精泡洗并反复吹打沉淀3min去盐。倒掉酒精，风干后每个样品加30-50μL ddH2O溶解。抽提的甘蓝型油菜基因组DNA，用Nanodrop微量核酸检测仪检测浓度。
b.阳性转基因植株检测
取转化植株幼嫩叶片，采用CTAB法进行DNA的提取，用PCR扩增载体上的GUS基因进行阳性苗鉴定，所用的引物为:
GUS-F:5’-ACGACTCGTCCGTCCTGTAG-3′和
GUS-R:5′-TTGCAAAGTCCCGCTAGTGC-3′，
对照为非转基因的野生型植株(WT)。
检测结果表明(图4中的A图)，OE-1、-3、-7、-10、-18、-19和-22这7个转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带(750bp)，而野生型对照则没有电泳条带，表明转基因油菜基因组中已经含有外源基因DNA片段。
(4)过表达BnMED16转基因油菜的qPCR鉴定
a.甘蓝型油菜叶片基因组RNA的提取
利用Super总RNA提取试剂盒(购自Promega公司，美国)，抽提WT和步骤(3)中鉴定出的BnMED16过表达阳性株系叶片的总RNA。并利用II Q RT SuperMix forqRNA(+gDNA wiper)试剂盒(Vazyme公司，中国)将RNA反转录成cDNA
b.实时荧光定量PCR
为了确定BnMED16在油菜中是否过量表达，采用时荧光定量PCR(qPCR)方法对步骤(3)鉴定得到的转基因植株进行分析。qPCR使用Green Realtime PCR Master Mix-Plus-试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，采用油菜管家基因BnActin7(Brassica napusactin-7)作为内标基因，其引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。BnActin7(Gene ID:106418315)的qPCR引物为：
BnActin7-F1:5’-TCTTCCTCACGCTATCCTCCG-3’和
BnActin7-R1:5’-AGCCGTCTCCAGCTCTTGC-3’
BnMED16基因的qPCR引物为：
Q-BnMED16-F2:5’-CTTCTAAGCAGCCAAATCCG-3’和
Q-BnMED16-R2:5’-GCTAACCTTATACCTCTTTAATCCC-3’
(该对引物是以实施例1中测序得到的核苷酸序列设计的qPCR特异性引物)
PCR程序：95℃预变性30sec，然后经40个循环(95℃10sec、60℃10sec、72℃26sec)。将步骤(3)鉴定得到的转基因植株分析过表达的植株编号前面加OE(overexpression的缩写)。
如图4中的A图所示，OE-1、-3、-10、-18、-19和-22株系的BnMED16表达水平均显著高于非转基因的野生型(WT)对照，OE-1和-18株系的表达量达到野生型株系的8和6倍以上，OE-3和-10株系的表达量在3倍以上，OE-22株系的表达量约为野生型的2倍。表明这几个株系为独立的BnMED16过表达转基因株系。
实施例3：BnMED16过表达转基因油菜抗菌核病的评价
(1)BnMED16过表达株系对核盘菌的免疫反应
对油菜幼苗(四叶一心期时)倒二叶进行菌核病病原菌核盘菌(sclerotiniasclerotiorum由华中农业大学生命科学学院实验室保存，经实验室活化)的离体接种处理，取野生型和实施例2中表达量显著升高的阳性株系的倒二叶，叶片剪下置于透明的方形盒中，每个转基因植株叶片与非转基因对照并排置于一个盒中，叶片下铺几层滤纸片和湿纱布，取新鲜制备的菌丝块，有菌丝的面朝下，接种于叶片中部稍稍偏离主脉的位置，每叶接种两个菌丝块。盖上盖子保湿，然后置22℃黑暗培养。从接种0h到72h持续对叶片进行观察，发现核盘菌病斑在BnMED16过表达转基因株系中的生长面积要比非转基因株系中小很多，损伤组织的面积也要小，以接菌后36h抗性差异最为显著(图5中的A图)；相比于野生型，转基因油菜叶片菌核病病斑面积减少了81.20％(图5中的B图)。因此，BnMED16基因能有效增强油菜叶片对菌核病的抗性。
(2)接菌后油菜叶片RNA的提取
利用Super总RNA提取试剂盒(Promega公司，美国)，抽提步骤(1)中核盘菌处理36h后叶片的总RNA。并利用II Q RT SuperMix for qRNA(+gDNA wiper)试剂盒(Vazyme公司，中国)将RNA反转录成cDNA
(3)qPCR检测抗病相关基因表达
qPCR使用Green Realtime PCR Master Mix-Plus-试剂盒，抗病性相关基因引物如下：
BnCAT1基因的qPCR引物为：
Q-BnCAT1-F:5’-TACAGACACGAAACAGCA-3’和
Q-BnCAT1-R:5’-GACAGAAACTAGCAAGCC-3’
BnPER21基因的qPCR引物为：
Q-BnPER21-F:5’-TTGCCCAAGTCCAAACCC-3’和
Q-BnPER21-R:5’-GACCAGGAGCCCTCTATG-3’
BnPER54基因的qPCR引物为：
Q-BnPER54-F:5’-TTCTCCCACCATCCCTAT-3’和
Q-BnPER54-R:5’-TCAGCAGAGCCAGACCTT-3’
BnPGIP基因的qPCR引物为：
Q-BnPGIP-F:5’-CCAGTTCATAGACCTTTCCTTCAAC-3’和
Q-BnPGIP-R:5’-GCTGGAAACGACCCAAATGACT-3’
BnChitinase1基因的qPCR引物为：
Q-BnChitinase1-F:5’-GTAAAGGCTACTACGGTCGTGGA-3’和
Q-BnChitinase1-R:5’-CCTGTCCTGAAAGCCACAGTTG-3’
BnGSL05基因的qPCR引物为：
Q-BnGSL05-F:5’-CTGGGAGATATGGTGGTATGAGG-3’和
Q-BnGSL05-R:5’-ACTTGTCACGGGCGTATTGG-3’
BnPR1基因的qPCR引物为：
Q-BnPR1-F:5’-ATCTCCGAAAAGGCCAGGGA-3’和
Q-BnPR1-R:5’-TACCATTTACCGCATCGCCC-3’
BnPDF1.2基因的qPCR引物为：
Q-BnPDF1.2-F:5’-CATCACCCTTCTCTTCGCTGC-3’和
Q-BnPDF1.2-R:5’-ATGTCCCACTTGACCTCTCGC-3’
BnERF1基因的qPCR引物为：
Q-BnERF1-F:5’-GTTCCGAGCCAAACCCTAATACC-3’和
Q-BnERF1-R:5’-GGAACATCAAGAAAGCCAGAGAAGT-3’
使用Primer Premier 5.0软件该基因的编码区设计特异性引物，并应用Primer-BLAST(NCBI)在芸苔属植物基因数据库(BRAD)和油菜EST数据库中进行引物特异性比对分析，以验证引物的特异性。
