CN110317820B - 一种α-半乳糖苷酶LrgalA基因 - Google Patents

一种α-半乳糖苷酶LrgalA基因 Download PDF

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Abstract

本发明涉及α‑半乳糖苷酶技术领域，具体地，涉及一种α‑半乳糖苷酶LrgalA基因及以及含该基因的重组质粒和重组菌及其构建方法。所述α‑半乳糖苷酶LrgalA基因的核苷酸序列如SEQUENCE ID NO.3所示。在50℃条件下，所述α‑半乳糖苷酶的在pH4.5‑6.0之间都具有较高的活性，在pH为6.0时，即达到最高酶活，pH为6.5时还保留75％以上的酶活力；在pH为6.0条件下，α‑半乳糖苷酶活力在温度为65℃时达到最大值，到60‑70℃时酶活力含具有80％以上的相对酶活力，超过75℃检测，相对酶活力急剧下降。α‑半乳糖苷酶LrgalA具有较好的热稳定性，60℃处理0.5h后，残留约85％酶活力，该酶热稳定性较好。该酶和甘露聚糖酶协同能够有效的提高富含富含甘露聚糖原料的降解，提高还原糖的释放。

Description

一种α-半乳糖苷酶LrgalA基因
技术领域
本发明涉及α-半乳糖苷酶技术领域，具体地，涉及一种α-半乳糖苷酶编码LrgalA基因及利用该基因生产新型α-半乳糖苷酶的方法，以及该α-半乳糖苷酶在降解饲料上的应用。
背景技术
α-半乳糖苷酶广泛存在于真菌、细菌、植物和人体中。α-半乳糖苷酶能催化水解含有α-连接的末端非还原D-半乳糖的低聚多糖、脂多糖和多聚糖。
目前，玉米豆柏型饲料是我国主要饲料，该饲料中含有高达10％～20％的果胶质和α-半乳糖苷类物质等抗营养困子。由于动物体肠胃道内缺乏分解α-半乳糖营类物质的酶，动物无法消化吸收饲料中的α-半乳糖苷类物质。α-半乳糖苷类物质一方面会增加小肠内容物的渗透性和保水性：另一方面α半乳糖苷类物质被消化道后段的厌氧菌代谢产生氧气、二氧化碳及少量的甲皖气体，这些气体会引起动物胀气、恶心、下痢等影响动物的采食量。目前，去除玉米豆柏型饲料中α-半乳糖苷类物质等抗营养因子的方法主要有三种：l植物育种时利用技术手段剔除生成这种寡糖的基因。2.利用乙醇提取去除棉子糖类寡糖。3.加入外源性的微生物α-半乳糖背酶降解玉米豆柏型饲料中α-半乳糖苷类物质。由于人们对转基因技术在农作物应用上存在较大质疑，且不能大规模的生产寡糖缺失转基因改良大豆：通过物理或化学的加工工艺来消除豆柏中的低聚寡糖，不仅导致豆柏的营养流失还耗时耗力，大大增加了饲料的生产成本。而通过在玉米豆柏型饲料中添加α-半乳糖苷酶，除了可以降解不溶性的低聚糖、提高饲料利用率外，还能有效的消除肠道胀气从而提高动物采食量。已有研究表明，在饲养中添加α-半乳糖苷酶后，能够提高动物的的日平均增重重量。
因此，研究α-半乳糖苷酶，优化α-半乳糖苷酶基因的表达和提高α-半乳糖苷酶生产还原糖的效率具有极大的市场价值。
发明内容
为此，本发明提供了一种优化的α-半乳糖苷酶LrgalA基因，利用该基因生产新型α-半乳糖苷酶的方法，以及该α-半乳糖苷酶在降解饲料上的应用。
本发明的技术方案如下：一种α-半乳糖苷酶LrgalA基因，所述基因的核苷酸序列如SEQUENCE ID NO.3所示。
一种重组质粒，包含如SEQUENCE ID NO.3所示的基因，所述重组载体为重组pPICZaA质粒，所述基因插入所述pPICZaA质粒的多克隆位点。
一种重组菌，包含上述的重组质粒。
所述重组菌为重组毕赤酵母X33菌株。
一种上述的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
1)密码子偏好性优化：对α-半乳糖苷酶LrgalA的核苷酸序列SEQUENCE ID NO.2根据酵母菌的密码子偏好性进行改造，获得在酵母菌内高效表达的人工核苷酸序列SEQUENCEID NO.3；
2)pPICZaA表达载体构建：以质粒pPICZaA为载体，将核苷酸序列SEQUENCE IDNO.3插入启动子AOX1下游，5'端酶切位点为EcoR I，3'端酶切位点为Not I，构建pPICZaA-LrMan5B表达载体。
一种α-半乳糖苷酶LrgalA的体外表达方法，所述α-半乳糖苷酶LrgalA的核苷酸序列如SEQUENCE ID NO.2所示，包括如下步骤：
1)密码子偏好性优化：对α-半乳糖苷酶LrgalA的核苷酸序列SEQUENCE IDNO.2根据酵母菌的密码子偏好性进行改造，获得适宜在酵母菌内高效表达的核苷酸序列SEQUENCEID NO.3；
2)pPICZaA表达载体构建：以质粒pPICZaA为载体，将核苷酸序列SEQUENCE IDNO.3插入启动子AOX1下游，5'端酶切位点为EcoR I，3'端酶切位点为Not I，构建pPICZaA-LrgalA表达载体；
