CN112142853A - 真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明在甘蓝型油菜中克隆了一个病程相关蛋白(类甜蛋白Thaumatin‑like protein,TLP)和受体类激酶(Receptor‑like kinase)天然融合的基因BnTLK1。实验证实BnTLK1蛋白能够抑制核盘菌以及灰霉菌菌丝的生长，正调控真菌抗性。本发明为探索病原菌与植物互作中抗病基因的进化与功能研究奠定了基础，有助于解决生产上由菌核病造成的油菜产量和品质的巨大损失，能够为今后油菜等作物的定向分子设计和遗传改良创制新种质提供更多的备选方案。

Description

真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因及其应用。
背景技术
新基因是指在物种进化过程中某个特定时间出现在以前不存在的位点上的基因，是具有新功能的DNA片段。新基因存在多种起源机制，包括基因复制、基因融合、基因分裂、从头合成起源以及基因水平转移等。1978年，GILBERT提出一个新基因形成的模型，即新基因可以由不相关的基因融合形成。融合基因指的是以前存在于不同基因的编码区经进化连在一起形成一个编码基因。基因融合事件约占所有原核基因的0.5％，绝大多数基因融合发生在细菌和真菌中，而在多倍体植物中融合基因的研究仍处于起始阶段。目前在植物中已经鉴定出一定数量的融合基因。在罂粟中催化吖啶生物碱合成第一步反应的去甲乌药碱合成酶(NCS)的催化域在DNA水平重复了2-4次从而形成了具有多个催化域的NCS融合基因，以提高NCS酶的催化活性；拟南芥编码的AK-HSD融合蛋白，由于连接区中存在跨越AK和HSD结构域的两个ACT结构域，能够受到苏氨酸的反馈抑制。综上所述，植物中通过基因融合产生的新基因能够强化原有基因的功能活性或者加强代谢网络的调控，对物种进化以及物种适应性具有重要意义。
油菜是我国重要的油料作物之一，菜籽油在我国食用油市场中具有举足轻重的地位。菌核病是油菜最严重的病害之一，能造成油菜植株早枯、角果减少、千粒重降低，严重影响油菜的产量和品质。油菜菌核病抗性主要受核基因控制，属微效多基因控制的复杂数量性状。因此聚合不同抗性位点是菌核病防控的有效策略。类甜蛋白(Thaumatin-likeproteins，TLP)是病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins，PR)家族的第5亚家族蛋白(PR5)。研究表明，TLP蛋白广泛参与植物应对生物胁迫和非生物胁迫过程。TLP功能的多样性一定程度上取决于其序列的多变性和复杂性。除了典型的TLP结构域，即具有16个保守的半胱氨酸残基和REDDD结构，还存在非典型的TLP，如仅包括10个半胱氨酸残基的小TLP，以及C端与激酶融合的TLP-Kinase(TLP-K)等。TLP-K中的激酶属于富含丝氨酸苏氨酸类激酶，拟南芥中的研究表明PR5K(一种TLP-K)的激酶结构域在体外具有自我磷酸化功能，暗示该融合基因可能行使生物学功能。
目前虽然在水稻、高粱、小麦以及拟南芥等物种中均报道发现TLP-K融合基因，但是对其生物学功能并不清楚，对油菜中TLP-K融合基因BnTLK1的功能解析有助于解决生产上由菌核病造成的油菜产量和品质的巨大损失，能够为今后油菜等作物的定向分子设计和遗传改良创制新种质提供更多的备选方案。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种TLP-Kinase融合基因BnTLK1。利用原核表达系统在体外表达BnTLK1蛋白并纯化，通过培养皿抑菌实验证实BnTLK1蛋白能够抑制核盘菌以及灰霉菌菌丝的生长。在模式植物拟南芥中过表达BnTLK1获得的转基因阳性植株经活体接种实验证明病斑明显小于野生型，而抑制拟南芥内源TLK1基因的表达，病斑扩张程度要高于野生型，因此融合基因BnTLK1正调控真菌抗性。
本发明提供真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因，所述BnTLK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述核苷酸序列进行同义突变，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1蛋白，所述BnTLK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述氨基酸序列由SEQ ID NO.1的核苷酸序列编码。
本发明还提供真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因TLP结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述核苷酸序列进行同义突变，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因TLP结构域，所述结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码。
本发明还提供真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因在抗核盘菌和灰霉方面的应用，所述BnTLK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因TLP结构域在抗核盘菌和灰霉方面的应用，所述BnTLK1基因TLP结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种原核表达载体，包含所述的真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因或所述的TLP结构域的核苷酸序列。
本发明还提供一种植物表达载体，包含所述的真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因或所述的TLP结构域的核苷酸序列。
本发明还提供一种重组菌株，其特征在于，包含所述的真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因或所述的TLP结构域的核苷酸序列。
本发明还提供所述的原核表达载体或所述的植物表达载体在抗核盘菌和灰霉方面的应用。
本发明还提供所述的原核表达载体或所述的植物表达载体在在甘蓝型油菜遗传改良和分子育种方面的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.目前虽然在水稻、高粱、小麦以及拟南芥等物种中均报道发现TLP-K融合基因，但目前为止TLP-K融合基因的功能在油菜菌核病抗性方面还缺乏足够的深入研究，本发明克隆的BnTLK1基因丰富了油菜中对这类基因的研究，也为后续深入研究BnTLK1中激酶域赋予植物的抗性及其调控机理奠定基础。
2.本发明中克隆得到的BnTLK1基因，为其它作物抗病育种提供了新的遗传资源，为提高其它作物对菌核病抗性具有指导和借鉴作用。
3.本发明构建的植物重组表达载体转化油菜后获得的BnTLK1过表达株系，从BnTLK1的功能获得方面进行研究，为TLP的抗病功能研究提供了原材料，具有重要意义。
4.本发明通过对BnTLK1过表达株系在抗菌核病方面的一系列研究，体外抑菌以及体内遗传实验证明BnTLK1对核盘菌等真菌具有抑制能力，能够提高植物的菌核病抗性，正调控植物真菌抗性，BnTLK1是调控植物抗菌核病的有效基因。
5.BnTLK1这一油菜菌核病抗性基因的发现，为发掘和鉴定作物抗菌核病基因，并探讨抗菌核病基因的分子作用机理，具有重要的理论指导意义。
