CN101319206A - 在转基因水稻中高效生产木聚糖酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在转基因水稻中高效生产木聚糖酶的方法，本发明的技术方案是构建含有木聚糖酶重组基因的、能在植物中高效表达的载体，利用农杆菌介导转化水稻幼胚或成熟胚诱导形成的愈伤组织，得到转基因植株，使木聚糖酶在转基因植株的茎、叶和种子中表达。采用本发明方法获得的转基因水稻是富含木聚糖酶的饲料稻品种，转木聚糖酶基因水稻的谷粒可用于单胃动物饲料，稻叶和秸秆可以作为反刍动物饲料，可方便直接地用于饲料中而无需在饲料中添加通过发酵技术生产的木聚糖酶添加剂，提高谷物饲料转化效率，大幅度降低饲料成本，经济效益十分显著。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域中利用转基因植物生产酶制剂的方法，尤其是涉及利用转基因水稻生产木聚糖酶的方法。
背景技术
我国是世界上饲料原料需求大国，随着饲料粮总需求量不断增加，其缺口也逐年增大。我国养殖业的能量饲料资源十分短缺，而作为我国大宗粮食作物-水稻的秸秆和谷粒由于富含木聚糖等抗营养因子饲用效率低下。谷物饲料中的木聚糖是一种不能被单胃动物消化吸收的抗营养因子(Bedford，1995；Choct等，1990)，在动物胃肠道的消化吸收过程中与金属离子、蛋白质和一些营养物质结合成不易被吸收利用的物质，不仅增加饲料成本还降低了动物的生产性能。
我国是世界上最大的养殖国之一，动物在将饲料营养转化为畜产品的过程中，有很多食入养分未吸收而被排入到环境中去，对土壤和水源造成巨大污染(N、P的污然最为严重)。我国每年产生禽畜粪便10多亿吨，养殖业对生态环境造成了很大威胁。如何通过饲料改良减轻动物粪便造成的污染问题，是农业和畜牧业可持续发展需要解决的迫切问题。
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)能水解谷物和秸秆中的木聚糖，在半纤维素降解中起着关键作用，可大幅度提高纤维素类物质的利用效率，具有广泛应用前景(Biely，1985；孙建义，1998)。研究表明，在肉鸡饲料中添加含木聚糖酶的酶制剂能提高饲料转化效率和生长速率10％以上，木聚糖酶能提高稻谷不同养分消化率7.16％-96.46％；肉鸡生长速度和饲料转化效率分别提高了17.1-20.0％和15.2-15.9％，并接近玉米饲料水平(李卫芬等，1999；2004；王敏奇等，2003)。木聚糖酶主要作用机理：通过有效降解谷物饲料细胞壁中的木聚糖，使胞内营养物质释放出来，有利于动物消化酶分解；并通过消化酶活性的提高和消化道内容物粘度的降低，维持消化道正常形态结构，提高饲料养分的消化吸收率，减少大肠杆菌数量使畜禽的腹泻率大幅度降低，促进动物健康生长；从而提高
谷物饲料转化效率，接近玉米相同的饲养效果，并大幅度降低饲料成本，提高养殖业的饲料报酬。此外，还具有减少畜禽排泄物中有害物质(氮和磷)排放量和代替抗生素的功效，经济效益十分显著(Bedford，1995；Choct等，1995)。因此世界各国尤其发达国家均普遍使用微生物酶制剂来提高养殖业的经济效益(Cassen，1996；居乃琥，2000)。
目前用于提高饲料利用率的木聚糖酶均来自微生物(Wong等，1988；刘明启等，2004)，一般采用微生物发酵系统生产木聚糖酶，但其使用成本仍然较高，从而制约了木聚糖酶的广泛应用(Kimura等，2003)。
利用植物表达系统生产酶制剂是近年发展起来的生物新技术，主要是采用特异启动子诱导外源重组酶基因在农作物中高效表达，使农作物的茎、叶或种子等组织富含重组酶。利用该技术获得的农作物新品种不仅可大规模生产酶制剂，而且其秸秆和/或种子可加工优质饲料，从而降低养殖业生产成本，大幅度提高生产效率(Goddijin et al.，1995，Hellwig et al.，2004；Whitelam，1995)。
