CN107164398B

CN107164398B - 一种重组α-半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN107164398B
Application number: CN201710522450.0A
Authority: CN
Inventors: 朱廷恒; 潘艳青; 潘籽龙; 孙徽; 汪琨; 王渭霞
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Ningxia ranzhize Food Co., Ltd
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2020-05-26
Anticipated expiration: 2037-06-30
Also published as: CN107164398A

Abstract

本发明公开了一种重组α‑半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。酿酒酵母是食品安全菌，构建的重组α‑半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌产α‑半乳糖苷酶，可以进行豆类、糖蜜的发酵加工，可以去除发酵原料中的抗营养因子不良寡糖，提高食品、饲料的营养价值和消化吸收率，提高资源的利用率。酿酒酵母中转入的α‑半乳糖苷酶源于嗜热真菌米赫根毛霉(R.miehei)，有一定的热稳定性。本发明的工程菌产生的重组α‑半乳糖苷酶则有一定的热稳定性，其最适温度在60℃，在60℃水浴80min后还可以保持80％的活性。

Description

一种重组α-半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种重组α-半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用，该菌株或产生的酶可以应用于饲料、食品中的抗营养因子的降解，应用于造纸工业中的纸浆预处理、临床医疗中的器官移植或血型改造等。

(二)背景技术

大豆是重要的食品原料，可以加工成豆奶等营养丰富的食品。豆粕是大豆工业的主要固态副产物，是我国非常重要的饲料原料之一。但是，大豆中含有大量的难以消化的不良寡糖，如棉子糖、水苏糖等α-半乳寡糖。这些不良寡糖是抗营养因子，不能很好地被人或动物吸收利用，而在肠道中经过厌氧发酵产生大量气体，引起腹胀、腹泻、胃肠痛等现象。

甘蔗糖蜜是蔗糖生产过程的副产物，其中含有大量的糖分，常被用作工业微生物发酵的培养基碳源。利用糖蜜发酵生产有用的物质不仅可以解决蔗糖生产污染环境问题，而且能够实现资源化利用，具有重要的意义。但是，甘蔗糖蜜还含有一部分不能被酿酒酵母等食品级生物安全微生物利用的糖分，主要由蜜二糖、棉子糖、水苏糖等构成，通常占甘蔗糖蜜总重量的5％。

α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)，是一种可以催化α-半乳糖苷键的水解的外切水解酶，催化移除不同底物中α-连接的末端非还原D-半乳糖，水解棉籽糖、水苏糖、半乳甘露聚糖及半乳糖脂等。因此，该酶可以消除豆粕、糖蜜中的棉籽糖和水苏糖等抗营养因子，可以作为添加剂应用于食品、饲料工业，提高食品或饲料的消化吸收率和营养价值。

此外，α-半乳糖苷酶还可以用在医疗、造纸业中。细胞溶酶体内α-半乳糖苷酶酶活降低可以引起一种的罕见的遗传性疾病Fabry病。目前，对该病进行α-半乳糖苷酶替代疗法疗效可以得到增强。α-半乳糖苷酶还可以用来水解抗原、改造血型，从而降低异种器官移植、输血过程中的免疫排斥反应。而在造纸工业中，α-半乳糖苷酶可以水解软木中的半纤维成分半乳葡聚甘露聚糖，分离出其中的α-半乳糖，对纸浆预处理有一定的作用。

α-半乳糖苷酶在植物(水稻、豆芽、咖啡豆、葡萄等)、细菌(链霉菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、双歧杆菌和巨大芽孢杆菌)中、真菌(根霉、青霉、黑曲霉、米曲霉)等生物中存在。但是，在酿酒酵母、乳酸菌等常用的食品安全级的微生物中，酶活很低，甚至没有该酶。因此，将其他生物来源的α-半乳糖苷酶基因克隆，利用基因工程技术转入酵母菌等，然后进行食品、豆粕的发酵加工，不仅可以去除不良寡糖抗营养因子，还可以提高益生菌的数量，提高食品、饲料品质。此外，转α-半乳糖苷酶基因的酵母菌在培养的时候，可以充分利用糖蜜中的难发酵糖，提高资源利用率。虽有将α-半乳糖苷酶转入毕赤酵母的报道(CN105219791A)，但是毕赤酵母不是饲料、食品等加工的生物安全菌(见《饲料添加剂品种目录(2013)》)，而酿酒酵母是啤酒发酵、酿造、豆粕类加工的可食用生物安全菌。此外，普通的α-半乳糖苷酶热稳定性差，不便于食品、饲料加工。因此，需要构建转α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母，还需要克隆热稳定性好、耐高温的α-半乳糖苷酶基因并转入酿酒酵母。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种重组α-半乳糖苷酶基因及其重组基因工程菌酿酒酵母，该工程菌可以产生α-半乳糖苷酶并应用于食品、饲料加工、生产α-半乳糖苷酶等，可以去除不良寡糖等抗营养因子。酿酒酵母被用于豆类食品加工、豆粕饲料加工等，但是酿酒酵母几乎没有α-半乳糖苷酶活性，不能去除豆类中的不良寡糖。本发明构建的重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌具有α-半乳糖苷酶活性，可以去除不良寡糖。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组α-半乳糖苷酶基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种所述重组α-半乳糖苷酶基因编码的重组α-半乳糖苷酶，所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还涉及一种由所述重组α-半乳糖苷酶基因构建的重组载体。

