CN101668418B - 包括用含3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培养基培养植物组织的共存步骤的提高植物转化效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的课题是：提供一种与传统公知的土壤杆菌法相比、提高植物转化效率的方法。本发明的特征之一是：包括用含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培养基培养接种了土壤杆菌的植物组织的共存步骤。

Description

包括用含3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培养基培养植物组织的共存步骤的提高植物转化效率的方法

技术领域

本申请要求2007年2月28日提交的日本国专利申请2007-49161的优先权。

本发明涉及提高利用土壤杆菌的植物转化的效率的方法。

背景技术

作为主要谷类即玉米、稻等单子叶植物的转化方法，传统上已知有电穿孔法、粒子枪法等。但是，这些物理基因导入方法存在如下问题：导入了多拷贝的基因，基因的插入不是完好形式，转化植物多见畸形、不育，等等。

利用土壤杆菌细菌的基因导入法作为双子叶植物的转化法有着普遍的应用。土壤杆菌属细菌的宿主仅限于双子叶植物，认为其不能寄生在单子叶植物中(非专利文献1)，但正在尝试用土壤杆菌转化单子叶植物。

Grimsley等人报告称：在土壤杆菌的T-DNA中插入玉米条纹病毒(Maizestreak virus)的DNA，再将其接种至玉米生长点，确认了玉米条纹病毒的感染。而在仅接种玉米条纹病毒的DNA时，不能确认上述感染症状，可以解释成：以上现象表明土壤杆菌能够向玉米中导入DNA(非专利文献2)。但是，病毒在未整合入核基因组的情况下仍具有增殖可能性，该结果并不能说明T-DNA整合到核上。Grimsley等人进一步揭示：感染效率以接种至玉米的茎顶部生长点时为最高(非专利文献3)，其感染需要土壤杆菌的质粒的Vir C基因(非专利文献4)。

Gould等人用针损伤玉米的生长点后，接种带有卡那霉素抗性基因和GUS基因的强病原性土壤杆菌EHA1，用卡那霉素选择处理后的生长点，结果得到了显示抗性的植物。为了确认其子代的种子中具有导入的基因而进行了Southren分析，结果对于一部分种子确认了导入基因(非专利文献5)。这提示：在用卡那霉素对经土壤杆菌处理的生长点进行选择而得到的植物体中，混合存在有转化细胞和非转化细胞(嵌合现象)。

Mooney等人尝试了使用土壤杆菌对小麦的胚导入卡那霉素抗性基因。首先，通过用酶处理胚使其细胞壁损伤，然后接种土壤杆菌。处理后的愈伤组织中增殖出极少数的认为具有卡那霉素抗性的愈伤组织，但这些愈伤组织不能再生成植物体。此外，在通过Southren分析来确认卡那霉素抗性基因的存在时，在所有抗性愈伤组织中均观察到导入基因的结构突变(非专利文献6)。

Raineri等人在损伤稻的胚盘后，用强病原性的土壤杆菌A281(pTiBo542)处理了稻的8个品种，在日本晴、藤坂5号这2个品种中观察到肿瘤状组织的增殖。而且，将带有下述质粒的土壤杆菌接种于稻胚，观察到卡那霉素抗性愈伤组织的增殖，所述质粒是在从T-DNA中除去激素合成基因而得的Ti质粒中插入卡那霉素抗性基因和GUS基因而得到的。在该抗性愈伤组织中，确认到了GUS基因的表达，但不能获得转化植物。这些可以解释为：土壤杆菌的T-DNA被导入到稻的细胞中(非专利文献7)。

如上述，有研究报告揭示：在稻、玉米、小麦等稻科作物中也能够利用土壤杆菌进行基因导入。然而，其都存在再现性的问题，此外，关于导入基因的确认是不完全的、没有给出有说服力的结果(非专利文献8)。

Chan等人报告：将在2，4-D共存下培养了2天的稻未成熟胚损伤后，在含马铃薯悬浮培养细胞的培养基中对其接种了带有npt II基因和GUS基因的土壤杆菌。在含G418培养基上培养经过处理的未成熟胚，结果由诱导产生的愈伤组织得到了再分化植物体。在通过Southren分析确认再分化植物体及其子代植物体中的GUS基因的存在时，确认了无论是再分化本代还是子代植物体中均存在导入基因(非专利文献9)。该结果支持用土壤杆菌转化稻，但转化效率非常低，仅为1.6％，相对于供试的250个未成熟胚，显示正常生长的再生植物体只有1个个体。为了摘出稻的未成熟胚，需要大量劳力，因此很难说这样的低转化效率到达了实用水平。

