JP2017060421A - ピキア酵母を用いた遺伝子組換えによるアスパルティックプロテアーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ピキア酵母を用いて、活性体のアスパルティックプロテアーゼを遺伝子工学的手法により、安定的に大量に製造する製造方法の提案。【解決手段】（１）アスパルティックプロテアーゼを分泌するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌からアスパルティックプロテアーゼ遺伝子をクローニングする工程と、（２）ピキア酵母での異種タンパク質の発現・制御可能なプラスミドの構築工程と、（３）前記プラスミドをピキア酵母に導入して形質転換体を調製する工程と、（４）形質転換体を培養してアスパルティックプロテアーゼを産生する工程と、（５）産生した前記プロテアーゼを成熟化させる工程と、を含む、活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法。アスパルティックプロテアーゼを産生する工程（４）において培養にメタノール水溶液を使用し、前記メタノール水溶液の濃度が０．１〜１．０重量％の範囲である、活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法。【選択図】図４

Description

本発明は、ピキア酵母を用いた遺伝子組換えによるアスパルティックプロテアーゼの製造方法に関する。

アスパルティックプロテアーゼはプロテアーゼの一種で、弱酸性条件下において安定かつ高活性を示す酵素タンパク質である。
アスパルティックプロテアーゼに属するプロテアーゼは、キモシンに代表されるように乳中のカゼインタンパク質を限定分解することにより、凝乳を引き起こすことからチーズ製造に用いられている（特許文献１）。
また、当該ファミリーに属する酵素の中には、ミオグロビンやヘモグロビンを部分分解することにより、それらを含む溶液の脱色を引き起こすプロテアーゼも存在する（非特許文献１）。

ところでミオグロビンやヘモグロビンを含む溶液の脱色に関わるプロテアーゼを糸状菌等から調製する場合、種菌の調製から糖類を多量に含むペプトン-酵母エキス-麦芽エキス-グルコース培地での培養、各種クロマトグラフィーによる培養上清中からの精製には、数週間を要する（特許文献２）。
よって、純度の高い酵素製剤としての供給法として糸状菌等の培養上清からの調製は必ずしも効率的とは断言できない状況にある。

一方、糸状菌由来アスパルティックプロテアーゼを親株より調製する代替製造方法として、遺伝子組換え技術を利用する方法が試みられている。
例えば宿主として大腸菌を用いる方法が報告されている。
前記宿主として大腸菌を用いる方法としては、まず、組み換えアスパルティックプロテアーゼを不溶性タンパク質として得て、酸性条件下でリフォールディングと自己触媒的な活性化、カラムクロマトグラフィーによる前駆体タンパク質の回収など、活性体を得るまでに数ステップのステップが必要である（非特許文献２）。

また、宿主としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓを用いてアスパルティックプロテアーゼを産生する方法も知られている。
まず、前駆体タンパク質を得て、酸性条件下（ｐＨ ２）でのインキュベートを行うことで組み換えタンパク質の活性化を行う。大腸菌を宿主として用いる方法と比較し、組み換えプロテアーゼを菌体外に分泌させることが可能であるが、培養液１Ｌあたり５０ ｍｇ程度の前駆体タンパク質しか得ることができない（非特許文献３）。

特開平６−２６１７５３号公報 特開２００９−２１９４８３号公報

Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．９３巻 １３４９〜１３５５（２０１３年） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２０、９７４〜９８１（１９９３年） Ｅｕｒ. Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２３７巻、７１９〜７２５（１９９６年）

本発明の目的は、ピキア酵母を用いて、活性体のアスパルティックプロテアーゼを遺伝子工学的手法により、安定的にかつ大量に製造できる製造方法を確立することにある。

前記課題を解決するために本発明者らが鋭意検討した結果、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌からアスパルティックプロテアーゼ遺伝子をクローニングする工程を含む活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法が、前記課題を解決することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、
［１］（１）アスパルティックプロテアーゼを分泌するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌からアスパルティックプロテアーゼ遺伝子をクローニングする工程と、
（２）ピキア酵母での異種タンパク質の発現・制御可能なプラスミドの構築工程と、
（３）前記プラスミドをピキア酵母に導入して形質転換体を調製する工程と、
（４）形質転換体を培養してアスパルティックプロテアーゼを産生する工程と、
（５）産生した前記プロテアーゼを成熟化させる工程と、
を含むことを特徴とする、活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法を提供するものである。

また本発明の一つは、
［２］前記アスパルティックプロテアーゼを分泌するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌からクローニングされるアスパルティックプロテアーゼ遺伝子の塩基配列数が９００から１２００ｂｐの範囲である、前記［１］に記載の活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法を提供するものである。

また本発明の一つは、
［３］前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌が、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ（アスペルギルス レペンス） ＭＫ８２および同受託番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０２１２２菌株として寄託されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ（アスペルギルス グラウカス） ＭＡ０１９６の少なくとも一方である、前記［１］または［２］に記載の活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法を提供するものである。

