JP5227303B2 - 3,6−ジクロロ−o−アニシン酸を含む共存培地で植物組織を培養する共存工程を含む、植物の形質転換効率を上昇させる方法 - Google Patents
3,6−ジクロロ−o−アニシン酸を含む共存培地で植物組織を培養する共存工程を含む、植物の形質転換効率を上昇させる方法 Download PDFInfo
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Description
(i)アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、3,6−ジクロロ−o−アニシン酸を含む共存培地で培養する共存工程;
(ii)(i)で得られた組織をオーキシンを含む培地で培養し、形質転換体を薬剤選抜する選抜工程;および、
(iii)(ii)で選抜された組織を選抜薬剤を含む再分化培地で培養し再分化させる再分化工程;を含む、形質転換植物の作成方法を提供する。
本発明において使用される植物組織はアグロバクテリウム菌を接種される。本明細書で使用する「接種する」とは、アグロバクテリウム菌を植物組織に接触させることをいい、当該技術分野においては種々のアグロバクテリウム菌を接種する方法が公知である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウム菌を液体培地に懸濁した懸濁液に植物組織を加える方法、共存培地上の植物組織にアグロバクテリウム菌の懸濁液を直接滴下する方法、植物組織中にアグロバクテリウム菌懸濁液を注入する方法、およびアグロバクテリウム菌懸濁液中に植物組織を浸漬し減圧する方法等があげられる。しかしながら、本発明において使用されるアグロバクテリウム菌を接種された植物組織は、これらの方法によりアグロバクテリウム菌を接種された植物組織に限定されない。
本工程は、上記のようにアグロバクテリウム菌を接種した植物細胞を、アグロバクテリウム菌の共存下にて、オーキシン類を含む培地で培養することにより、植物細胞へのアグロバクテリウム菌からDNAの導入を確実にする工程である。本工程で使用される培地は、本明細書中では「共存培地」という。共存培地は、植物細胞を培養するために通常使用されるものでよく、例えば、LS無機塩類(非特許文献30)やN6無機塩類(非特許文献31)を基本とする培地、具体的にはLS−AS培地等があげられる。
本発明は、以上に記載した共存工程を特徴とするものである。以下に記載する選抜工程および再分化工程は、アグロバクテリウム菌による植物の形質転換方法において一般に行われている方法である。したがって、以下の記載は例示のためのものであり、本発明は以下の記載により限定されるものではない。
本工程は、上記選抜工程により選抜された組織を、培地で培養し再分化させる工程である。本工程で使用される培地は、本明細書中では「再分化培地」という。再分化培地は、オーキシン類は含まない。再分化培地として使用可能な培地は、例えば、LS無機塩類やN6無機塩類を基本とする培地、例えば具体的にはLSZ培地等があげられる。
(i)アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、3,6−ジクロロ−o−アニシン酸を含む共存培地で培養する共存工程;
(ii)(i)で得られた組織をオーキシンを含む培地で培養し、形質転換体を薬剤選抜する選抜工程;および、
(iii)(ii)で選抜された組織を選抜薬剤を含む再分化培地で培養し再分化させる再分化工程;を含む、形質転換植物の作成方法もまた、本発明により提供される。
プラスミドサイズ: 12347bp
実施例1
種々のオーキシンを添加した共存培地の形質転換効率に及ぼす効果
材料および方法
受粉後7から14日目のトウモロコシ(品種:A188)の未熟胚(大きさ1.0−1.5 mm)を無菌的に採取し、LS−inf液体培地(非特許文献11)で1回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるための前処理(46℃、3分間の熱処理および15,000 rpm、10分間の遠心処理)を行った。100μMアセトシリンゴンを含むLS−inf液体培地に約1.0x109cfu/mlでアグロバクテリウム菌系 LBA4404 (pSB131) (非特許文献11)を懸濁し接種源とした。熱・遠心処理した未熟胚に接種源を加え、30秒間撹拌した後、5分間室温で静置した。2,4−Dを除き、5μM AgNO3および5μM CuSO4を含むLS−AS培地(非特許文献11、固化剤は8g/lアガロース)に1.5mg/lの濃度で2,4,5−T(2,4,5−トリクロロフェノキシ酢酸)、ピクロラム(4−アミノ−3,5,6−トリクロロピコリン酸)、TIBA(2,3,5−トリヨード安息香酸)、ダイカンバをそれぞれ添加した共存培地にアグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。対照の培地は5μM AgNO3および5μM CuSO4を含むLS−AS培地(固化剤は8g/lアガロース)とした。