6.选育抗菌核病的油菜材料一直为油菜育种家所重视，BnTLK1的开发和利用将有助于解决生产上油菜抗菌核病问题。由于目前生产上菌核病造成的油菜产量和品质损失巨大，使得选育抗病品种显得尤其重要，BnTLK1基因的克隆能够为今后油菜等作物的定向分子设计和遗传改良创制新种质提供更多的备选方案，为进一步培育具有菌核病抗性的油菜品种提供了新的育种材料，同时也为采用基因工程手段提高植物对菌核病的抗性提供方向指导，在作物抗菌核病的育种实践、品种改良及品种推广均具有重要的实践指导价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为GST-BnTLK1原核表达载体简图；
图2为BnTLK1蛋白的表达与纯化；
图3为BnTLK1蛋白的体外抑菌实验；
图4为PBI121-BnTLK1及PBI121-BnTLPTLK1过表达载体简图；
图5为pCam23A-pUCC-AtTLK1干扰表达载体简图；
图6为转BnTLK1、BnTLPTLK1基因拟南芥植株及AtTLK1-RNAi拟南芥植株的PCR鉴定；
图7为转BnTLK1、BnTLPTLK1基因拟南芥植株及AtTLK1-RNAi拟南芥植株的qRT-PCR分析；
图8为转BnTLK1、BnTLPTLK1基因拟南芥植株及AtTLK1-RNAi拟南芥植株的抗病表型鉴定。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下面以BnTLK1、BnTLPTLK1的过表达提高拟南芥对菌核病抗性、AtTLK1的干扰表达降低拟南芥对菌核病抗性的结果对本发明的原理和特征进行描述，下述实施例中所用的材料、试剂、载体和菌株等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买。
实施例1：BnTLK1、BnTLPTLK1基因的克隆与序列测定
取油菜中双11的幼嫩叶片，用TriZol Reagent(life technologies公司)提取油菜总RNA，使用NANODROP软件检测总RNA的含量和纯度，取2.0μg总RNA做反转录，所采用的反转录试剂盒为Takara公司产品，反转录反应的步骤参考该试剂盒的使用说明。以反转录反应合成的cDNA为模板，使用引物：
BnTLK1：5’-ATGTTCGCAGGAGTGTTGTC-3’
5’-TAGTGGCTTGGTGTCAAAA-3’
BnTLPTLK1：5’-ATGTTCGCAGGAGTGTTGTC-3’
5’-TAATTGGGAATGGACGAGG-3’
进行常规PCR扩增；PCR反应体系(50μL)为：2μL cDNA，正/反向引物(浓度10μM)各2μL，2×Phanta Max Master Mix为25μL和19μL ddH2O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：95℃3min；95℃15sec，53℃15sec，72℃90sec，32个循环；72℃10min。PCR扩增分别获得长度为1869bp和696bp的片段。琼脂糖凝胶电泳回收该片段后，与pEASY-T1 Sample CloningVector(Takara公司)进行连接反应，反应体系(20μL)为：4μL PCR产物，16μL pEASY-T1Sample Cloning Vector。25℃连接10min。取10μL连接产物，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加800μL液体LB培养基，复苏1h，涂于氨苄抗生素的LB平板上，37℃培养14h。挑选白色单克隆菌落，在含氨苄抗生素的液体LB培养基中扩增培养，测序。经测序分析表明，序列含有完整的开放阅读框，全长分别为1869bp和696bp，序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，其编码蛋白分别含有622和232个氨基酸，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
实施例2：AtTLK1特异序列的克隆与序列测定
取野生型拟南芥的幼嫩叶片，用TriZol Reagent(life technologies公司)提取总RNA，使用NANODROP软件检测总RNA的含量和纯度，取2.0μg总RNA做反转录，所采用的反转录试剂盒为Takara公司产品，反转录反应的步骤参考该试剂盒的使用说明。以反转录反应合成的cDNA为模板，使用引物：
5’-ATCTCGGCTAGGACGCTATG-3’
5’-TTCAACAACGCAACCAGCGC-3’
进行常规PCR扩增；PCR反应体系(50μL)为：2μL cDNA，正/反向引物(浓度10μM)各2μL，2×Phanta Max Master Mix为25μL和19μL ddH2O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：95℃3min；95℃15sec，53℃15sec，72℃15sec，32个循环；72℃10min。PCR扩增获得237bp的片段。琼脂糖凝胶电泳回收该片段后，与pEASY-T1 Sample Cloning Vector(Takara公司)进行连接反应，反应体系(20μL)为：4μL PCR产物，16μL pEASY-T1 Sample CloningVector。25℃连接10min。取10μL连接产物，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加800μL液体LB培养基，复苏1h，涂于氨苄抗生素的LB平板上，37℃培养14h。挑选白色单克隆菌落，在含氨苄抗生素的液体LB培养基中扩增培养，测序。经测序分析表明，AtTLK1基因序列长度为237bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
实施例3：BnTLK1蛋白的原核表达与纯化
本发明所用的表达载体为pGEX-4T-1，带有GST标签，GST-BnTLK1原核表达载体简图如图1所示，通过PCR反应克隆获得BnTLK1基因(SEQ ID NO.1)，使用引物：
5’-ATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGTTCGCAGGAGTGTTGTC-3’
5’-GCTCGAGTCGACCCGGGAATTCCTAGTGGCTTGGTGTCAAAA-3’
进行PCR扩增，扩增模板为实施例1中的pEASY-BnTLK1重组质粒。PCR反应体系(50μL)为：2μL cDNA，正/反向引物(浓度10μM)各2μL，2×Phanta Max Master Mix为25μL和19μLddH2O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：95℃3min；95℃15sec，53℃15sec，72℃90sec，32个循环；72℃10min。采用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段后，通过同源重组连接pGEX-4T-1载体(本实验室保存)。重组体系参考同源重组试剂盒说明书(诺唯赞公司)。取10μL连接产物，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加800μL液体LB培养基，复苏1h，涂于氨苄抗性的LB平板上，37℃培养14h。挑选白色单克隆菌落，在氨苄抗性的LB培养基中扩增培养，测序。根据质粒提取试剂盒说明书(天根公司)提取测序正确的重组菌株质粒，热激法转化大肠杆菌DL21(DE3)感受态细胞，将测序成功的重组表达载体GST-BnTLK1转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，菌液PCR检测。将未加入IPTG的菌液与加入IPTG(终浓度为0.4mmol/L)的菌液在17℃过夜培养后，各取200μL 95℃加热使蛋白变性，12％SDS-PAGE电泳检测。结果如图2(a)所示，M泳道代表marker，泳道1和2分别为未加入IPTG的菌液和加入IPTG的菌液变性后的混合物，可见加入IPTG的诱导菌液在95KDa附近出现蛋白质条带，参见箭头指示的位置，与预计融合蛋白大小一致，目的条带位置正确。将IPTG诱导的菌液进行超声裂解，取裂解液的上清液利用亲和层析进行蛋白纯化。纯化后的蛋白通过12％SDS-PAGE电泳分析检测。检测结果如图2(b)所示，泳道3和4均为IPTG诱导的菌液进行超声裂解纯化后的蛋白，目的条带位置正确且清晰，证明可溶性蛋白表达量较高，可进行后续蛋白功能验证。
