WO2016104583A1 - アグロバクテリウム菌を用いた、ソルガム属植物への遺伝子導入方法およびソルガム属植物の形質転換植物の作成方法 - Google Patents

アグロバクテリウム菌を用いた、ソルガム属植物への遺伝子導入方法およびソルガム属植物の形質転換植物の作成方法 Download PDF

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WO2016104583A1
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plant
agrobacterium
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tissue
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雅子 綱島
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日本たばこ産業株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4666—Sorghum, e.g. sudangrass

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing a gene into a sorghum plant via an Agrobacterium.
  • the present invention further relates to a method for producing a transformed plant of a sorghum plant via an Agrobacterium.
  • Sorghum is a gramineous short-day monocotyledonous plant native to Africa. Sorghum has high water use efficiency, high resistance to drought and high temperature, is the main cereal after corn, rice, wheat and barley, and is an important food in African and Asian countries. In addition, since sorghum has a high sugar content and can be used as a raw material for bioethanol, technical development for improving the agricultural traits of sorghum has been actively conducted. The entire genome of sorghum has been deciphered, and analysis of genes and quantitative loci (QTLs) related to useful agronomic traits unique to sorghum is also progressing. Development of genetic recombination technology in sorghum is considered to play an important role in improving sorghum agronomic traits.
  • QTLs quantitative loci
  • direct DNA introduction method For transformation of monocotyledonous plants such as barley, wheat, corn and rice, which are the main cereals, physicochemical methods (direct DNA introduction method) such as polyethylene glycol method, electroporation method, particle gun method and agro
  • a biological method indirect DNA introduction method that utilizes the functions of bacteria belonging to the genus Bacteria is known.
  • the gene introduction method hereinafter referred to as the Agrobacterium method
  • the introduced copy number of the target gene is kept low by controlling the expression of genes in the pathogenic region (vir region) of the Ti plasmid, It is rarely introduced in a fragmented manner. Therefore, many individuals can be obtained in which the target gene is highly expressed in the obtained transformant, and there is a great advantage that the difference in expression level between individuals is small compared to the direct introduction method.
  • the Agrobacterium method is universally used as a transformation method for dicotyledonous plants.
  • the host of Agrobacterium in nature is limited to dicotyledonous plants, and for a long time it has been thought not to infest monocotyledons.
  • a high-efficiency transformation method via Agrobacterium was reported for the first time in the main crop of rice. (Hiei et al. 1994: Non-Patent Document 1).
  • maize Ishida et al. 1996: Non-patent document 2
  • wheat Choeng et al.
  • Non-Patent Document 5 reports the success of Agrobacterium-mediated transformation.
  • Prior art related to sorghum transformation method by Agrobacterium method 1) Plant tissue inoculated with Agrobacterium As a sorghum tissue used for inoculating Agrobacterium, immature embryos are used. Patent Document 5). 2) Pretreatment As one of the methods for improving the transformation efficiency by the Agrobacterium method, heat treatment or centrifugation treatment is applied to the plant material to be transformed for transformation into several monocotyledonous plants. (Hiei et al. 2006: Non-Patent Document 6). Also in sorghum, it has been reported that treatment of immature embryos prior to infection with Agrobacterium at 43 ° C. for 3 minutes improves the transformation efficiency by about 3 times compared to the untreated group (Gurel et al.
  • Non-patent document 7 2009: Non-patent document 7).
  • the centrifuging process produced a negative result in sorghum transformation.
  • 4) Callus formation process The callus formation process is a process of dedifferentiating plant tissue. In the tissue culture process of sorghum, phenol compounds are excessively produced and callus formation tends to be inhibited (Cai et al. 1987: Non-Patent Document 8).
  • PVPP polyvinylpolypyrrolidone
  • BAP 6-benzylaminoproline
  • the transient expression or trait of the transgene can be obtained by using a medium with an increased ammonium nitrate concentration in the tobacco as a medium for preculturing plant material before inoculation with Agrobacterium. It has been reported that conversion efficiency has been improved (Boyko et al. 2009: Non-Patent Document 17). In addition, it has been reported that the transformation efficiency of Arabidopsis thaliana and tobacco has been improved by adding potassium chloride and rare earth element chloride to the medium for pre-culturing plant tissues before inoculation with Agrobacterium (Boyko et al. IV 2011: Non-patent document 18).
  • Non-patent Document 14 A method for promoting the transient expression of the transgene by adding an antioxidant or copper to the co-culture medium has also been reported.
  • L-cysteine 0.4 g / L
  • DTT dithiothreitol
  • N6 medium is mainly used as a rice bran culture medium.
  • the B5 medium has been developed for liquid culture, but is also used for many plant tissue cultures as a solid medium.
  • R2 medium is a medium developed for rice suspension culture cells based on B5 medium.
  • CC medium is a medium devised as a callus formation medium from corn protoplasts.
  • the table below shows the total concentrations of NH 4 + and NO 3 ⁇ as nitrogen sources and various inorganic ions (MS medium, LS medium, N6 medium, B5 medium, R2 medium and CC medium, which are known basic media)
  • MS medium, LS medium, N6 medium, B5 medium, R2 medium and CC medium which are known basic media
  • concentration of magnesium ion, potassium ion, calcium ion, and sodium ion is summarized.
  • An object of the present invention is to provide a method for introducing a gene into a sorghum plant, which is more efficient than a conventionally known Agrobacterium method, and a method for producing a transformed plant of the sorghum genus. .
  • the present inventors have prepared a process for preparing a plant material of a sorghum plant, a process for inoculating Agrobacterium on the tissue of the plant material, and / or coexistence.
  • the process by using a medium in which the concentration of the nitrogen source and / or the concentration of inorganic ions selected from magnesium ion, potassium ion, calcium ion and sodium ion is higher than that of a medium containing 1-fold amount of LS inorganic salt
  • the inventors have found that gene transfer efficiency and transformation efficiency are improved in plants of the genus Sorghum.
  • the present invention is preferably carried out in the modes described below, but is not limited thereto.