また本発明の一つは、
［４］形質転換体を培養してアスパルティックプロテアーゼを産生する工程（４）において培養にメタノール水溶液を使用し、前記メタノール水溶液の濃度が０．１〜１．０重量％の範囲である、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法を提供するものである。

また本発明の一つは、
［５］前記活性体アスパルティックプロテアーゼが、ヘモグロビンおよびミオグロビンの少なくとも一方の分解用活性体アスパルティックプロテアーゼである、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法を提供するものである。

本発明の活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法によれば、ピキア酵母を用いて、活性体のアスパルティックプロテアーゼを遺伝子工学的手法により、安定的にかつ大量に製造できる。
特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ ＭＡ０１９６の少なくとも一種を使用した場合には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ ＭＡ０１９６の少なくとも一種由来のアスパルティックプロテアーゼと同じ完全分子構造を有し、しかもプロテアーゼ活性も同一である組換えアスパルティックプロテアーゼを、安定的にかつ大量に製造することができる。

図１は、ＭＫ８２プロテアーゼ発現形質転換株のプロテアーゼ遺伝子のコピー数を示したグラフである。 図２は、ＭＫ８２プロテアーゼ発現形質転換株のプロテアーゼ活性を示したグラフである。 図３は、ＭＫ８２プロテアーゼ発現形質転換株（Ｎｏ．８）を培養し、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて調べた結果を示したものである。 図４は、ＭＫ８２プロテアーゼ発現形質転換株の生育と培養上清のプロテアーゼ活性を示したグラフである。 図５は、ＢＭＭＹ培地で培養して得られたＭＫ８２プロテアーゼ（プロ−成熟タンパク質）とその活性化物（成熟タンパク質）を示したものである。 図６は、ＭＡ０１９６プロテアーゼ発現形質転換株（Ｎｏ．５０−５）を培養し、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて調べた結果を示したものである。 図７は、ＭＡ０１９６プロテアーゼ発現形質転換株の生育と培養上清のプロテアーゼ活性を示したグラフである。 図８は、ＢＭＭＹ培地で培養して得られたＭＡ０１９６プロテアーゼ（プロ−成熟タンパク質）とその活性化物（成熟タンパク質）を示しめしたものである。 図９は、組み換えＭＫ８２プロテアーゼを冷蔵庫、３０℃、３７℃、５０℃で放置した際の残存活性を示したグラフである。

本発明の製造方法により得られる活性体アスパルティックプロテアーゼは、例えば、色素タンパク質を部分分解して脱色する用途に使用することができる。
前記色素タンパク質を部分分解できる酵素をコードする遺伝子としては、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ ＭＡ０１９６由来のアスパルティックプロテアーゼ遺伝子等を用いることができる。
これらは、公知の脱色活性測定法により色素タンパク質に対する活性を確認することができ、ＮＢＲＣ等の微生物株保存機関の分譲株に対して本発明の方法を適用することにより、同等の酵素と遺伝子を取得することができ、色素タンパク質の部分分解用途に利用可能である。
なお脱色活性測定法はＪ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．９３巻、１３４９から１３５５、２０１３年に報告されている。この脱色活性測定法を利用して本発明の製造方法により得られる活性体アスパルティックプロテアーゼによる色素タンパク質の部分分解の性能を定量的に測定することができる。

また本発に使用するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ ＭＡ０１９６等の糸状菌の培養には公知の培地用成分を使用することができる。

例えば、培養に使用する炭素源としては、グルコース、マンノース、フラクトース、マンノース、リボース、キシロース等のアルドース類、グルコン酸、マンノン酸等のアルドン酸類、グルカル酸、マンナル酸等のアルダル酸類、ソルビトール、マンニトール等のアルジトール類、グルクロン酸、マンヌロン酸等のウロン酸類等、
植物、動物由来のでんぷん、抽出液等、
エタノール、グリセリン等の水酸基含有化合物等を挙げることができる。
また培養に使用する窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を挙げることができる。
また培養に使用するリン源としては、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等を挙げることができる。
また培養に使用するカリウム源としては、塩化カリウム、硝酸カリウム等を挙げることができる。

前記炭素源、窒素源、リン源、カリウム源等は一種もしくは二種以上を使用することができる。

前記培地用成分として、必要に応じてｐＨを調整するための緩衝成分、ポリアクリル酸誘導体等のゲル化成分等を配合することができる。

前記糸状菌を培養するときの条件は以下の通りである。

前記糸状菌の培養を行うときの温度は、１５〜５５℃の範囲であることが好ましく、さらに好ましくは２５〜４５℃の範囲である。
前記糸状菌の培養を行うときの時間は、１２時間〜１２日の範囲であることが好ましく、より好ましくは２〜１１日の範囲であり、さらに好ましくは３〜１０日の範囲である。
前記糸状菌の培養を行うときのｐＨは、２〜８の範囲の範囲が好ましく、より好ましくは３〜７の範囲であり、さらに好ましくは４〜６の範囲である。