qPCR反应体系为20μL：含有SYBR Mix 10μL，正反向引物(10μmol/L)各0.8μL，模板2μL和DEPC处理过的无菌水。扩增条件为：95℃，30sec；然后95℃5s，60℃30s，72℃27s，40个循环；每个循环于72℃复性末端进行荧光检测。反应结束后先加热到95℃，然后降至72℃，再缓慢升温至95℃，记录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔解曲线。每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复。用引物对Q-BnCAT1-F/R、Q-BnPER21-F/R、Q-BnPER54-F/R、Q-BnPGIP-F/R、Q-BnChitinase1-F/R、Q-BnGSL05-F/R、Q-BnPR11-F/R、Q-BnPDF1.2-F/R和Q-BnERF1-F/R分别对BnCAT1(BnaA07g11370D)、BnPER21(BnaC03g20530D)、BnPER54(BnaA10g24230D)、BnPGIP(BnaC09g48930D)、BnChitinase1(BnaC04g49090D)、BnGSL05(BnaA09g01630D)、BnPR1(BnaC08g03660D)、BnPDF1.2(BnaC02g23620D)和BnERF1(BnaA01g23940D)基因进行特异性的PCR扩增。同时用引物对BnActin7-F1/R1对油菜BnActin7基因做特异扩增作为内参，以作为内对照进行相对定量分析。检测上述抗病相关基因在核盘菌诱导36h后油菜叶片中的表达变化。
结果显示，当核盘菌侵染36h时，活性氧积累相关基因(BnCAT1、BnPER21、BnPER54)，茉莉酸信号途径及下游抗病相关基因(BnPGIP、BnChitinase1、BnGSL05、BnPR1、BnPDF1.2和BnERF1)的转录水平均显著升高(图6)，说明BnMED16基因可以通过植株积累较多的过氧化氢增强天然免疫信号，并通过茉莉酸信号途径来调控甘蓝型油菜对核盘菌的抗性。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因及应用
<141> 2019-06-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3744
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(3744)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3744)
<400> 1
atg aat cag ccc caa gtt tct ctg ggt aac agc act gga gga gac gcc 48
Met Asn Gln Pro Gln Val Ser Leu Gly Asn Ser Thr Gly Gly Asp Ala
1 5 10 15
aag gaa gaa gaa gaa gaa gaa gaa gaa gaa gtg aat caa cat cag cta 96
Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val Asn Gln His Gln Leu
20 25 30
gaa gag gag gag gag gct gaa tct agg gat caa atc gtc gtc gag gag 144
Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Ser Arg Asp Gln Ile Val Val Glu Glu
35 40 45
aaa tca gac gat cag atg gag gtt gat ccc gtg agt ccc gca act gtc 192
Lys Ser Asp Asp Gln Met Glu Val Asp Pro Val Ser Pro Ala Thr Val
50 55 60
ttc tgc gtt acg ctt aaa cag ccc aac tcc aat ctg ctc cat aag atg 240
Phe Cys Val Thr Leu Lys Gln Pro Asn Ser Asn Leu Leu His Lys Met
65 70 75 80
agc gtc cct gaa ctc tgc cgt aac ttc agt gcc gtc gcc tgg tgt ggc 288
Ser Val Pro Glu Leu Cys Arg Asn Phe Ser Ala Val Ala Trp Cys Gly
85 90 95
aag ttg aat gct att gct tgc gct tct gag acc tgc gcc agg att cca 336
Lys Leu Asn Ala Ile Ala Cys Ala Ser Glu Thr Cys Ala Arg Ile Pro
100 105 110
agc tcc aag gca att cca ccc ttt tgg atc cca att cac atc tta att 384
Ser Ser Lys Ala Ile Pro Pro Phe Trp Ile Pro Ile His Ile Leu Ile
115 120 125
ccc gag cga cct act gag tgt gcc gtg ttc aat gtt gtt gca gac tct 432
Pro Glu Arg Pro Thr Glu Cys Ala Val Phe Asn Val Val Ala Asp Ser
130 135 140
cct cgt gat tct gtc caa ttt att gaa tgg tct ccc act tct tgt cct 480
Pro Arg Asp Ser Val Gln Phe Ile Glu Trp Ser Pro Thr Ser Cys Pro
145 150 155 160
cgt gcc tta ctc att gct aac ttt cat gga cgg att act atc tgg acc 528
Arg Ala Leu Leu Ile Ala Asn Phe His Gly Arg Ile Thr Ile Trp Thr
165 170 175
cag cct act cag ggt gcg gct aat cta gtg cac gat gct acc tct tgg 576
Gln Pro Thr Gln Gly Ala Ala Asn Leu Val His Asp Ala Thr Ser Trp
180 185 190
cag tgt gag cat gaa tgg cgt cag gac att gct gtt gtt aca aag tgg 624
Gln Cys Glu His Glu Trp Arg Gln Asp Ile Ala Val Val Thr Lys Trp
195 200 205
ttg acg ggg gct tct cct tat aag tgg tta tcc tcc aac tcc aag aca 672
Leu Thr Gly Ala Ser Pro Tyr Lys Trp Leu Ser Ser Asn Ser Lys Thr
210 215 220
agt tct gga aca aat gca aag tca act ttc gag gag aaa ttt ctc tca 720
Ser Ser Gly Thr Asn Ala Lys Ser Thr Phe Glu Glu Lys Phe Leu Ser
225 230 235 240
cag agc tcc gaa agc tca gct cgg tgg ccc aac ttt ctc tgt gta tgc 768
Gln Ser Ser Glu Ser Ser Ala Arg Trp Pro Asn Phe Leu Cys Val Cys
245 250 255
tct gtt ttc tca tcg ggg tcc gtt cag ctt cat tgg tcc cag tgg cct 816
Ser Val Phe Ser Ser Gly Ser Val Gln Leu His Trp Ser Gln Trp Pro
260 265 270
tct aac caa gga ggc act gca cca aag tgg ttt agt aca aag aaa ggt 864