本发明提供一种由所述重组载体转化制备的重组α-半乳糖苷酶基因工程菌，所述重组α-半乳糖苷酶基因工程菌以酿酒酵母为宿主菌构建而成。

本发明涉及一种所述重组α-半乳糖苷酶在降解含α-半乳糖苷键底物中的应用，所述的应用是将重组α-半乳糖苷酶基因工程菌接种至添加有含α-半乳糖苷键的底物和诱导物IPTG的YNB筛选培养基，在30℃培养，实现底物的降解，获得降解产物。

进一步，所述的底物为标准检验底物(如5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷(X-α-Gal))、含有棉子糖(棉籽糖是一种三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖组成，降解后可能变成二塘、单糖的混合物，彻底降解后变成单糖)、水苏糖的豆粕、糖蜜、食品原料、纸浆等。

进一步，当所述的底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷，所述的应用为：将重组α-半乳糖苷酶基因工程菌接种至添加有含α-半乳糖苷键的底物和诱导物IPTG的YNB筛选培养基，在30℃培养，实现底物的降解，获得降解产物5-氯-4-溴-3-吲哚；所述底物以4mg/mL二甲基甲酰胺溶液的形式加入，所述底物溶液与IPTG体积比为1.5:1，所述YNB筛选培养基中，底物终浓度为0.2mg/mL，IPTG终浓度1mmol/L；YNB(ura-)筛选培养基终浓度组成：葡萄糖20g/L、酵母氮碱(YNB)6.7g/L、腺嘌呤0.04g/L、L-色氨酸0.02g/L、L-亮氨酸0.1g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。

当所述的底物为棉子糖，所述的应用为：将重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌接种至YNB筛选培养基，在30℃、180rpm条件下培养到对数期，然后以体积浓度10％的接种量转接入YPGR诱导培养基中进行表达，30℃培养12h后，将发酵液离心收集细胞后，超声波破碎(美国Sonics公司VCX500超声波破碎仪，破碎参数：在输出功率/频率130W/20KHz，时间为10min，工作3s停3s)后，取破碎混合液与棉子糖溶液以体积比1:1混合，60℃水解反应完全，实现对棉子糖的降解；所述棉子糖溶液是以pH5.5、50mM的MES缓冲液为溶剂配制成0.01g/mL；所述YPGR诱导培养基终浓度组成：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，棉籽糖20g/L，半乳糖20g/L，溶剂为水，pH自然。

本发明根据报道的源于嗜热真菌米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的耐热α-半乳糖苷酶基因序列，再加上酵母的分泌信号肽序列，组成重组的分泌型α-半乳糖苷酶全基因。根据全基因序列进行化学合成，克隆到酿酒酵母表达载体，利用基因工程技术转入酵母菌，然后进行豆类、糖蜜的发酵加工，可以去除发酵原料中的抗营养因子不良寡糖，提高食品、饲料的营养价值和消化吸收率，提高资源的利用率。

α-半乳糖苷酶是可以催化α-半乳糖苷键水解的外切水解酶，催化移除不同底物中α-连接的末端非还原D-半乳糖，水解棉籽糖家族低聚糖、半乳甘露聚糖及半乳糖脂。α-半乳糖苷酶在含上述α-半乳糖苷键的底物上反应，可以降解底物。

X-α-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)是一种半乳糖苷酶的显色底物，转α半乳糖苷酶基因的酵母菌落产生分泌型的α-半乳糖苷酶，在含该酶底物X-α-gal的平板上降解底物分解成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。蓝色物质可以使整个培养菌落显蓝色，从而说明成功构建了转α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母，该工程菌可以应用于底物的水解。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

1)酿酒酵母是食品安全菌，构建的重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌产α-半乳糖苷酶，可以进行豆类、糖蜜的发酵加工，可以去除发酵原料中的抗营养因子不良寡糖，提高食品、饲料的营养价值和消化吸收率，提高资源的利用率。

2)α-半乳糖苷酶可以用于医疗、造纸工业。医疗上可以用于抗原、血型改造，降低器官移植、输血等临床医疗中的免疫排斥反应。在造纸工业中α-半乳糖苷酶的酶解作用可以增强纸浆预处理效果。