实施例4：BnTLK1的体外抑菌实验
以核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和灰霉(Botrytis cinerea)作为BnTLK1抗菌活性检测的指示菌，采用平板法检测BnTLK1对真菌生长的抑制能力。取无菌PDA培养皿，将菌丝块置于PDA平板中央，24℃黑暗条件培养至菌丝长度1cm。在菌丝块两端约1cm处分别放置圆形滤纸片，在每边滤纸片中滴入100μL浓度约为2mg/mL的BnTLK1蛋白溶液，加入蛋白缓冲液作为对照。24℃下培养6-12小时，观察PDA平皿中BnTLK1蛋白对菌丝生长产生的影响。结果如图3(a)-(b)所示，与对照相比，加有BnTLK1的滤纸片周围核盘菌和灰霉的菌丝生长明显受到抑制，而对照中菌丝则能够正常生长。将上述核盘菌菌丝置于倒置显微镜下观察，结果如图3(c)-(d)所示，BnTLK1蛋白周围核盘菌菌丝顶端出现了打结、缠绕现象，对照中核盘菌菌丝正常生长。说明BnTLK1蛋白能够阻碍病原真菌顶端菌丝的生长，从而抑制菌丝扩展。
实施例5：BnTLK1、BnTLPTLK1基因过表达载体构建和遗传转化
本发明所用的表达载体为PBI121，购买自康体生命，PBI121-BnTLK1及PBI121-BnTLPTLK1过表达载体简图如图4所示，通过PCR反应克隆获得BnTLK1、BnTLPTLK1基因，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，使用引物：
BnTLK1：5’-CGGGGGACTCTAGAGGATCCATGTTCGCAGGAGTGTTGTC-3’
5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCCTAGTGGCTTGGTGTCAAAA-3’
BnTLPTLK1：5’-CGGGGGACTCTAGAGGATCCATGTTCGCAGGAGTGTTGTC-3’
5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCCTAATTGGGAATGGACGAGG-3’
进行PCR扩增，扩增模板为上述pEASY-BnTLK1重组质粒。PCR反应体系(50μL)为：2μL cDNA，正/反向引物(浓度为10μM)各2μL，2×Phanta Max Master Mix为25μL和19μLddH2O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：95℃3min；95℃15sec，53℃15sec，72℃90sec，32个循环；72℃10min。采用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段后，通过同源重组连接PBI121载体。重组体系参考同源重组试剂盒说明书(诺唯赞公司)。取10μL连接产物，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加800μL液体LB培养基，复苏1h，涂于卡那抗性的LB平板上，37℃培养14h。挑选白色单克隆菌落，在卡那抗性的LB培养基中扩增培养，测序。根据质粒提取试剂盒说明书(天根公司)提取测序正确的重组菌株质粒，热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞，涂布于含卡那和利福平的LB平板上，28℃，暗培养2天，使用本实施例中的引物检测阳性单克隆，在卡那和利福平抗性的液体LB培养基中扩增培养，用于拟南芥的遗传转化。
采用农杆菌介导的拟南芥遗传转化方法将PBI121-BnTLK1和PBI121-BnTLPTLK1分别导入野生型拟南芥(Col-0)，通过卡那筛选获得抗性苗，经PCR鉴定最终确定阳性转基因株系，结果如图6(a)-(b)所示，能扩增出条带的即为阳性转基因株系。
实施例6：AtTLK1基因RNA干扰载体构建及遗传转化
本发明所用载体为干扰载体pUCCRNAi和表达载体pCam23A。拟南芥(Col-0)的AtTLK1基因的编码序列及其特异序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。pCam23A-pUCC-AtTLK1干扰表达载体简图如图5所示，通过PCR反应克隆获得AtTLK1基因，核苷酸序列为SEQ ID NO.6，使用引物：
5’-CGCAGATCTGATCTCGGCTAGGACGCTATG-3’
5’-CGCCTCGAGTTCAACAACGCAACCAGCGC-3’
进行PCR扩增，扩增模板为上述pEASY-AtTLK1重组质粒。PCR反应体系(50μL)为：2μL cDNA，正/反向引物(浓度10μM)各2μL，2×Phanta Max Master Mix为25μL和19μL ddH2O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：95℃3min；95℃15sec，53℃15sec，72℃15sec，32个循环；72℃10min。采用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。
pUCCRNAi含有三组同尾酶和一个199bp的内含子，如图2所示。先将干扰载体用BamHI和SalI双酶切，目的片段用XhoI和BglII双酶切，酶切体系(30μL)为：酶各1μL，10×Buffer 3μL，ddH2O 15μL，恒温孵育器37℃，30min。酶切后通过T4连接酶将目的片段连到载体上，体系(30μL)为：载体10μL，目的片段1μL，T4 DNA Ligase 1μL，T4 DNA Ligase buffer3μL，ddH2O 15μL，恒温孵育器16℃连接过夜。然后将重组干扰载体用XhoI和BglII双酶切，与目的片段进行第二轮的连接，构成完整的干扰载体，酶切及连接体系同上。恒温孵育器16℃连接过夜。连接产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收。回收的干扰载体与表达载体pCam23A用限制性内切酶PstI酶切后用T4 DNA连接酶连接，酶切及连接体系同上。
取10μL连接产物，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加800μL液体LB培养基，复苏1h，涂于卡那抗性的LB平板上，37℃培养14h。挑选白色单克隆菌落，在卡那抗性的LB培养基中扩增培养，测序。根据质粒提取试剂盒说明书(天根公司)提取测序正确的重组菌株质粒，热激法转化农杆菌GV3301感受态细胞，涂布于含卡那和利福平的LB平板上，28℃，暗培养2天，使用上述引物检测阳性单克隆，在卡那和利福平抗性的液体LB培养基中扩增培养，用于拟南芥的遗传转化。
采用农杆菌介导的拟南芥遗传转化方法将pCam23A-pUCC-AtTLK1导入野生型拟南芥(Col-0)，通过卡那筛选获得抗性苗，经PCR鉴定最终确定阳性转基因株系。结果如图6(c)所示，能扩增出条带的即为阳性转基因株系。
实施例7：转基因植株分子鉴定