3)重组蛋白表达：将所述的pPICZaA-LrgalA表达载体线性化，电转导入处于化学感受态的表达菌株Pichia pastoris X33，形成重组表达菌株pPICZaA-LrMan5B-Pichiapastoris X33，挑选高效表达的阳性克隆进行培养，并利用甲醇诱导重组表达菌分泌表达α-半乳糖苷酶LrgalA。
上述的α-半乳糖苷酶LrgalA在降解棕榈粕上的应用，α-半乳糖苷酶LrgalA和β-甘露糖苷酶协同降解棕榈粕。
所述的α-半乳糖苷酶LrgalA在降解饲料上的应用，α-半乳糖苷酶LrgalA和β-甘露糖苷酶协同降解饲料。
本发明的有益效果为：本发明提供了所述编码α-半乳糖苷酶的基因，以及含该基因的重组质粒和重组菌，该重组质粒的构建方法，α-半乳糖苷酶的体外表达方法，以及利用该α-半乳糖苷酶水解生产还原糖的应用。在50℃条件下，所述α-半乳糖苷酶的在pH4.5-6.0之间都具有较高的活性，在pH为6.0时，即达到最高酶活，pH为6.5时还保留75％以上的酶活力；在pH为6.0条件下，α-半乳糖苷酶活力在温度为65℃时达到最大值，到60-70℃时酶活力含具有80％以上的相对酶活力，超过75℃检测，相对酶活力急剧下降。α-半乳糖苷酶LrgalA在pH为3.0-8.0条件下能残留50％以上的活力。α-半乳糖苷酶LrgalA具有较好的热稳定性，60℃处理0.5h后，残留约85％酶活力，该酶热稳定性较好。本发明中α-半乳糖苷酶和β-甘露糖苷酶协同分解棕榈粕提高还原糖的释放量，这表明α-半乳糖苷酶LrgalA在饲料工业中提高饲料的利用率上具有重要的意义。
附图说明：
图1是质粒pPICZaA-LrgalA的双酶切的产物在琼脂糖凝胶上电泳检测结果图。泳道M为DNA分子量Marker,其条带分子量自上向下依次为5000bp,3000bp，2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500b,250bp和100bp。泳道1为所述质粒pPICZaA-LrgalA的酶切的产物，其中，1500bp至1000bp之间的条带为质粒pPICZaA的DNA片段，1000bp至750bp之间的条带为LrgalA的DNA片段。泳道1为质粒pPICZaA的DNA片段。
图2是质粒pPICZaA-LrgalA图谱。
图3是α-半乳糖苷酶LrgalA的SDS-PAGE图；质粒pPICZaA-LrgalA导入毕赤酵母后，毕赤酵母表达产物的SDS-PAGE检测结果图。图3中Marker为蛋白质分子量，最左侧数字标示了Marker泳道的蛋白质条带的分子量；泳道1为含有LrgalA基因编码的α-半乳糖苷酶的毕赤酵母表达菌株发酵液，泳道2为纯化后的LrgalA基因编码的α-半乳糖苷酶。
图4为在50℃下，pH值对α-半乳糖苷酶的酶活力的影响的检测结果图。横坐标代表pH值，纵坐标代表相对酶活力，以最高酶活组结果为100％。
图5为温度对α-半乳糖苷酶酶活力的影响的检测结果图，横坐标代表温度值，纵坐标代表相对酶活力，以最高酶活组结果为100％。
图6为pH值对α-半乳糖苷酶的稳定性的影响的检测结果图，横坐标代表pH值，纵坐标代表残留相对酶活力，以不处理组的酶活为100％。
图7为α-半乳糖苷酶温度耐受性的测定的结果图，横坐标代表温度值，纵坐标代表残留相对酶活力，以不处理组的酶活为100％。
图8为在5L发酵罐小试中不同时间下检测α-半乳糖苷酶活力。横坐标代表时间，纵坐标代表酶活力。
图9为LrgalA序列优化前后比对。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的，技术方案及技术效果更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。应理解，此处所描述的具体实施例，仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。
实施例1α-半乳糖苷酶LrgalA基因的挖掘
本实例通过对Genbank中记载的基因组数据挖掘分析，得到编码α-半乳糖苷酶LrgalA的核酸序列LrgalA，如Sequence ID NO.2所示。其编码的蛋白质序列如SEQUENCE IDNO.1。该序列SEQUENCE ID NO.1是一种新型糖基水解酶36家族α-半乳糖苷酶，由713个氨基酸组成。根据如下表1所示的毕赤酵母密码子频率表，通过基因优化合成获得适合在毕赤酵母中表达的编码α-半乳糖苷酶LrgalA的优化核酸序列，LrgalA-OPT序列如Sequence IDNO.3所示。优化前后，核苷酸序列的一致性为74.8％,如图9所示。
表1毕赤酵母密码子频率表
实例2α-半乳糖苷酶LrgalA表达载构建
根据Sequence ID NO.3设计PCR引物，在上游PCR引物的5’端和下游PCR引物的3’端分别添加限制性内切酶EcoR I和Not I的酶切位点，PCR引物序列如下:
LrgalA-F正向引物:5’-ctagaattcGCTTTGGACGTTGGTATCC-3’