3)酿酒酵母中转入的α-半乳糖苷酶源于嗜热真菌米赫根毛霉(R.miehei)，有一定的热稳定性。在酿酒酵母进行饲料添加剂发酵豆粕的加工、食品加工、纸浆处理等过程中，会通过发酵等产生一定的热量导致体系升温，现有的酿酒酵母α-半乳糖苷酶活性很低，几乎检测不到。虽有报道的重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母，但是转入的是普通的α-半乳糖苷酶，热稳定性差，在工业化加工应用的过程中不耐高温，很容易失活。普通的微生物或酶不能正常发挥催化作用，本发明的工程菌产生的重组α-半乳糖苷酶则有一定的热稳定性，其最适温度在60℃，在60℃水浴80min后还可以保持80％的活性。

(四)附图说明

图1酿酒酵母表达载体pYES2图谱。

图2为转重组α半乳糖苷酶基因的酿酒酵母。有颜色反应的菌落为转化子，在图中颜色较深(A)，无色菌落为对照酵母菌株(B)，在图中颜色很浅。

图3粗酶液酶活差异，野生代表表野生型菌株，2、4、11、14分别代转α-半乳糖苷酶基因的不同重组工程菌株。

图4酶的热稳定性曲线图。

图5薄层色谱(TLC)法测棉籽糖的降解图。

图6酶活测定标准曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1、化学合成重组α-半乳糖苷酶基因序列

α-半乳糖苷酶基因开放阅读框(ORF)序列，见NCBI网站GenBank登录号KC357714.1。对α-半乳糖苷酶基因ORF序列根据酿酒酵母的密码子进行优化，在前面加上分泌信号肽的基因序列，信号肽序列源于产朊假丝酵母分泌性酶(见NCBI网站GenBank登录号Y12659.1，位置766-843)，组成新的α-半乳糖苷酶重组表达基因序列(下划线为信号肽序列)SEQ ID NO.1所示，即重组α-半乳糖苷酶基因：

ATGTCGTTGACAAAAGATGCCTCAGAGGACCAAGAAGACATCAAGAGTCTCACGATGAACACTAGTTT AGTTGATTCCAGGTTGTTGTTGATCACCGCTATTTCCTCTTCCTTGTTGCTATTGGTCTTGTTGCCTTGTGCTTATGCTGCAGCAGGATTGTTATCAACAGGCATTCATAAGCACCCAGATTTGGATACTTGGTTCTTGGTTACCGAGAGATCTACTTACGTTGTAGGAGCTACAGACGACGGTTATTTGTTGAACTTGCATTGGGGCGATAGATTGAACGAATTGGACAACGACTTGAACGCTACTAGAATCTTCACCACCACTACTTTCAACCCACCAATTACCTACGCTCAAGAAGAATTGCCAGCTTTTGGAGGCTTGAGATACAGAGAATTGGCTTTGAAGGTTGAATTGCCAAACGGAGTTAGGGAATTGAACTTGTTGTACTCCGGTAGATCTAACATGACAGGCGATTCATTGTTGGACTTGGAATTGGAAGCAGGAAACTATACCGGTTTGACAGTTACCTTGCACTACGAATTGGACGTTGATAACGACATCATCAGGAGATCCTACACTATCAGAAACGGCTTGAAGAAGGGTAACGTTAACTTGTCTAAGGCTTTGTCAGCAGCTTGGCATCCACCATCAGCTATGGGTTTAGACGAAGAAAGAGAATTGTTGACCTTGTCAGGCGATTGGGCTCACGAAGCTATTACTCAAAGAACCAGATTGAGACCAGGAGTTTCACATACAGTCCAATCTCCAAGAGGTTTTCCATCTCATCAATCCTACCCATACTTCGCTTTGAGACAAGTTCCAACAGGAGAAACTTCTCCAGGAACTTCTAACGAAGTCTACTTTGGAGCTTTGGCTTGGTCAGGATCTTGGGAAATTACAGTTGACACCACCATATATGGTTACTCAAGAATTACCGGAGGTATTCATCATCAAGATTTTGGTTGGACCTTGGAACCAGGCGAATCTTTTACTACTCCAGTTTTCGCAGCAGGTTATACTAATGAAGGTTTACCAGGAGCTAGAAAAAGAATGCCAAGACACGTTAGGAAGTACCAGTTGAAGAACGTTAAGACCCAGCAAAAGAAGGAAGACATGTACAACCCAGTCCTATACAACTCTTGGGAAGCTTTGACTTTCAACATCACCTACGACAAGCAAATCGCTTTAGCAGATAAAGCAGCAGCTATGGGCATTGAATTATTTGCCGTTGACGACGGTTGGTTTGGAGCTAGAGATAACGATTCAGCAGGTTTAGGAGATTGGTTCGTTAACAAGAGAAAGTTCCCACACGGAATGAAACCATTGGCAGATCACGTTCATAACTTGGGAATGAAGTTCGGTCTTTGGTTCGAACCAGAATCTTTCAACCCAAACTCCGACTTGTATAGGAAGCATCCAGATTGGGCTTTTTACTACGACGGTATTCCAAGATACGAAGCTAGAAACCAGTTGTTGATGAACTTGGGTTTGCCAGAAGTCAGAGAATACTTGTACAACAGGATCTCCACCTTGGTTAAGGAAATTGGCATCGACTTCATCAAGTGGGATATGAACAGACCATTCGCAGAAGTTACCATGCACAACTACAAGGACAGAAACCCTAGAGAAGCTTGGGTATTAGCAGTTGAAGGCTTTTACTCCATCATCGATAAGTTGAAGCAGGAATTTCCAGACTTGATGATTGAAACTTGCGCTTCAGGTGGAGGTAGAATGGATATTGGCATTTTGCAAAAGGTCGATCAAGCTTGGACTTCAGATAACACTAGACCAGACGCTAGATTGTTCATCCAATACGGAGCTTCTATGTTCTTGCCACCTAGAATTATGTACGGTTGGGTTACAGATTCTCCATACGATTCCCAGATCGAAATTCCATTGTCCTTCAGGTTCCACGTTTCCTTTATGGGCGGTTTAGGCGTTGGTTCTAATTTGAATAACATGGAGGAATCCGATATCAAAGAAGCCGCAGGTTGGATCGAATTGTACAAGCAAATCAGACACGTCATACAAAACGGCGATTTGGATTGGCTTGTTCAACCATCTTGCGTTGGAGATTTGGTTGCCGTTTCTCAAACTACTTCCCAAGATAGATCAGAGGCAGTTGTTTTGGCTTACAGATTCAACTCCGTTTTCTCCGATCAGTTGAACCCATTGAGATTGAGATACTTAGATCCAAAGCACACCTACAGAGTTAGAGTTTACCAGGATGATCCATCTACTCCATCAGACGAATACGAAATGTCAGGAGCTTTGTTGTTGTCCAGAGGTATTGTTTTGCCAGGCTTGAACAACATCATGTTCAGAAGCGCAGTTGTTTGGGTTCAACAAAAATGA。