已有的研究表明，利用转基因模式植物-烟草作为生物反应器开展的微生物木聚糖酶基因转导及表达研究已经获得成功(Sun等，1997；Herbers等，1995；1996)。Herbers等人(1995，1996)将热纤梭菌木聚糖酶XynZ和瘤胃微生物木聚糖酶D导入烟草表达，且没有危害烟草的生长。微生物木聚糖酶也在油菜籽中获得了表达，它定位于油菜种子中的油质体膜上，实现了外源基因与植物油体特异调控基因的融合表达(Liu等，1997)。2000年澳大利亚的Patel等人将瘤胃真菌木聚糖酶基因(xynA)导入大麦胚乳中表达，这些研究表明利用微生物木聚糖酶基因在植物中的高效表达来生产木聚糖酶是一条可行的技术途径。但是有关微生物木聚糖酶在其它农作物中表达的研究很少。鉴于水稻是我国重要的农作物，将来源于微生物并经过人工修饰能耐受饲料制粒等高温加工的木聚糖酶重组基因转移到水稻中表达，利用农作物如水稻的稻叶和秸秆来生产饲用酶有广泛的应用前景，迄今为止，在国内外尚未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种在转基因水稻中高效生产木聚糖酶的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种转基因水稻中高效生产木聚糖酶的方法，该方法包括以下步骤：
(1)构建含有木聚糖酶基因的植物表达载体。
(2)用农杆菌介导得到转基因植株，使木聚糖酶基因在转基因植株的种子、茎叶中表达。
进一步地，所述步骤(1)具体为：将木聚糖酶重组基因atx添加Ru3ep片段后，插入到植物表达载体pXYL06上，获得Atx-Ru3ep-pXYL06载体，将载体导入根癌农杆菌EHA105，获得工程菌Atx-EHA105，利用农杆菌介导的遗传转化系统将木聚糖酶基因导入水稻基因组中。所述步骤(2)具体为：利用农杆菌介导的遗传转化系统，将木聚糖酶重组基因导入水稻基因组中，经过抗性筛选、分化和生根培养获得了转基因水稻植株。
本发明的有益效果是，本发明方法将来源于微生物并经过人工修饰能耐受饲料制粒等高温加工的木聚糖酶基因转移到水稻中，并在水稻叶片、茎杆和种子中高效表达，培育富含木聚糖酶的饲料稻品种，可以大量、廉价生产木聚糖酶。而且转木聚糖酶基因水稻的谷粒可用于单胃动物饲料，稻叶和秸秆可以作为反刍动物饲料，而无需在饲料中添加通过发酵技术生产的木聚糖酶添加剂，对于稻谷及其秸秆的开发利用具有重要意义，不仅提高农作物价值，而且可减少作为“胶囊化木聚糖酶”饲料的转基因作物在单位饲料中的使用量，降低饲料成本。无论从经济角度还是使用方便的角度来说，都更具优势。优势如下：1、原材料通过农业方式获得，生产成本低廉，水稻的谷粒和秸秆均可以直接饲喂动物或加工饲料；2、相对于发酵的方法，使用植物生物反应器，无需发酵工艺设备，大大降低资本投资；3、水稻是我国重要的农作物，生产规模可以迅速扩大。
附图说明
图1是表达载体pXYL06的物理图谱；
图2是PCR扩增得到的木聚糖酶基因电泳图谱，图中，1为标准分子量，2为木聚糖酶基因(640bp)；
图3是表达载体的酶切电泳图，图中，1为标准分子量，2为pXYL06质粒，3为pXYL06质粒，4为木聚糖酶基因(640bp)atx-Ru3ep-pXYL06载体BamH I/Pst I双酶切；
图4是用于转化的目的基因电泳图谱，图中，1为marker(100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1500bp、2000bp、3000bp)，2为atx-Ru3ep-pXYL06质粒(转化后的EHA105中抽提)，3为atx-Ru3ep-1301EHA105菌液，4为阳性对照：atx-Ru3ep-pXYL06质粒，5为阴性对照：pXYL06质粒，6为阴性对照：EHA105菌液；
图5是再生植株PCR检测木聚糖酶基因的电泳图，图中，1为marker，2为阳性质粒，3为野生水稻，4-8为转基因水稻；
图6是再生植株RT-PCR检测木聚糖酶基因的电泳图，图中，1为marker，2-3、5-6为转基因水稻，4为野生水稻；