经实施例5和实施例6的PCR检测呈阳性的植株，取叶片提取RNA，逆转录制备cDNA，以cDNA为模板进行荧光定量PCR鉴定目的基因表达量。以拟南芥Actin作为内参基因，设计AtActin引物AtActin-qF、AtActin-qR；BnTLK1引物BnTLK1-qF、BnTLK1-qR，BnTLPTLK1引物BnTLPTLK1-qF、BnTLPTLK1-qR，AtTLK1引物AtTLK1-qF、AtTLK1-qR。引物序列如下：
AtActin-qF：5’-CCCGCTATGTATGTCGCCA-3’
AtActin-qR：5’-AACCCTCGTAGATTGGCACA-3’
BnTLK1-qF：5’-GAAGATAATAACAGCACCAT-3’
BnTLK1-qR：5’-ACCATTACCACAACCGCAAC-3’
BnTLPTLK1-qF：5’-CTTCATAGAATGTCCCGGCT-3’
BnTLPTLK1-qR：5’-GTCTGGCTAGGCTGTGACGG-3’
AtTLK1-qF：5’-ATGTTGCTCGCAGGAGTGTTG-3’
AtTLK1-qR：5’-GACCGTACCATGAAGATGGCG-3’
PCR反应体系(20μL)：2μL cDNA，正/反向引物(浓度10μM)各1μL，10μL 2×SYBRGreen Master Mix和6μL ddH2O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：95℃5min；95℃15sec，58℃30sec，72℃15sec，40个循环；95℃15sec；60℃60sec；95℃15sec。采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量(以野生型植株为参照)。结果如图7所示，横坐标为不同编号的阳性转基因株系，纵坐标为表达丰度，BnTLK1、BnTLPTLK1过表达的拟南芥阳性转基因植株中目的基因的表达量远高于野生型植株，而AtTLK1-RNAi拟南芥植株中目的基因的表达量远低于野生型植株，说明目的基因过表达及干扰表达成功。
实施例8：转基因植株表型鉴定
以野生型拟南芥为对照，待BnTLK1、BnTLPTLK1过表达以及AtTLK1-RNAi转基因拟南芥生长到5周左右接种核盘菌。分别在接种后36h、48h、60h测量并计算菌斑大小，菌斑大小以((长+宽)/2)表示，利用Excel软件统计并作图。结果如图8(a)和(c)所示，BnTLK1转基因植株接种后36h、48h、60h的病斑均显著小于(p<0.05)野生型拟南芥。AtTLK1转基因植株接种后36h、48h、60h的病斑均显著大于(p<0.05)野生型拟南芥。图8(b)同样显示在接种后48hBnTLK1转基因植株的病斑显著小于野生型拟南芥，图8(d)显示在接种后48hAtTLK1转基因植株的病斑显著大于野生型拟南芥，以上结果表明融合基因BnTLK1正调控菌核病抗性。
综上，本发明利用原核表达系统在体外表达BnTLK1蛋白并纯化，通过培养皿抑菌实验证实BnTLK1蛋白能够抑制核盘菌以及灰霉菌菌丝的生长。在模式植物拟南芥中过表达BnTLK1获得的转基因阳性植株经活体接种实验证明病斑明显小于野生型，而抑制拟南芥内源AtTLK1基因的表达，病斑扩张程度要高于野生型，因此融合基因BnTLK1正调控真菌抗性。本发明为探索病原菌与植物互作中抗病基因的进化与功能研究奠定了基础，也为后续深入研究BnTLK1中激酶域赋予植物的抗性及其调控机理奠定基础，有助于解决生产上由菌核病造成的油菜产量和品质的巨大损失，为进一步培育具有菌核病抗性的油菜品种提供了新的育种材料，同时也为采用基因工程手段提高植物对菌核病的抗性提供方向指导，在作物抗菌核病的育种实践、品种改良及品种推广均具有重要的实践指导价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID NO.1
ATGTTCGCAGGAGTGTTGTCAGGGAGTATCCTTACCATAGAGAACAAATGTAATCAGACAGTTTGGCCAGTTATCTTCTCATATGATTCAAACCTCTCCACCACTGGTTTCGTTCTCAGAAGCGGCGAGGCGCGTGTCCTGCAGGCGCCGTCTTCATGGTATGGTCTTATCTCGGCTAGGACGCTCTGCTCAACCAACTCGAGTGGTTACTTCTCGTGCGCCACCGGAGACTGTGAATCCGGCTTCATAGAATGTCCCGGCTCATATTCTTGGTCTGCCGTGACGTATGTCTACTTTAGAATGGACCACGGCGGAGTTAGCAGCTACACGATCACTGTCGAGCACGGTTACAACCTTCCCTTAGTGGTAGTCCCGTCACAGCCTAGCCAGACATGTATCAGCGCCGGTTGTTTGGTTGACTTGAACAAGACTTGTCCAGAGGATCTTGGTTTTTTCACCGGTGGGAAACAAATCGGCTGCATTAGCGCGTGCAGAAAGTACAACACCAAAGAAATTTGCTGCACTAATGACTTCAGGTCAAAGCAAAGATGCGAGAGGACGATGTACACGAAGAACTTCGAGCAAGCTTGCCCACTCACCTATAGCTATGCCTTCGAAGATAATAACAGCACCATGACATGCCCTAAGTCAACTGACTTCGTCCTCACCTTTTGTCCCTCGTCCATTCCCAATAACACAAGAAGCTCCATGTCTCCATTTGCAGGACCCAAAAATAATTCTAAAGGGAAGTTAAAACCCATACTCGGAGGTTCATCAGCTTTAGCCGTGTTGATCATTGCTGTTGCGGTTGTGGTAATGGTGAGAGCAAAGAATGCGAGAAGAAAGCGTGATTCAAATTACGAGAACATTGAAGCGGTTGTAATGTTGAAACGATATAGTTATGCAGACGTCAAGAAGATGACAAACTCATTCGCTCATGTTCTTGGAAAAGGAGGATATGGAACTGTCTACAAAGGAAAACTACCCGATTCGAGCGGACAAGATATTGCACTCAAGATCTTGAAAGACCCAAAAGAGAATGGAGAAGACTTCATCAACGAACTAGCTAGCATGAGCATAGCATCTCATGTCAACATCGTTTCTCTATTTGGATTCTGCTATGAAGGGAGCAAGAGAGCTATCATTTACGAGTTCATGCCTAATGGATCCCTTGACAAGTTTATTTCCGAAGATATGTCAACGAAGATGGACTGCGAAACATTATACAACATTGCGTTAGGTGTTGCTCGTGGCTTAGACTACTTGCACAATAGTTGTGTATCAAAGATTGTGCATTTCGATATAAAGCCACAGAATATACTCCTAGATGAAGATTTGTGCCCGAAGATTTCGGATTTTGGTCTTGCTAAGCTTTGCAAGAAAAACGATAGCATTATATCCATGTTGGACGCGAGAGGGACCGTTGGTTATATTGCTCCTGAAGTGTTTTCCAAGAGTTATGGAGCAGTTTCGCATAAGTCTGATGTGTATAGTTATGGAATGGTGGTGCTTGAGCTCATCGGGGTGACCAGTAGAGAGAGAGCTGAAACTTCTAGGTCTAATATGAGTACAATGTACTTTCCGGATTGGATATATGAGGATCTGGAGAGGAATGAAAATATGAGAGTAGGAGATCATGTTATTGAAGAGGAAGAGGAGATAGTGAAGAAAATGACATTAGTGGGTTTGTGGTGTATTCAGACCAATCCATGTGATCGTCCACCGATGAAAAAGGTTGTTGAAATGTTAGAGGGAGGTGTAGAAGCTCTAGTGGTCCCACCTAAGCCTCTCTTGACTCCAGCCATAATGGCTTGGGAAACCGATGAAGAGAGTGAAGAGACTACCAGTCTTTTGACACCAAGCCACTAG