  • a method for gene transfer to a plant material tissue of a plant of the genus Sorghum (I) preparing the plant material; (Ii) a step of inoculating the tissue of the plant material with Agrobacterium; and (iii) a coexistence step of culturing the tissue inoculated with the Agrobacterium in the presence of the Agrobacterium; Wherein, in the step (i), (ii) and / or (iii) above, a medium having an increased magnesium ion concentration, wherein the magnesium ion concentration is 4.0 mM or more and 100 mM or less.
  • the said method characterized by using the said culture medium.
  • a method for gene transfer to a plant material tissue of a plant of the genus Sorghum (I) preparing the plant material; (Ii) a step of inoculating the tissue of the plant material with Agrobacterium; and (iii) a coexistence step of culturing the tissue inoculated with the Agrobacterium in the presence of the Agrobacterium;
  • a medium having an increased concentration of nitrogen source wherein the total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ is The said method using the said culture medium which is more than 60 mM and 270 mM or less.
  • a method for gene transfer to a plant material tissue of a plant of the genus Sorghum (I) preparing the plant material; (Ii) a step of inoculating the tissue of the plant material with Agrobacterium; and (iii) a coexistence step of culturing the tissue inoculated with the Agrobacterium in the presence of the Agrobacterium;
  • a medium having an increased concentration of nitrogen source and / or magnesium ion wherein NH 4 + and NO 3
  • a method for gene transfer to a plant material tissue of a plant of the genus Sorghum (I) preparing the plant material; (Ii) a step of inoculating the tissue of the plant material with Agrobacterium; and (iii) a coexistence step of culturing the tissue inoculated with the Agrobacterium in the presence of the Agrobacterium;
  • a medium having an increased nitrogen source and / or potassium ion concentration wherein NH 4 + and NO 3
  • the medium has a total concentration of ⁇ 60 mM to 270 mM and a potassium ion concentration of 24 mM to 65 mM.
  • a method for gene transfer to a plant material tissue of a plant of the genus Sorghum (I) preparing the plant material; (Ii) a step of inoculating the tissue of the plant material with Agrobacterium; and (iii) a coexistence step of culturing the tissue inoculated with the Agrobacterium in the presence of the Agrobacterium;
  • a medium having an increased concentration of nitrogen source and / or calcium ion wherein NH 4 + and NO 3
  • a method for gene transfer to a plant material tissue of a plant of the genus Sorghum (I) preparing the plant material; (Ii) a step of inoculating the tissue of the plant material with Agrobacterium; and (iii) a coexistence step of culturing the tissue inoculated with the Agrobacterium in the presence of the Agrobacterium;
  • a medium having an increased nitrogen source and / or sodium ion concentration wherein NH 4 + and NO 3
  • a method for producing a transformed plant of a plant of the genus Sorghum Performing steps (i)-(iii) according to the method of any one of embodiments 1 to 7, (Iv) a resting step of culturing the tissue cultured in the coexistence step in a resting medium; and (v) a step of redifferentiating the tissue in a redifferentiation medium; Said method.
  • Agrobacterium is a bacterium selected from the group consisting of LBA4404, EHA101, EHA105, AGL0, AGL1, and C58C1.
  • the present invention makes it possible to introduce a sorghum plant with high efficiency. Further, it is possible to produce a sorghum transformed plant with high efficiency. According to the method of the present invention, the cost for obtaining a plant body transformed with sorghum can be reduced.
  • the present invention is a method for gene transfer to a plant material tissue of a plant of the genus Sorghum (Sorghum), (I) preparing the plant material; (Ii) a step of inoculating the tissue of the plant material with Agrobacterium; and (iii) a coexistence step of culturing the tissue inoculated with the Agrobacterium in the presence of the Agrobacterium; Wherein, in the step (i), (ii) and / or (iii), a medium having an increased nitrogen source concentration and / or inorganic ion concentration is used.
  • the method is provided.
  • the present invention is a method for producing a transformed plant of a sorghum plant, wherein (i) a step of preparing the plant material; (Ii) inoculating Agrobacterium on the tissue of the plant material; (Iii) a coexistence step of culturing the tissue inoculated with the Agrobacterium in the presence of the Agrobacterium; (Iv) a resting step of culturing the tissue cultured in the coexistence step in a resting medium; and (v) a step of redifferentiating the tissue in a redifferentiation medium; Wherein, in the step (i), (ii) and / or (iii), a medium having an increased nitrogen source concentration and / or inorganic ion concentration is used. The method is provided.
  • the plant from which the plant material that can be used in the present invention is derived is a sorghum plant.
  • the sorghum genus may be called the sorghum genus, in this specification, it describes in a unified manner with the name of "sorghum genus".
  • Examples of the plant of the genus “Sorghum” in the present specification include, but are not limited to, sorghum (Sorghum bicolor).
  • Sorghum (S. bicolor) is particularly preferred in the present invention.
  • Sorghum (S. bicolor) when it describes with "Sorghum (S. bicolor)" in this specification, it shall show the specific plant species called “sorghum” in "Sorghum genus”.
  • Sorghum (S. bicolor) is sometimes called sorghum, oyster millet or sorghum, but they are all the same plant species and can be used in the present invention.
  • Plant material that can be used in the present invention includes, but is not limited to, cells, leaves, roots, stems, berries, or any other plant cells belonging to the genus Sorghum for use in gene transfer or transformation of plants by the Agrobacterium method. It includes all aspects of the plant such as plant tissue, immature embryo, mature seed, callus or somatic embryo-like tissue (hereinafter referred to as callus or simply callus in this specification), or a complete plant body.
  • Preferred forms of plant material for use in the method of the present invention are immature embryos, fully-ripened seeds, and callus derived from them, and most preferred are immature embryos.
  • the term “immature embryo” refers to an embryo of an immature seed that is in the ripening process after pollination.
  • the stage (ripening stage) of the immature embryo provided for the method of the present invention is not particularly limited, and may be collected at any time after pollination, but preferably after 2 days after pollination. Is preferably 7 to 24 days after pollination. Although immature embryos can be used on the day of removal, they may be pre-cultured immature embryos.
  • ripe seed refers to a seed that has matured as a seed after the ripening process after pollination has been completed.
  • callus refers to an undifferentiated cell mass that grows randomly.
