CN112746084A - 一种单轮筛选全阳性的肉眼可视水稻基因筛选方法及基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种实现单轮筛选全阳性的肉眼可视水稻基因筛选方法，所述方法包括培养愈伤组织；合成序列表中SEQ ID No.1中所示序列的筛选标记基因，扩增后连接于载体中形成植物表达载体，转入根癌农杆菌；将愈伤组织与农杆菌接触10‑30分钟，其中，所述农杆菌中引入了所述植物表达载体，所述植物表达载体中携带所述筛选标记基因；进行愈伤组织培养；取带有颜色、状态良好的愈伤组织进行分化再生。并且本发明提供一种表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在遗传转化方面的应用。本发明利用Cb基因构建植物表达载体，导入水稻细胞后造成水稻转化阳性愈伤呈深绿色。

Description

一种单轮筛选全阳性的肉眼可视水稻基因筛选方法及基因
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种可实现单轮筛选全阳性的筛选标记基因及其在水稻遗传转化方面的应用。
背景技术
转基因技术，是20世纪80年代初兴起的一种有效的植物定向改良技术。该技术主要通过农杆菌、基因枪转化等方法将目的基因导入植物受体，经过标记筛选和分子检测，获得稳定表达的转化植株，实现目标性状的快速定向改良，具有可用基因资源广、改良效率高等优点。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了高效的方法，在水稻、小麦、玉米等作物中广泛应用。但现有转基因技术，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记，该类基因可能随食物进入肠道,存在与肠道微生物基因交换产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。为了替代抗生素抗性基因，其他类型筛选标记基因被陆续研究开发，如除草剂抗性基因、氨基酸代谢筛选基因等，但这些筛选标记基因要么存在安全性等类似问题，要么筛选效率和成本不适于规模化应用。而陆续发现的荧光蛋白基因为转基因技术提供了一种新的筛选标记的选择，但常用的GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白需要借助激光显微镜才能观察到荧光。
发明内容
针对上述问题，本发明希望提供一种能够实现高效筛选并且不需要借助激光显微镜就可以实现筛选的标记基因。本发明将该基因整合到表达载体中，通过可视化筛选水稻遗传转化阳性愈伤。
具体而言，在第一个方面，本发明提供一种实现单轮筛选全阳性的肉眼可视水稻基因筛选方法，其特征在于，
(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
(2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得愈伤组织；
(3)合成序列表中SEQ ID No.1中所示序列的筛选标记基因，扩增后连接于载体中形成植物表达载体，转入根癌农杆菌；
(4)将步骤(2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触10-30分钟，其中，所述农杆菌中引入了所述植物表达载体，所述植物表达载体中携带所述筛选标记基因；
(5)将步骤(4)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养48小时；
(6)将步骤(5)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
(7)将步骤(6)处理后的愈伤组织转移筛选培养基上，进一步培养；
(8)选取带有颜色、状态良好的愈伤组织进行分化再生。
在一种优选实现方式中，所述方法还包括当带有颜色的愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上，28℃光照培养。
在另一种优选实现方式中，所述步骤(3)包括：将所述筛选标记基因连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-PCvision载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。
在另一种优选实现方式中，所述步骤(3)还包括：从含有PUC57-AMP-PCvision载体的大肠杆菌XL-blue中，用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，用BamH I酶切，回收PCvision片段，同时利用BamH I酶对1300UBI进行线性化处理，回收1300UBI，将上述的PCvision片段和1300UBI片段用T4连接酶进行连接，得到植物表达载体1300UBI-PCvision。
另一方面，本发明提供一种可实现肉眼可视化、全阳性筛选的水稻筛选标记基因，其特征在于，所述水稻筛选标记基因的核苷酸序列包含序列表中SEQ ID NO.1所示序列。
另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含所述的筛选标记基因。
另一方面，本发明提供一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含所述的Cb基因或权利要求6所述的表达盒。
另一方面，本发明提供一种所述的基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述可实现单轮筛选全阳性的筛选标记基因实现水稻阳性愈伤筛选，获得转基因植物或植物部分。
本发明的筛选标记基因，命名为PCvision，该基因经过化学合成而来。
此外，本发明提供一种含有所述PCvision基因的植物超表达载体。构建方法是利用BamHI酶切位点，用BamHI酶切1300UBI载体并回收，由于合成的PCvision序列两端加有BamHI酶切位点，可以利用T4连接酶将PCvision连接到1300UBI载体，得到植物表达载体1300UBI-PCvision。
在另一个方面，本发明提供一种利用1300UBI-PCvision表达载体(其含有所述可实现单轮筛选全阳性的Cb基因)，将载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：
(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；
(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带1300UBI-PCvision载体的农杆菌接触15分钟；
(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；
(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得肉眼可见的颜色愈伤组织；
(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。
其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。
在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。
表1培养基的示例性配方
Figure BDA0002256157580000041
表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM。