近年来，有报告称：通过利用具有强病原性土壤杆菌的一部分病原性基因的超级二元载体，即使在稻、玉米等单子叶植物中，也能够进行稳定、高效率的转化(非专利文献10和11)。这些报告认为，利用土壤杆菌进行的转化除了能够实现稳定、高效率的转化之外，还具有下述优点：所得转化植物的突变少，导入基因的拷贝数少、且多为完好形式。继在稻、玉米中取得成功之后，还有报告称在主要谷类即小麦(非专利文献12)、大麦(非专利文献13)和蜀黍(非专利文献14)中利用土壤杆菌进行了转化。

Ishida等人(1996)以玉米自交系(inbred)为材料利用土壤杆菌进行了转化。其后，相继又有关于利用土壤杆菌转化玉米的报告(非专利文献15-21)。作为改善利用土壤杆菌转化玉米的效率的尝试，有：在N6基本培养基中转化选择细胞(非专利文献20)、在培养基中添加AgNO₃和羧苄西林(非专利文献20、22)、在共存培养基中添加半胱氨酸(非专利文献21)，等等。Ishida等人(2003)(非专利文献22)报告：通过用含AgNO₃和羧苄西林的培养基选择共存培养后的玉米未成熟胚，提高了玉米的转化效率。

通过如上述地改变培养基组成、选择标记基因，提高了利用土壤杆菌转化玉米的效率，并扩大了适应品种。但是，其效率仍比与玉米同属单子叶作物的稻要低，在考察分离出的新基因的效果的实验研究中、以及在通过基因重组制作新玉米品种等情况下，希望开发出具有更高转化效率的方法。

麦草畏(Dicamba)(3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)与2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)一样作为植物激素的生长素在植物组织培养中使用。在玉米的组织培养中也使用麦草畏。Duncan等报告：分别用含4.5μM的2，4-D和15μM的麦草畏的培养基培养玉米的未成熟胚，与2，4-D相比，使用含麦草畏的培养基时具有再分化能力的愈伤组织的形成率高(非专利文献23)。但是，近年报告的利用土壤杆菌进行的玉米转化中，几乎所有的未成熟胚培养均是使用含2，4-D的培养基进行的(非专利文献15-21、24和25)。Frame等报告：分别用含2，4-D和麦草畏的培养基进行利用土壤杆菌的玉米转化，使用含麦草畏的培养基时的转化效率高。但是，Frame等所比较的培养基中，2，4-D的浓度为6.75μM，而麦草畏的浓度与之不同，为15μM，是2，4-D的浓度的2倍以上，而且除2，4-D和麦草畏以外，在组成上也存在差异。于是，讨论认为产生转化效率差异的原因是含麦草畏的培养基的硝酸银浓度比含2，4-D的培养基高，而没有记述生长素的差异带来的效果(非专利文献26)。

如上述，在利用土壤杆菌的玉米转化中，采用目前的方法虽可稳定地获得转化植物，但与同为单子叶作物的稻相比，转化效率低，希望开发出能够以更高效率获得转化体的方法。

专利文献1：特开2000-342255

专利文献2：特开2000-342256

专利文献3：特开2000-23675

专利文献4：特开2000-342253

专利文献5：WO2005/017169

专利文献6：WO2005/017152

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发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的是：提供一种与传统公知的土壤杆菌法相比、提高植物转化效率的方法。

解决问题的方法

本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过采用包含用含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(麦草畏)的共存培养基培养接种了土壤杆菌的植物组织的共存步骤的转化方法，与使用2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的传统方法相比，植物的转化效率提高，从而想到了本发明。本发明优选以以下描述的方式实施，但不限于此。

本发明提供一种提高植物转化效率的方法，该方法包括用含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培养基培养接种了土壤杆菌的植物组织的共存步骤。

在本发明的优选方式中，共存培养基中不含有除3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸以外的生长素类。

此外，在本发明的优选方式中，共存培养基中的3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的浓度为0.5-3.0mg/l。