前記糸状菌の培養の際に使用する水に特に限定はなく、イオン交換水、蒸留水、水道水、通常の水道水から塩素を除去した工業用水等が使用される。

次に発現系としては、プロモーター、シグナル配列の選択が重要である。プロモーターはピキア酵母において異種蛋白質の発現、すなわち異種蛋白質の分泌を制御可能なものとして通常利用されているものであれば特に限定されない。具体的にはアルコールオキシダーゼ由来のプロモーター等が例示される。

プロ−成熟タンパク質の配列としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ ＭＡ０１９６由来等のネイティヴな配列（ｃＤＮＡ：相補的ＤＮＡ）を用いることができる。
例えば、ＭＶＮＴＳＬＬＡＡＬＴＡで示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
前記シグナル配列としては上記のアミノ酸配列に対応するコドンを有する塩基配列であれば特に限定されない。
その一例として、表１に示すプライマー（ＭＫ８２＿ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿ＦとＭＫ８２＿ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿Ｒ、ＭＡ０１９６＿ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿ＦとＭＡ０１９６＿ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿Ｒ。これらは配列表に記載される配列表番号１〜４にそれぞれ対応する。）などが例示される。

前記糸状菌である遺伝子供与体からのｃＤＮＡの調製は、市販のキット、具体的には、キアゲン社製ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔによる糸状菌の菌体からのトータルＲＮＡの抽出、ＴａＫａＲａバイオ社製ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔを用いることにより調製可能である。

また、ターミネーター、選択マーカーなども公知のものを利用することができる。
ターミネーターとしてはＡＯＸ１ターミネーターなどが例示される。
選択マーカーとしてはピキア酵母由来のＡＲＧ４、ＨＩＳ４、パン酵母由来のＳＵＣ２、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３などのアミノ酸／核酸合成遺伝子またはゼオシン、Ｇ４１８などの薬剤耐性遺伝子等が例示される。

また、発現用プラスミドを宿主の染色体上に導入する場合は相同領域を用いることができる。相同領域としては上記のアミノ酸／核酸合成遺伝子、アルコールオキシダーゼ遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍｅＤＮＡ遺伝子、Ｔｙ因子、その他のピキア酵母の既知遺伝子などが例示される。

発現用プラスミド（発現ベクター）は、プロモーターの下流にシグナル配列、アスパルティックプロテアーゼをコードする遺伝子、ターミネーター、選択マーカー、相同領域などを連結することにより調製することができる。
前記発現用プラスミドの具体例については、例えば、市販品キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ｐＰＩＣＺ Ａ， Ｂ， ＆ Ｃ Ｐｉｃｈｉａ Ｖｅｃｔｏｒｓ、製品番号Ｖ１９０−２０等、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ｖ１９０２０）を参考に再現することができる。

宿主としては、例えばピキア酵母（ピキア・パストリス）を用いることができる。
具体的にはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株（ライフテクノロジーズ社より入手可能。）などが例示される。

プラスミドをピキア酵母に導入し形質転換体を調製する手段としては、前述の発現用プラスミドを制限酵素ＢｓｔＸ Ｉで処理し、線状にしたものを宿主の染色体上に組み込む方法がある。
なお、形質転換体は前記発現用プラスミドを１つ組み込んだものが良い。

前記発現用プラスミドを宿主細胞内に導入する（宿主染色体に組込む）方法は公知の手法を用いることができる。
例えば、エレクトロポレーション法が例示される。
前記エレクトロポレーション法を実施する方法としては、例えば、Ｂｉｏ Ｒａｄ社製Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌを使用して、２００ Ｖ, ２５ｍＦ, ２００ Ω, ２ ｍｍ等の条件により実施することができる。

［培養（産生）工程］
次に培養工程について説明する。前記培養工程は形質転換体を培地で培養して組換えアスパルティックプロテアーゼを産生させる工程である。
培地としてはピキア酵母の培養に通常用いられるものであれば、特に限定されるものではない。
例えば、ＭＭＨ培地（イーストナイトロジェンベース、ヒスチジンおよびビオチンからなる）、ＢＭＭＨ培地（リン酸塩、イーストナイトロジェンベース、ヒスチジン、ビオチンからなる）、ＢＭＭＹ培地（酵母エキス、ペプトン、リン酸塩、イーストナイトロジェンベース、ヒスチジンおよびビオチンからなる）などが例示される（表２）。

前記培地を使用した培養工程における形質転換体の培養には、前記培地にメタノール水溶液を使用することが好ましい。
前記メタノール水溶液の濃度としては０．１〜１．０重量％の範囲が好ましく、０．３〜０．７重量％の範囲がより好ましく、０．５重量％であれば最も好ましい。

培養はｐＨ４．５〜６．０の条件下で行われることが好ましい。また、培養後の上清をｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液にて透析すると、プロ配列の自己消化を進めることができる。

培養条件としては培養温度１０〜４５℃程度で、培養時間２〜８日間程度が例示される。培養様式としてはバッチ培養、フェドバッチ培養（フェドバッチ）などを用いることができる。