在优选的实施方案中，所述PCvision标记基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，具体如：
ATGGCCTCCAAGATCTCCGACAACGTCCGCATTAAGCTGTACATGGAGGGGACCGTGAACAACCACCACTTCATGTGCGAGGCCGAGGGCGAGGGCAAGCCATACGAGGGGACCCAGATGGAGAACATCAAGGTGACCAAGGGCGGCCCGCTCCCGTTCTCCTTCGACATCCTCACCCCAAACTGCCAGTACGGCTCCGTGGCGATTACCAAGTACACAAGCGGCATCCCGGACTACTTCAAGCAATCCTTCCCGGAGGGCTTCACTTGGGAGCGCACCACAATCTACGAGGACGGCGCCTACCTCACCACCCAACAAGAAACTAAGCTCGACGGCAACTGCCTCGTGTACAATATCAAGATTTTAGGCTGCAATTTCCCGCCGAATGGCCCGGTCATGCAGAAGAAGACACAAGGTTGGGAGCCATGCTGCGAGATGAGGTACACTCGTGATGGCGTGCTCTGCGGCCAGACACTCATGGCCCTCAAGTGCGCCGACGGCAACCATCTCACTTGTCATCTCCGCACCACCTACCGCAGCAAGAAGGCGGCCAAGGCTTTACAGATGCCACCGTTTCACTTCTCCGATCACCGCCCGGAGATCGTGAAGGTGTCCGAGAACGGCACACTCTTCGAGCAGCACGAGTCCTCCGTGGCGAGGTACTGCCAGACTTGTCCGAGCAAGCTGGGCCACAATTGA
附图说明
图1为1300UBI-PCvision载体质粒示意图。
图2为筛选时期呈现深绿色的愈伤
图3为图2蓝色愈伤经分化后所获得的转基因植株
图4为转基因植株的PCR检测电泳图。扩增片段为Cb基因，片段大小为480bp。M为DL2kb marker；PC为阳性对照；NC为阴性对照；1-5为随机挑选的转基因植株。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,VitalyCitovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
本发明通过自行设计获得一条新的DNA序列，并给这个DNA序列末端加上终止密码子TGA，形成一个新基因，该基因被命名为PCvision，序列如SEQ ID NO:1所示。验证后申请人发现其具有重大实验价值和经济价值。
将设计好的PCvision基因送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-PCvision载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。
PCvision基因植物表达载体的构建和农杆菌的转化
从上面含有PUC57-AMP-PCvision载体的大肠杆菌XL-blue，用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，用BamH I酶切，回收PCvision片段。同时利用BamH I酶对1300UBI进行线性化处理，回收1300UBI，将上述的PCvision片段和1300UBI片段用T4连接酶(购于NEB公司)进行连接，得到植物表达载体1300UBI-PCvision(图1)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。
以PCvision为筛选标记基因的水稻遗传转化方法
1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养
将日本晴(安徽省农业科学院水稻研究所保存)的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。
两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5d。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。
2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备
将含有1300UBI-PCvision载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density660nm，660nm吸光值)至约0.10-0.25，室温静置30min以上。
3、侵染和共培养
向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。
4、前筛选和筛选培养
共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5d。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，带有颜色的愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。
5、分化再生
每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。
6、生根与移栽
当颜色愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。
7、分子鉴定
在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增PCvision的PCR引物为5’-CCGACAACGTCCGCATTAAGCT-3’及5’-CGGCGCACTTGAGGGCCATGA-3’，产生长度为490bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行35个循环：94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，最后在72℃延伸10分钟。随机挑选8棵转基因植株，经鉴定，均为阳性，阳性率达到100％。
实施效果
本发明通过分离胚诱导愈伤组织，相比用完整种子诱导愈伤，不仅愈伤组织生长的较快、状态较好，平均比用潮霉素筛选的阳性愈伤筛选时间缩短3-5天。而且能有效减少细菌、真菌污染，减少浪费，节约成本。此外种子清洗后，用无菌水30℃浸泡过夜，能使种子充分吸胀，促进种胚的新陈代谢，提高愈伤组织诱导率，改善愈伤组织状态。
本发明通过LB固体平板两次活化培养，再制备悬浮液，而不是挑单菌落再用液体培养和扩大培养，可以简化操作，便于批量应用，同时减少污染的可能，节约成本。农杆菌菌液浓度对转化效率影响较大。过高的农杆菌菌液浓度，不仅无必要，而且会使农杆菌过度繁殖，增加农杆菌对愈伤组织的伤害，降低转化效率。
本发明选择50mL离心管，而不是培养皿进行侵染，既方便操作，同时有利于愈伤组织和农杆菌的充分接触，从而提高转化效率。选择在三张无菌滤纸上加入悬浮培养基的，而不是固体培养基方式共培养；选择23℃黑暗培养，而不是更高的温度如28℃；可以避免农杆菌过度生长，明显改善愈伤组织状态，从而显著提高转化效率。
由于侵染时菌液浓度较低，共培养温度较低，滤纸共培养方式，共培养结束后几乎没有农杆菌过度生长的情况，因而不需要对愈伤组织进行洗菌操作。不仅节约了成本，减少了污染可能，还避免了洗菌过程对愈伤组织的伤害，提高了转化效率，也便于规模化操作。
采取一轮筛选，而不是两轮筛选，可以缩短实验周期，节约成本。
采取直接分化，而不是先预分化，可以减轻工作量，同时有效节约成本。选择培养皿作为分化再生的组培容器，而不是三角瓶，便于操作，同时最大程度利用光照培养架的空间，便于规模化应用。