此外，在本发明的优选方式中，与仅使用2，4-二氯苯氧基乙酸作为共存培养基中的生长素类的情况相比较，植物的转化效率提高1.3倍以上、更优选2.4倍以上。

此外，在本发明的优选方式中，接种土壤杆菌的植物组织来源于单子叶植物的组织；在更优选的方式中，接种土壤杆菌的植物为玉米、小麦或大麦。接种土壤杆菌的单子叶植物的组织为未成熟胚、愈伤组织、花芽或完熟种子的发芽部位，最优选为未成熟胚(未熟胚)。

而且，在本发明的优选方式中，植物组织经过热处理和/或离心处理。

此外，在本发明的优选方式中，共存培养基还包含硝酸银和/或硫酸铜。

在本发明的其它方式中，本发明提供一种转化植物的制备方法，该制备方法包含以下步骤：

(i)用含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培养基培养接种了土壤杆菌的植物组织的共存步骤；

(ii)用含生长素的培养基培养(i)中所得的组织、并对转化体进行药物选择的选择步骤；和，

(iii)用含选择药物的再分化培养基培养(ii)中选择出的组织、使之再分化的再分化步骤。

以下具体说明本发明的构成。

本发明提供一种提高植物转化效率的方法，其包括共存步骤——用含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培养基培养接种了土壤杆菌的植物组织。

使用土壤杆菌进行的植物组织转化通常按以下步骤进行。即，(i)接种步骤：将土壤杆菌接种到植物组织、(ii)共存步骤：用含2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的共存培养基进行培养、(iii)选择步骤：用含2，4-D和选择药物的选择培养基进行培养、和(iv)再分化步骤：用含选择药物的再分化培养基进行培养。

在如上述的传统转化方法中，许多情况下在共存步骤中使用2，4-D作为生长素类，基本上没有用其它生长素类替代2，4-D、或与2，4-D同时在共存培养基中使用的情况。而且，在本说明书中，“生长素”和“生长素类”包括本技术领域公知的天然来源的生长素和人工合成的生长素，包括例如2，4-D、麦草畏、4-氨基-3，5，6-三氯2-吡啶甲酸(毒莠定，picloram)、2，3，5-三碘苯甲酸(TIBA)、2，4，5-三氯苯氧基乙酸(2，4，5-T)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)等。

在本发明中，以在共存培养基中含有3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(麦草畏)为特征之一，通过这样来提高植物的转化效率。在本发明的更优选方式中，共存培养基中不含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(麦草畏)以外的生长素类。

植物是否被转化，可以采用公知的各种方法来确定。例如通过使转化的基因为GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)基因、萤光素基因或者GFP基因等报告基因，采用简便公知的方法目测观察这些报告基因的表达部位，可以确认有无转化。此外，可以利用抗生素抗性基因、除草剂抗性基因等选择标记基因的表达，通过用含抗生素或者除草剂的培养基培养植物细胞、或者用抗生素溶液、除草剂溶液处理植物，以其抗性的表达为指标，来确认有无转化。

为了更切实地确定是否发生了转化，例如可以这样进行：采用Southren杂交法确认导入基因整合到植物染色体上、以及确认导入基因在子代植物中的表达(遗传给子代)等。Southren杂交法可以按公知方法进行，例如按分子克隆(Molecular Cloning)(非专利文献29)中记载的方法进行。此外，子代植物中表达的确认，可以通过考察GUS基因等报告基因的表达、除草剂耐性基因等选择标记基因的表达的方法来施行。具体而言，可以按非专利文献11记载的方法进行，但不限于此。

转化效率可以采用本领域技术人员一般使用的计算方法来确定。例如，可以通过用转化了的植物数除以接种了土壤杆菌的外植体(explant)数而算出的值来求出。

在本发明中，“植物的转化效率提高”是指：与如上述的共存培养基中仅包含2，4-D作为生长素的传统的利用土壤杆菌的转化方法相比较，转化效率有所提高。使用本发明的方法，则与使用2，4-D的方法相比，转化效率在实施例1中提高至1.3倍，在实施例2中提高至2.4倍。因此，根据本发明，转化效率优选提高至1.3倍以上、更优选2.0倍以上、更优选2.4倍以上。

