CN108179153B - 农杆菌eha105介导地细基江蓠繁枝变种转基因方法 - Google Patents

农杆菌eha105介导地细基江蓠繁枝变种转基因方法 Download PDF

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Abstract

农杆菌EHA105介导地细基江蓠繁枝变种转基因方法，涉及细基江蓠繁枝变种转基因的方法。将长外植体培养于含茉莉酸甲酯、激动素、2,4‑D和卡那霉素的MES培养基中诱导愈伤组织，培养后，观察并统计愈伤的诱导率；用接菌环挑取农杆菌EHA105，接种在LB液体培养基中培养，隔天按质量百分比1％～2％接种到新鲜的LB培养基中，振荡培养，进行二次活化；当OD600为0.4～0.5时，收集菌液于无菌离心管中，离心，去上清，用无菌海水重悬，得重悬农杆菌菌液；将获得的愈伤组织接种到重悬农杆菌菌液中培养后，愈伤组织用含羧苄青霉素、卡那霉素的无菌海水清洗后，于荧光显微镜中观察GFP报告基因的表达情况及绿色荧光。

Description

农杆菌EHA105介导地细基江蓠繁枝变种转基因方法
技术领域
本发明涉及细基江蓠繁枝变种转基因的方法，尤其是涉及利用植物激素组合诱导并获得细基江蓠繁枝变种愈伤组织，进一步运用农杆菌EHA105携带GFP报告基因侵染细基江蓠繁枝变种愈伤组织，从而实现GFP基因在细基江蓠繁枝变种愈伤组织中表达的农杆菌EHA105介导地细基江蓠繁枝变种转基因方法。
背景技术
细基江蓠繁枝变种(Gracilariatenuistipitatavar.liui Zhang et Xia)隶属于红藻门真红藻纲、杉藻目、江蓠科、江蓠属；有着适应广、耐高温、生长快、产量高、栽培方法简易的特点；是提取琼胶和卡拉胶的重要工业原料，也是贝类鲍的天然饵料，具有重要的经济价值([1]钟晨辉等.IAA浓度对细基江蓠繁枝变种切段再生芽的诱导效果[J].福建水产.2012，Vol,34No.6)。此外，其在海藻生物修复富营养化水域、防止海区赤潮等方面具有独特的应用价值([2]黄鹤忠等.细基江蓠繁枝变型对水体硝态氮变化的生理响应[J].海洋科学，2006，30(11):32－36)。
随着世界经济的发展，琼脂的需求量逐年增加，天然产的江蓠已经无法满足人们的需求，进行江蓠大规模的人工养殖已迫在眉睫。但江蓠人工养殖过程中容易出现藻种老化、藻体染病和不耐高温等问题，已严重阻碍了江蓠人工养殖的发展。利用分子基因工程技术对江蓠藻种进行品种改良是解决当前江蓠人工养殖所产生问题的有效途径([3]VishalGupta,Manoj Kumar,Puja Kumarietal.Optimization of protoplast yields from thered algaeGracilaria dura(C.Agardh)J.Agardh and G.verrucosa(Huds.)Papenfuss.JApplPhycol(2011)23:209–218；[4]Sook-Yee Gan,Song Qin,Rofina YasminOthmanetal.Transient expression of lacZ in particle bombardedGracilariachangii(Gracilariales,Rhodophyta).Journal of Applied Phycology 15:351–353,2003)。此外，鲍鱼养殖过程中容易发生病害，人们发现通过营养手段提高鲍鱼的抗病能力将是防治鲍鱼病害的有效途径。江蓠作为鲍鱼的天然优质饵料，利用转基因工程技术实现某种功能性外源蛋白(如海洋动物抗菌肽)在江蓠中高效表达，并将转基因江蓠直接喂食鲍鱼将可能提高鲍鱼的抗病能力。然而，目前江蓠的基因工程研究已远远落后于其它大型海洋经济藻类如紫菜等，主要原因在于缺乏一种使用方便和转化率高的遗传转化体系。
发明内容
本发明的目的在于提供利用植物激素组合诱导并获得细基江蓠繁枝变种愈伤组织，进一步运用农杆菌EHA105携带GFP报告基因侵染细基江蓠繁枝变种愈伤组织，从而实现GFP基因在细基江蓠繁枝变种愈伤组织中表达的农杆菌EHA105介导地细基江蓠繁枝变种转基因方法。
本发明包括以下步骤：
1)将长外植体培养于含茉莉酸甲酯(MeJA)、激动素(KT)、2,4-D和卡那霉素的MES培养基中诱导愈伤组织，培养后，观察并统计愈伤的诱导率；
在步骤1)中，所述长外植体可为1～2cm长外植体，所述茉莉酸甲酯可为20uM茉莉酸甲酯，所述激动素可为0.5mg/L激动素，所述2,4-D可为2.0mg/L或1.5mg/L，所述卡那霉素可为200mg/L，所述MES培养基可为21‰MES培养基，所述培养的条件可为20℃，暗，培养21天。
2)用接菌环挑取农杆菌EHA105，接种在LB液体培养基中培养，隔天按质量百分比1％～2％接种到新鲜的LB培养基中，振荡培养，进行二次活化；当OD600为0.4～0.5时，收集菌液于无菌离心管中，离心，去上清，用无菌海水重悬，得重悬农杆菌菌液；
在步骤2)中，所述农杆菌EHA105可携带植物双元表达载体pMC85-GFP质粒DNA单菌落；所述LB液体培养基可接种在5mL含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的LB液体培养基，21‰海水配制中；所述培养可在28℃，200rpm培养过夜；所述新鲜的LB培养基可采用含50mg/L卡那霉素、100uM AS、21‰海水配制中；所述离心可采用6500rpm离心3min；所述用无菌海水重悬可采用等体积的21‰无菌海水重悬。
3)将步骤1)获得的愈伤组织接种到步骤2)中的重悬农杆菌菌液中培养后，愈伤组织用含羧苄青霉素、卡那霉素的无菌海水清洗后，于荧光显微镜中观察GFP报告基因的表达情况及绿色荧光。