  • a plant tissue differentiated cell is a medium containing a plant growth regulator such as auxin (eg, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)), cytokinin (referred to as a dedifferentiation medium). It can be obtained by culturing. The process for obtaining this callus is called a dedifferentiation process, and this process is called a dedifferentiation process.
  • auxin eg, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)
  • cytokinin referred to as a dedifferentiation medium
  • the medium in which the concentration of nitrogen source and / or inorganic ion is increased refers to the concentration of nitrogen source and / or inorganic ion contained in MS (LS) basal medium well known to those skilled in the art.
  • MS (LS) basal medium refers to a medium containing a high concentration of nitrogen source and / or inorganic ions compared to the concentration of. High concentration means higher than the concentration of the nitrogen source and / or inorganic ions contained in the MS (LS) basal medium (Zhao, et al., 2000: Non-Patent Document 5).
  • MS (LS) basal medium contains NH 4 + and NO 3 ⁇ as nitrogen sources, and the total concentration thereof is 60.0 mM.
  • the MS (LS) basal medium contains 1.5 mM magnesium ions, 20.0 mM potassium ions, and 3.0 mM calcium ions. MS (LS) basal medium does not contain sodium ions. If the MS (LS) basal medium contains a higher concentration of nitrogen source and / or inorganic ions than the concentration of nitrogen source and / or inorganic ions contained in the MS (LS) basal medium, the medium will contain nitrogen source concentrations and / or inorganic ion concentrations. Medium with increased concentration.
  • the medium in which the concentration of the nitrogen source and / or the concentration of inorganic ions is increased is the above-mentioned (i) plant material preparation step, (ii) Agrobacterium inoculation step, and (iii) Used in at least one step of the coexistence step.
  • the medium is used in at least the step (iii).
  • the medium in which the concentration of the nitrogen source and / or the concentration of inorganic ions is increased is a medium in which the concentration of magnesium ions is increased.
  • the magnesium ion concentration in the medium in which the magnesium ion concentration is increased is 4.0 mM or more and 100 mM or less, preferably 4.8 mM or more and 90.4 mM or less.
  • the lower limit of the magnesium ion concentration may be selected from 4.0 mM or more, 4.8 mM or more, and 7.5 mM or more, and the upper limit is 100 mM or less, 90.4 mM or less, 80 mM or less, 70 mM or less. , 60 mM or less, 50 mM or less, 45.3 mM or less, 40.0 mM or less.
  • the lower limit and upper limit of the magnesium ion concentration can be appropriately selected from the above numerical values and combined.
  • the medium with increased nitrogen source concentration and / or inorganic ion concentration is a medium with increased nitrogen source concentration.
  • the total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ in the medium in which the concentration of the nitrogen source is increased is more than 60 mM and 270 mM or less, preferably 62 mM or more and 270 mM or less.
  • the lower limit of the total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ may be selected from more than 60 mM, 62 mM or more, 65 mM or more, 70 mM or more, 75 mM or more, and 80 mM or more, and the upper limit is 270 mM.
  • NH 4 + and NO 3 — may be selected from 263 mM or less, 250 mM or less, 225 mM or less, 200 mM or less, 175 mM or less, 150 mM or less, 125 mM or less, 115 mM or less, and 112 mM or less.
  • the lower limit and upper limit of the total concentration of NH 4 + and NO 3 — can be appropriately selected from the above numerical values and combined.
  • the medium in which the concentration of nitrogen source and / or the concentration of inorganic ions is increased is a medium in which the concentration of nitrogen source and / or the concentration of magnesium ion, potassium ion, calcium ion or sodium ion is increased.
  • the total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ in the medium in which the concentration of the nitrogen source and / or the concentration of magnesium ion, potassium ion, calcium ion or sodium ion is increased is 60 mM or more and 270 mM or less, preferably 62 mM or more and 112 mM or less. is there.
  • the lower limit of the total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ may be selected from 60 mM or more, 62 mM or more, 65 mM or more, 70 mM or more, 75 mM or more, and 80 mM or more, and the upper limit is 270 mM or less.
  • the lower limit and the upper limit of the total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ can be appropriately selected and combined from the above group of numerical values.
  • the magnesium ion concentration in the medium in which the concentration of the nitrogen source and / or the magnesium ion concentration is increased is 2.6 mM or more and 100 mM or less, preferably 4.8 mM or more and 90.4 mM or less.
  • the lower limit of the magnesium ion concentration may be selected from 2.6 mM or more, 4.0 mM or more, 4.8 mM or more, and 10.0 mM or more, and the upper limit is 100 mM or less, 90.4 mM or less, You may select from 80 mM or less, 70 mM or less, 60 mM or less, 50 mM or less, and 45.3 mM or less.
  • the lower limit and the upper limit of the magnesium ion concentration can be appropriately selected and combined from the above numerical group.
  • the potassium ion concentration in the medium in which the concentration of nitrogen source and / or potassium ion is increased is 24 mM or more and 65 mM or less, preferably 24 mM or more and 60 mM or less.
  • the lower limit of the potassium ion concentration may be selected from 24.0 mM or more, 27.0 mM or more, and 30 mM or more, and the upper limit is 70 mM or less, 65 mM or less, 64.1 mM or less, 60 mM or less, You may select from 55 mM or less, 50 mM or less, and 45 mM or less.
  • the lower limit and the upper limit of the potassium ion concentration can be appropriately selected and combined from the above numerical group.
  • the calcium ion concentration in the medium in which the concentration of the nitrogen source and / or the calcium ion concentration is increased is 5.2 mM or more and 10 mM or less, preferably 5.2 mM or more and 9.6 mM or less.
  • the lower limit of the calcium ion concentration may be selected from 5.2 mM or more, 5.5 mM or more, and 6.0 mM or more, and the upper limit is 10 mM or less, 9.6 mM or less, 9.0 mM or less. 8.0 mM or less, 7.5 mM or less, 7.0 mM or less, and 6.9 mM or less.
  • the lower limit and the upper limit of the calcium ion concentration can be appropriately selected and combined from the above numerical value group.
  • the sodium ion concentration in the medium in which the concentration of the nitrogen source and / or the concentration of sodium ion is increased is 0.6 mM or more and 200 mM or less, preferably 0.6 mM or more and 150 mM or less, more preferably 40.0 mM or more and 50.0 mM or less.