SEQ ID NO.2
ATGTTCGCAGGAGTGTTGTCAGGGAGTATCCTTACCATAGAGAACAAATGTAATCAGACAGTTTGGCCAGTTATCTTCTCATATGATTCAAACCTCTCCACCACTGGTTTCGTTCTCAGAAGCGGCGAGGCGCGTGTCCTGCAGGCGCCGTCTTCATGGTATGGTCTTATCTCGGCTAGGACGCTCTGCTCAACCAACTCGAGTGGTTACTTCTCGTGCGCCACCGGAGACTGTGAATCCGGCTTCATAGAATGTCCCGGCTCATATTCTTGGTCTGCCGTGACGTATGTCTACTTTAGAATGGACCACGGCGGAGTTAGCAGCTACACGATCACTGTCGAGCACGGTTACAACCTTCCCTTAGTGGTAGTCCCGTCACAGCCTAGCCAGACATGTATCAGCGCCGGTTGTTTGGTTGACTTGAACAAGACTTGTCCAGAGGATCTTGGTTTTTTCACCGGTGGGAAACAAATCGGCTGCATTAGCGCGTGCAGAAAGTACAACACCAAAGAAATTTGCTGCACTAATGACTTCAGGTCAAAGCAAAGATGCGAGAGGACGATGTACACGAAGAACTTCGAGCAAGCTTGCCCACTCACCTATAGCTATGCCTTCGAAGATAATAACAGCACCATGACATGCCCTAAGTCAACTGACTTCGTCCTCACCTTTTGTCCCTCGTCCATTCCCAATTAG
SEQ ID NO.3
MFAGVLSGSILTIENKCNQTVWPVIFSWESNLSTTGFVLRSGEARVLQAPSSWYGLISARTLCSTNSSGYFSCATGDCESGFIECPGSYSWSAVTYVYFRMDHGGVSSYTITVEHGYNLPLVVVPSQPSQTCISAGCLVDLNKTCPEDLGFFTGGKQIGCISACRKYNTKEICCTNDFRSKQRCERTMYTKNFEQACPLTYSYAFEDNNSTMTCPKSTDFVLTFCPSSIPNNTRSSMSPFAGPKNNSKGKLKPILGGSSALAVLIIAVAVVVMVRAKNARRKRDSNYENIEAVVMLKRYSYADVKKMTNSFAHVLGKGGYGTVYKGKLPDSSGQDIALKILKDPKENGEDFINELASMSIASHVNIVSLFGFCYEGSKRAIIYEFMPNGSLDKFISEDMSTKMDCETLYNIALGVARGLDYLHNSCVSKIVHFDIKPQNILLDEDLCPKISDFGLAKLCKKNDSIISMLDARGTVGYIAPEVFSKSYGAVSHKSDVYSYGMVVLELIGVTSRERAETSRSNMSTMYFPDWIYEDLERNENMRVGDHVIEEEEEIVKKMTLVGLWCIQTNPCDRPPMKKVVEMLEGGVEALVVPPKPLLTPAIMAWETDEESEETTSLLTPSH*
SEQ ID NO.4
MFAGVLSGSILTIENKCNQTVWPVIFSYDSNLSTTGFVLRSGEARVLQAPSSWYGLISARTLCSTNSSGYFSCATGDCESGFIECPGSYSWSAVTYVYFRMDHGGVSSYTITVEHGYNLPLVVVPSQPSQTCISAGCLVDLNKTCPEDLGFFTGGKQIGCISACRKYNTKEICCTNDFRSKQRCERTMYTKNFEQACPLTYSYAFEDNNSTMTCPKSTDFVLTFCPSSIPN*
SEQ ID NO.5
ATGAAGAAGCACAAAGCAAGAAAAAACATATATAACACAAAGTGTATTGTAGTACGTATATATTCACTCTTTGGAACGTTTTGGTTTTCGTTTAAGCCAATGACGAAGAGGTCGCCATTAATTCTCCTCCTTGCTTCACACTTGTTCGTATCAGGAGTGTTTTCCAATAGTATCATAACCATAGAAAACAAATGCAACAACACAATTTGGCCAGTCATCTTCTCATGGCGGTCACAAGTTTCCACCACCGGCTTCACTCTCAAGACCGGAGAGGAACGTGCCATAAACGCACCATCTTCATGGTACGGTCTTATCTCAGCTAGGACTCTTTGCTCCAATGACTCAACAGGAAACTTCTCATGCGCCACGGGAGACTGTGAATCCGGCGAGATCGAGTGTCCCGGCACCTACAAATGGTCTCCTGTAACTTACGTCATATTTAGAATCGATGACGGACAAATCAACAGCTATATCATCAGCCTCGAGTTCGGTTACAACCTTCCACTAACGGTTGTTCCGTCAAACCCGGCATGTATCAGCTCAGGTTGTATGGTTGACTTGAACAAGACATGTCCAAATGATCTTAAGGAATTCTCCAGGAGAGGTTTAGTCGCCTGCAAAAGTGCGTGTCGACAATCCGCATCCGATGAGAATTGTTGCACTAATTACTTCAAGTATAAGCAAACTTGTAAGCCGACACCGTACGTACAGAACTTCGACCGTGCTTGCCCATCCGCTTATAGCTACCCCTTCAGCGGTAATAACAGTACCTTCACATGCACAAATTCAACTGATTACGTGATCACGTTTTGTCCCTCCTCCATTCCCAACACCACAAGCAGCTCGATGGCTCAACTACCACAACCAAAACATAATTCTCTACGGAAGTTAAAACCGATACTTGGAGGCTCAGCAGCTTTAATTGTGTTGATCAGTATTGTTGTGATTGCGCTAGTAGTGAGAGCGAGGCATGCGAAAAGAAAGAGTGAATTGAACGACGAGAACATTGAAGCGGTTGTGATGTTGAAACGTTATAGCTTTGAAAAAGTCAAGAAGATGACAAACTCGTTTGATCATGTTATTGGGAAAGGAGGATTTGGAACTGTCTATAAAGGAAAACTACCCGATGCCAGCGGCCGAGATATTGCTCTGAAGATCTTGAAAGAGTCAAAAGGGAATGGAGAAGAGTTCATCAATGAACTAGTTAGCATGAGTAGAGCTTCTCATGTTAACATCGTTTCTCTTTTTGGATTTTGCTATGAAGGGAGCCAGAGAGCTATTATCTACGAGTTCATGCCGAATGGATCCCTTGACAAGTTTATATCCGAGAATATGTCAACAAAGATAGAGTGGAAAACATTATACAACATCGCGGTAGGTGTTGCTCGTGGGCTCGAGTACTTGCACAATAGTTGTGTATCCAAGATTGTGCATTTCGATATAAAGCCACAGAATATACTCATAGACGAAGACTTATGCCCGAAGATTTCGGATTTCGGTCTTGCTAAGCTATGCAAAAAGAAAGAAAGTATCATATCAATGTTAGACGCGAGAGGGACAGTAGGGTACATTGCTCCTGAAATGTTTTCCAAGAACTATGGAGGAGTTTCGCATAAGTCAGATGTGTATAGTTATGGAATGGTGGTTCTTGAGATGATTGGGGCAACGAAAAGAGAAGAAGTTGAAACTTCTGCGACCGATAAAAGTTCAATGTACTTTCCTGATTGGGTCTATGAGGATCTTGAGAGGAAAGAAACCATGAGACTATTAGAAGATCATATAATCGAAGAAGAAGAAGAAGAGAAGATAGTGAAGAGAATGACATTAGTGGGTTTGTGGTGTATACAAACCAATCCATCTGATCGTCCACCAATGAGAAAAGTTGTTGAAATGTTAGAGGGCAGTCGTCTAGAAGCTCTACAGGTTCCACCTAAGCCTCTCTTGAATTTACACGTAGTAACGGATTGGGAAACTTCTGAAGATAGTCAACAGACTTCTAGACTCTCGACACAAAGCTTGTTAGAGAGAAAAACTCGTTCGAATTACCAATATACTGTGGAAGCGGTTTAA