在步骤3)中，所述重悬农杆菌菌液可采用含200mg/L卡那霉素、100uM AS，所述培养的条件可抽真空15min，25℃，黑暗，共培养48h；所述愈伤组织用含羧苄青霉素、卡那霉素的无菌海水清洗可采用含250mg/L羧苄青霉素、200mg/L卡那霉素的21‰无菌海水清洗3遍。
所述茉莉酸甲酯对细基江蓠繁枝变种生长具有以下影响：
将采集的细基江蓠繁枝变种清洗藻体，去除藻体表面的杂物，再用无菌海水清洗后培养；所述细基江蓠繁枝变种可从福建东山岛采集；所述清洗藻体可用软毛刷于过滤海水中清洗藻体；从培养的藻体中选取健康生长的藻体，摘取中间部位外植体，无菌海水清洗浸泡；将外植体培养于茉莉酸甲酯(MeJA)的MES培养基中培养后，观察长外植体新生芽的生长情况并统计分析。所述培养可将长外植体培养于含不同浓度茉莉酸甲酯的21‰MES培养基中，MES培养基中含卡那霉素。
本发明以植物表达载体pMDC85-GFP质粒载体中的GFP基因为报告基因，启动子为CaMV 35S；研究发现MES培养基中加入MeJA(茉莉酸甲酯)能显著提高细基江蓠繁枝变种外植体的出芽率，由50％提高到100％，并增加外植体顶端芽的个数；MES培养基中加入20μMMeJA、2.0mg/L 2,4-D、0.5mg/L KT，成功地诱导出了细基江蓠繁枝变种愈伤组织，诱导率为56.98％；农杆菌EHA105(携带pMC85-GFP质粒DNA)与愈伤组织于含100μM AS(乙酰丁香酮)的21‰无菌海水中，25℃，黑暗,共培养48h后荧光显微镜中观察，结果表明GPF基因能够在细基江蓠繁枝变种愈伤组织中表达，表达GFP基因的细胞呈绿色。本发明的建立将为大型经济藻类细基江蓠繁枝变种的分子遗传育种和基因工程开发利用，提供强有力的技术支撑。
附图说明
图1为茉莉酸甲酯对细基江蓠繁枝变种外植体生长的影响(处理前)。
图2为茉莉酸甲酯对细基江蓠繁枝变种外植体生长的影响(0μM MeJA，暗培养14天)。
图3为茉莉酸甲酯对细基江蓠繁枝变种外植体生长的影响(20μM MeJA，暗培养14天，新生芽位于外植体顶端的左右两侧)。
图4为诱导获得的细基江蓠繁枝变种愈伤组织。在图4中，藻段顶端再生部分为诱导的类愈伤组织。
图5为转基因类愈伤组织的GFP荧光检测结果。在图5中，箭头所示为发GFP绿色荧光的细胞。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明实施例包括以下步骤：
1)将长外植体培养于含茉莉酸甲酯(MeJA)、激动素(KT)、2,4-D和卡那霉素的MES培养基中诱导愈伤组织，培养后，观察并统计愈伤的诱导率；所述长外植体为1～2cm长外植体，所述茉莉酸甲酯可为20uM茉莉酸甲酯，所述激动素为0.5mg/L激动素，所述2,4-D可为2.0mg/L或1.5mg/L，所述卡那霉素可为200mg/L，所述MES培养基为21‰MES培养基，所述培养的条件为20℃，暗，培养21天。
2)用接菌环挑取农杆菌EHA105，接种在LB液体培养基中培养，隔天按质量百分比1％～2％接种到新鲜的LB培养基中，振荡培养，进行二次活化；当OD600为0.4～0.5时，收集菌液于无菌离心管中，离心，去上清，用无菌海水重悬，得重悬农杆菌菌液；所述农杆菌EHA105可携带植物双元表达载体pMC85-GFP质粒DNA单菌落；所述LB液体培养基可接种在5mL含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的LB液体培养基，21‰海水配制中；所述培养可在28℃，200rpm培养过夜；所述新鲜的LB培养基可采用含50mg/L卡那霉素、100uMAS、21‰海水配制中；所述离心可采用6500rpm离心3min；所述用无菌海水重悬可采用等体积的21‰无菌海水重悬。
3)将步骤1)获得的愈伤组织接种到步骤2)中的重悬农杆菌菌液中培养后，愈伤组织用含羧苄青霉素、卡那霉素的无菌海水清洗后，于荧光显微镜中观察GFP报告基因的表达情况及绿色荧光。所述重悬农杆菌菌液可采用含200mg/L卡那霉素、100uM AS，所述培养的条件可抽真空15min，25℃，黑暗，共培养48h；所述愈伤组织用含羧苄青霉素、卡那霉素的无菌海水清洗可采用含250mg/L羧苄青霉素、200mg/L卡那霉素的21‰无菌海水清洗3遍。
所述茉莉酸甲酯对细基江蓠繁枝变种生长具有以下影响：
将采集的细基江蓠繁枝变种清洗藻体，去除藻体表面的杂物，再用无菌海水清洗后培养；所述细基江蓠繁枝变种可从福建东山岛采集；所述清洗藻体可用软毛刷于过滤海水中清洗藻体；从培养的藻体中选取健康生长的藻体，摘取中间部位外植体，无菌海水清洗浸泡；将外植体培养于茉莉酸甲酯(MeJA)的MES培养基中培养后，观察长外植体新生芽的生长情况并统计分析。所述培养可将长外植体培养于含不同浓度茉莉酸甲酯的21‰MES培养基中，MES培养基中含卡那霉素。
实验结果表明，茉莉酸甲酯能显著提高细基江蓠繁枝变种新生芽的出芽率，并增加外植体顶端芽的个数，茉莉酸甲酯的最适使用浓度为20uM；不同MeJA浓度处理的外植体出芽情况统计如表1和图1～3所示。
表1
Figure BDA0001530986170000041
以下给出实验结果：
1)愈伤诱导实验结果表明含1～2cm长外植体培养于含20uM MeJA、0.5mg/L KT(激动素)、2.0mg/L 2,4-D的MES培养基中，能够诱导出愈伤组织，愈伤诱导率为56.98％，细基江蓠繁枝变种类愈伤组织的诱导情况统计表如表2、图4所示。
表2
Figure BDA0001530986170000051
2)荧光显微观察结果表明GFP报告基因能在细基江蓠繁枝变种愈伤组织中表达，表达GFP基因的细胞呈绿色，如图5所示。
本发明的建立将为大型经济藻类细基江蓠繁枝变种的分子遗传育种和基因工程开发利用，提供有力的技术支撑。