なお、前記培養工程に先立って前培養を行うことが好ましい。前培養用の培地としては、例えば、ＢＭＹＧ培地が例示される（表２）。

また、前培養の培養条件としては温度２０〜４０℃の範囲であれば好ましい。また濁度（６００ｎｍ）が６になるまで培養することが好ましい。

［精製工程］
次に精製工程について説明する。前記精製工程は培養上清から回収された活性体の組換えアスパルティックプロテアーゼを精製する工程である。
その精製方法としては、例えば、ｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸緩衝液にて透析後、アセトン分画に代表される有機溶媒による分画法やゲル濾過法が例示される。

アセトンによる分画法では、例えば、０から４℃の範囲で酵素液を冷却後、撹拌しながら流速０．５から１．０ＭＬ／ｈの流速にてアセトンを８０％（Ｖ／Ｖ）となるように添加し、その後３０分撹拌後、遠心分離（１５，０００×ｇ、１５ｍｉｎ）で沈殿として回収できる。

ゲル濾過処理は、ゲル濾過用担体を用いて分子量の違いにより目的とする組換えアスパルティックプロテアーゼを精製・回収するものである。ゲル濾過用担体としてはアガロース、架橋デキストラン（例えば、セルロファインなど）などを用いることができる。
組換えアスパルティックプロテアーゼの分子量を考慮して、前記ゲル濾過用担体は分画分子量領域が１０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ程度にあるものを用いることが好ましい。具体的には、東ソー社製Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標） ＨＷ−５５ゲル濾過用樹脂等を用いて夾雑タンパク質を除くことが可能である。

上述した各工程を経て、遺伝子組換えによるアスパルティックプロテアーゼを製造することができる。

以下に実施例に基づき本発明について詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２からのアスパルティックプロテアーゼ遺伝子の発現、組み換えタンパク質の生産

なお、本実施例において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）による分析は以下の条件で行った。以下の実施例についても同様である。
還元条件で被験体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマーシーブリリアントブルーによる染色により検出した。分子量マーカーとして１４〜７９ｋＤａの組換え蛋白（和光純薬社製、中分子量マーカー）を用いた。
プロテアーゼ活性および脱色活性の測定は既報の方法に従った（Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．９３巻、１３４９から１３５５、２０１３年）。
また本実施例に使用したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ（アスペルギルス レペンス） ＭＫ８２は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されている。

まずＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ１）プロモーターの制御下でアスパルティックプロテアーゼが発現される発現ベクターの構築について説明する。

（１）アスパルティックプロテアーゼ遺伝子のクローニング工程
ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）によりプロテアーゼｃＤＮＡを５’および３’末端にそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩ（商品名。ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製）およびＸｂａＩ（商品名。ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製）サイト（ＭＫ８２株プロテアーゼ用）を付加するように増幅した。
ＰＣＲプライマー用オリゴＤＮＡは表１に示すプライマーを用いた。
鋳型ＤＮＡにはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２由来のｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙを用い、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した結果、プロテアーゼｃＤＮＡに相当する１．２ｋｂのＰＣＲ産物を得た。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２由来ＤＮＡは、プロ配列と成熟タンパク質配列３９０アミノ酸残基をコードする。
このＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２由来ＤＮＡの遺伝子配列を、配列表番号５として配列表に記載した。

本発明に使用するアスパルティックプロテアーゼを分泌するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌からクローニングされるアスパルティックプロテアーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列数は９００から１２００ｂｐの範囲であることが好ましい。

（２）ピキア酵母での異種タンパク質の発現・制御可能なプラスミドの構築工程
ピキア酵母発現ベクターであるｐＰＩＣＺα Ａ（商品名。インビトロジェン社）を前記制限酵素ＫｐｎＩおよび前記制限酵素ＸｂａＩ（ＭＫ８２プロテアーゼ用）で消化して得られた断片に、上記のＰＣＲ産物を同制限酵素で消化したプロテアーゼｃＤＮＡ断片を挿入し、発現ベクターを構築した。
前記発現ベクターは、プロテアーゼｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ゼオシン耐性遺伝子を含んでいる。

（３）前記プラスミドをピキア酵母に導入して形質転換体を調製する工程
本発明において、この工程ではアスパルティックプロテアーゼ発現ベクターを用いて酵母形質転換体を作製する。ここではＭＫ８２アスパルティックプロテアーゼ発現ベクターを用いて酵母形質転換体を作製した。なお組み換え酵素をＭＫ８２プロテアーゼと称する。