以下，对本发明的提高植物转化效率的方法的各步骤进行说明。

(1)土壤杆菌的接种步骤

本发明中使用的植物组织接种土壤杆菌。本说明书中使用的“接种”是指：使土壤杆菌与植物组织接触，本技术领域中各种接种土壤杆菌的方法是公知的。作为本方法，可以列举出例如：在将土壤杆菌悬浮在液体培养基中而得到的悬浊液中加入植物组织的方法、将土壤杆菌的悬浊液直接滴加到共存培养基上的植物组织上的方法、向植物组织中注入土壤杆菌悬浊液的方法、和将植物组织浸渍在土壤杆菌悬浊液中并减压的方法等。然而，本发明中使用的接种了土壤杆菌的植物组织并不限于采用这些方法接种了土壤杆菌的植物组织。

在该土壤杆菌的接种步骤中，为了改善利用土壤杆菌的转化效率，可以使土壤杆菌的悬浊液中包含例如乙酰丁香酮(acetosyringone)、表面活性剂、多孔性陶瓷等各种添加剂。

本发明中可使用的土壤杆菌可以是公知的任何土壤杆菌。在本发明的优选方式中，土壤杆菌为例如LBA4404、EHA101和AGL1、C58C1等，但不限于此。当在载体方面不使用超级二元载体(非专利文献10和11)时，从转化效率的观点来看，优选使用含有土壤杆菌A281(非专利文献31)所具有的Ti质粒pTiBo542的菌株。

公知土壤杆菌具有将插入在土壤杆菌内的质粒T-DNA中的基因导入到植物的基因组中的性质。因此，可在本发明中使用的土壤杆菌具有将希望表达的基因插入到T-DNA中而得到的质粒。于是，通过将具有该质粒的土壤杆菌接种到植物组织，可以转化植物。这样，可以赋予组织中的植物细胞以优选的形状。可在本发明中使用的土壤杆菌用质粒例如有pSB131、U0009B、U0017S、pSB134、pNB131和pIG121Hm等，但不限于此。在不使用含Ti质粒pTiBo542的菌株作为土壤杆菌株的情况下，从转化效率的观点来看，优选使用超级二元载体(非专利文献10和11)。

可在本发明中使用的植物组织所来源的植物可以是单子叶植物和双子叶植物，优选为单子叶植物，更优选为玉米、小麦、大麦，最优选为玉米。此外，可在本发明中使用的植物组织可以是例如植物的细胞、叶、根、茎、果实、未成熟胚、愈伤组织、花芽、完熟种子的发芽部位、其它部位的植物组织，优选为未成熟胚、花芽和完熟种子的发芽部位，最优选为未成熟胚。在本说明书中，未成熟胚是指：处于受粉后的成熟过程中的未熟种子的胚。对于用于本发明的方法的未成熟胚的时期(成熟期)没有特殊限制，可以是在受粉后的任何时期采集的未成熟胚。优选受粉7～14天后的未成熟胚。

为了提高转化效率，如上述的植物组织还可以经过各种处理。作为这样的处理，可以列举出例如：加热处理(专利文献1)、离心处理(专利文献2)、热和离心处理(专利文献4)以及加压处理(专利文献5)等。

(2)共存步骤

本步骤中，通过在土壤杆菌的共存下用含生长素类的培养基培养如上述地接种了土壤杆菌的植物细胞，来将DNA从土壤杆菌确实地导入植物细胞。本步骤中使用的培养基在本说明书中称为“共存培养基”。共存培养基可以是植物细胞培养中通常使用的培养基例如以LS无机盐类(非专利文献30)、N6无机盐类(非专利文献31)为基本成分的培养基，具体地可以列举出LS-AS培养基等。

根据传统的转化法，在共存培养基中添加2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)作为生长素类。在本发明中，共存培养基中包含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(麦草畏)是其特征之一。本发明的优选方式中，共存培养基中不含麦草畏以外的生长素类。

共存培养基中麦草畏的量，可以与传统方法中2，4-D的量相同，优选为0.5-3.0mg/l、更优选为0.5-2.5mg/l、更优选为1.0-2.0mg/l、最优选为1.5mg/l。

为了提高转化效率，在共存培养基中，除了麦草畏以外，还可以加入各种添加剂。这样的添加剂有例如硝酸银(专利文献3)、硫酸铜(非专利文献6)和半胱氨酸(非专利文献21)等。