LrgalA-R反向引物:5’-atagcggccgcTTAGTCGTAGGACTCCTTCAA-3’
通过PCR基因扩增后，将PCR产物和载体质粒pPICZaA通过限制性内切酶EcoR I和Not I分别消化，回收纯化后，在T4连接酶的作用下，连接产物转化大肠杆菌进行增殖。提取质粒，用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，酶切后的产物在琼脂糖凝胶上电泳检测,如图1所示。验证正确质粒即为阳性克隆，命名为质粒pPICZaA-LrgalA。图谱如图2所示。
实施例3表达LrgalA基因编码的的α-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母的构建与验证
挑取生长良好的毕赤酵母单菌落，接种到装20mL YPD培养基的100ml三角瓶中，30℃培养24h，然后将培养液以1％的接种量转接到100mLYPD培养基的500mL摇瓶中，30℃、250rpm培养至OD600＝1.2-1.5；将培养液于4℃、1500g离心5min收集菌体，用预冷的无菌水重悬菌体。如上离心，用20mL预冷的1M山梨醇洗酵母细胞两次。用0.25mL预冷的1M山梨醇重悬酵母细胞，即为酵母感受态细胞。取100μL酵母感受态细胞与2μL约1μg线性化质粒pPICZaA-LrgalA混合转入预冷的电转杯中。冰上放置5min。按装置推荐的真核细胞转化参数(电压1.5kV、电阻200Ω、电容25μF、电击时间为4～10msec)电击。立刻加入1mL预冷的1M山梨醇，转入灭菌的离心管中取适量菌液涂布YPDS平板上，30℃恒温孵育直至2天后单菌落出现。
随机挑取YPDS平板上长出的毕赤酵母单菌落，提取总DNA，以5’AOX和3’AOX为引物，进行PCR鉴定重组子。5’AOX和3’AOX引物序列如下：
5’AOX：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’
3’AOX：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’
PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳检测,检测结果为阳性，证明线性化质粒pPICZaA-LrgalA已成功整合至毕赤酵母X-33基因组上。
实施例4重组α-半乳糖苷酶LrgalA的表达与纯化
挑取实施例3中验证后的生长良好的表达菌株，接种至含5mLBMG的指形瓶中，30℃震荡过夜。将培养过夜的菌液转接至含有50mL YPDG的500mL三角瓶内，用八层纱布封口，保证良好的透气环境，在28℃、250rpm培养过夜。取培养过夜的菌液1500g，离心3min，用50mL新鲜的BMMY培养基重悬于500mL三角瓶中，用八层纱布封口，在28℃、250rpm振荡培养。每隔6h加入甲醇，至甲醇终浓度为0.5～1.0％。每12h取适量培养液测定OD600值以及酶活力，以确定重组蛋白表达的最佳收获时间。将发酵产物6000rpm离心10min，过HITRAP Q FF层析柱层析，通过SDS-PAGE检测分析纯化产物。如图3所示，泳道1为α-半乳糖苷酶LrgalA表达菌株发酵液，泳道2为纯化的α-半乳糖苷酶LrgalA，泳道1和泳道2在40KDa附近有明显条带，与预期大小相符，表明LrgalA在毕赤酵母中成功表达。
经过一级种二级种后，将重组毕赤酵母接种于BSM发酵培养基，培养24h，继续补料甘油，培养至菌体OD值达到300；进行甲醇诱导5天，使重组毕赤酵母生产α-半乳糖苷酶从发酵液中分离α-半乳糖苷酶液，并通过喷雾干燥制备固体α-半乳糖苷酶制剂备用。
实施例5LrgalA酶学特性的研究
5.1LrgalA酶活测定：以15mM对硝基苯酚-α-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)溶液为底物测定α-半乳糖苷酶活力：
空白测定：取200μL 15mM对硝基苯酚-α-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)，在65℃水浴预热3min，加入50μL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)，于65℃准确反应10min，加入750uL 2MNa2CO3终止反应，使用分光光度计测定OD410值。
样品测定：取200μL 5mM的对硝基苯基β-D-木糖苷，在65℃水浴预热3min，加入50μL适当稀释的酶液，于65℃准确反应10min，加入750uL 2M Na2CO3终止反应，使用分光光度计测定OD410值。
计算公式如下(1)
8.1α-半乳糖苷酶活计算公式
U＝(aΔOD+b)/(V*T)*D
U：α-半乳糖苷酶酶活U/mL；
aΔOD+b：对硝基酚含量μmol；
D：稀释倍数；
V：反应液体积ml；