Ser Asn Gln Gly Gly Thr Ala Pro Lys Trp Phe Ser Thr Lys Lys Gly
275 280 285
ctt tta ggt gca ggg cct agt ggg att atg gct gct gat gct atc ata 912
Leu Leu Gly Ala Gly Pro Ser Gly Ile Met Ala Ala Asp Ala Ile Ile
290 295 300
acg gac agt ggt gcc atg cat gta gca ggg gtt ccg att gta aat ccc 960
Thr Asp Ser Gly Ala Met His Val Ala Gly Val Pro Ile Val Asn Pro
305 310 315 320
tca aca att gta gta tgg gag gtg acc cct ggc ccg gga aat gta ctc 1008
Ser Thr Ile Val Val Trp Glu Val Thr Pro Gly Pro Gly Asn Val Leu
325 330 335
cag gcg act cca aaa atc tct aca ggc agt cat gtg cca cca tcc ctt 1056
Gln Ala Thr Pro Lys Ile Ser Thr Gly Ser His Val Pro Pro Ser Leu
340 345 350
agt tct tcc gct tgg aca ggc ttt gct cct tta gct gca tac ttg ttc 1104
Ser Ser Ser Ala Trp Thr Gly Phe Ala Pro Leu Ala Ala Tyr Leu Phe
355 360 365
aac tgg caa gaa tac ttg ata tcc gag ata aat aaa ggg aag aag cct 1152
Asn Trp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser Glu Ile Asn Lys Gly Lys Lys Pro
370 375 380
acg gat caa gaa tcc agc gat gca ata tca ctt agc tgc tcg cca gtt 1200
Thr Asp Gln Glu Ser Ser Asp Ala Ile Ser Leu Ser Cys Ser Pro Val
385 390 395 400
tcc aat ttt tct gct tac gta agt ccc gaa gct gca gct cag tct gcg 1248
Ser Asn Phe Ser Ala Tyr Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Gln Ser Ala
405 410 415
gca acc act aca tgg gga tct gga gtt act gct gtt gct ttt gat cca 1296
Ala Thr Thr Thr Trp Gly Ser Gly Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Pro
420 425 430
act cgt ggt ggt tca gta ata gct gtt gtt ata gtt gag gga cag tac 1344
Thr Arg Gly Gly Ser Val Ile Ala Val Val Ile Val Glu Gly Gln Tyr
435 440 445
atg tcg cca tat gat cca gat gaa ggt cct tca att aca ggt tgg aaa 1392
Met Ser Pro Tyr Asp Pro Asp Glu Gly Pro Ser Ile Thr Gly Trp Lys
450 455 460
gta cag cgc tgg gaa tca agt gtt caa cct gtt gta ctg cat cag ata 1440
Val Gln Arg Trp Glu Ser Ser Val Gln Pro Val Val Leu His Gln Ile
465 470 475 480
ttt gga aac cca act tca aat ttt ggt gga cag gtc ccc aca caa act 1488
Phe Gly Asn Pro Thr Ser Asn Phe Gly Gly Gln Val Pro Thr Gln Thr
485 490 495
gtc tgg gta tcg aga gtg gat ttg agc ata cca cct aca aac gat ttc 1536
Val Trp Val Ser Arg Val Asp Leu Ser Ile Pro Pro Thr Asn Asp Phe
500 505 510
aag aat cat caa aca gct gtt gca ggg cct agt gtg gat gca caa aag 1584
Lys Asn His Gln Thr Ala Val Ala Gly Pro Ser Val Asp Ala Gln Lys
515 520 525
gag cct gat tct ggt gat gac aag gct aac aag gtt gtt ttt gac cct 1632
Glu Pro Asp Ser Gly Asp Asp Lys Ala Asn Lys Val Val Phe Asp Pro
530 535 540
ttt gat ttg cca agt gat att cgt aca ctt gca cgg att gtc tat tct 1680
Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ile Arg Thr Leu Ala Arg Ile Val Tyr Ser
545 550 555 560
gct cat ggt ggt gaa att gcg gtt gct ttt ctt cgg ggt gga gtt cat 1728
Ala His Gly Gly Glu Ile Ala Val Ala Phe Leu Arg Gly Gly Val His
565 570 575
atc ttt tcg ggt cca act ttt tca ccc gtt gaa aac tat caa ata aat 1776
Ile Phe Ser Gly Pro Thr Phe Ser Pro Val Glu Asn Tyr Gln Ile Asn
580 585 590
gtc ggc tca gct att gct gca ccc gca ttt tct cca acg agc tgc tgc 1824
Val Gly Ser Ala Ile Ala Ala Pro Ala Phe Ser Pro Thr Ser Cys Cys
595 600 605
tcg gct tct gta tgg cat gat gct gct aag gac tgt gct atg tta aat 1872
Ser Ala Ser Val Trp His Asp Ala Ala Lys Asp Cys Ala Met Leu Asn
610 615 620
atc att cgt gtt ctt cca cct gcc ctt cca cct aac caa tca aag gtt 1920