在本步骤中，共存培养基中可以仅含有麦草畏作为生长素类，或者也可以含有麦草畏及其它生长素类。生长素类一般具有使植物组织脱分化的作用，因此，在本步骤和接下来的选择步骤中，所有植物组织的一部分或全部成为脱分化组织(愈伤组织)。本说明书中使用的术语“脱分化(dedifferentiation)组织”或“愈伤组织”是指：通过用含生长素、细胞分裂素等植物生长调节物质的培养基培养经分化的植物组织的一部分(外植体)而得到的组织，该组织是无定形的未分化状态的细胞块，其不具有作为原来的植物组织的形态。因此，脱分化组织关系到的所有方式均在本发明的范围内，包括以脱分化组织的状态开始共存步骤的情况，以及分化的植物组织在共存步骤中或以下的选择步骤中全部脱分化和部分脱分化的情况，等等。

本步骤中“培养”是指：使植物组织着床(置床)于固体化的共存培养基上或液体共存培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间(期間)内生长繁育。共存培养基的固体化可以通过添加本技术领域公知的固体化剂来进行，作为这样的固体化剂，已知有例如琼脂糖等。本步骤中的培养温度可以适宜地选择，优选在20℃-35℃、更优选25℃进行。此外，本步骤的培养优选在暗处进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选择，优选为1天-10天、更优选为7天。

(3)选择步骤

本发明以以上描述的共存步骤为特征。以下描述的选择步骤和再分化步骤为在利用土壤杆菌的植物转化方法中通常采用的方法。因此，以下的描述仅用于示例，本发明不受以下的描述的限定。

本步骤中，用含生长素类的培养基培养通过上述步骤得到的组织，通过有无基因导入来选择转化体。本步骤中使用的培养基在本说明书中称做“选择培养基”。可作为选择培养基使用的培养基可以列举出例如：以LS无机盐类(非专利文献30)、N6无机盐类(非专利文献31)为基本成分的培养基，具体地有例如LSD1.5培养基等。按常规方法，选择培养基中添加生长素类，优选2，4-D。在本发明中，对于本选择步骤中使用的生长素类没有特殊限定，优选为2，4-D。而且，视需要可以加入各种添加物。

转化植物的选择，可以通过例如用含适当选择药物的选择培养基培养经过上述共存步骤的植物，根据有无对选择药物的抗性来进行。可在本步骤中使用的选择药物，可以使用本技术领域通常使用的选择药物。例如，作为选择药物，可以使用抗生素和/或除草剂。作为抗生素，可以使用例如潮霉素(Hygromycin)、卡那霉素或灭瘟素S(blastcidin S)等。而且，作为除草剂，可以使用例如草胺膦(フオスフイノスライシン，phosphinothricin)、双丙氨膦(bialaphos)或草甘膦(glyphosate)等。

为了进行本选择步骤，插入土壤杆菌中的T-DNA中的DNA，不仅要包含希望在植物中表达的基因，还必须包含例如对选择药物的抗性基因等。这样的对选择药物的抗性基因在本技术领域是公知的。在本步骤中，例如在含潮霉素的选择培养基中进行选择的情况下，植物中必须由土壤杆菌导入潮霉素耐性基因。

或者，转化植物的选择可以基于植物细胞的糖营养缺陷性(糖要求性)来进行。已知植物细胞能够利用的糖有蔗糖、葡萄糖等，但不能利用甘露糖。因此，用仅含甘露糖作为碳源的培养基培养植物组织时，由于没有可利用的糖，植物组织会枯死。基于糖营养缺陷性的选择正是利用了这一原理。即，为了利用该选择方法，插入土壤杆菌中的T-DNA中的DNA除了希望在植物中表达的基因外，还必须包含磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase：PMI)基因。此处，导入了PMI基因的植物细胞能够利用甘露糖作为碳源。因此，仅有用如上述的土壤杆菌转化了的植物组织能够在仅以甘露糖为碳源的培养基上生长繁育，这样就能够仅选择出转化植物组织(非专利文献16)。这样的方法也可以针对其它糖进行。例如，导入了木糖异构酶基因的植物细胞能够利用木糖作为碳源，因此适用于这种方法。

因此，在基于糖营养缺陷性进行转化植物的选择时，植物组织应从土壤杆菌导入使得能够利用通常植物细胞不能利用的糖类的基因。这样的基因在本技术领域是公知的，可以使用例如PMI基因、木糖异构酶基因等。此外，在选择培养基中，需要排除植物细胞通常能够使用的、培养基中通常包含的蔗糖和葡萄糖等，取而代之仅含通常的植物细胞不能利用的糖类作为碳源。此处，“通常的植物细胞不能利用的糖类”是指：因野生型植物细胞中不存在编码代谢酶的基因而不能作为营养源的糖类，包括例如甘露糖、木糖等。