T：反应时间
同一试样三个平行测定值的相对误差不超过8.0％。
酶活力单位(U)的定义为在最适测定条件下，每分钟生成1μmol的pNP所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
5.2pH和温度对LrgalA酶活力的影响
测定酶在50℃下，不同pH(3.0～8.0)下缓冲液的酶活力。pH3.0～8.0，使用0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
确定最适pH后，在酶最适pH条件下测定不同温度(30～80℃)下的酶活力，确定酶的最适作用温度。
结果如图4所示，该α-半乳糖苷酶在4.5-6.5之间都具有较高的活性，在pH为6.0时，即达到最高酶活，随在pH为6.5时还保留75％以上的酶活力。
图5所示，α-半乳糖苷酶LrgalA在温度为65℃时达到最大值，到60-70℃时酶活力含具有80％以上的相对酶活力。超过75℃检测，相对酶活力急剧下降。
5.3α-半乳糖苷酶LrgalA pH耐受性的测定
将酶保存在不同pH值的缓冲液中，室温保存12小时，最适作用pH6.0和最适作用温度65℃条件下测定酶活力，缓冲液为0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，反应时间5min。
图6所示该酶在pH 3.0-8.0的范围测定α-半乳糖苷酶LrgalA的pH稳定性，如图6所示，α-半乳糖苷酶LrgalA在pH为3.0-8.0能残留50％以上的活力。
5.4α-半乳糖苷酶LrgalA温度耐受性的测定
将α-半乳糖苷酶LrgalA在不同温度下(30～80℃)保存30min，在最适pH5.0和最适温度65℃条件下测定酶活力。
图7表明，α-半乳糖苷酶LrgalA具有较好的热稳定性，60℃处理0.5h后，残留约85％酶活力，该酶热稳定性较好。
实施例6α-半乳糖苷酶LrgalA表达菌株5L-发酵罐高密度发酵
经过一级种二级种后，将重组毕赤酵母接种于BSM发酵培养基，培养24h，继续补料甘油，培养至菌体OD值达到300；进行甲醇诱导5天，使重组毕赤酵母生产α-半乳糖苷酶。图8表明α-半乳糖苷酶LrgalA表达菌株5L-发酵罐高密度发酵经甲醇诱导4.5天后产酶达1085U/ml。
实施例7α-半乳糖苷酶LrgalA与β-甘露聚糖酶LrMan5B协同水解棕榈粕,其中β-甘露糖苷酶LrMan5B的获取见申请号为CN201710665651.6的中国发明专利文献。
分别取三只50ml的离心管，每个离心管中装有7ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲，pH5.5，加入0.05g棕榈粕粉(过60目筛)，震荡均匀。一个离心管加入900U的β-甘露聚糖酶LrMan5B基因编码的β-甘露聚糖酶，另一个离心管钟加入10Uα-半乳糖苷酶LrgalA，第三个离心管中同时加入900U的β-甘露聚糖酶LrMan5B基因编码的β-甘露聚糖酶和10Uα-半乳糖苷酶LrgalA。用缓冲液将三个离心管的最终反应体系调整为10ml。在55℃下作用3h。然后将反应物置于沸水中煮沸10min终止反应，室温冷却，12000rpm离心20min。用DNS法检测还原糖。
DNS法检测还原糖方法：
(1)取2ml适当稀释酶解反应液上清和3ml DNS试剂于洁净的试管，沸水浴中反应5min。
(2)冷却后，在分光光度计540nm处比色，测定OD值。根据甘露糖标准曲线，计算酶解反应生成的还原糖。
同一试样设三个平行测定值。
酶的协同率为两个酶同时添加还原糖的生成量比二者单独添加时还原糖的生成量之和。
表3LrMan5B基因编码的β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶LrgalA协同分解洋槐豆胶检测结果
结果如表3所示，当只添加β-甘露聚糖酶LrMan5B，还原糖生出来生产量为40.34mg，而添加β-甘露糖苷酶的同时添加α-半乳糖苷酶LrgalA时，还原糖糖的含量达69.55mg，还原糖的生成量提高1.34倍，表明α-半乳糖苷酶LrgalA在饲料生产中能够提高富含还原糖的原料-棕榈粕的还原糖的释放，提高饲料的利用率。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
序列表
<110> 东莞泛亚太生物科技有限公司
<120> 一种α-半乳糖苷酶LrgalA基因
<140> 2018113098932
<141> 2018-11-06
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2142
<212> DNA
<213> α-半乳糖苷酶基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atggtgacaa agaagtctac atacgtggtt ggtgctacag cagatggata tgttatcaac 60