将上述重组序列交商业公司通过化学合成法合成DNA。

2、重组基因的表达载体构建

2.1基因扩增、酶切和表达载体连接

以重组α-半乳糖苷酶基因DNA(SEQ ID NO.1所示)为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增(反应体系和程序见表1、表2)，两条引物外侧分别设计酶切位点(BamH I/Xba I)，PCR产物经过纯化后进行酶切，酶切产物回收后和用同样双酶切开的酵母表达载体pYES2(图1，购自Invitrogen公司)进行连接反应(表3，Takara公司Ligation试剂盒)。

PCR引物：

GalB-F:CGGGATCCCGATGTCGTTGACAAAAGATGCCT下划线为酶切位点BamH I和保护碱基

GalB-R:GCTCTAGAGCTCATTTTTGTTGAACCCAAACA下划线为酶切位点Xba I和保护碱基

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应程序

表3 连接反应体系：

2.2连接的重组载体转化大肠杆菌

1)取50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，放于冰上进行融化10min。

2)加入5μL连接产物并混匀。冰上放置30min。

3)42℃热激90s，立即冰上放置2min。

4)加入450μL LB培养基(1L：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶剂为水，pH7.2)，使终体积为500μL。37℃，200rpm培养1h。

5)取200μL步骤4)培养液涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板(1L：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，溶剂为水，pH 7.2)，37℃培养箱中培养12h。

2.3表达载体正确构建

挑选步骤5)5个转化子菌落进行质粒测序，选择序列和构建正确的克隆进行繁殖，提取质粒后保存，进行酵母转化。含α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母重组表达质粒命名为pYES2-GalB。

3、酿酒酵母的遗传转化

3.1酿酒酵母的接种、培养

挑取YPD培养基(1L：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，琼脂15g，溶剂为水，pH自然)上活化的酿酒酵母WHU2a单菌落接种于5mL的YPD液体培养基(1L：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，溶剂为水，pH自然)中，28℃、200rpm过夜培养。