発現ベクター用いて、選択マーカーを利用してピキア酵母を形質転換していくことにより、ピキア酵母発現株を作製した。
まず、ピキア酵母発現ベクターを制限酵素ＢｓｔＸＩ（商品名。ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製）で消化、線状化し、ジーンパルサーにてピキア酵母ＧＳ１１５に導入した。
選択寒天培地（ゼオシン添加ＹＰＤＳ培地）に生育したクローンよりＳｉｎｇｌｅＣｏｌｏｎｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎを行い、プロテアーゼ発現形質転換体の単一クローンを得た。
クローンの分離の際、ゼオシン濃度５０ｍｉｃｒｏｇ／ｍｌの選択培地から形質転換体（ＭＫ８２プロテアーゼ発現株、Ｎｏ．８とＮｏ．２−６）、２００μｇ／ｍｌの選択培地から形質転換体（ＭＫ８２プロテアーゼ発現株、Ｎｏ．６）を得た。
定量ＰＣＲにてそれぞれの形質転換株のプロテアーゼ遺伝子コピー数を調べたところ、Ｎｏ．６が一番多かった。

図１は、ＭＫ８２プロテアーゼ発現形質転換株３株（Ｎｏ．６、Ｎｏ．８、Ｎｏ．２−６）についてプロテアーゼ遺伝子のコピー数を示したグラフである。
また図２は、ＭＫ８２プロテアーゼ発現形質転換株３株（Ｎｏ．６、Ｎｏ．８、Ｎｏ．２−６）についてＢＭＧＹ培地で培養した際のプロテアーゼ活性を示したグラフである。

形質転換体はＹＰＤ培地で３０℃、４８時間培養し、遠心（２８００ｒｐｍ×１０分）にて集菌し、２０％グリセロールを分散溶媒として１ｍＬずつチューブに分注し、−８０℃で保存した。

（４）形質転換体を培養してアスパルティックプロテアーゼを産生する工程
以上のようにして作製した組換えアスパルティックプロテアーゼ発現形質転換体をＭＭＨ培地、ＢＭＭＨ培地、ＢＭＭＹ培地、ＢＭＧＹ培地を用いて５００ＭＬ坂口フラスコにて振とう（タイテック社製振とう培養機ＢＲ−３０００ＬＦ、１４０ｒｐｍ、３０℃）培養した。
また、２４時間ごとに終濃度で０．５重量％となるようにメタノールを添加した。

［アスパルティックプロテアーゼ産生量を向上させる条件の検討］
・培地組成の検討
ＢＭＧＹ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ）にて、３０℃、１４０ ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が６の時点で遠心分離アスパルティックプロテアーゼ発現形質転換株を集菌した。
なお、ＯＤ６００とは６００ｎｍの波長の可視光が培養液の濁度により散乱され透過光が減少する割合を示したものであり、前記培養液に含まれる菌濃度を測る尺度となる。
ＯＤ６００が１となるようにＭＭＨ培地、ＢＭＭＨ培地またはＢＭＭＹ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ）に懸濁し、３０℃、１４０ ｒｐｍで培養した。２４時間毎に最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）となるようにメタノールを添加した。培養９６時間後に培養液を回収し、遠心分離により上清と沈殿に分けた。比較例として形質転換していないＧＳ１１５も培養した。

表３は、ＭＫ８２プロテアーゼ生産形質転換株における酵素生産に与える培地組成の影響試験結果を示したものである。
また図３は、ＭＫ８２プロテアーゼ発現形質転換株（Ｎｏ．８）を培養し、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて調べた結果を示したものである。
図３におけるレーンＭは、分子量マーカーであり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１４，０００）、Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０，０００）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ＡｎｈｙｄｒａｓｅＩＩ（３０，０００）、Ａｌｄｏｌａｓｅ（４２，０００）、ＢＳＡ（７９，０００）からなる。
また図３におけるレーン１〜レーン１２の内容はそれぞれ次の通りである。
・レーン１ ：ＭＭＨ培地培養上清
・レーン２ ：ＢＭＭＨ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ４．５）
・レーン３ ：ＢＭＭＨ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ５．０）
・レーン４ ：ＢＭＭＨ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ６．０）
・レーン５ ：ＢＭＭＹ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ４．５）
・レーン６ ：ＢＭＭＹ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ５．０）
・レーン７ ：ＢＭＭＹ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ６．０）
・レーン８ ：ＢＭＭＹ培地（５０ｍｌ／５００ｍｌフラスコ、ｐＨ６．０）
・レーン９ ：ＢＭＭＹ培地（７０ｍｌ／５００ｍｌフラスコ、ｐＨ６．０）
・レーン１０：ＢＭＭＹ培地（１００ｍｌ／５００ｍｌフラスコ、ｐＨ６．０）
・レーン１１：ＢＭＭＹ培地（１００ｍｌ／５００ｍｌフラスコ、ｐＨ５．０）
・レーン１２：ＢＭＧＹ培地

・培地量の検討
ＢＭＧＹ培地（１００ｍｌ／５００ＭＬ坂口フラスコ）にて３０℃、１４０ ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が６の時点で遠心分離アスパルティックプロテアーゼ発現形質転換株を集菌した。ＯＤ６００が１となるようにＢＭＭＹ培地（５０、７０、１００ｍｌ／５００ＭＬ坂口フラスコ）に懸濁し、３０℃、１４０ ｒｐｍで培養した。２４時間毎に最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）となるようにメタノールを添加した。培養９６時間後に培養液を回収し、遠心分離により上清と沈殿に分けた。
結果を表３および図３に示す。