cttcactggg gaaagcgttt gacacaactt gatgacttga atgcaactgt acctttgagt 120
gatcaatcac agaatccacc aattagctat gccatggaag aattaccagc ttttggtgga 180
ctaagatatc gtgacaacgt gctcaaggtg gatttaccag atgggactcg tgaactgaat 240
ttgctgtatt caggagcaaa gagcaaggat gatactcttc ttgatatcga gctgtccgat 300
ggcaaccgta ccgatttcaa ggtgacactg cactatgaac tggacactga gaacgatatg 360
atacgtcgat cgtatactgt tgagaatgga ctgaagggtc gtgtcaacct tgacttggca 420
ttgtcagctg catggcatcc accaacagca cttgacgttg acgagaaacg agagttactg 480
acattggcag gcgaatggaa caatgaagca caagtacaat caaccgagtt gaagcctggc 540
atagcccata cgatccagac acccaaagga tttactgatc atgtgtcata tccatacttt 600
gccatcagac aagtaccaag tgaagtgaat cctggcactg aagtttactt tggtactctt 660
gcatggggag gtagttggga gattacagca cataccaaca cctatggcta tactcgtatc 720
actggtggca tgcatcatct tgattttgga tggacacttg aaccaggaga atcattcaca 780
acaccagtgt ttattgctgg attcacagat gaaggcttac caggcgcacg tagacgctta 840
ccacgtcatg ctcgaaagta tcagcaattg agcctgcaga cacaaaagaa tgacagtctt 900
tatcatcctg ttctttacaa ctcttgggaa gctgttactt ttgatgtcac ttttgacaag 960
caagttgcct tggctgaaaa agctgctcca cttggtgttg aattatttgt tattgatgat 1020
ggctggtttg gggatcgtaa caacgactct gcaggattag gagattggta tcccaacaag 1080
gaaaagttcc caaatggtct caagcccctt gcagaccatg tgcatgatct cggcatgcag 1140
tttggcgtgt ggtttgaacc cgagtcggtc aatcccaatt ccaatcttta tcgtgaacat 1200
cctgattggg tgctttatta tgacggtgtc ccaagatacg aagcacgtaa tcagctgtta 1260
ctcaaccttg gattaccaga agtgcaagat tacatttatg atcatgtgag cagcatcatt 1320
gaagagaatg atattgacta tatcaagtgg gatatgaatc gaccctatca aggcgttact 1380
atgcatcatt atgatagaaa tcctcgagaa gcatgggtgc tgattgcgcg tggatatcaa 1440
aatttgctag ccaagctcaa gaaacgattt cccaatctgt ggattgaaag ctgtgctagt 1500
ggtggtggac gtatggatct cagtgtgctt gaacatgctg atcaagtttg gaccagtgac 1560
aatacaagac ctgatgctcg tcttaagatt caatatggtg cttcattgtt tttgcctcca 1620
agagccatgt atggttgggt gactgaaagt ggggatgata acaatgtgca cataccttta 1680
tccttccggt tccacacatc tttcatgggt ggccttggta ttggtgccaa cttgaacaag 1740
tactcagacg atgatatgaa agagagcaca gcttggattg cattgtataa gaagcttcga 1800