2,4−Dをオーキシンとした対照の共存培地で培養した未熟胚からは20.6%の効率で形質転換植物が得られた。これに対し、ダイカンバをオーキシンとして添加した共存培地で培養した未熟胚の形質転換効率は27.3%と高く、共存培地のオーキシンをダイカンバにすることにより、形質転換効率の向上することが明らかとなった。したがって、共存培地にオーキシンとしてダイカンバを含ませることにより、2,4−Dを使用する従来法に比べ、27.3/20.6=1.33倍形質転換効率が上昇することが明らかとなった。一方、2,4,5−Tおよびピクロラムをオーキシンとした培地での形質転換効率は対照に比べ劣った。TIBAを添加した培地で共存培養を行った未熟胚からは形質転換植物は得られなかった(図1)。
実施例2
滴下接種法での形質転換効率に及ぼす共存培地中のダイカンバと2,4−Dの影響
材料および方法
pSB11(非特許文献27)を基本骨格とするベクターに必要なエレメントを付加し、図2、配列番号1のベクターU0009Bを構築した。実施例1と同様の方法で調整したアグロバクテリウム菌系LBA4404(U0009B)の接種源1mlに約80mgのハイドロキシアパタイト(Bio−Rad)を添加した。遺伝子導入効率を高めるための前処理(46℃、3分間の熱処理および15,000rpm、10分間の遠心処理)を行った未熟胚(品種A188)を2,4−Dを除き、5μM AgNO3および5μM CuSO4を含むLS−AS培地(非特許文献11、固化剤は8g/lアガロース)に1.5mg/lの濃度ダイカンバを添加した共存培地に胚盤が上になるように置床した。対照の培地は5μMAgNO3および5μMCuSO4を含むLS−AS培地(固化剤は8g/lアガロース)とした。接種源中のハイドロキシアパタイトが均等に分散するようにボルテックスミキサーで撹拌した後、5μlの接種源を未熟胚上に滴下した。滴下した接種源が乾いた後、未熟胚を同培地上の別の場所に移動した。培養器をシールした後、25℃、暗黒下で7日間共存培養を行った。共存培養後の未熟胚を実施例1と同様の方法で培養し、再分化植物を得るとともに再分化植物の葉でのGUS遺伝子の発現を調査した。
2,4−Dをオーキシンとした対照の共存培地で培養した未熟胚からは11.5%の効率で形質転換植物が得られた。これに対し、ダイカンバをオーキシンとして添加した共存培地で培養した未熟胚の形質転換効率は28.0%と高く、共存培地のオーキシンをダイカンバにすることにより、滴下接種法による形質転換においても効率の向上することが明らかとなった(図3)。本方法によれば、共存培地にダイカンバを添加することにより、2,4−Dを使用する従来法に比べ、28.0/11.5=2.43倍形質転換効率が上昇した。
実施例3
サザン分析
材料および方法
実施例1で得られたGUS遺伝子の発現を示す形質転換植物の葉から小鞠らの方法(非特許文献28)に従いDNAを抽出した。抽出したDNAに制限酵素BamHIを処理し、GUS遺伝子をプローブとしたサザン法による導入遺伝子の検出を行った。サザン法はMolecular Cloning(非特許文献29)に記載の方法に従って行った。
いずれの形質転換体もGUSプローブにハイブリダイズするバンドを示した。そのパターンは形質転換体ごとに異なり、導入遺伝子が植物の染色体上にランダムに挿入されていることが示された。GUS陽性を示した個体のバンド数は1−3本で、挿入された導入遺伝子のコピー数はいずれも少ないことが明らかとなった(表1)。
Claims (10)
- アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、3,6−ジクロロ−o−アニシン酸を含む共存培地で培養する共存工程、および、共存工程で得られた組織を2,4−ジクロロフェノキシ酢酸を含む選抜培地で培養する選抜工程を含む、植物の形質転換効率を上昇させる方法。
- 共存培地中に3,6−ジクロロ−o−アニシン酸以外のオーキシン類は含まない、請求項1の方法。
- 共存培地中の3,6−ジクロロ−o−アニシン酸の濃度が0.5−3.0mg/lである、請求項1または2の方法。
- 2,4−ジクロロフェノキシ酢酸のみを共存培地中のオーキシン類として使用する場合と比較して、植物の形質転換効率が少なくとも1.3倍上昇する、請求項1−3のいずれか1項の方法。
- 植物組織が単子葉植物の組織由来である、請求項1−4のいずれか1項の方法。
- 植物組織が熱処理および/または遠心処理されている、請求項1−5のいずれか1項の方法。
- 共存培地が、硝酸銀および/または硫酸銅をさらに含む、請求項1−6のいずれか1項の方法。
- 植物組織が、トウモロコシ組織である、請求項1−7のいずれか1項の方法。
- 以下の工程:
(i)アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、3,6−ジクロロ−o−アニシン酸を含む共存培地で培養する共存工程;
(ii)(i)で得られた組織を2,4−ジクロロフェノキシ酢酸を含む培地で培養し、形質転換体を薬剤選抜する選抜工程;および、
(iii)(ii)で選抜された組織を選抜薬剤を含む再分化培地で培養し再分化させる再分化工程;
を含む、形質転換植物の作成方法。 - 植物がトウモロコシである、請求項9の方法。
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