  • the lower limit of the sodium ion concentration may be selected from 0.6 mM or more, 1.0 mM or more, 4.0 mM or more, 10.0 mM or more, 20.0 mM or more, 30.0 mM or more, and 40.0 mM or more.
  • the upper limit is selected from 200 mM or less, 175 mM or less, 150.1 mM or less, 150 mM or less, 125 mM or less, 100 mM or less, 90.1 mM or less, 90 mM or less, 80 mM or less, 70 mM or less, 60 mM or less, and 50 mM or less Also good.
  • the lower limit and the upper limit of the sodium ion concentration can be appropriately selected and combined from the above numerical value group.
  • the gene introduction method and the preparation method of a transformed plant of this invention utilize Agrobacterium genus bacteria. Except for the steps specified in particular, it can be carried out in accordance with each step of a gene transfer method and a transformation method using a known genus Agrobacterium.
  • plant materials such as immature embryos and mature seeds are taken out from the plant body or seeds, or if necessary, by obtaining callus derived therefrom,
  • a plant material suitable for gene transfer or transformation is prepared.
  • the definition of “plant material” is as described above.
  • the plant material is prepared by isolating and collecting a tissue (including immature embryos, mature seeds, etc.) from a plant body of a sorghum plant.
  • plant material may be prepared by inducing callus from isolated and collected tissue. If desired, the plant material may be further cultured prior to infection with Agrobacterium.
  • the size of the plant material of the sorghum plant used in the present invention is not particularly limited.
  • a plant having a size of 1.0 to 3.0 mm can be used.
  • step (i) as described above, a medium in which the concentration of the nitrogen source and / or the concentration of inorganic ions is increased can be used.
  • various treatments for improving transformation efficiency may be performed.
  • Examples of such treatment include heat treatment, centrifugal treatment, heat treatment and centrifugal treatment, and pressure treatment.
  • the treatment for increasing the transformation efficiency is described in the following item 2. Will be described in detail.
  • step (Ii) Inoculating Agrobacterium in plant material tissue
  • step (ii) inoculating Agrobacterium in the plant material tissue of the sorghum plant prepared in step (i).
  • inoculating refers to bringing Agrobacterium into contact with a plant tissue
  • various methods of inoculating Agrobacterium are known in the art. Examples of the method include a method of adding a plant tissue to a liquid medium in which Agrobacterium is suspended, a method of directly dropping a suspension of Agrobacterium on a plant tissue on a coexisting medium, and an agrobacterium in a plant tissue. Examples thereof include a method of injecting a suspension of bacteria and a method of immersing plant tissue in the suspension of Agrobacterium and reducing the pressure.
  • the method of inoculating Agrobacterium in the method of the present invention is not limited to these methods.
  • various additives such as acetosyringone, surfactant, and porous ceramic sugar are added to Agrobacterium. It can be included in the suspension.
  • the Agrobacterium that can be used in the present invention is not particularly limited and may be any known Agrobacterium that can be used for the Agrobacterium transformation method.
  • the Agrobacterium is Agrobacterium tumefaciens such as, but not limited to, LBA4404, EHA101, EHA105, AGL0, AGL1 and C58C1.
  • Agrobacterium has a property of introducing a gene inserted into T-DNA of a plasmid in Agrobacterium into the plant genome. Therefore, Agrobacterium that can be used in the present invention has a plasmid in which a gene intended to be expressed in a plant is inserted into T-DNA.
  • a plant can be transformed by inoculating plant tissues with Agrobacterium having the plasmid. Thereby, the preferable character is provided to the plant cell in the tissue.
  • Examples of the plasmid for Agrobacterium that can be used in the present invention include, but are not limited to, pLC41, pSB131, U0009B, U0017S, pSB134, pNB131, and pIG121Hm.
  • step (ii) as described above, a medium in which the concentration of the nitrogen source and / or the concentration of inorganic ions is increased can be used.
  • various treatments for improving the transformation efficiency may be performed.
  • treatments for improving the transformation efficiency include heat treatment, centrifugal treatment, heat treatment and centrifugal treatment, pressure treatment, treatment using a medium in which the concentration of metal salt containing copper ions is increased, and treatment using a medium in which the concentration of silver nitrate is increased, Etc.
  • the treatment for increasing the transformation efficiency is described in the following item 2. Will be described in detail.
  • step (iii) Coexistence step
  • a coexistence step is performed in which the tissue of the plant material inoculated with Agrobacterium in step (ii) is cultured in the presence of the Agrobacterium.
  • This step is a step of ensuring the introduction of DNA from Agrobacterium into plant cells by culturing the plant tissue inoculated with Agrobacterium in the presence of Agrobacterium.
  • the medium used in step (iii) is referred to herein as “coexisting medium”.
  • the co-culture medium may be one usually used for normal cultivation of plant cells, such as LS inorganic salts (Linsmaier, E., and Skoog, F., (1965) 965Physiol. Plant, 18: 100-127). Examples include basic media.
  • LS inorganic salts Lismaier, E., and Skoog, F., (1965) 965Physiol. Plant, 18: 100-127.
  • Examples include basic media.
  • a medium in which the concentration of the nitrogen source and / or the concentration of inorganic ions is increased can be used as the co-culture medium.
  • 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), picloram, dicamba or other auxins can be added as auxins.
  • other plant growth regulators such as kinetin and cytokinin such as 4PU can be added.
  • “Cultivation” in step (iii) means that a plant tissue is placed on a solidified co-culture medium or in a liquid co-culture medium, and grown at an appropriate temperature, light / dark conditions and period.
  • the form of the medium is not particularly limited as long as the culture components are sufficiently supplied to the plant tissue.
  • Solidification of the co-culture medium can be carried out by adding a solidifying agent known in the art, and for example, agarose is known as such a solidifying agent. In the present invention, such a solidified co-culture medium can be suitably used.
  • the culture temperature in step (iii) can be appropriately selected, and is preferably 18 ° C-35 ° C, more preferably 25 ° C.
  • the culture in step (iii) is preferably performed in the dark, but is not limited thereto.
  • the culture period in step (iii) can also be appropriately selected, and is preferably 1 day to 7 days, more preferably 2 days to 5 days. More preferably, it is 3 days to 4 days.