ccagtgattc aaaatggtga tctcgattgg ttagtgccac cttcaaaggt tggtgaaatg 1860
attgctgtat cccagacaac atcaaaggat caacaagaag cagtgatctt ggcattccga 1920
atcagcagcc ctttttcagc tccaatgaat ccagtacgac cacgttttct caaggatgat 1980
gtagtatatc gggttcaaat ctggttacag gatccacaca aggttgctga agaatacgac 2040
atgtctggtg ctttactcat gcacaaggga attagtcttg atggattgaa tagagccatg 2100
tttactagtg cagttgttta tttgaaagag tcatacgatt aa 2142
<210> 2
<211> 2142
<212> DNA
<213> α-半乳糖苷酶基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
gctttggacg ttggtatcca caagcatcca tccttcgaga cttggttcct ggtcaccaag 60
aagtccactt acgttgttgg agctaccgca gacggttacg ttatcaacct gcattggggt 120
aagcgtctga ctcaactgga cgacttgaac gctaccgttc cattgtccga ccaatctcaa 180
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ggagctaagt ctaaggacga cactttgctg gacatcgagt tgtcagacgg taacagaacc 360
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gagtggaaca acgaagctca agttcagtcc accgaattga agccaggtat cgctcatacc 600
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aagctgaaga agcgtttccc taacttgtgg atcgagtctt gcgcttcagg aggaggtaga 1560
atggacttgt ccgtcttgga acacgcagat caggtttgga cttccgataa caccagacca 1620
gacgctagac tgaagatcca atacggagct tccctgttct tgccacctag agctatgtac 1680
ggttgggtta ccgagtcagg agacgataac aacgtccaca tcccattgtc cttccgtttc 1740
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gacatgaagg agtctacagc ttggatcgct ctgtacaaga agctgagacc agtcatccag 1860
aacggagact tggattggtt ggttccacca tctaaggtcg gagagatgat tgccgtttcc 1920
caaactacct ccaaggacca acaagaggct gttatcctgg ctttcagaat ctcctcccca 1980
ttctcagctc caatgaaccc agtcagacca agattcctga aggacgacgt cgtctacaga 2040
gttcagattt ggctgcagga cccacataag gttgcagaag agtacgatat gtccggtgct 2100
ttgttgatgc acaagggtat ttccctggac ggtttgaaca gagctatgtt cacctccgca 2160
gttgtttact tgaaggagtc ctacgactaa 2190

Claims (1)

1.一种α-半乳糖苷酶LrgalA和β-甘露糖苷酶在协同降解棕榈粕上的应用，其特征在于，所述α-半乳糖苷酶LrgalA基因的核苷酸序列如SEQUENCE ID NO.3所示。
CN201811309893.2A 2018-11-06 2018-11-06 一种α-半乳糖苷酶LrgalA基因 Active CN110317820B (zh)

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全国饲料工作办公室 等.《2010 中国饲料工业年鉴》.中国商业出版社,2011,第101页. *

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