此外，可以导入容易检测的基因作为筛选的指标，通过有无该基因的表达来进行选择。作为这种作为筛选的指标的基因，可以列举出GFP基因等。检测表达这些基因的细胞、组织的方法是本技术领域公知的。可以监测表达如上述的基因的部位，通过切分表达部位等来进行选择。

本步骤可以变更培养基的成分组成，反复进行多轮。例如、在多轮选择步骤中，通过在各轮选择步骤中提高选择药物的浓度，可以增强药物选择的切实可行性，提高获得转化了的植物体的可能性。本选择步骤优选进行至少2轮、更优选进行3轮。此外，在进行多轮选择步骤的情况下，通过切割取下用含选择药物的培养基培养的组织中的增殖部分，仅将该增殖部分用于下一轮选择步骤，可以高效地获得转化组织。

本步骤中“培养”是指：使植物组织着床于固体化的选择培养基上或液体选择培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间(期間)内生长繁育。选择培养基的固体化可以利用诸如上述的琼脂糖等进行。本步骤中的培养温度可以适宜地选择，优选在20℃-35℃、更优选在25℃进行。此外，本步骤的培养优选在暗处进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选择，例如，在进行3轮选择步骤的情况下，可以第1轮选择进行2周、第2轮选择进行3周、第3轮选择进行3周，共计8周。此外，多轮选择步骤整体优选进行6-10周、更优选7-9周。此外，在进行多轮的选择的情况下，可以变更每轮的培养时间、温度和明暗条件。

(4)再分化步骤

本步骤中，用培养基培养上述选择步骤中选择出的组织，从而使之再分化。本步骤中使用的培养基在本说明书中中称做“再分化培养基”。再分化培养基不含生长素类。可以作为再分化培养基使用的培养基可以列举出例如以LS无机盐类、N6无机盐类为基本成分的培养基，具体例如有LSZ培养基等。

本步骤中，一般地，再分化培养基含有选择药物。可以在本步骤中使用的选择药物的定义与选择步骤中的相同。然而，在本步骤中，并非一定要使用与选择步骤中使用过的选择药物相同的选择药物。在这种情况下，必须从土壤杆菌向植物中导入2种以上的对选择药物的抗性基因。

本发明中“再分化”是指：全部或部分脱分化的植物组织重新获得原植物组织或植物体的性质。在本发明中，通过共存步骤和选择步骤中的生长素类的作用，所有接种了土壤杆菌的植物组织的全部或一部分出现了脱分化。因此，通过进行本步骤，脱分化组织发生再分化，可以获得完整的转化植物体。

本步骤中“培养”是指：使植物组织着床于固体化的再分化培养基上或液体再分化培养基中，使之在合适的温度、明暗条件和时间(期間)内生长繁育。再分化培养基的固体化可以利用诸如上述的琼脂糖等进行。本步骤中的培养温度可以适宜地选择，优选在20℃-35℃、更优选25℃进行。此外，本步骤的培养优选在16-24小时/天的照明下进行，但不限于此。本步骤的培养时间也可以适宜选择，优选7天-21天，更优选14天。

在进行本步骤之后，可以通过本技术领域公知的方法容易地得到完整的转化植物体。因此，本发明还提供包含以下步骤的转化植物的制备方法：

(i)用含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培养基培养接种了土壤杆菌的植物组织的共存步骤；

(ii)用含生长素的培养基培养(i)中所得的组织、并用药物选择转化体的选择步骤；和

(iii)用含选择药物的再分化培养基培养(ii)中选择出的组织，使之再分化的再分化步骤。

发明的效果

根据本发明，可以提高植物的转化效率。这样，可以高效率地获得转化了的植物体，可以降低获得该植物体的成本。

附图说明

图1为图表，显示了共存培养基中生长素的种类对玉米转化效率的影响。各区提供33-35个未成熟胚。纵轴表示转化效率(各区中，所得的GUS阳性植物数/接种未成熟胚数)，横轴表示共存培养培养基中所含的生长素的种类。共存培养基中的生长素浓度均为1.5mg/l。