SEQ ID NO.6
ATCTCGGCTAGGACGCTATGCTCCATCGACTCAACAGGAACATTCTCTTGCGCCACAGGAGACTGCGAATCGGGTACGATCGAGTGTCCTGGCAATTACGGTTGGGCTCCGGTGACTTATGTCTACTTTAGAATGAACAGCTACACCATCAGTGTTGAGTACGGTTACAACCTTCCACTAATGGTGGTCCCTTCACAGCGTAGCCGGACATGTATCAGCGCTGGTTGCGTTGTTGAA
SEQ ID NO.7
MKKHKARKNIYNTKCIVVRIYSLFGTFWFSFKPMTKRSPLILLLASHLFVSGVFSNSIITIENKCNNTIWPVIFSWRSQVSTTGFTLKTGEERAINAPSSWYGLISARTLCSNDSTGNFSCATGDCESGEIECPGTYKWSPVTYVIFRIDDGQINSYIISLEFGYNLPLTVVPSNPACISSGCMVDLNKTCPNDLKEFSRRGLVACKSACRQSASDENCCTNYFKYKQTCKPTPYVQNFDRACPSAYSYPFSGNNSTFTCTNSTDYVITFCPSSIPNTTSSSMAQLPQPKHNSLRKLKPILGGSAALIVLISIVVIALVVRARHAKRKSELNDENIEAVVMLKRYSFEKVKKMTNSFDHVIGKGGFGTVYKGKLPDASGRDIALKILKESKGNGEEFINELVSMSRASHVNIVSLFGFCYEGSQRAIIYEFMPNGSLDKFISENMSTKIEWKTLYNIAVGVARGLEYLHNSCVSKIVHFDIKPQNILIDEDLCPKISDFGLAKLCKKKESIISMLDARGTVGYIAPEMFSKNYGGVSHKSDVYSYGMVVLEMIGATKREEVETSATDKSSMYFPDWVYEDLERKETMRLLEDHIIEEEEEEKIVKRMTLVGLWCIQTNPSDRPPMRKVVEMLEGSRLEALQVPPKPLLNLHVVTDWETSEDSQQTSRLSTQSLLERKTRSNYQYTVEAV
SEQ ID NO.8
ISARTLCSIDSTGTFSCATGDCESGTIECPGNYGWAPVTYVYFRMNSYTISVEYGYNLPLMVVPSQRSRTCISAGCVVE
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因及其应用
<130> 2020
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1869
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 1
atgttcgcag gagtgttgtc agggagtatc cttaccatag agaacaaatg taatcagaca 60
gtttggccag ttatcttctc atatgattca aacctctcca ccactggttt cgttctcaga 120
agcggcgagg cgcgtgtcct gcaggcgccg tcttcatggt atggtcttat ctcggctagg 180
acgctctgct caaccaactc gagtggttac ttctcgtgcg ccaccggaga ctgtgaatcc 240
ggcttcatag aatgtcccgg ctcatattct tggtctgccg tgacgtatgt ctactttaga 300
atggaccacg gcggagttag cagctacacg atcactgtcg agcacggtta caaccttccc 360
ttagtggtag tcccgtcaca gcctagccag acatgtatca gcgccggttg tttggttgac 420
ttgaacaaga cttgtccaga ggatcttggt tttttcaccg gtgggaaaca aatcggctgc 480
attagcgcgt gcagaaagta caacaccaaa gaaatttgct gcactaatga cttcaggtca 540
aagcaaagat gcgagaggac gatgtacacg aagaacttcg agcaagcttg cccactcacc 600
tatagctatg ccttcgaaga taataacagc accatgacat gccctaagtc aactgacttc 660
gtcctcacct tttgtccctc gtccattccc aataacacaa gaagctccat gtctccattt 720
gcaggaccca aaaataattc taaagggaag ttaaaaccca tactcggagg ttcatcagct 780
ttagccgtgt tgatcattgc tgttgcggtt gtggtaatgg tgagagcaaa gaatgcgaga 840
agaaagcgtg attcaaatta cgagaacatt gaagcggttg taatgttgaa acgatatagt 900
tatgcagacg tcaagaagat gacaaactca ttcgctcatg ttcttggaaa aggaggatat 960
ggaactgtct acaaaggaaa actacccgat tcgagcggac aagatattgc actcaagatc 1020
ttgaaagacc caaaagagaa tggagaagac ttcatcaacg aactagctag catgagcata 1080
gcatctcatg tcaacatcgt ttctctattt ggattctgct atgaagggag caagagagct 1140
atcatttacg agttcatgcc taatggatcc cttgacaagt ttatttccga agatatgtca 1200
acgaagatgg actgcgaaac attatacaac attgcgttag gtgttgctcg tggcttagac 1260
tacttgcaca atagttgtgt atcaaagatt gtgcatttcg atataaagcc acagaatata 1320
ctcctagatg aagatttgtg cccgaagatt tcggattttg gtcttgctaa gctttgcaag 1380
aaaaacgata gcattatatc catgttggac gcgagaggga ccgttggtta tattgctcct 1440