  • the immature embryo When an immature embryo is used as the plant material, the immature embryo may be cultured while being placed so that the scutellum side faces upward and the hypocotyl side is in contact with the medium in the co-culture in the step (iii) of the present invention, or The immature embryo may be cultured by placing it in contact with the medium with the hypocotyl side facing up and the scutellum side facing down. Preferably, immature embryos are co-cultured by placing them so that the scutellum side is facing upward and the hypocotyl side is in contact with the medium.
  • various treatments for improving the transformation efficiency may be performed.
  • examples of such treatment include centrifugation treatment, pressurization treatment, treatment using a medium in which the concentration of a metal salt containing copper ions is increased, and treatment using a medium in which the concentration of silver nitrate is increased.
  • the treatment for increasing the transformation efficiency is described in the following item 2. Will be described in detail.
  • step (iv) the plant tissue is cultured in the resting medium after the coexistence step.
  • This step is a step of removing the Agrobacterium from the plant cell and growing the plant cell after the coexistence step.
  • the medium used in step (iv) is referred to as “resting medium” in the present specification.
  • the resting medium may be those usually used for culturing plant cells, such as LS inorganic salts and N6 inorganic salts (Chu, C.-C., (1978) Proc. Symp. Plant Tissue Culture., Peking: Science Press, pp. 43-50).
  • the resting medium in this step preferably contains an antibiotic. Unlike the antibiotics for selection used in the following selection process, the antibiotics contained in the resting medium are intended to eliminate Agrobacterium. Although not necessarily limited, cefotaxime and / or carbenicillin, timentin and the like can be preferably used as antibiotics.
  • the resting medium in step (iv) preferably contains a plant growth regulator.
  • the plant growth regulator preferably includes picloram and / or 2,4-D, dicamba belonging to auxins. Since auxins generally have an action of dedifferentiating plant tissues, most or all of the plant tissues become dedifferentiated tissues (callus) in the step (iv) and the subsequent selection step if desired.
  • the term “dedifferentiated tissue” or “callus” refers to culturing a part (explant) of a differentiated plant tissue in a medium containing plant growth regulators such as auxin and cytokinin. The resulting tissue refers to an amorphous and undifferentiated cell mass that does not have the form of the original plant tissue.
  • the resting medium preferably contains a carbohydrate.
  • sugars such as sucrose, glucose and maltose, and sugar alcohols such as mannitol and sorbitol can be used. Although it is not a genus of sorghum, it has been reported that in rice, callus formation and regeneration efficiency improved by changing sucrose concentration, mannitol and sorbitol concentration (Kavi Kishor (1987) Plant Science 48: 189-194). In sorghum, the type and concentration of the sugar source can be appropriately changed.
  • “Cultivation” in step (iv) means that a plant tissue is placed on a solidified resting medium or in a liquid resting medium and grown at an appropriate temperature, light / dark conditions and period.
  • the form of the medium is not particularly limited as long as the medium components are sufficiently supplied to the plant tissue.
  • the solidification of the resting medium can be carried out by adding a solidifying agent known in the art, and as such a solidifying agent, for example, agarose or the like is known.
  • the culture temperature in step (iv) can be appropriately selected, and is preferably 20 ° C-35 ° C, more preferably 25 ° C.
  • the culture in this step is preferably performed in a dark place, but is not limited thereto.
  • the culture period in this step can also be appropriately selected, and is preferably 1 day to 28 days, more preferably 7 days to 21 days.
  • various treatments for improving transformation efficiency may be performed.
  • Such treatment includes, for example, centrifugation, pressurization, medium supplemented with L-proline and / or L-asparagine (Elkonin, et al., 1995: Non-Patent Document 9), nitrate ion concentration and phosphorus Medium with increased acid ion concentration (Elkonin, et al., 2000: Non-patent document 10); Medium added with polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) (Gao, et al., 2005: Non-patent document 11); Use of a medium supplemented with 6-benzylaminoproline (BAP) (Wu, et al., 2014: Non-Patent Document 12) as a resting medium, and the like.
  • the treatment for increasing the transformation efficiency is described in the following item 2. Will be described in detail.
  • a selection step may be included between the resting step (iv) and the redifferentiation step (v).
  • a selection process is a process generally performed in the plant transformation method by Agrobacterium. The selection step is not essential in the method for producing a transformed plant of the present invention. For example, when the transformation improvement treatment described later is performed, the target transformant can be obtained without going through the selection step.
  • the following description is for illustration and this invention is not limited by the following description.
  • the selection step is a step of selecting a transformant based on the presence or absence of the transgene from the tissue obtained in the above step.
  • the medium used in the selection step is referred to as “selection medium” in the present specification.
  • Examples of the medium that can be used as the selection medium include a medium based on LS inorganic salts and N6 inorganic salts, such as an MS medium.
  • auxins preferably 2,4-D and / or picloram and dicamba are added to the selective medium.
  • the selection medium contains a plant growth regulator.
  • the auxin used in the selection process is not particularly limited, and is preferably 2,4-D.
  • various additives can be added as necessary.
  • the selection of the transformed plant can be performed, for example, by culturing the plant that has undergone the coexistence step and / or the resting step in a selection medium containing an appropriate selection agent, and determining whether or not there is resistance to the selection agent.
  • a selection medium containing an appropriate selection agent containing an appropriate selection agent
  • the selective drug that can be used in the selection process those usually used in the technical field can be used.
  • antibiotics or herbicides can be used as selective drugs.
  • the antibiotic for example, hygromycin, kanamycin, or blasticidin S can be used.
  • the herbicide for example, phosphinoslysin, bialaphos or glyphosate can be used.
  • the DNA inserted into the T-DNA in Agrobacterium may contain not only genes intended to be expressed in plants but also, for example, resistance genes for selected drugs. is necessary. Resistance genes for such selective drugs are known in the art.
  • the selection step for example, when selection is performed in a selection medium containing hygromycin, it is necessary that the plant is introduced with a hygromycin resistance gene in addition to the gene intended to be expressed in the plant.
  • selection of transformed plants can be performed based on the sugar requirement of plant cells.