試験した中で、ＢＭＭＹ培地で培養して得られた培養上清のプロテアーゼ活性が高かった（表３）。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて純度を調べたところ、同プロテアーゼはプロ配列−成熟タンパク質複合体として分泌されていることがわかった（図３）。
よって、プロ−成熟タンパク質であっても活性を示すことがわかった。

・培養時間の検討
ＢＭＧＹ培地（１００ｍｌ／５００ＭＬ坂口フラスコ）にて３０℃、１４０ ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が６の時点で遠心分離アスパルティックプロテアーゼ発現形質転換株を集菌した。ＯＤ６００が１となるようにＢＭＭＹ培地（５０、７０、１００ｍｌ／５００ＭＬ坂口フラスコ）に懸濁し、３０℃、１４０ ｒｐｍで培養した。２４時間毎に最終濃度０．５％となるようにメタノールを添加した。培養は、７から１０日間行い、培養液を回収し、遠心分離により上清と沈殿に分けた。

図４は、ＭＫ８２プロテアーゼ発現形質転換株の生育と培養上清のプロテアーゼ活性を示したグラフである。
培養は、１４０ｒｐｍで振とうしながら、ＢＭＭＹ培地（１００ｍｌ／５００ＭＬ坂口フラスコ）で行い、２４時間ごとに終濃度０．５％となるようにメタノールを添加した。 図４中の黒丸印（参照符号１）は形質転換株の生育量、白丸印（参照符号２）はプロテアーゼ活性を示す。

生育は培養５日目で一定となったが、プロテアーゼ量は増大し、１１日以降に一定となった。

（５）産生した前記プロテアーゼを成熟化させる工程
・透析による組み換え酵素の成熟化
ＢＭＧＹ培地（１００ｍｌ／５００ＭＬ坂口フラスコ）にて９日間培養した後、培養上清を回収し２０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で透析した。遠心分離により沈殿を除き、上清をＳＤＳ-ＰＡＧＥに供し、成熟タンパク質酵素の単一性を確認した。

図５は、ＢＭＭＹ培地で培養して得られたＭＫ８２プロテアーゼ（プロ−成熟タンパク質）とその活性化物（成熟タンパク質）を示したものである。
図５中のレーンＭは、分子量マーカーであり、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１４，０００）、Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０，０００）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ＡｎｈｙｄｒａｓｅＩＩ（３０，０００）、Ａｌｄｏｌａｓｅ（４２，０００）、ＢＳＡ（７９，０００）からなる。
図５中のレーン１から４は培養上清を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）にて透析することで成熟体としたサンプルを示す。
図５レーン５および６は培養上清を示す。
結果を図５に示す。

・組み換え酵素の回収
２０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）にて透析した酵素液１００ｍｌを冷蔵保存し、同酵素液に対して撹拌しながら１．０ＭＬ／ｈの流速にてアセトンを８０％（Ｖ／Ｖ）となるように添加し、その後３０分撹拌後、遠心分離（１５，０００×ｇ、１５ｍｉｎ）で沈殿として回収した。

表４に、培養上清、透析による成熟タンパク質の調製、アセトン分画によるプロテアーゼの回収結果を示した。

上記の操作により活性体アスパルティックプロテアーゼを得た。
この活性体アスパルティックプロテアーゼが、遺伝子組換えによるアスパルティックプロテアーゼである。

親株から得られる精製酵素溶液は培養液１００ｍｌあたり１５から１６Ｕであるが（Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．９３巻、１３４９から１３５５、２０１３年）、組み換え体では培養液１００ｍｌあたり２２０Ｕの酵素液がえられた。

・活性体アスパルティックプロテアーゼの特性について
先の工程（５）により回収した組み換えＭＫ８２プロテアーゼ（活性体アスパルティックプロテアーゼ）の特性は次の通りである。

既報の方法に従い（前記非特許文献１）、親株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２）由来プロテアーゼと調製したＭＫ８２プロテアーゼについて酵素特性を比較して親株酵素と類似した結果を得た。

表５にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２由来プロテアーゼIIと組み換えＭＫ８２プロテアーゼとの特性比較を示した。
また表６にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＫ８２由来プロテアーゼII（同表中に「プロテアーゼII」と記載した）と組み換えＭＫ８２プロテアーゼ（同表中に「組み換えプロテアーゼ」と記載した）との脱色活性およびプロテアーゼ活性比較を示した。

特に、ミオグロビンやヘモグロビンに対する分解能や脱色活性については親株由来酵素と同程度であった。

組み換えＭＫ８２プロテアーゼの保存性を調べたところ、４℃では１か月以上保存可能であることを確認した。
図９は、組み換えＭＫ８２プロテアーゼを冷蔵庫、３０℃、３７℃、５０℃で放置した際の残存活性を示したグラフである。黒丸（参照符号５）は４℃、白四角（参照符号６）は３０℃、黒三角（参照符号７）は３７℃、白丸（参照符号８）は５０℃における残存活性を示す。
ＭＫ８２プロテアーゼ安定性を継時的に調べた結果を示す（図９）。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ ＭＡ０１９６からのアスパルティックプロテアーゼ遺伝子の発現、組み換えタンパク質の生産

ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ１）プロモーターの制御下でアスパルティックプロテアーゼが発現される発現ベクターの構築

（１）アスパルティックプロテアーゼ遺伝子のクローニング工程
実施例１の場合と同様の操作により実施した。
まずＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）によりプロテアーゼｃＤＮＡを５’および３’末端に制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ（商品名。ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社製）サイト（ＭＡ０１９６株プロテアーゼ用）を付加するように増幅した。
ＰＣＲプライマー用オリゴＤＮＡは表１に示すプライマーを用いた。
鋳型ＤＮＡにはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ ＭＡ０１９６由来のｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙを用い、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した結果、プロテアーゼｃＤＮＡに相当する約１．２ｋｂのＰＣＲ産物を得た。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ ＭＡ０１９６由来ＤＮＡは、プロ配列と成熟タンパク質配列３８６アミノ酸残基をコードする。
このＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ ＭＡ０１９６由来ＤＮＡの遺伝子配列を、配列表番号６として配列表に記載した。
なお本実施例に使用したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ（アスペルギルス グラウカス） ＭＡ０１９６は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０２１２２菌株として寄託されている。

（２）ピキア酵母での異種タンパク質の発現・制御可能なプラスミドの構築工程
ピキア酵母発現ベクターであるｐＰＩＣＺα Ａ（商品名。インビトロジェン社）を前記制限酵素ＫｐｎＩおよび前記制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＭＡ０１９６プロテアーゼ用）で消化して得られた断片に、上記のＰＣＲ産物を同制限酵素で消化したプロテアーゼｃＤＮＡ断片を挿入し、発現ベクターを構築した。
前記発現ベクターは、プロテアーゼｃＤＮＡ、ＡＯＸ１ターミネーター、ゼオシン耐性遺伝子を含んでいる。

（３）前記プラスミドをピキア酵母に導入して形質転換体を調製する工程
ＭＡ０１９６アスパルティックプロテアーゼ発現ベクターを用いて酵母形質転換体を作製した。なお組み換え酵素をＭＡ０１９６プロテアーゼと称する。

ＭＡ０１９６プロテアーゼ発現株の取得、培養条件の検討については、先に説明した実施例１における方法と同様の方法に従った。変更点、相違点を以下に述べる。
ＭＡ０１９６プロテアーゼ発現株の取得にはゼオシン濃度５０ｍｉｃｒｏｇ／ｍｌの選択培地のみを使用し、形質転換体Ｎｏ．５０−５を取得した。

（４）形質転換体を培養してアスパルティックプロテアーゼを産生する工程
アスパルティックプロテアーゼ産生量を向上させる条件を検討した。
先に説明した実施例１における方法と同様の方法により前培養を行い、ＭＭＨ培地、ＢＭＭＨ培地またはＢＭＭＹ培地の３種で検討した。
ＭＭＨ培地およびメタノール無添加のＢＭＧＹ培地では、遺伝子発現はほとんど見られなかった。
一方メタノールを添加したＢＭＭＨ、ＢＭＭＹ培地で培養して得られた培養上清には顕著なプロテアーゼ活性が見られた。
その中でも、ＢＭＭＹ培地では得られた培養上清のプロテアーゼ活性が最も高かった。

表５に、ＭＡ０１９６プロテアーゼ生産形質転換株における酵素生産に与える培地組成の影響試験結果を示した。

培養上清をＳＤＳ-ＰＡＧＥに供したところ、培地の種類によって異なる分子質量のタンパク質バンドが見られ、組換え酵素は翻訳後プロ配列が切断されていない状態で細胞外へ分泌され、自己消化によりプロ配列が切断されると推測された。

図６は、ＭＡ０１９６プロテアーゼ発現形質転換株（Ｎｏ．５０−５）を培養し、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて調べた結果を示したものである。
レーンＭは、分子量マーカーであり、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ＡｎｈｙｄｒａｓｅＩＩ（３０，０００）、Ａｌｄｏｌａｓｅ（４２，０００）、ＢＳＡ（７９，０００）からなる。
またレーン１〜レーン７の内容はそれぞれ次の通りである。
・レーン１：ＭＭＨ培地
・レーン２：ＢＭＭＨ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ４．５）
・レーン３：ＢＭＭＨ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ５．０）
・レーン４：ＢＭＭＨ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ６．５）
・レーン５：ＢＭＭＹ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ４．５）
・レーン６：ＢＭＭＹ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ５．０）
・レーン７：ＢＭＭＹ培地（７ｍｌ／ｔｕｂｅ、ｐＨ６．５）
結果を図６に示す。

先に説明した実施例１における条件と同様の条件でメタノールを添加しながら培養（ＢＭＭＹ培地、７０ｍｌ／５００ＭＬ坂口フラスコ）を行い、培養液を回収後、遠心分離により上清と沈殿に分けた。
メタノール添加を続けながら、形質転換株の培養を継続し、生育と培養上清中のプロテアーゼ活性の推移を調べたところ、定常期に入った培養３日目以降もプロテアーゼの生産は続いた。