Ile Ile Arg Val Leu Pro Pro Ala Leu Pro Pro Asn Gln Ser Lys Val
625 630 635 640
gat caa tca atg tgg gag cgg gcg att gct gag aga ttc tgg tgg agt 1968
Asp Gln Ser Met Trp Glu Arg Ala Ile Ala Glu Arg Phe Trp Trp Ser
645 650 655
ctt ttg gtc gga gtt gat tgg tgg gat gca gtt ggc tgt aca cag agt 2016
Leu Leu Val Gly Val Asp Trp Trp Asp Ala Val Gly Cys Thr Gln Ser
660 665 670
gct gca gag gat ggc att gtt tcg ctg acc agc gtg att gct gtc atg 2064
Ala Ala Glu Asp Gly Ile Val Ser Leu Thr Ser Val Ile Ala Val Met
675 680 685
gat gct gat ttt cac tcc ctt cct tca aca caa cac agg caa caa tat 2112
Asp Ala Asp Phe His Ser Leu Pro Ser Thr Gln His Arg Gln Gln Tyr
690 695 700
ggt cct aat cta gac agg atc aaa tgt cgg cta ctt gaa gga acc aat 2160
Gly Pro Asn Leu Asp Arg Ile Lys Cys Arg Leu Leu Glu Gly Thr Asn
705 710 715 720
gct cag gag gtt cgt gcc atg gtc tta gat atg caa gca aga ttg ttg 2208
Ala Gln Glu Val Arg Ala Met Val Leu Asp Met Gln Ala Arg Leu Leu
725 730 735
ttg gac atg ctt gga aaa gga att gaa tca gct ctt gtt aac cct tca 2256
Leu Asp Met Leu Gly Lys Gly Ile Glu Ser Ala Leu Val Asn Pro Ser
740 745 750
gcg ttg gtt att gag cca tgg cga aca gat ggt gag acc ata tta agc 2304
Ala Leu Val Ile Glu Pro Trp Arg Thr Asp Gly Glu Thr Ile Leu Ser
755 760 765
acc gat cct gag gca ttg gct gtc gat cct gct ctt gtt tcc agt att 2352
Thr Asp Pro Glu Ala Leu Ala Val Asp Pro Ala Leu Val Ser Ser Ile
770 775 780
cag gct tat gtg gat gct gtt ctt gac ctg gct tct cat ttt atc aca 2400
Gln Ala Tyr Val Asp Ala Val Leu Asp Leu Ala Ser His Phe Ile Thr
785 790 795 800
cgt tta aga cgc tat gcg agt ttt tgt cgg aca ctt gca agc cat gct 2448
Arg Leu Arg Arg Tyr Ala Ser Phe Cys Arg Thr Leu Ala Ser His Ala
805 810 815
gct tcc act gga act ggc agt aat cgc aac atg gtt gcc agt ccc aca 2496
Ala Ser Thr Gly Thr Gly Ser Asn Arg Asn Met Val Ala Ser Pro Thr
820 825 830
caa aat gct tcg tct cct gca aca acc cag gct gtt cct gac aag tca 2544
Gln Asn Ala Ser Ser Pro Ala Thr Thr Gln Ala Val Pro Asp Lys Ser
835 840 845
gtg aat cac gga cca ggg caa cct act gct act act agt act aca aac 2592
Val Asn His Gly Pro Gly Gln Pro Thr Ala Thr Thr Ser Thr Thr Asn
850 855 860
ccc agc gga agc aca caa atg caa gct tgg atg caa ggt gcc ata gcg 2640
Pro Ser Gly Ser Thr Gln Met Gln Ala Trp Met Gln Gly Ala Ile Ala
865 870 875 880
aag ttt agt agc tca aat gat gga gta tca aac tct act gca agc cca 2688
Lys Phe Ser Ser Ser Asn Asp Gly Val Ser Asn Ser Thr Ala Ser Pro
885 890 895
gtc agt ggt tca gct acc ttc atg cca ata agc atc aat aca gga aca 2736
Val Ser Gly Ser Ala Thr Phe Met Pro Ile Ser Ile Asn Thr Gly Thr
900 905 910
ttt cct gga aca cca gct gtt cgg ctc att ggg gac tgt cat ttc ctt 2784
Phe Pro Gly Thr Pro Ala Val Arg Leu Ile Gly Asp Cys His Phe Leu
915 920 925
cac cgg tta tgc cag ctg ttg cta ttc tgt tac ttc cag agg tta cag 2832
His Arg Leu Cys Gln Leu Leu Leu Phe Cys Tyr Phe Gln Arg Leu Gln
930 935 940
gct tcg cga aat cac cag aaa aac gct gat gcc agt tca caa aag ctt 2880
Ala Ser Arg Asn His Gln Lys Asn Ala Asp Ala Ser Ser Gln Lys Leu
945 950 955 960
caa acg ggg gct acc agc aag tcg gaa gag gtc aac tct gct aaa cca 2928
Gln Thr Gly Ala Thr Ser Lys Ser Glu Glu Val Asn Ser Ala Lys Pro
965 970 975
aac cct gcc ttg aac agg atg gag gaa gcc cag gga ttc cgg act tct 2976
Asn Pro Ala Leu Asn Arg Met Glu Glu Ala Gln Gly Phe Arg Thr Ser
980 985 990
cag ttg ggt gct gga gtg aaa ggg att gat gat aat tct gcc cgt aca 3024