在生根培养基中加入适量的NAA(0.4mg/L)，能够促进根系生长，从而提高移栽成活率。
通过上述发明，结合发明人对诱导、农杆菌悬浮、前筛选、筛选和分化再生培养基中的氮源优化([NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM)，通过Cb基因表达呈现深绿色或浅蓝作为筛选标记获得了阳性率为100％的水稻转化植株。
需要说明的是，虽然上述实施例中均是以电热纤维布的形势进行的描述，但是本发明不仅限于电热纤维布的制备，电热纤维丝、电热纤维网或者电热纤维所能构成的其他构造都可以通过本发明的方法实现。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<120> 一种单轮筛选全阳性的肉眼可视水稻基因筛选方法及基因
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 699
<212> DNA
<213> man made
<400> 1
atggcctcca agatctccga caacgtccgc attaagctgt acatggaggg gaccgtgaac 60
aaccaccact tcatgtgcga ggccgagggc gagggcaagc catacgaggg gacccagatg 120
gagaacatca aggtgaccaa gggcggcccg ctcccgttct ccttcgacat cctcacccca 180
aactgccagt acggctccgt ggcgattacc aagtacacaa gcggcatccc ggactacttc 240
aagcaatcct tcccggaggg cttcacttgg gagcgcacca caatctacga ggacggcgcc 300
tacctcacca cccaacaaga aactaagctc gacggcaact gcctcgtgta caatatcaag 360
attttaggct gcaatttccc gccgaatggc ccggtcatgc agaagaagac acaaggttgg 420
gagccatgct gcgagatgag gtacactcgt gatggcgtgc tctgcggcca gacactcatg 480
gccctcaagt gcgccgacgg caaccatctc acttgtcatc tccgcaccac ctaccgcagc 540
aagaaggcgg ccaaggcttt acagatgcca ccgtttcact tctccgatca ccgcccggag 600
atcgtgaagg tgtccgagaa cggcacactc ttcgagcagc acgagtcctc cgtggcgagg 660
tactgccaga cttgtccgag caagctgggc cacaattga 699
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物1(man made2)
<400> 2
ccgacaacgt ccgcattaag ct 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物2(man made3)
<400> 3
cggcgcactt gagggccatg a 21

Claims (9)

1.一种实现单轮筛选全阳性的肉眼可视水稻基因筛选方法，其特征在于，
(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
(2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得愈伤组织；
(3)合成序列表中SEQ ID No.1中所示序列的筛选标记基因，扩增后连接于载体中形成植物表达载体，转入根癌农杆菌；
(4)将步骤(2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触10-30分钟，其中，所述农杆菌中引入了所述植物表达载体，所述植物表达载体中携带所述筛选标记基因；
(5)将步骤(4)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养48小时；
(6)将步骤(5)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
(7)将步骤(6)处理后的愈伤组织转移筛选培养基上，进一步培养；
(8)选取带有颜色、状态良好的愈伤组织进行分化再生。
2.根据权利要求1所述的水稻基因筛选方法，其特征在于，所述方法还包括当带有颜色的愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上，28℃光照培养。
3.根据权利要求1所述的水稻基因筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：将所述筛选标记基因连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-PCvision载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。
4.根据权利要求3所述的水稻基因筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)还包括：从含有PUC57-AMP-PCvision载体的大肠杆菌XL-blue中，用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，用BamH I酶切，回收PCvision片段，同时利用BamH I酶对1300UBI进行线性化处理，回收1300UBI，将上述的PCvision片段和1300UBI片段用T4连接酶进行连接，得到植物表达载体1300UBI-PCvision。
5.一种可实现肉眼可视化、全阳性筛选的水稻筛选标记基因，其特征在于，所述水稻筛选标记基因的核苷酸序列包含序列表中SEQ ID NO.1所示序列。
6.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求5所述的筛选标记基因。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求5所述的Cb基因或权利要求6所述的表达盒。
8.一种权利要求5-7所述的基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述可实现单轮筛选全阳性的筛选标记基因实现水稻阳性愈伤筛选，获得转基因植物或植物部分。
9.一种利用1300UBI-PCvision表达载体将载体导入水稻细胞的方法，1300UBI-PCvision表达载体含有所述可实现单轮筛选全阳性的Cb基因)，包括下述步骤：
(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；
(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带1300UBI-PCvision载体的农杆菌接触15分钟；
(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；
(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得肉眼可见的颜色愈伤组织；
(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。
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