図７は、ＭＡ０１９６プロテアーゼ発現形質転換株の生育と培養上清のプロテアーゼ活性を示したグラフである。
培養は、１４０ｒｐｍで振とうしながら、ＢＭＧＹ培地（７０ｍｌ／５００ＭＬ坂口フラスコ）で行い、２４時間ごとに終濃度０．５％となるようにメタノールを添加した。
図７中の黒丸印（参照符号３）は形質転換株の生育量、白丸印（参照符号４）はプロテアーゼ活性を示す。

（５）産生した前記プロテアーゼを成熟化させる工程
ＢＭＧＹ培地（１００ｍｌ／５００ＭＬ坂口フラスコ）にて９日間培養した後、培養上清を回収し２０ ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で透析した。遠心分離により沈殿を除き、上清をＳＤＳ-ＰＡＧＥに供し、成熟タンパク質酵素の単一性を確認した。

図８は、ＢＭＭＹ培地で培養して得られたＭＡ０１９６プロテアーゼ（プロ−成熟タンパク質）とその活性化物（成熟タンパク質）を示しめしたものである。
図８中のレーンＭは、分子量マーカーであり、Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０，０００）、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ＡｎｈｙｄｒａｓｅＩＩ（３０，０００）、Ａｌｄｏｌａｓｅ（４２，０００）からなる。
図８中のレーン１から２は培養上清、レーン３および４は培養上清を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）にて透析することで成熟体としたサンプルを示す。

また、得られたプロテアーゼ総活性に変化はなかった。
結果を表８に示す。

上記の操作により活性体アスパルティックプロテアーゼを得た。
この活性体アスパルティックプロテアーゼが、遺伝子組換えによるアスパルティックプロテアーゼである。

・活性体アスパルティックプロテアーゼの特性について
先の工程（５）により回収した組み換えＭＡ０１９６プロテアーゼ（活性体アスパルティックプロテアーゼ）の特性は次の通りである。

培養条件を検討した結果、ＢＭＭＹ培地（ｐＨ ６．５）が最適で、７日間培養で親株ＭＡ０１９６株の培養系と比較して約１２倍の生産を達成することができた。また、培養上清に含まれる主要なタンパク質もＭＡ０１９６プロテアーゼのみであった。
先に説明した方法に従い、親株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ ＭＡ０１９６）由来プロテアーゼと調製したＭＡ０１９６プロテアーゼについて酵素特性を比較し、至適温度やｐＨについて同程度であることを確認した。
表９にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ ＭＡ０１９６由来プロテアーゼと組み換えＭＡ０１９６プロテアーゼの特性比較をしめす。

また、組み換えＭＡ０１９６プロテアーゼの保存性を調べ、４℃では１か月以上保存可能であることを確認した。

本発明によれば、ミオグロビンやヘモグロビンなどの色素タンパク質の分解と色素タンパク質溶液の脱色ができるアスパルティックプロテアーゼを安定的にかつ大量に製造することができる。

１ 形質転換株の生育量
２ プロテアーゼ活性
３ 形質転換株の生育量
４ プロテアーゼ活性
５ ４℃
６ ３０℃
７ ３７℃
８ ５０℃

Claims (5)

1. （１）アスパルティックプロテアーゼを分泌するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌からアスパルティックプロテアーゼ遺伝子をクローニングする工程と、
   （２）ピキア酵母での異種タンパク質の発現・制御可能なプラスミドの構築工程と、
   （３）前記プラスミドをピキア酵母に導入して形質転換体を調製する工程と、
   （４）形質転換体を培養してアスパルティックプロテアーゼを産生する工程と、
   （５）産生した前記プロテアーゼを成熟化させる工程と、
   を含むことを特徴とする、活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法。
2. 前記アスパルティックプロテアーゼを分泌するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌からクローニングされるアスパルティックプロテアーゼ遺伝子の塩基配列数が９００から１２００ｂｐの範囲である、請求項１に記載の活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法。
3. 前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌が、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−７３菌株として寄託されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｅｐｅｎｓ（アスペルギルス レペンス） ＭＫ８２および同受託番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０２１２２菌株として寄託されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ（アスペルギルス グラウカス） ＭＡ０１９６の少なくとも一方である、請求項１または２に記載の活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法。
4. 形質転換体を培養してアスパルティックプロテアーゼを産生する工程（４）において培養にメタノール水溶液を使用し、前記メタノール水溶液の濃度が０．１〜１．０重量％の範囲である、請求項１〜３のいずれかに記載の活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法。
5. 前記活性体アスパルティックプロテアーゼが、ヘモグロビンおよびミオグロビンの少なくとも一方の分解用活性体アスパルティックプロテアーゼである、請求項１〜４のいずれかに記載の活性体アスパルティックプロテアーゼの製造方法。

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