图2显示了土壤杆菌菌株LBA4404(U0009B)所携带的质粒U0009B的结构。

质粒名：U0009B.prj

质粒大小：12347bp

图3为图表，显示了共存培养基中的生长素种类对采用滴下接种法时的玉米转化效率的影响。各区提供25-26个未成熟胚。纵轴表示转化效率(各区中，所得的GUS阳性植物数/接种未成熟胚数)，横轴表示共存培养培养基中生长素的种类。共存培养基中的生长素的浓度均为1.5mg/l。

实施例

以下，通过实施例说明本发明，但实施例仅为举例，并不是对本发明的限制。本发明的范围应以权利要求书的描述为准。而且，本领域技术人员基于本说明书的描述，可以容易地进行修正、变更。

实施例1

添加各种生长素的共存培养基对转化效率的效果

材料和方法

无菌条件下采集受粉后第7～14天的玉米(品种：A188)的未成熟胚(大小1.0-1.5mm)，用LS-inf液体培养基(非专利文献11)清洗1次。为了提高基因导入效率进行了前处理(46℃、3分钟的热处理和15,000rpm、10分钟的离心处理)。在含100μM乙酰丁香酮的LS-inf液体培养基中以约1.0×10⁹cfu/ml悬浮土壤杆菌菌株LBA4404(pSB131)(非专利文献11)作为接种源。向经过了热和离心处理的未成熟胚中加入接种源，搅拌30秒钟后，室温静置5分钟。将接种土壤杆菌后的未成熟胚以胚盘向上的方式分别着床于下述共存培养基，所述共存培养基是在含5μM AgNO₃和5μM CuSO₄的LS-AS培养基(非专利文献11、固体化剂为8g/l琼脂糖)分别添加浓度为1.5mg/l的2，4-D、2，4，5-T(2，4，5-三氯苯氧基乙酸)、毒莠定(Picloram，4-氨基-3，5，6-三氯2-吡啶甲酸)、TIBA(2，3，5-三碘苯甲酸)、麦草畏而得到的。对照培养基为含5μMAgNO₃和5μM CuSO₄的LS-AS培养基(固体化剂为8g/l琼脂糖)。

将25℃、黑暗条件下培养7天而得到的未成熟胚着床于含5μM AgNO₃、5mg/l草胺膦(PPT)、250mg/l羧苄西林、100mg/l头孢噻肟(cefotaxime)的LSD1.5培养基(非专利文献11)，25℃、黑暗条件下培养10天。将未成熟胚移植到PPT浓度为10mg/l的相同培养基上，相同条件下培养3周。用手术刀切取观察到增殖的愈伤组织，着床于相同组成的培养基上，相同条件下培养3周。切取增殖的愈伤组织，着床于含10μM CuSO₄、5mg/l PPT的LSZ培养基(非专利文献11)，25℃、照明下培养约2周。考察观察到植物体再分化的未成熟胚的个数，并且切取再分化出的植物的叶的一部分，浸渍在含0.1％的Triton X-100的0.1M磷酸缓冲液(pH 6.8)中，37℃静置1小时。除去磷酸缓冲液后，添加了含1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和20％甲醇的磷酸缓冲液。37℃处理24小时后，考察了GUS基因的表达。

结果

从用以2，4-D为生长素的对照共存培养基培养的未成熟胚中，以20.6％的效率获得了转化植物。与此相对，用添加麦草畏作为生长素的共存培养基培养的未成熟胚的转化效率高达27.3％，可知：通过以麦草畏为共存培养基的生长素，转化效率得以提高。因此，可知：通过使共存培养基中含有麦草畏做为生长素，与使用2，4-D的传统方法相比，转化效率提高27.3/20.6＝1.33倍。另一方面，以2，4，5-T和毒莠定为生长素的培养基的转化效率比对照差。从用添加TIBA的培养基共存培养的未成熟胚中，没有得到转化植物(图1)。