  • Sugars that can be used by plant cells include sucrose and glucose, but it is known that mannose cannot be used. Therefore, when plant tissue is cultured in a medium containing only mannose as a carbon source, the plant tissue dies because there is no available sugar. Selection based on sugar requirement utilizes this principle. That is, in order to use this selection method, DNA inserted into T-DNA in Agrobacterium is not only a gene intended to be expressed in plants, but also phosphorylated mannose isomerase (PMI). ) It is necessary to include a gene. Here, the plant cell introduced with the PMI gene can use mannose as a carbon source.
  • PMI phosphorylated mannose isomerase
  • the selection process can be repeated several times by changing the component composition of the medium. For example, in the multiple selection steps, the concentration of the selected drug is increased in each selection step, thereby increasing the certainty of drug selection and increasing the possibility of obtaining transformed plants.
  • This selection process is preferably performed at least once, more preferably twice, and even more preferably three times.
  • the transformed tissue is efficiently obtained by cutting off the proliferated portion of the tissue cultured in the medium containing the selected drug and subjecting only the proliferated portion to the next selection step. It is also possible to do.
  • “Cultivation” in the selection step means that a plant tissue is placed on a solidified selection medium or in a liquid selection medium, and allowed to grow at an appropriate temperature, light / dark conditions and period.
  • the form of the medium is not particularly limited as long as the medium components are sufficiently supplied to the plant tissue.
  • the selection medium can be solidified, for example, with agarose or the like.
  • the culture temperature in the selection step can be appropriately selected, and is preferably 20 ° C-35 ° C, more preferably 25 ° C.
  • the culture in this step is preferably performed in a dark place, but is not limited thereto.
  • the culture period of this step can also be selected as appropriate.
  • the selection process is performed twice, the primary selection is performed for one week and the secondary selection is performed for two weeks, for a total of three weeks.
  • the entire selection process is preferably performed for 2-8 weeks, more preferably 3-6 weeks.
  • step (v) Redifferentiation step
  • a tissue cultured in a resting medium is selected if necessary and then redifferentiated in a redifferentiation medium.
  • the medium used in step (v) is referred to herein as “regeneration medium”.
  • Auxin and cytokinin may be appropriately added to the regeneration medium.
  • Examples of the regeneration medium include a medium based on LS inorganic salts and N6 inorganic salts, such as an MS medium.
  • the regeneration medium may contain a selective drug.
  • the selective drugs that can be used in the redifferentiation step (v) are the same as those defined in the selection step. However, the same selective drug as that used in the selection process is not necessarily used in the redifferentiation process. In that case, it is necessary for the plant to be introduced with resistance genes for two or more selected drugs from Agrobacterium.
  • Redifferentiation in the present invention means that a plant tissue that has been completely or partially dedifferentiated again acquires the properties of the original plant tissue or plant body.
  • auxins are used during the coexistence process and / or the selection process, all or part of the plant tissue is dedifferentiated. Therefore, by using the redifferentiation step, the dedifferentiated tissue is redifferentiated and a completely transformed plant body can be obtained.
  • “Cultivation” in the redifferentiation step means that a plant tissue is placed on a solidified redifferentiation medium or in a liquid redifferentiation medium, and allowed to grow at an appropriate temperature, light / dark conditions and period.
  • the form of the medium is not particularly limited as long as the medium components are sufficiently supplied to the plant tissue.
  • the regeneration medium can be solidified using, for example, agarose.
  • the culture temperature in the redifferentiation step can be appropriately selected, and is preferably 20 ° C-35 ° C, more preferably 25 ° C.
  • the culture in the redifferentiation step is preferably performed under illumination for 16-24 hours / day, but is not limited thereto.
  • the culture period of the redifferentiation step can also be appropriately selected, and is preferably 7 days to 56 days, more preferably 14 days to 42 days.
  • various treatments for improving transformation efficiency may be performed.
  • examples of such treatment include 1 mg / L NAA, 1 mg / L IAA, 1 mg / L IBA, MS medium containing 1 ⁇ mol / L copper sulfate (Non-patent Document 13), 0.5 mg / L zeatin, 1 mg / L
  • an improved MS medium Non-patent Document 12
  • IAA indole-3-acetic acid
  • 0.1 mg / L thidiazuron may be used as the regeneration medium.
  • the treatment for increasing the transformation efficiency is described in the following item 2. Will be described in detail.
  • the transformation improving process refers to a process for achieving improvement in transformation efficiency.
  • the “transformation improving process” is a concept including a process for improving gene transfer efficiency, a process for improving callus formation rate, and / or a process for improving regeneration efficiency.
  • Such a transformation improving process is not limited, but includes, for example, any one of the following processes a) to k) or a combination thereof.
  • a) to e) all have the effect of improving gene transfer efficiency
  • e) to i) have the effect of improving the callus formation rate
  • e) , H) and k) have the effect of improving the regeneration efficiency.
  • j) has not yet been confirmed as to which stage of gene transfer efficiency, callus formation rate, or redifferentiation efficiency is effective, it has the effect of improving transformation efficiency as a result.
  • the process of j) may not necessarily be included in the method of the present invention.
  • the process of j) for the method of the present invention is performed in a redifferentiation step.
  • the heat treatment can be performed using a method described in WO ⁇ 1998/054961, for example.
  • the heat treatment can be performed in the step (i) or (ii) of the present invention.
  • the treatment is performed at 33 ° C. to 60 ° C., preferably 37 ° C. to 52 ° C., for 5 seconds to 24 hours, preferably 1 minute to 24 hours. .
  • Centrifugation can be performed using, for example, the method described in WO202002 / 012520. Centrifugation can be performed in any of steps (i) to (iv) of the present invention.
  • the conditions for the centrifugal treatment before contacting the plant material with Agrobacterium are, for example, 100G to 250,000G, preferably 500G to 200,000G, more preferably 1000G to 150,000G.
  • the treatment may be performed for 1 second to 4 hours, more preferably 1 second to 2 hours.
  • the conditions for performing the centrifugal treatment after the coexistence step are, for example, 100G-250,000G, 500G-200000G, preferably 1000G-150,000G, most preferably about 1100G-1110,000G.
  • the treatment may be performed for 1 second or longer, preferably 1 second to 4 hours, more preferably 1 second to 2 hours, and still more preferably 1 second to 10 minutes.