Gln Leu Gly Ala Gly Val Lys Gly Ile Asp Asp Asn Ser Ala Arg Thr
995 1000 1005
aca aag atg gga tct ggg aat gct ggt caa ggc tat act ttt gag gag 3072
Thr Lys Met Gly Ser Gly Asn Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Phe Glu Glu
1010 1015 1020
gtg aga gtt ctt ttc cat ata cta atg gat ctc tgc aag aga aca gct 3120
Val Arg Val Leu Phe His Ile Leu Met Asp Leu Cys Lys Arg Thr Ala
1025 1030 1035 1040
gcg ctt ccg cat ccc ttg cct ggc tct cag gta ggt agt gga aac atc 3168
Ala Leu Pro His Pro Leu Pro Gly Ser Gln Val Gly Ser Gly Asn Ile
1045 1050 1055
caa gtt cga ctg cac tat att gat gga aac tac act gtg ttg cct gag 3216
Gln Val Arg Leu His Tyr Ile Asp Gly Asn Tyr Thr Val Leu Pro Glu
1060 1065 1070
gtg gta gaa gca gct ctt gga cca cat atg cag aac atg cct cgt cca 3264
Val Val Glu Ala Ala Leu Gly Pro His Met Gln Asn Met Pro Arg Pro
1075 1080 1085
aga gga gct gat gct gct ggg ctt cta cta cgg gag ttg gag ctt cat 3312
Arg Gly Ala Asp Ala Ala Gly Leu Leu Leu Arg Glu Leu Glu Leu His
1090 1095 1100
ccc cca tcc gaa gaa tgg cat aga aga aat tta ttc ggt ggt ccc ggg 3360
Pro Pro Ser Glu Glu Trp His Arg Arg Asn Leu Phe Gly Gly Pro Gly
1105 1110 1115 1120
aca gat cct gag gat gcg gtc ccg tca gat gat act ttt ttc acg cag 3408
Thr Asp Pro Glu Asp Ala Val Pro Ser Asp Asp Thr Phe Phe Thr Gln
1125 1130 1135
ggt cat tcc cta gat gtg tac gac aga gtc caa agt ctt tgg cca aga 3456
Gly His Ser Leu Asp Val Tyr Asp Arg Val Gln Ser Leu Trp Pro Arg
1140 1145 1150
aaa cgc aga atg tct gaa aga gat gcg gct ttt ggt tta aat act tct 3504
Lys Arg Arg Met Ser Glu Arg Asp Ala Ala Phe Gly Leu Asn Thr Ser
1155 1160 1165
gtg ggt ttg ggt gct tat ctt ggg atc atg ggt tct cgt agg gat gtt 3552
Val Gly Leu Gly Ala Tyr Leu Gly Ile Met Gly Ser Arg Arg Asp Val
1170 1175 1180
gtc acc gcg acg tgg aaa act ggt ctt gaa gga gtt tgg tac aag tgc 3600
Val Thr Ala Thr Trp Lys Thr Gly Leu Glu Gly Val Trp Tyr Lys Cys
1185 1190 1195 1200
ata aga tgc tta agg cag aca tct gca ttt gct tca cca ggt gct tct 3648
Ile Arg Cys Leu Arg Gln Thr Ser Ala Phe Ala Ser Pro Gly Ala Ser
1205 1210 1215
aag cag cca aat ccg aat gaa cgt gag gcg tgg tgg acc agc cgt tgg 3696
Lys Gln Pro Asn Pro Asn Glu Arg Glu Ala Trp Trp Thr Ser Arg Trp
1220 1225 1230
gtt tat tgc tgc ccc atg tgt ggt gga acg tgg gtc cgt gtt gta tag 3744
Val Tyr Cys Cys Pro Met Cys Gly Gly Thr Trp Val Arg Val Val
1235 1240 1245
<210> 2
<211> 1247
<212> PRT
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 2
Met Asn Gln Pro Gln Val Ser Leu Gly Asn Ser Thr Gly Gly Asp Ala
1 5 10 15
Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val Asn Gln His Gln Leu
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Ser Arg Asp Gln Ile Val Val Glu Glu
35 40 45
Lys Ser Asp Asp Gln Met Glu Val Asp Pro Val Ser Pro Ala Thr Val
50 55 60
Phe Cys Val Thr Leu Lys Gln Pro Asn Ser Asn Leu Leu His Lys Met
65 70 75 80
Ser Val Pro Glu Leu Cys Arg Asn Phe Ser Ala Val Ala Trp Cys Gly
85 90 95
Lys Leu Asn Ala Ile Ala Cys Ala Ser Glu Thr Cys Ala Arg Ile Pro
100 105 110
Ser Ser Lys Ala Ile Pro Pro Phe Trp Ile Pro Ile His Ile Leu Ile
115 120 125
Pro Glu Arg Pro Thr Glu Cys Ala Val Phe Asn Val Val Ala Asp Ser
130 135 140
Pro Arg Asp Ser Val Gln Phe Ile Glu Trp Ser Pro Thr Ser Cys Pro
145 150 155 160
Arg Ala Leu Leu Ile Ala Asn Phe His Gly Arg Ile Thr Ile Trp Thr
165 170 175
Gln Pro Thr Gln Gly Ala Ala Asn Leu Val His Asp Ala Thr Ser Trp
180 185 190
Gln Cys Glu His Glu Trp Arg Gln Asp Ile Ala Val Val Thr Lys Trp