图7是转基因水稻潮霉素快速检测图，图中1为野生水稻，2和4为未转化水稻，3和5-8为转基因水稻；
图8是转基因水稻的形态及木聚糖酶活性图，图中，1-3为转基因水稻，4为野生水稻。
具体实施方式
用植物作为反应器来生产重要的、有经济价值的蛋白质是“分子农业”发展的新趋势。水稻是我国重要的农作物，在已成功构建能编码优良性能木聚糖酶的重组基因基础上(GenBank Accession No.AY858101)，根据植物基因表达特点，构建适合单子叶植物转化的木聚糖酶基因表达载体，以水稻为转基因材料，通过农杆菌介导将已构建的表达载体导入水稻愈伤组织中；经HYG抗性来选择转基因水稻，并采用分子鉴定等技术进行检测，同时分析木聚糖酶的表达水平，获得利用转基因水稻生产木聚糖酶的方法。
本发明在转基因水稻中高效生产木聚糖酶的方法，包括以下步骤：
(1)构建含有木聚糖酶基因的植物表达载体；
本发明的木聚糖酶基因是来源于褐色单孢菌和枯草芽孢杆菌的重组基因，重组基因能较好耐受饲料制粒等的高温，重组基因GenBank登录号为AY858101。
首先构建用于单子叶植物转化的木聚糖酶基因表达载体：以经修饰的重组基因置于组成型启动子(CaMV 35S)驱动之下，表达载体中有报告基因gus和筛选标记基因hyg(潮霉素抗性基因)，携带目的基因的双元表达载体的酶基因末端插入6个his序列，便于木聚糖酶表达产物的纯化。
上述表达载体的构建是通过如下方法完成：木聚糖酶重组基因atx添加Ru3ep片段后(编码基因序列No1，Ru3ep片段序列No2)，插入到植物表达载体pXYL06上，获得Atx-Ru3ep-pXYL06载体，将载体导入根癌农杆菌EHA105，获得工程菌Atx-EHA105，利用农杆菌介导的遗传转化系统将木聚糖酶基因导入水稻基因组中，所选外植体为水稻幼胚或成熟胚诱导形成的愈伤组织。
(2)用农杆菌介导得到转基因植株，使木聚糖酶基因在转基因植株的种子、茎叶中表达。
利用农杆菌介导的遗传转化系统，将木聚糖酶重组基因导入水稻基因组中，经过抗性筛选、分化和生根培养获得了转基因水稻植株。通过PCR、Northern杂交对转化水稻植株进行分子鉴定，验证外源基因已经整合到水稻基因组中。最后对转基因植株进行木聚糖酶的活性分析。
以下五个实施例详细阐明了本发明的具体实施方式。
实施例1：木聚糖酶表达载体的构建
1、材料的准备：
木聚糖酶基因：使用GenBank登录号为AY858101的木聚糖酶基因。
菌种：大肠杆菌E.coli DH5α、根癌农杆菌EHA105。
各种限制性内切酶、
质粒和T-载体购自Promega公司。
化学试剂：酵母浸膏和胰蛋白胨购自OXOID公司，组织培养用试剂购自Sigma公司。其他化学试剂均为国产分析纯。引物合成：上海博亚生物技术有限公司，测序：由上海博亚生物技术有限公司完成。
2、木聚糖酶基因表达载体构建
Ru3ep克隆导入到T-载体上，连接产物转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定测序后得到pGEM E/H，Xba I和Pst I酶切pGEM Ru3ep，Bam HI和Xba I酶切pGEM Atx，分别回收目的片段，将两片段加T4DNA连接酶连接，连接产物转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定测序后得到pGEMAtx E/H。
Bam HI和Pst I酶切pGEM Atx E/H，Bam HI和Pst I酶切pXYL06质粒，琼脂糖电泳回收目的片段，两片段加T4DNA连接酶连接，连接产物转化E.coli感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定测序后得到Atx-E/H-pXYL06载体。
实施例2：遗传转化的前期准备
1.水稻转化起始材料的获得
以水稻幼胚诱导愈伤组织：取水稻未成熟种子(灌浆期)消毒，用镊子夹住种子挤出幼胚，置入N6培养基中，25-28℃暗处培养5天；继代培养时，用镊子剥胚性愈伤组织(去掉芽及膜状物)，置入继代培养基中(突起面向上)，25-28℃暗处培养3天。