3.2酿酒酵母扩大培养

取2.5mL过夜培养的酿酒酵母菌液，接种于50mL YPD液体培养基中，28℃、200rpm培养4h，OD₆₀₀达到0.7-0.9。

3.3酵母感受态细胞的制备

(1)将培养液装到已灭菌的离心管中，6000rpm、4℃离心5min。

(2)用20mL无菌水洗涤一次，离心去上清，收集细胞。

(3)用1mL 0.1mol/L LiAc充分悬浮细胞，并将悬液转移至1.5ml离心管中，12000rpm、4℃离心1min，弃上清。

(4)加入400μL 0.1mol/L LiAc，上下震荡细胞悬液，取50μL悬液于1.5ml离心管中，12000rpm、4℃离心1min，除去LiAc，即为感受态细胞，准备转化。

3.4酵母转化体系

(1)在冰上配制转化混合液(见表4，按照顺序依次加入)

表4 酿酒酵母转化混合液

(2)剧烈振荡1min，将体系充分混合

(3)28℃保温30min

(4)42℃水浴热激25min

(5)12000rpm离心1min，弃上清

(6)加1mL无菌水到1.5mL EP管中，用移液枪轻轻悬浮，尽量避免剧烈振荡。

5.涂布

取200μL转化菌液涂布YNB(ura-)筛选培养基，涂布的平板放置在30℃培养箱培养3天。

表5 YNB(ura-)筛选培养基(1L，溶剂为水，pH自然)

4、转化子的筛选、鉴定

在上述筛选培养基上培养后，长出的菌落即为候选转α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母克隆，这些克隆再经过质粒提取，转入大肠杆菌后提取质粒进行测序验证后，获得重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌。

实施例2重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌降解含α-半乳糖苷键的底物

将20μL诱导物IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和50μLα-半乳糖苷酶显色底物X-α-gal(4mg/mL，溶剂为二甲基甲酰胺)涂布于YNB(ura-)筛选培养基(表5)平板上，放置20min进行充分吸收扩散后，分别划线接种实施例1制备的重组α半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌和未转基因的对照菌株(酿酒酵母WHU2a)，30℃培养48h后，进行观察。结果显示重组α半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌菌落为蓝色，对照菌株则不显蓝色(图2)，结果说明重组酿酒酵母工程菌能够产生α-半乳糖苷酶。

实施例3重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌的α-半乳糖苷酶酶活和热稳定性测定结果

1)、酶活测定

发酵方法是先将重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌接种至YNB(ura-)筛选培养基，在30℃、180rpm条件下培养到对数期，然后以体积浓度10％的接种量转接入YPGR诱导培养基(蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，棉籽糖20g/L，半乳糖20g/L，溶剂为水，pH自然，115℃灭菌30min)中进行表达，30℃培养12h后，将发酵液离心收集细胞后，通过超声波破(美国Sonics公司VCX500超声波破碎仪，破碎参数：在输出功率/频率130W/20KHz，时间为10min，工作3s停3s)碎后，取粗酶液进行酶活测定，并以原始出发菌株为对照，酶活力的差别如图3表示。

α-半乳糖苷酶的酶活测定方法：酶活力测定采用pNPG法。其原理是α-半乳糖苷酶可与底物pNPG等摩尔反应生成黄色的对硝基苯酚(pNP)，通过检测pNP的生成量从而得出α-半乳糖苷酶的活性。具体操作方法如表6：

表6 酶活性测定方法

根据标准曲线来计算酶活，酶活(U/mL)的定义为：在测定条件下，每分钟分解pNPG释放1μmol pNP所需的酶量。

由图3比较可知，工程菌的酶活力在14.5U/mL左右，而出发菌株的酶活力几乎检测不到，差异显著(P<0.05)。说明工程菌成功的表达了α-半乳糖苷酶。

标准曲线(图6)制作：

pNP用50mM的MES缓冲液(pH5.5，2-吗啉代乙磺酸)配置成5mM的溶液，与50mM的MES缓冲液(pH5.5)混合反应后，加入1M的Na₂CO₃终止反应，测定OD₄₀₅的吸光度来确定浓度。pNP标准溶液配制如表7。

表7 pNP标准溶液配制

Table 3-16 pNP standard solution prepare

以OD₄₀₅的吸光值为横坐标，以pNP的量为纵坐标制作标准曲线如下：

酶活计算公式为：

酶活(y)＝(0.1576X-0.0077)×F×100/T

X：OD₄₀₅的光吸收值；F：酶液的稀释倍数；100：反应体系中10μL酶液换算成1mL的换算因子；T：反应时间。

2)酶的热稳定性测定

将酶液与pH 5.5、50mM MES(2-吗啉代乙磺酸)缓冲液，以体积比1：3混合，然后在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的温度梯度下分别放置0、20、40、60、80min，然后测定其酶活，从而得出其相对酶活力曲线。重组α-半乳糖苷酶的最适温度在60℃，见图4。该酶可以在在60℃水浴80min后还可以保持80％的活性。