Claims (4)

1.农杆菌EHA105介导地细基江蓠繁枝变种转基因方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将长外植体培养于含茉莉酸甲酯、激动素、2,4-D和卡那霉素的MES培养基中诱导愈伤组织，培养后，观察并统计愈伤的诱导率；所述长外植体为1～2cm长外植体；所述茉莉酸甲酯为20uM茉莉酸甲酯；所述激动素为0.5 mg/L激动素；所述2,4-D为2.0mg/L，所述卡那霉素为200mg/L；所述MES培养基为21‰ MES培养基，所述培养的条件为20℃，暗，培养21天；
2）用接菌环挑取农杆菌EHA105，接种在LB液体培养基中培养，隔天按质量百分比1%～2%接种到新鲜的LB培养基中，振荡培养，进行二次活化；当OD600为0.4～0.5 时，收集菌液于无菌离心管中，离心，去上清，用无菌海水重悬，得重悬农杆菌菌液；所述农杆菌EHA105携带植物双元表达载体pMDC85-GFP质粒DNA单菌落；所述LB液体培养基是接种在5mL含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的LB液体培养基，21‰海水配制中；
3）将步骤1）获得的愈伤组织接种到步骤2）中的重悬农杆菌菌液中培养后，愈伤组织用含羧苄青霉素、卡那霉素的无菌海水清洗后，于荧光显微镜中观察GFP报告基因的表达情况。
2.如权利要求1所述农杆菌EHA105介导地细基江蓠繁枝变种转基因方法，其特征在于在步骤2）中，所述培养是在28℃，200rpm 培养过夜；所述新鲜的LB培养基采用含50mg/L卡那霉素、100uM AS、21‰海水配制中；所述离心采用6500 rpm离心3min；所述用无菌海水重悬采用等体积的21‰无菌海水重悬。
3.如权利要求1所述农杆菌EHA105介导地细基江蓠繁枝变种转基因方法，其特征在于在步骤3）中，所述重悬农杆菌菌液采用含200mg/L卡那霉素、100uM AS，所述培养的条件抽真空15min，25℃，黑暗，共培养48h。
4.如权利要求1所述农杆菌EHA105介导地细基江蓠繁枝变种转基因方法，其特征在于在步骤3）中，所述愈伤组织用含羧苄青霉素、卡那霉素的无菌海水清洗采用含250mg/L羧苄青霉素、200mg/L卡那霉素的21‰无菌海水清洗3遍。
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