gaagtgtttt ccaagagtta tggagcagtt tcgcataagt ctgatgtgta tagttatgga 1500
atggtggtgc ttgagctcat cggggtgacc agtagagaga gagctgaaac ttctaggtct 1560
aatatgagta caatgtactt tccggattgg atatatgagg atctggagag gaatgaaaat 1620
atgagagtag gagatcatgt tattgaagag gaagaggaga tagtgaagaa aatgacatta 1680
gtgggtttgt ggtgtattca gaccaatcca tgtgatcgtc caccgatgaa aaaggttgtt 1740
gaaatgttag agggaggtgt agaagctcta gtggtcccac ctaagcctct cttgactcca 1800
gccataatgg cttgggaaac cgatgaagag agtgaagaga ctaccagtct tttgacacca 1860
agccactag 1869
<210> 2
<211> 696
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 2
atgttcgcag gagtgttgtc agggagtatc cttaccatag agaacaaatg taatcagaca 60
gtttggccag ttatcttctc atatgattca aacctctcca ccactggttt cgttctcaga 120
agcggcgagg cgcgtgtcct gcaggcgccg tcttcatggt atggtcttat ctcggctagg 180
acgctctgct caaccaactc gagtggttac ttctcgtgcg ccaccggaga ctgtgaatcc 240
ggcttcatag aatgtcccgg ctcatattct tggtctgccg tgacgtatgt ctactttaga 300
atggaccacg gcggagttag cagctacacg atcactgtcg agcacggtta caaccttccc 360
ttagtggtag tcccgtcaca gcctagccag acatgtatca gcgccggttg tttggttgac 420
ttgaacaaga cttgtccaga ggatcttggt tttttcaccg gtgggaaaca aatcggctgc 480
attagcgcgt gcagaaagta caacaccaaa gaaatttgct gcactaatga cttcaggtca 540
aagcaaagat gcgagaggac gatgtacacg aagaacttcg agcaagcttg cccactcacc 600
tatagctatg ccttcgaaga taataacagc accatgacat gccctaagtc aactgacttc 660
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<210> 3
<211> 622
<212> PRT
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 3
Met Phe Ala Gly Val Leu Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Glu Asn Lys
1 5 10 15
Cys Asn Gln Thr Val Trp Pro Val Ile Phe Ser Trp Glu Ser Asn Leu
20 25 30
Ser Thr Thr Gly Phe Val Leu Arg Ser Gly Glu Ala Arg Val Leu Gln
35 40 45
Ala Pro Ser Ser Trp Tyr Gly Leu Ile Ser Ala Arg Thr Leu Cys Ser
50 55 60
Thr Asn Ser Ser Gly Tyr Phe Ser Cys Ala Thr Gly Asp Cys Glu Ser
65 70 75 80
Gly Phe Ile Glu Cys Pro Gly Ser Tyr Ser Trp Ser Ala Val Thr Tyr
85 90 95
Val Tyr Phe Arg Met Asp His Gly Gly Val Ser Ser Tyr Thr Ile Thr
100 105 110
Val Glu His Gly Tyr Asn Leu Pro Leu Val Val Val Pro Ser Gln Pro
115 120 125
Ser Gln Thr Cys Ile Ser Ala Gly Cys Leu Val Asp Leu Asn Lys Thr
130 135 140
Cys Pro Glu Asp Leu Gly Phe Phe Thr Gly Gly Lys Gln Ile Gly Cys
145 150 155 160
Ile Ser Ala Cys Arg Lys Tyr Asn Thr Lys Glu Ile Cys Cys Thr Asn
165 170 175
Asp Phe Arg Ser Lys Gln Arg Cys Glu Arg Thr Met Tyr Thr Lys Asn
180 185 190
Phe Glu Gln Ala Cys Pro Leu Thr Tyr Ser Tyr Ala Phe Glu Asp Asn
195 200 205
Asn Ser Thr Met Thr Cys Pro Lys Ser Thr Asp Phe Val Leu Thr Phe
210 215 220
Cys Pro Ser Ser Ile Pro Asn Asn Thr Arg Ser Ser Met Ser Pro Phe
225 230 235 240
Ala Gly Pro Lys Asn Asn Ser Lys Gly Lys Leu Lys Pro Ile Leu Gly
245 250 255
Gly Ser Ser Ala Leu Ala Val Leu Ile Ile Ala Val Ala Val Val Val
260 265 270
Met Val Arg Ala Lys Asn Ala Arg Arg Lys Arg Asp Ser Asn Tyr Glu
275 280 285
Asn Ile Glu Ala Val Val Met Leu Lys Arg Tyr Ser Tyr Ala Asp Val
290 295 300
Lys Lys Met Thr Asn Ser Phe Ala His Val Leu Gly Lys Gly Gly Tyr
305 310 315 320
Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Leu Pro Asp Ser Ser Gly Gln Asp Ile
325 330 335
Ala Leu Lys Ile Leu Lys Asp Pro Lys Glu Asn Gly Glu Asp Phe Ile
340 345 350
Asn Glu Leu Ala Ser Met Ser Ile Ala Ser His Val Asn Ile Val Ser
355 360 365
Leu Phe Gly Phe Cys Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Ala Ile Ile Tyr Glu
370 375 380