以水稻成熟胚诱导愈伤组织：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子消毒，置入N6培养基中，28℃光照培养3周；继代培养时，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织(淡黄色，致密呈球状)，置入继代培养基中，在28℃光照培养1周。
上述水稻幼胚和成熟胚的胚性愈伤均可作为转化起始材料，培养基的配置参照“Plant Cell，Tissue and Organ Culture：fundamental methods”(O.L.Gamborg，G.C.Phillips eds.，Springer)。
2.农杆菌EHA105感受态制备
1)菌单菌落，接种于5ml LB/YEP液体培养基(rif50mg/L)，28℃，200rpm，培养16-24h；
2)取2ml培养物于50ml新的培养基种继续培养到OD800＝0.5左右；
3)5000rpm 4℃离心5min弃上清，回收菌体；
4)10ml预冷的0.1M NaCl悬浮，5000rpm 4℃离心5min，弃上清，回收菌体；
5)2ml预冷的0.05M CaCl2(含甘油0.5ml)悬浮；
6)200ul每管分装，液氮速冻，-80℃保存。
实施例3：农杆菌介导的遗传转化
1、Atx-E/H-1301载体导入农杆菌EHA105
1)从-80℃冰箱中取出200ul感受态细胞农杆菌EHA105，冰浴化开；
2)往200ul感受态细菌中加入3-5ul Atx-Ru3ep-pXYL06Vector质粒，快速轻轻混匀，冰浴静置30min；
3)快速浸入液氮，维持5min，再37℃冰浴5min；
4)加入4倍无抗生素的液体培养基，混匀，28℃摇2-4h；
5)涂布前一般将菌液浓缩为原感受态细胞体积，即4000-5000rpm离心5min，取部分上清，再用枪头吹吸均匀，最后涂布至培养基(rif+，50ug/ml；Km+，50ug/ml)表面。培养前，需28℃正放1h至菌液完全吸收，再倒放48h以上；
6)挑斑摇菌(rif+，50ug/ml；Km+，50ug/ml)，抽质粒做PCR验证。
2、农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆或吸取所保存的农杆菌菌液100ul于5mlYEP(含50mg/l Km和50mg/l Rif)培养液中，28℃，220rpm振荡培养20-24h至菌液OD600的终浓度为0.1-0.8；
3、转化：将摇好的适量农杆菌菌液置于离心管中，4℃，4000rpm，离心2min，去上清。用含乙酰丁香酮200umol/l的AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01；将长到一定大小的水稻胚性愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染约20min；将愈伤组织置于共培养基上(在培养基上铺一层无菌滤纸)，25℃暗培养2-3天。
4、选择培养：将愈伤组织用无菌水清洗5-6次，转入含500mg/l头孢拉定(或头孢噻肟钠)和50mg/l潮霉素的选择培养基上，28℃光照培养2周；将存活的抗性愈伤转到含500mg/l头孢拉定(或头孢噻肟钠)和50mg/l潮霉素的选择培养基上进行第二轮选择，28℃光照培养2周，长出颗粒性的抗性愈伤组织。
5、再生：挑取颜色鲜黄的抗性愈伤，移入装有分化培养基，生长迅速，3-4周后分化成苗。待苗长至1cm左右，放入生根培养基中生根壮苗，即得到再生水稻苗。
实施例4再生植株的检测
1、转基因植株的基因组DNA提取
参照《植物基因工程》中CTAB法提取(王关林、方宏筠主编，2002)
1)取0.2-0.5g新鲜叶片，于含有液氮的研钵内轻轻碾碎冷冻的叶片样品。一旦组织开始融化，加入700μl CTAB提取缓冲液；