实施例4 重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌降解棉籽糖

重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌进行发酵后，超声波破碎后离心取上清液作为粗酶液，进行棉籽糖降解能力分析。用薄层色谱(TLC)法测棉籽糖的降解情况。测定结果见图5。从棉籽糖降解情况来看，在处理30min时棉籽糖已经水解了一部分，且随着时间的加长，降解得越来越多，到2h时已经水解了大部分，说明重组的α-半乳糖苷酶是可以对降解棉籽糖。

具体方法：

1)重组α-半乳糖苷酶粗酶液的制备

重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌按照实施例3中的方法进行发酵后，6000rpm离心10min去除上清液，并用pH5.5的MES缓冲液洗涤后重悬，用超声波细胞破碎仪进行破碎处理，处理后的样品6000rpm离心5min，取上清液4℃保存备用。

2)薄层色谱分析

1)反应原理：根据物质与硅胶板吸附力与分配系数的差异，使样品中的多种物质得以分离。根据溶解度的不同，以及吸附力的差异，最终混合物将分离，在显色剂作用下，形成一系列斑点。本次测定用G型硅胶板。

2)试剂：

展开剂及体积比：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水＝9:10:4:2

显色剂：1g尿素+4.5mL磷酸溶液+48mL水饱和正丁醇

3)测定步骤

①棉籽糖标样的配制

称取棉籽糖0.01g溶于1mL MES缓冲液(50mM，pH5.5)中，4℃保存备用。

②样品的处理

用粗酶液10μL和棉籽糖10μL(0.01g/mL)混匀后，60℃进行水解反应30、60、90、120min后，TLC测定。

③测定方法

在硅胶板上1cm处用铅笔画一条直线，在直线上进行点样。待样品干燥后，将硅胶板直立于层析缸中展开(注意展开剂要低于直线)，当展开液跑至离顶部1cm处拿出。用吹风机吹干后，将显色液喷于硅胶板上，然后立即放入预先调好的温度为140℃的烘箱中烘至显色。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组α-半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2364