195 200 205
Leu Thr Gly Ala Ser Pro Tyr Lys Trp Leu Ser Ser Asn Ser Lys Thr
210 215 220
Ser Ser Gly Thr Asn Ala Lys Ser Thr Phe Glu Glu Lys Phe Leu Ser
225 230 235 240
Gln Ser Ser Glu Ser Ser Ala Arg Trp Pro Asn Phe Leu Cys Val Cys
245 250 255
Ser Val Phe Ser Ser Gly Ser Val Gln Leu His Trp Ser Gln Trp Pro
260 265 270
Ser Asn Gln Gly Gly Thr Ala Pro Lys Trp Phe Ser Thr Lys Lys Gly
275 280 285
Leu Leu Gly Ala Gly Pro Ser Gly Ile Met Ala Ala Asp Ala Ile Ile
290 295 300
Thr Asp Ser Gly Ala Met His Val Ala Gly Val Pro Ile Val Asn Pro
305 310 315 320
Ser Thr Ile Val Val Trp Glu Val Thr Pro Gly Pro Gly Asn Val Leu
325 330 335
Gln Ala Thr Pro Lys Ile Ser Thr Gly Ser His Val Pro Pro Ser Leu
340 345 350
Ser Ser Ser Ala Trp Thr Gly Phe Ala Pro Leu Ala Ala Tyr Leu Phe
355 360 365
Asn Trp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser Glu Ile Asn Lys Gly Lys Lys Pro
370 375 380
Thr Asp Gln Glu Ser Ser Asp Ala Ile Ser Leu Ser Cys Ser Pro Val
385 390 395 400
Ser Asn Phe Ser Ala Tyr Val Ser Pro Glu Ala Ala Ala Gln Ser Ala
405 410 415
Ala Thr Thr Thr Trp Gly Ser Gly Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Pro
420 425 430
Thr Arg Gly Gly Ser Val Ile Ala Val Val Ile Val Glu Gly Gln Tyr
435 440 445
Met Ser Pro Tyr Asp Pro Asp Glu Gly Pro Ser Ile Thr Gly Trp Lys
450 455 460
Val Gln Arg Trp Glu Ser Ser Val Gln Pro Val Val Leu His Gln Ile
465 470 475 480
Phe Gly Asn Pro Thr Ser Asn Phe Gly Gly Gln Val Pro Thr Gln Thr
485 490 495
Val Trp Val Ser Arg Val Asp Leu Ser Ile Pro Pro Thr Asn Asp Phe
500 505 510
Lys Asn His Gln Thr Ala Val Ala Gly Pro Ser Val Asp Ala Gln Lys
515 520 525
Glu Pro Asp Ser Gly Asp Asp Lys Ala Asn Lys Val Val Phe Asp Pro
530 535 540
Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ile Arg Thr Leu Ala Arg Ile Val Tyr Ser
545 550 555 560
Ala His Gly Gly Glu Ile Ala Val Ala Phe Leu Arg Gly Gly Val His
565 570 575
Ile Phe Ser Gly Pro Thr Phe Ser Pro Val Glu Asn Tyr Gln Ile Asn
580 585 590
Val Gly Ser Ala Ile Ala Ala Pro Ala Phe Ser Pro Thr Ser Cys Cys
595 600 605
Ser Ala Ser Val Trp His Asp Ala Ala Lys Asp Cys Ala Met Leu Asn
610 615 620
Ile Ile Arg Val Leu Pro Pro Ala Leu Pro Pro Asn Gln Ser Lys Val
625 630 635 640
Asp Gln Ser Met Trp Glu Arg Ala Ile Ala Glu Arg Phe Trp Trp Ser
645 650 655
Leu Leu Val Gly Val Asp Trp Trp Asp Ala Val Gly Cys Thr Gln Ser
660 665 670
Ala Ala Glu Asp Gly Ile Val Ser Leu Thr Ser Val Ile Ala Val Met
675 680 685
Asp Ala Asp Phe His Ser Leu Pro Ser Thr Gln His Arg Gln Gln Tyr
690 695 700
Gly Pro Asn Leu Asp Arg Ile Lys Cys Arg Leu Leu Glu Gly Thr Asn
705 710 715 720
Ala Gln Glu Val Arg Ala Met Val Leu Asp Met Gln Ala Arg Leu Leu
725 730 735
Leu Asp Met Leu Gly Lys Gly Ile Glu Ser Ala Leu Val Asn Pro Ser
740 745 750
Ala Leu Val Ile Glu Pro Trp Arg Thr Asp Gly Glu Thr Ile Leu Ser
755 760 765
Thr Asp Pro Glu Ala Leu Ala Val Asp Pro Ala Leu Val Ser Ser Ile
770 775 780
Gln Ala Tyr Val Asp Ala Val Leu Asp Leu Ala Ser His Phe Ile Thr
785 790 795 800
Arg Leu Arg Arg Tyr Ala Ser Phe Cys Arg Thr Leu Ala Ser His Ala
805 810 815
Ala Ser Thr Gly Thr Gly Ser Asn Arg Asn Met Val Ala Ser Pro Thr
820 825 830
Gln Asn Ala Ser Ser Pro Ala Thr Thr Gln Ala Val Pro Asp Lys Ser
835 840 845
Val Asn His Gly Pro Gly Gln Pro Thr Ala Thr Thr Ser Thr Thr Asn
850 855 860
Pro Ser Gly Ser Thr Gln Met Gln Ala Trp Met Gln Gly Ala Ile Ala
865 870 875 880