2)样品于65℃温育30-60min；然后加入等体积氯仿∶异戊醇∶乙醇混合液混匀的于室温放置15min；12000r/min离心10min；
3)用除去尖端的移液尖头小心地将上层水相移至另一离心管内，务必避免界面蛋白质和底部有机相叶绿素的污染；
4)加入约2/3体积的预冷的异丙醇(-20℃)，小心混匀，放置5min；
5)12000r/min，离心10min，倾去上清，得DNA沉淀；
6)沉淀用70％酒精洗涤两次，离心弃上清；风干后溶于500μl含200μg/LRNase的ddH2O中。加入等体积氯仿∶异戊醇∶乙醇混合液，混匀，12000r/min，离心10min；
7)小心取出上清加入1/10体积的NaAc(pH 5.2)和两倍体积的无水乙醇，混匀。-20℃放置30min；12000r/min，离心5min。去上清；
8)沉淀用70％酒精洗涤，室温干燥后溶于50μl无菌水中，用于PCR检测。
2.再生植株的PCR检测
木聚糖酶基因检测引物：
5RX01：5-AG GAT CCA ACC ATG GCT GTT ACA TCC AAC GAG AC-3
3RX02(30bp)：5-CCT GCA GTC AGT GGT GGT GGT GGT GGT GAC-3
反应体系(50μl)：再生植株DNA 1.0μl；10×PCR buffer 5.0μl；MgCl2；3.0μl；dNTP 1.0μl；5RX011.0ul；3RX011.0μl；Taq酶0.5μl；加水至50μl。
反应条件：94℃，2min；94℃，50s；62℃，50s；(-0.2℃ per cycle)72℃1min；35个循环；72℃延伸10min。筛选出的阳性植株(如图5所示)。
3、转基因水稻植株总RNA的RT-PCR分析
1)水稻总RNA的提取：取基因组DNA的PCR验证为阳性的转基因水稻的叶片50-100mg于研钵中，用液氮浸泡并磨成粉末，转入1.5ml eppendorf管中，加入1ml Trizol试剂，剧烈振荡，放置5min；加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，12000r/min离心30s；取上层水相于一新1.5ml eppendorf中，加0.5ml异丙醇，于-20℃下放置30min，12000r/min离心10min；弃上清液，加1ml 75％乙醇，混合，12000r/min离心2min；弃上清液，室温或真空干燥沉淀，加20-100μl水，于-20℃下贮存。
2)第一链cDNA的合成：采用上海生工生物工程有限公司的MMLV第一链cDNA合成试剂盒，在冰浴的试管中加入如下反应混合物：
轻轻混匀后离心3-5s；反应混合物在70℃下水浴5min后，冰浴30s，然后离心3-5s；将试管冰浴，再加入如下组分：
轻轻混匀后离心3-5s；37℃水浴5min，加入1μl M-MuLV RT(200U/μl)，终体积为200μl；反应混合物37℃水浴60min；在70℃加热10min结束反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。
3)cDNA的PCR分析：利用木聚糖酶基因的特异性引物5RX01和3RX02对cDNA进行PCR分析，PCR的反应体系和反应条件同上，仅是反应的模板换成cDNA。RT-PCR分析检测结果见图6。
结果表明木聚糖酶基因已经整合到水稻基因组中。
实施例5转基因水稻后代中木聚糖酶活性的检测
转基因水稻T0代植株经过分子检测，木聚糖酶基因为阳性的植株自交授粉结实后，所的种子为T1种子。T1种子播种后可以正常萌发、发育成T1植株。对T1植株进行PCR检测，自交授粉，得到T2种子。选择PCR检测木聚糖酶基因为阳性的T1植株用来进行植酸酶活性分析。
1)木聚糖酶活力单位定义：每分钟产生相当于1μmol还原糖(以木糖计)的酶量为1个酶活力单位(U)。
2)试剂：木聚糖和活性亮蓝木聚糖(Remanzol brilliant blue R Xylan，RBB-Xylan)购自美国Sigma公司。