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

atgtcgttga caaaagatgc ctcagaggac caagaagaca tcaagagtct cacgatgaac 60

actagtttag ttgattccag gttgttgttg atcaccgcta tttcctcttc cttgttgcta 120

ttggtcttgt tgccttgtgc ttatgctgca gcaggattgt tatcaacagg cattcataag 180

cacccagatt tggatacttg gttcttggtt accgagagat ctacttacgt tgtaggagct 240

acagacgacg gttatttgtt gaacttgcat tggggcgata gattgaacga attggacaac 300

gacttgaacg ctactagaat cttcaccacc actactttca acccaccaat tacctacgct 360

caagaagaat tgccagcttt tggaggcttg agatacagag aattggcttt gaaggttgaa 420

ttgccaaacg gagttaggga attgaacttg ttgtactccg gtagatctaa catgacaggc 480

gattcattgt tggacttgga attggaagca ggaaactata ccggtttgac agttaccttg 540

cactacgaat tggacgttga taacgacatc atcaggagat cctacactat cagaaacggc 600

ttgaagaagg gtaacgttaa cttgtctaag gctttgtcag cagcttggca tccaccatca 660

gctatgggtt tagacgaaga aagagaattg ttgaccttgt caggcgattg ggctcacgaa 720

gctattactc aaagaaccag attgagacca ggagtttcac atacagtcca atctccaaga 780

ggttttccat ctcatcaatc ctacccatac ttcgctttga gacaagttcc aacaggagaa 840

acttctccag gaacttctaa cgaagtctac tttggagctt tggcttggtc aggatcttgg 900

gaaattacag ttgacaccac catatatggt tactcaagaa ttaccggagg tattcatcat 960

caagattttg gttggacctt ggaaccaggc gaatctttta ctactccagt tttcgcagca 1020

ggttatacta atgaaggttt accaggagct agaaaaagaa tgccaagaca cgttaggaag 1080

taccagttga agaacgttaa gacccagcaa aagaaggaag acatgtacaa cccagtccta 1140

tacaactctt gggaagcttt gactttcaac atcacctacg acaagcaaat cgctttagca 1200

gataaagcag cagctatggg cattgaatta tttgccgttg acgacggttg gtttggagct 1260

agagataacg attcagcagg tttaggagat tggttcgtta acaagagaaa gttcccacac 1320

ggaatgaaac cattggcaga tcacgttcat aacttgggaa tgaagttcgg tctttggttc 1380

gaaccagaat ctttcaaccc aaactccgac ttgtatagga agcatccaga ttgggctttt 1440

tactacgacg gtattccaag atacgaagct agaaaccagt tgttgatgaa cttgggtttg 1500

ccagaagtca gagaatactt gtacaacagg atctccacct tggttaagga aattggcatc 1560

gacttcatca agtgggatat gaacagacca ttcgcagaag ttaccatgca caactacaag 1620

gacagaaacc ctagagaagc ttgggtatta gcagttgaag gcttttactc catcatcgat 1680

aagttgaagc aggaatttcc agacttgatg attgaaactt gcgcttcagg tggaggtaga 1740

atggatattg gcattttgca aaaggtcgat caagcttgga cttcagataa cactagacca 1800

gacgctagat tgttcatcca atacggagct tctatgttct tgccacctag aattatgtac 1860

ggttgggtta cagattctcc atacgattcc cagatcgaaa ttccattgtc cttcaggttc 1920

cacgtttcct ttatgggcgg tttaggcgtt ggttctaatt tgaataacat ggaggaatcc 1980

gatatcaaag aagccgcagg ttggatcgaa ttgtacaagc aaatcagaca cgtcatacaa 2040

aacggcgatt tggattggct tgttcaacca tcttgcgttg gagatttggt tgccgtttct 2100

caaactactt cccaagatag atcagaggca gttgttttgg cttacagatt caactccgtt 2160

ttctccgatc agttgaaccc attgagattg agatacttag atccaaagca cacctacaga 2220

gttagagttt accaggatga tccatctact ccatcagacg aatacgaaat gtcaggagct 2280

ttgttgttgt ccagaggtat tgttttgcca ggcttgaaca acatcatgtt cagaagcgca 2340

gttgtttggg ttcaacaaaa atga 2364

<210> 2

<211> 787

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Met Ser Leu Thr Lys Asp Ala Ser Glu Asp Gln Glu Asp Ile Lys Ser

1 5 10 15

Leu Thr Met Asn Thr Ser Leu Val Asp Ser Arg Leu Leu Leu Ile Thr

20 25 30

Ala Ile Ser Ser Ser Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Cys Ala Tyr

35 40 45

Ala Ala Ala Gly Leu Leu Ser Thr Gly Ile His Lys His Pro Asp Leu

50 55 60

Asp Thr Trp Phe Leu Val Thr Glu Arg Ser Thr Tyr Val Val Gly Ala

65 70 75 80

Thr Asp Asp Gly Tyr Leu Leu Asn Leu His Trp Gly Asp Arg Leu Asn

85 90 95

Glu Leu Asp Asn Asp Leu Asn Ala Thr Arg Ile Phe Thr Thr Thr Thr

100 105 110

Phe Asn Pro Pro Ile Thr Tyr Ala Gln Glu Glu Leu Pro Ala Phe Gly

115 120 125

Gly Leu Arg Tyr Arg Glu Leu Ala Leu Lys Val Glu Leu Pro Asn Gly

130 135 140

Val Arg Glu Leu Asn Leu Leu Tyr Ser Gly Arg Ser Asn Met Thr Gly

145 150 155 160

Asp Ser Leu Leu Asp Leu Glu Leu Glu Ala Gly Asn Tyr Thr Gly Leu

165 170 175

Thr Val Thr Leu His Tyr Glu Leu Asp Val Asp Asn Asp Ile Ile Arg

180 185 190

Arg Ser Tyr Thr Ile Arg Asn Gly Leu Lys Lys Gly Asn Val Asn Leu

195 200 205

Ser Lys Ala Leu Ser Ala Ala Trp His Pro Pro Ser Ala Met Gly Leu

210 215 220

Asp Glu Glu Arg Glu Leu Leu Thr Leu Ser Gly Asp Trp Ala His Glu

225 230 235 240

Ala Ile Thr Gln Arg Thr Arg Leu Arg Pro Gly Val Ser His Thr Val

245 250 255

Gln Ser Pro Arg Gly Phe Pro Ser His Gln Ser Tyr Pro Tyr Phe Ala

260 265 270

Leu Arg Gln Val Pro Thr Gly Glu Thr Ser Pro Gly Thr Ser Asn Glu

275 280 285

Val Tyr Phe Gly Ala Leu Ala Trp Ser Gly Ser Trp Glu Ile Thr Val

290 295 300

Asp Thr Thr Ile Tyr Gly Tyr Ser Arg Ile Thr Gly Gly Ile His His

305 310 315 320

Gln Asp Phe Gly Trp Thr Leu Glu Pro Gly Glu Ser Phe Thr Thr Pro

325 330 335

Val Phe Ala Ala Gly Tyr Thr Asn Glu Gly Leu Pro Gly Ala Arg Lys

340 345 350

Arg Met Pro Arg His Val Arg Lys Tyr Gln Leu Lys Asn Val Lys Thr

355 360 365

Gln Gln Lys Lys Glu Asp Met Tyr Asn Pro Val Leu Tyr Asn Ser Trp

370 375 380

Glu Ala Leu Thr Phe Asn Ile Thr Tyr Asp Lys Gln Ile Ala Leu Ala

385 390 395 400

Asp Lys Ala Ala Ala Met Gly Ile Glu Leu Phe Ala Val Asp Asp Gly

405 410 415

Trp Phe Gly Ala Arg Asp Asn Asp Ser Ala Gly Leu Gly Asp Trp Phe

420 425 430

Val Asn Lys Arg Lys Phe Pro His Gly Met Lys Pro Leu Ala Asp His

435 440 445

Val His Asn Leu Gly Met Lys Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Ser