Lys Phe Ser Ser Ser Asn Asp Gly Val Ser Asn Ser Thr Ala Ser Pro
885 890 895
Val Ser Gly Ser Ala Thr Phe Met Pro Ile Ser Ile Asn Thr Gly Thr
900 905 910
Phe Pro Gly Thr Pro Ala Val Arg Leu Ile Gly Asp Cys His Phe Leu
915 920 925
His Arg Leu Cys Gln Leu Leu Leu Phe Cys Tyr Phe Gln Arg Leu Gln
930 935 940
Ala Ser Arg Asn His Gln Lys Asn Ala Asp Ala Ser Ser Gln Lys Leu
945 950 955 960
Gln Thr Gly Ala Thr Ser Lys Ser Glu Glu Val Asn Ser Ala Lys Pro
965 970 975
Asn Pro Ala Leu Asn Arg Met Glu Glu Ala Gln Gly Phe Arg Thr Ser
980 985 990
Gln Leu Gly Ala Gly Val Lys Gly Ile Asp Asp Asn Ser Ala Arg Thr
995 1000 1005
Thr Lys Met Gly Ser Gly Asn Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Phe Glu Glu
1010 1015 1020
Val Arg Val Leu Phe His Ile Leu Met Asp Leu Cys Lys Arg Thr Ala
1025 1030 1035 1040
Ala Leu Pro His Pro Leu Pro Gly Ser Gln Val Gly Ser Gly Asn Ile
1045 1050 1055
Gln Val Arg Leu His Tyr Ile Asp Gly Asn Tyr Thr Val Leu Pro Glu
1060 1065 1070
Val Val Glu Ala Ala Leu Gly Pro His Met Gln Asn Met Pro Arg Pro
1075 1080 1085
Arg Gly Ala Asp Ala Ala Gly Leu Leu Leu Arg Glu Leu Glu Leu His
1090 1095 1100
Pro Pro Ser Glu Glu Trp His Arg Arg Asn Leu Phe Gly Gly Pro Gly
1105 1110 1115 1120
Thr Asp Pro Glu Asp Ala Val Pro Ser Asp Asp Thr Phe Phe Thr Gln
1125 1130 1135
Gly His Ser Leu Asp Val Tyr Asp Arg Val Gln Ser Leu Trp Pro Arg
1140 1145 1150
Lys Arg Arg Met Ser Glu Arg Asp Ala Ala Phe Gly Leu Asn Thr Ser
1155 1160 1165
Val Gly Leu Gly Ala Tyr Leu Gly Ile Met Gly Ser Arg Arg Asp Val
1170 1175 1180
Val Thr Ala Thr Trp Lys Thr Gly Leu Glu Gly Val Trp Tyr Lys Cys
1185 1190 1195 1200
Ile Arg Cys Leu Arg Gln Thr Ser Ala Phe Ala Ser Pro Gly Ala Ser
1205 1210 1215
Lys Gln Pro Asn Pro Asn Glu Arg Glu Ala Trp Trp Thr Ser Arg Trp
1220 1225 1230
Val Tyr Cys Cys Pro Met Cys Gly Gly Thr Trp Val Arg Val Val
1235 1240 1245

Claims (6)

1.一种重组载体pCAMBIA2301-1300s-D35s-BnMED16-NOS，其特征在于，所述载体包含SEQ ID NO：1所示BnMED16基因的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的重组载体pCAMBIA2301-1300s-D35s-BnMED16-NOS在抗油菜菌核病中的应用。
3.权利要求1所述的重组载体pCAMBIA2301-1300s-D35s-BnMED16-NOS的制备方法，其特征在于，所述的方法是在所述重组载体pCAMBIA1300s的上游EcoRI/HidIII酶切位点处加入Double CaMV35S强启动子，改造成pCAMBIA2301-1300s载体；再将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列即BnMED16基因克隆到pCAMBIA2301-1300s的酶切位点EcoRI/SalI上得到。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：构建重组载体pCAMBIA2301-1300s-D35s-BnMED16-NOS；将得到的重组载体转入农杆菌GV3101，以下胚轴侵染法转化甘蓝型油菜，采用PCR方法鉴定得到转基因株系，通过qPCR方法鉴定BnMED16基因的表达水平，使重组载体pCAMBIA2301-1300s-D35s-BnMED16-NOS转染的BnMED16过表达转基因株系的油菜叶片表现出对油菜菌核病的抗性。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：
(1)根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，构建得到重组载体pCAMBIA2301-1300s-D35s-BnMED16-NOS；
(2)将步骤(1)所得的重组载体转入农杆菌GV3101，以下胚轴侵染法转化甘蓝型油菜，采用PCR方法鉴定并得到转基因株系；
(3)通过qPCR方法鉴定BnMED16基因的表达水平；
(4)对步骤(3)中BnMED16基因表达水平显著提高的过表达转基因株系进行油菜叶片离体接种核盘菌，接菌36h后，取菌斑周围一致部位的新鲜叶片，提取总RNA，通过qPCR方法鉴定活性氧积累相关基因BnCAT1、BnPER21和BnPER54，茉莉酸信号途径及下游抗病相关基因BnPGIP、BnChitinase1、BnGSL05、BnPR1、BnPDF1.2和BnERF1的表达水平。
6.BnMED16基因在抗油菜菌核病中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
CN201910591380.3A 2019-07-03 2019-07-03 调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因及应用 Pending CN110373423A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910591380.3A CN110373423A (zh) 2019-07-03 2019-07-03 调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910591380.3A CN110373423A (zh) 2019-07-03 2019-07-03 调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110373423A true CN110373423A (zh) 2019-10-25