pH 3-7为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，100ml缓冲液按以下比例混匀。
提取缓冲液：(50mM柠檬酸钠pH6，含10mMEDTA，1mMDTT，0.1％Triton)
1％木聚糖，DNS试剂：取50.00g 3，5-二硝基水杨酸溶于400ml水中，边搅拌边加入80.0gNaOH让其溶解，然后渐渐加入150g酒石酸钾钠，加热至45℃，冷却定容至5000ml，放于棕色瓶中，室温保存。
3)β-1，4-内切木聚糖酶活性测定参见文献Bailey et al.(1989)。用桦木木聚糖为底物，用DNS法测定β-1，4-内切木聚糖酶活性。β-1，4-内切木聚糖酶活性测定：在试验管和空白管中各加入1.8ml木聚糖底物，在一定温度下水浴中预热5min；在试验管中加200μl样品摇匀；精确反应10min后，两个管中都加入3.0ml DNS试剂。在空白管中再加入200μl样品。将两个试管同时沸水浴5min，取出试管，冷却至室温；然后以空白为对照在540nm处测定样品的吸光值。根据标准曲线上计算酶活。
4)准曲线制作：配制好10μmol/ml木糖母液(150mg木糖溶解于合适缓冲液中，定容至100ml)。用相应缓冲液稀释母液，使之成为0～10μmol/ml木糖浓度的标准液，每个标准液做三个重复，各试管中加入1.8ml底物，再加200μl标准稀释液，后面操作步骤和样品测定相同。空白为加入200μl相应缓冲液而代替加入200μl标准液。
5)转基因水稻叶片木聚糖酶活性的测定，取0.2g叶片加液氮研磨，加入1ml提取缓冲液，15,000g离心10分钟，上清也既为酶的粗提液。
6)木聚糖酶活性测定结果显示转基因水稻中木聚糖酶活性比未转基因对照高出10倍，表明木聚糖酶基因在水稻叶片中表达。进一步选育稳定遗传的、高表达木聚糖酶活性的水稻新种质材料，供水稻育种和生产使用。
Claims (3)
1、一种在转基因水稻中高效生产木聚糖酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)构建含有木聚糖酶基因的植物表达载体。
(2)用农杆菌介导得到转基因植株，使木聚糖酶基因在转基因植株的种子、茎叶中表达。
2.根据权利要求1所述的在转基因水稻中高效生产木聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：将木聚糖酶重组基因atx添加Ru3ep片段后，插入到植物表达载体pXYL06上，获得Atx-Ru3ep-pXYL06载体，将载体导入根癌农杆菌EHA105，获得工程菌Atx-EHA105，利用农杆菌介导的遗传转化系统将木聚糖酶基因导入水稻基因组中。
3.根据权利要求1所述的在转基因水稻中高效生产木聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：利用农杆菌介导的遗传转化系统，将木聚糖酶重组基因导入水稻基因组中，经过抗性筛选、分化和生根培养获得了转基因水稻植株。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102577948A (zh) * | 2012-02-07 | 2012-07-18 | 浙江大学 | 一种改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法 |
| CN105120657A (zh) * | 2013-02-28 | 2015-12-02 | 云火公司 | 重组植物细胞、其制备方法以及用其生产靶蛋白质的方法 |
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2008
- 2008-07-08 CN CNA2008100630551A patent/CN101319206A/zh active Pending
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