  • the time for centrifugation is appropriately selected according to the centrifugal acceleration.
  • the centrifugal acceleration is large, the gene introduction efficiency can be significantly improved even if the centrifugation time is very short, for example, 1 second or less.
  • the centrifugal acceleration is small, gene introduction efficiency can be significantly improved by performing the centrifugation process for a long time. Appropriate centrifugation conditions can be easily set through routine experiments.
  • the pressure treatment can be performed using, for example, the method described in WO 2005/017169.
  • the pressure treatment can be performed in any of steps (i) to (iv) of the present invention.
  • the pressure treatment is not limited, but is preferably performed in the range of 1.7 to 10 atm, more preferably in the range of 2.4 to 8 atm.
  • the heat treatment and the centrifugal treatment can be performed using, for example, the method described in WO 2002/012521.
  • the conditions for the heat treatment and the centrifugal treatment the conditions described for the heat treatment and the centrifugal treatment, respectively, can be adopted.
  • the treatment using a medium in which the concentration of the metal salt containing copper ions is increased at the time of inoculation with Agrobacterium and / or in the coexistence step can be performed using, for example, the method described in WO 2005/017152.
  • the said process can be performed in the process (ii) or (iii) of this invention.
  • the treatment can be performed using, for example, a medium containing a metal salt containing copper ions at a concentration of 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • the metal salt may be, for example, copper sulfate or copper gluconate.
  • Treatment using a medium in which the concentration of silver nitrate is increased at the time of inoculation with Agrobacterium and / or in the coexistence process is, for example, Zhao, Z.-Y., et al., (2001) Mol. Breed., 8: 323. -333; Non-patent Document 2; and / or Ishida, Y., et al., (2003) Plant Biotechnology, 20: 57-66.
  • the said process can be performed in the process (ii) or (iii) of this invention.
  • the treatment can be performed using, for example, a medium containing silver nitrate at a concentration of 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • the treatment using the MS medium containing 1 mg / L NAA, 1 mg / L IAA, 1 mg / L IBA, 1 ⁇ mol / L copper sulfate can be performed using the method described in Non-Patent Document 13, for example.
  • the treatment using the improved MS medium containing 0.5 mg / L zeatin, 1 mg / L indole-3-acetic acid (IAA), 0.1 mg / L thiazulone is performed using the method described in Non-Patent Document 12, for example. be able to.
  • the said process can be performed in the process (v) of this invention.
  • transformation refers to a step of obtaining a plant in which the introduced target gene is integrated into the nuclear genome and stably expressed.
  • the transformation process includes introduction of a target gene into cells of a target plant, callus formation from a tissue containing cells into which the gene has been introduced, and redifferentiation of callus in which the gene has been incorporated into the nuclear genome. Go through the process.
  • gene introduction means introduction of a target gene into cells of a target plant.
  • the gene transfer method of the present invention enables gene transfer to a sorghum plant with high efficiency. Further, it is possible to produce a sorghum transformed plant with high efficiency.
  • “high transformation efficiency” means that a target gene is introduced into a plant cell with high efficiency (high gene introduction efficiency), and callus with high efficiency from the plant tissue into which the target gene has been introduced. Is formed (high callus formation rate), and redifferentiation occurs with high efficiency (high redifferentiation efficiency) from the callus in which the target gene is incorporated.
  • “transformation efficiency is improved” means that the efficiency of introducing a target gene into a plant cell is improved, the rate of callus formation from a plant tissue into which the target gene is introduced is improved, the target gene This is a concept including that the efficiency of redifferentiation from a callus in which is incorporated is improved.
  • More reliable methods for determining whether or not a target plant has been transformed include, for example, integration of a transgene into a plant chromosome by Southern hybridization or PCR, and confirmation of expression of the transgene in a progeny plant (progeny Genetics).
  • Southern hybridization and PCR can be performed by well-known methods. For example, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. (2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, “New York”).
  • Confirmation of expression in progeny plants can be performed by a method of investigating the expression of a reporter gene such as a GUS gene and the expression of a selectable marker gene such as a herbicide resistance gene.
  • a reporter gene such as a GUS gene
  • selectable marker gene such as a herbicide resistance gene
  • Transient expression is a phenomenon in which a target gene transferred into the nucleus of a plant cell is expressed for a certain period using the protein expression mechanism of the plant cell. After the transient expression, a part of the target gene transferred into the nucleus is integrated into the nuclear genome, and the cell into which the target gene is integrated begins to stably express the target gene as a transformed cell.
  • the transient expression can be confirmed by various known methods.
  • a reporter gene such as a GUS ( ⁇ -glucuronidase) gene, luciferase gene, or GFP gene can be used as a gene to be introduced, and the expression sites of these reporter genes can be confirmed by visual observation using a simple and known method. It is.
  • the gene transfer efficiency can be evaluated, for example, by scoring the transient expression in stages. For example, as in the examples described later, the expression of the GUS gene in the scutellum tissue of immature embryos in the resting process is scored as 0 for immature embryos with blue spots and 0 for immature embryos with 1-10 immature embryos.
  • the immature embryos may be evaluated in 6 stages, with a score of 4 for immature embryos and a score of 5 for immature embryos in which 1/2 or more of the scutellum is blue.
  • the gene transfer efficiency can also be determined by a calculation method generally used by those skilled in the art. For example, it is possible to calculate by dividing the number of plant tissues into which genes have been introduced by the number of plant tissues inoculated with Agrobacterium.
  • an average value may be obtained by evaluating step by step whether or not callus has been formed visually.
  • the callus formation from an immature embryo is 1 (more than half of the scutellum is callus), 0.5 (part of the scutellum is callus), 0 (no callus formation), as in the examples described later.
  • Example 1 Effect and Method for Gene Transfer of High Nitrogen Coexisting Medium
  • Immature embryos of sorghum variety: Tx430
  • Agrobacterium suspension medium 0.5 mg / L nicotinic acid, 0.5 mg / L pyridoxine hydrochloride, 1 mg / L thiamine hydrochloride, 100 mg / L myo-inositol, 1 g / L casamino acid, 1.5 mg / L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2 , 4-D), 68.5 g / L sucrose, 36 g / L glucose, pH 5.2; see Non-Patent Document 5).