450 455 460

Phe Asn Pro Asn Ser Asp Leu Tyr Arg Lys His Pro Asp Trp Ala Phe

465 470 475 480

Tyr Tyr Asp Gly Ile Pro Arg Tyr Glu Ala Arg Asn Gln Leu Leu Met

485 490 495

Asn Leu Gly Leu Pro Glu Val Arg Glu Tyr Leu Tyr Asn Arg Ile Ser

500 505 510

Thr Leu Val Lys Glu Ile Gly Ile Asp Phe Ile Lys Trp Asp Met Asn

515 520 525

Arg Pro Phe Ala Glu Val Thr Met His Asn Tyr Lys Asp Arg Asn Pro

530 535 540

Arg Glu Ala Trp Val Leu Ala Val Glu Gly Phe Tyr Ser Ile Ile Asp

545 550 555 560

Lys Leu Lys Gln Glu Phe Pro Asp Leu Met Ile Glu Thr Cys Ala Ser

565 570 575

Gly Gly Gly Arg Met Asp Ile Gly Ile Leu Gln Lys Val Asp Gln Ala

580 585 590

Trp Thr Ser Asp Asn Thr Arg Pro Asp Ala Arg Leu Phe Ile Gln Tyr

595 600 605

Gly Ala Ser Met Phe Leu Pro Pro Arg Ile Met Tyr Gly Trp Val Thr

610 615 620

Asp Ser Pro Tyr Asp Ser Gln Ile Glu Ile Pro Leu Ser Phe Arg Phe

625 630 635 640

His Val Ser Phe Met Gly Gly Leu Gly Val Gly Ser Asn Leu Asn Asn

645 650 655

Met Glu Glu Ser Asp Ile Lys Glu Ala Ala Gly Trp Ile Glu Leu Tyr

660 665 670

Lys Gln Ile Arg His Val Ile Gln Asn Gly Asp Leu Asp Trp Leu Val

675 680 685

Gln Pro Ser Cys Val Gly Asp Leu Val Ala Val Ser Gln Thr Thr Ser

690 695 700

Gln Asp Arg Ser Glu Ala Val Val Leu Ala Tyr Arg Phe Asn Ser Val

705 710 715 720

Phe Ser Asp Gln Leu Asn Pro Leu Arg Leu Arg Tyr Leu Asp Pro Lys

725 730 735

His Thr Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Asp Asp Pro Ser Thr Pro Ser

740 745 750

Asp Glu Tyr Glu Met Ser Gly Ala Leu Leu Leu Ser Arg Gly Ile Val

755 760 765

Leu Pro Gly Leu Asn Asn Ile Met Phe Arg Ser Ala Val Val Trp Val

770 775 780

Gln Gln Lys

785

Claims

1.一种重组α-半乳糖苷酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述重组α-半乳糖苷酶基因编码的重组α-半乳糖苷酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.一种由权利要求1所述重组α-半乳糖苷酶基因构建的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体转化制备的重组α-半乳糖苷酶基因工程菌。

5.如权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于所述重组α-半乳糖苷酶基因工程菌以酿酒酵母为宿主菌构建而成。

6.一种权利要求2所述重组α-半乳糖苷酶在降解含α-半乳糖苷键底物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷或棉子糖。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷，所述的应用为：将重组α-半乳糖苷酶基因工程菌接种至添加有底物和IPTG的YNB筛选培养基，在30℃培养完全，获得降解产物5-氯-4-溴-3-吲哚；所述底物以4mg/mL二甲基甲酰胺溶液的形式加入，所述底物溶液与IPTG体积比为1.5:1。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的底物为棉子糖，所述的应用为：将重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌接种至YNB筛选培养基，在30℃、180rpm条件下培养到对数期，然后以体积浓度10％的接种量转接入YPGR诱导培养基中进行表达，30℃培养12h后，将发酵液离心收集细胞后，超声波破碎后，取破碎混合液与棉子糖溶液以体积比1:1混合，60℃水解反应完全，实现对棉子糖的降解；所述棉子糖溶液是以pH5.5、50mM的MES缓冲液为溶剂配制成0.01g/mL；所述YPGR诱导培养基终浓度组成：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，棉子糖20g/L，半乳糖20g/L，溶剂为水，pH自然。