Phe Met Pro Asn Gly Ser Leu Asp Lys Phe Ile Ser Glu Asp Met Ser
385 390 395 400
Thr Lys Met Asp Cys Glu Thr Leu Tyr Asn Ile Ala Leu Gly Val Ala
405 410 415
Arg Gly Leu Asp Tyr Leu His Asn Ser Cys Val Ser Lys Ile Val His
420 425 430
Phe Asp Ile Lys Pro Gln Asn Ile Leu Leu Asp Glu Asp Leu Cys Pro
435 440 445
Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Cys Lys Lys Asn Asp Ser
450 455 460
Ile Ile Ser Met Leu Asp Ala Arg Gly Thr Val Gly Tyr Ile Ala Pro
465 470 475 480
Glu Val Phe Ser Lys Ser Tyr Gly Ala Val Ser His Lys Ser Asp Val
485 490 495
Tyr Ser Tyr Gly Met Val Val Leu Glu Leu Ile Gly Val Thr Ser Arg
500 505 510
Glu Arg Ala Glu Thr Ser Arg Ser Asn Met Ser Thr Met Tyr Phe Pro
515 520 525
Asp Trp Ile Tyr Glu Asp Leu Glu Arg Asn Glu Asn Met Arg Val Gly
530 535 540
Asp His Val Ile Glu Glu Glu Glu Glu Ile Val Lys Lys Met Thr Leu
545 550 555 560
Val Gly Leu Trp Cys Ile Gln Thr Asn Pro Cys Asp Arg Pro Pro Met
565 570 575
Lys Lys Val Val Glu Met Leu Glu Gly Gly Val Glu Ala Leu Val Val
580 585 590
Pro Pro Lys Pro Leu Leu Thr Pro Ala Ile Met Ala Trp Glu Thr Asp
595 600 605
Glu Glu Ser Glu Glu Thr Thr Ser Leu Leu Thr Pro Ser His
610 615 620
<210> 4
<211> 231
<212> PRT
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)
<400> 4
Met Phe Ala Gly Val Leu Ser Gly Ser Ile Leu Thr Ile Glu Asn Lys
1 5 10 15
Cys Asn Gln Thr Val Trp Pro Val Ile Phe Ser Tyr Asp Ser Asn Leu
20 25 30
Ser Thr Thr Gly Phe Val Leu Arg Ser Gly Glu Ala Arg Val Leu Gln
35 40 45
Ala Pro Ser Ser Trp Tyr Gly Leu Ile Ser Ala Arg Thr Leu Cys Ser
50 55 60
Thr Asn Ser Ser Gly Tyr Phe Ser Cys Ala Thr Gly Asp Cys Glu Ser
65 70 75 80
Gly Phe Ile Glu Cys Pro Gly Ser Tyr Ser Trp Ser Ala Val Thr Tyr
85 90 95
Val Tyr Phe Arg Met Asp His Gly Gly Val Ser Ser Tyr Thr Ile Thr
100 105 110
Val Glu His Gly Tyr Asn Leu Pro Leu Val Val Val Pro Ser Gln Pro
115 120 125
Ser Gln Thr Cys Ile Ser Ala Gly Cys Leu Val Asp Leu Asn Lys Thr
130 135 140
Cys Pro Glu Asp Leu Gly Phe Phe Thr Gly Gly Lys Gln Ile Gly Cys
145 150 155 160
Ile Ser Ala Cys Arg Lys Tyr Asn Thr Lys Glu Ile Cys Cys Thr Asn
165 170 175
Asp Phe Arg Ser Lys Gln Arg Cys Glu Arg Thr Met Tyr Thr Lys Asn
180 185 190
Phe Glu Gln Ala Cys Pro Leu Thr Tyr Ser Tyr Ala Phe Glu Asp Asn
195 200 205
Asn Ser Thr Met Thr Cys Pro Lys Ser Thr Asp Phe Val Leu Thr Phe
210 215 220
Cys Pro Ser Ser Ile Pro Asn
225 230

Claims (10)

1.真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因，其特征在于，所述BnTLK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1蛋白，其特征在于，所述BnTLK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码。
3.真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因TLP结构域的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示。
4.真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因TLP结构域，其特征在于，所述结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码。
5.真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因在抗核盘菌和灰霉方面的应用，其特征在于，所述BnTLK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因TLP结构域在抗核盘菌和灰霉方面的应用，其特征在于，所述BnTLK1基因TLP结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种原核表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因或权利要求3所述的TLP结构域的核苷酸序列。
8.一种植物表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因或权利要求3所述的TLP结构域的核苷酸序列。
9.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求1所述的真菌病害相关的甘蓝型油菜BnTLK1基因或权利要求3所述的TLP结构域的核苷酸序列。
10.权利要求7所述的原核表达载体或权利要求8所述的植物表达载体在在甘蓝型油菜遗传改良和分子育种方面的应用。
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