实施例2

共存培养基中的麦草畏和2，4-D对滴下接种法的转化效率的影响

材料和方法

在以pSB11(非专利文献27)为基本骨架的载体中增加必要的元件，构建了图2、SEQ ID NO：1的载体U0009B。在同样采用实施例1的方法制备的土壤杆菌菌株LBA4404(U0009B)的接种源1ml中添加约80mg的羟基磷灰石(Bio-Rad)。为了提高基因导入效率对未成熟胚(品种A188)进行了前处理(46℃、3分钟的热处理和15,000rpm、10分钟的离心处理)，将所得未成熟胚以胚盘向上的方式着床于下述共存培养基，所述共存培养基是在含5μMAgNO₃和5μM CuSO₄的LS-AS培养基(非专利文献11、固体化剂为8g/l琼脂糖)中分别添加1.5mg/l浓度的2，4-D或麦草畏而得到的。对照培养基为含5μMAgNO₃和5μMCuSO₄的LS-AS培养基(固化剂为8g/l琼脂糖)。用漩涡混合器(Vortex Mixer)进行搅拌，使得接种源中的羟基磷灰石均匀分散，然后将5μl的接种源滴加到未成熟胚上。滴下的接种源干燥后，将未成熟胚移动到同一培养基上的其它位置。将培养器密封后，25℃、黑暗条件下进行7天的共存培养。采用以实施例1相同的方法培养共存培养后的未成熟胚，获得再分化植物，并且用再分化植物的叶考察了GUS基因的表达。

结果

从用以2，4-D为生长素的对照共存培养基培养的未成熟胚中，以11.5％的效率获得了转化植物。与此相对，用添加麦草畏作为生长素的共存培养基培养的未成熟胚的转化效率高达28.0％，可知：通过以麦草畏为共存培养基的生长素，在采用滴下接种法的转化中，效率有所提高(图3)。在采用滴下接种法的转化中，效率有所提高(图3)。根据本方法，通过在共存培养基中添加麦草畏，与使用2，4-D的传统方法相比，转化效率提高28.0/11.5＝2.43倍。

实施例3

Southren分析

材料和方法

从实施例1中得到的显示GUS基因表达的转化植物的叶，按小鞠等的方法(非专利文献28)抽提了DNA。将抽提出的DNA用制限酶BamHI处理，采用以GUS基因为探针的Southren法进行了导入基因的检测。Southren法按分子克隆(非专利文献29)中描述的方法进行。

结果

任何转化体均显示与GUS探针杂交的条带。其模式(pattern)因转化体而异，这显示：导入基因随机地插入到植物的染色体上。显示GUS阳性的个体的条带数为1-3条，可知：插入的导入基因的拷贝数都很少(表1)。

[表1]

表1转化当代植物(T0)中的GUS基因的拷贝数

GUS基因的拷贝数	1	2	3
				T0植物个体数	11	2	2

Claims (6)

1.一种提高玉米未成熟胚转化效率的方法，该方法包括：

(i)共存步骤：用含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培养基培养接种了土壤杆菌的玉米未成熟胚，所述共存培养基中不含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸以外的生长素类，且所述共存培养基为以LS无机盐类为基本成分的培养基，所述共存培养基还含有硝酸银和/或硫酸铜；和

(ii)选择步骤：用含有2，4-二氯苯氧基乙酸的选择培养基培养(i)中所得的组织，所述选择培养基中不含2，4-二氯苯氧基乙酸以外的生长素类，且所述选择培养基为以LS无机盐类为基本成分的培养基，所述选择培养基中含有抗生素和/或除草剂，所述抗生素选自潮霉素、卡那霉素、灭瘟素S、羧苄西林、头孢噻肟，所述除草剂选自草胺膦、双丙胺膦、草甘膦。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述共存培养基中的3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的浓度为0.5-3.0mg/l。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，与仅使用2，4-二氯苯氧基乙酸作为共存培养基中的生长素类的情况相比，玉米的转化效率提高至少1.3倍。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述玉米未成熟胚经过了热处理和/或离心处理。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述玉米未成熟胚经过了热处理和/或离心处理。

6.一种转化玉米的制备方法，该方法包括以下步骤：

(i)共存步骤，用含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培养基培养接种了土壤杆菌的玉米未成熟胚，所述共存培养基中不含3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸以外的生长素类，且所述共存培养基为以LS无机盐类为基本成分的培养基，所述共存培养基还含有硝酸银和/或硫酸铜；

(ii)选择步骤：用含2，4-二氯苯氧基乙酸的培养基培养(i)中所得的组织，所述选择培养基中不含2，4-二氯苯氧基乙酸以外的生长素类，且所述选择培养基为以LS无机盐类为基本成分的培养基，所述选择培养基中含有抗生素和/或除草剂，所述抗生素选自潮霉素、卡那霉素、灭瘟素S、羧苄西林、头孢噻肟，所述除草剂选自草胺膦、双丙胺膦、草甘膦；和

(iii)再分化步骤：用含选择药物的再分化培养基培养(ii)中选择出的组织，使其再分化。

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