Family

ID=68251677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910591380.3A Pending CN110373423A (zh) 2019-07-03 2019-07-03 调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110373423A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112142853A (zh) * 2020-09-10 2020-12-29 中国农业科学院油料作物研究所 真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因及其应用
CN112813075A (zh) * 2021-02-19 2021-05-18 浙江大学 芥蓝BoaWRKY4基因及其应用
CN114292317A (zh) * 2021-12-29 2022-04-08 浙江大学 油菜基因BnCAMTA3的抗病调控功能应用
CN114316007A (zh) * 2021-12-29 2022-04-12 浙江大学 油菜分泌肽基因BnRALF10的抗病功能应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101182524A (zh) * 2006-04-28 2008-05-21 中国农业大学 一种调控水稻分蘖角度的基因及其编码蛋白与应用
CN105063085A (zh) * 2015-07-31 2015-11-18 江苏大学 甘蓝型油菜基因BnMPK3及其抗油菜菌核病的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101182524A (zh) * 2006-04-28 2008-05-21 中国农业大学 一种调控水稻分蘖角度的基因及其编码蛋白与应用
CN105063085A (zh) * 2015-07-31 2015-11-18 江苏大学 甘蓝型油菜基因BnMPK3及其抗油菜菌核病的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENGGANG WANG 等: "The Arabidopsis Mediator Complex Subunit16 Is a Key Component of Basal Resistance against the Necrotrophic Fungal Pathogen Sclerotinia sclerotiorum", 《PLANT PHYSIOLOGY》 *
SILLITO D等: "Arabidopsis thaliana:a source of candidate disease-resistance genes for Brassica napus", 《GENOME》 *
侯国佐: "《贵州油菜》", 31 December 2008 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112142853A (zh) * 2020-09-10 2020-12-29 中国农业科学院油料作物研究所 真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因及其应用
CN112142853B (zh) * 2020-09-10 2022-02-11 中国农业科学院油料作物研究所 真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因及其应用
CN112813075A (zh) * 2021-02-19 2021-05-18 浙江大学 芥蓝BoaWRKY4基因及其应用
CN114292317A (zh) * 2021-12-29 2022-04-08 浙江大学 油菜基因BnCAMTA3的抗病调控功能应用
CN114316007A (zh) * 2021-12-29 2022-04-12 浙江大学 油菜分泌肽基因BnRALF10的抗病功能应用
CN114292317B (zh) * 2021-12-29 2023-04-07 浙江大学 油菜基因BnCAMTA3的抗病调控功能应用
CN114316007B (zh) * 2021-12-29 2023-04-07 浙江大学 油菜分泌肽基因BnRALF10的抗病功能应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110373423A (zh) 调控甘蓝型油菜菌核病抗性的中介因子BnMED16基因及应用
CN107164347A (zh) 控制水稻茎秆粗度、分蘖数、穗粒数、千粒重和产量的理想株型基因npt1及其应用
CN110643618B (zh) 小桐子MYB类转录因子JcMYB16基因及其在提高植物抗旱性中的应用
CN109797157A (zh) 一种抗非生物逆境转录因子PbrbHLH92及其引物、编码的蛋白和应用
CN102643830B (zh) 一种棉花抗旱相关基因GbMYB5的应用
CN107058339A (zh) 大豆GmCIB1基因和GmCRY2基因及其调控开花及衰老的作用
CN104903444B (zh) 对植物赋予高产性的核酸、制备产量增加的转基因植物的方法、使植物的产量增大的方法
CN109593778A (zh) 一种植物人工智能雄性不育系及应用
CN113789334B (zh) Hy5基因在调控植物对病虫害胁迫抗性中的应用
CN109266647B (zh) 水稻二化螟为害诱导型启动子及其应用
CN108728450B (zh) 狗牙根中一个受低温显著诱导的基因CdERF1及其应用
CN110564762A (zh) 调控甘蓝型油菜菌核病抗性的延伸因子BnELP4基因及应用
CN110358772A (zh) 提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因及制备方法与应用
CN109879947A (zh) 毛竹转录因子PheDof 2基因及应用
CN106554964B (zh) 棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用
AU2004210748A1 (en) Gene resistant to Aphis gossypii
CN109456969B (zh) 水稻褐飞虱为害诱导型启动子及其应用
CN111334492A (zh) 西瓜几丁质酶及其编码基因和应用
CN115161332B (zh) 一种刺葡萄VdERF2基因及其编码蛋白和应用
CN102732553B (zh) 提高植物产量的基因工程方法及材料
JP3283850B2 (ja) 花成制御遺伝子と花成制御方法
CN104278053B (zh) 一种提高植物耐旱能力的方法
CN108559753A (zh) 小麦条锈菌pstg_17694基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法
CN112724213B (zh) 甘薯花青苷合成和抗逆相关蛋白IbMYB4及其编码基因与应用
CN108034662A (zh) 小麦条锈菌pstg_06025基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20191025