  • Pretreatment (15,000 rpm (20,000 ⁇ g), centrifugation for 10 minutes and heat treatment at 43 ° C. for 3 minutes) was performed to increase gene transfer efficiency.
  • Agrobacterium was suspended at about 1.0 ⁇ 10 9 cfu / mL in an Agrobacterium suspension medium containing 100 ⁇ M acetosyringone to make an inoculum.
  • Agrobacterium strains include the GUS gene (Pubi-Iubi-IGUS-Tnos), which is controlled by the maize ubiquitin promoter and intron and mediated by the castor catalase intron, and cauliflower in WO 2014/157541 A1.
  • the inoculation source was added to the pretreated immature embryo and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • LS inorganic salt 0.5 mg / L nicotinic acid, 0.5 mg / L pyridoxine hydrochloride, 1 mg / L thiamine hydrochloride, 100 mg / L myo-inositol, 700 mg / L L-proline 1.5 mg / L 2,4-D, 20 g / L sucrose, 10 g / L glucose, 500 mg / L MES, 100 ⁇ M acetosyringone, 5 ⁇ M AgNO 3 , 5 ⁇ M CuSO 4 .5H 2 O, 8 g / L agar, pH 5.8; see Non-Patent Document 5 (excluding ascorbic acid), or the total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ is 22-362 mM, and the other LS inorganic salts are set to 1/5 concentration
  • the immature embryos inoculated with Agrobacterium were placed on the co-culture medium so that the scute
  • a medium with a total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ of 22-362 mM was prepared by adding NH 4 NO 3 .
  • immature embryos were treated with resting medium (LS inorganic salt, 0.5 mg / L nicotinic acid, 0.5 mg / L pyridoxine hydrochloride, 1 mg / L thiamine hydrochloride, 100 mg / L myo- Inositol, 1 g / L casamino acid, 3 mg / L 2,4-D, 30 g / L maltose, 7.5 g / L sorbitol, 7.8 ⁇ M CuSO 4 .H 2 O, 150 mg / L timentin, 3.5 g / L gellan gum , PH 5.8) and cultured at 25 ° C. in the dark.
  • LS inorganic salt 0.5 mg / L nicotinic acid, 0.5 mg / L pyridoxine hydrochloride, 1 mg / L
  • the total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ is 62 mM-262.1 mM compared to when using a co-culture medium (control group) containing 1-fold amount of LS inorganic salt as a control medium, and other LS inorganic salts
  • the average score of the transient expression of the GUS gene was higher when the co-culture medium with a 1/5 concentration was used (test groups 3 to 5). Therefore, even in a low inorganic salt medium, the use of a medium having a total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ of 62 mM or more and 262.1 mM or less can improve the efficiency of introducing foreign genes into immature sorghum embryos. confirmed.
  • Example 2 Effect of high Mg 2+ co-culture medium on gene transfer Material and method Co-culture medium containing 1-fold amount of control LS inorganic salt, or Mg 2+ concentration of 0.6-150.4 mM, other LS An immature embryo treated in the same manner as in Example 1 was placed in a test zone co-culture medium having an inorganic salt concentration of 1/5, and the transient expression of the GUS gene was evaluated. Medium with a Mg 2+ concentration of 0.6-150.4 mM was prepared by adding MgSO 4 . The test was performed twice using 6-7 immature embryos in one test group.
  • Example 3 Effect of high Mg 2+ and high N co-culture medium on gene transfer Materials and methods Co-culture medium containing 1-fold amount of control LS inorganic salt, or Mg 2+ concentration of 0.6-150.4 mM and NH 4 + An immature embryo treated in the same manner as in Example 1 was placed in a test zone co-culture medium in which the total concentration of NO 3 ⁇ was 62.0 mM and the other LS inorganic salts were 1/5 in concentration. Transient expression was evaluated. A medium with a Mg 2+ concentration of 0.6-150.4 mM adds MgSO 4 , and a medium with a total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ of 62.0 mM adds NH 4 NO 3 . Adjusted and created by. The test was conducted twice using 8 immature embryos in 1 test group.
  • Example 4 Effect on gene transfer of high K + and / or high N co-culture medium Co-culture medium containing 1-fold amount of material and method control LS inorganic salt, or K + concentration is 8.0-204.4 mM, Coexisting medium with 1/5 concentration of other LS inorganic salt, or coexistence of 1/5 LS inorganic salt containing K + and adjusted so that the total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ is 62.0 mM
  • An immature embryo treated in the same manner as in Example 1 was placed on the medium, and the transient expression of the GUS gene was evaluated.
  • a medium with a K + concentration of 8.0-204.4 mM was prepared and prepared by adding K 2 SO 4 . 6-7 immature embryos were used per test group, and the test was performed 4 times.
  • Example 5 Effect on gene transfer of high Ca 2+ and / or high N co-culture medium
  • immature embryos treated in the same manner as in Example 1 were placed and the transient expression of the GUS gene was evaluated.
  • a medium with a Ca 2+ concentration of 1.2-9.6 mM was prepared by adding CaSO 4 . The test was performed twice using 6-7 immature embryos in one test group.
  • Example 6 Effect of high Na + and / or high N co-culture medium on gene transfer Materials and methods Co-culture medium containing 1-fold amount of LS inorganic salt, or LS inorganic salt with Na + concentration of 0.6-250.0 mM Example 1 to a coexisting medium having a concentration of 1/5, or a coexisting medium of 1/5 LS inorganic salt containing Na + and adjusted to a total concentration of NH 4 + and NO 3 ⁇ of 62.0 mM. The immature embryos treated in the same manner as above were placed and the transient expression of the GUS gene was evaluated. A medium with a Na + concentration of 0.6-250.0 mM was prepared by adding Na 2 SO 4 . 6-7 immature embryos were used per test group, and the test was performed twice.
  • Example 7 Effect on transformation of high Mg 2+ co-culture medium Materials and methods To verify the effect of high Mg 2+ and / or high N co-culture medium on the production of sorghum transformants, callus induction medium and redifferentiation medium were used. Although it carried out by applying the media of Zhao et al. (2000: Non-Patent Document 5) and Wu et al. (2014: Non-Patent Document 12), no transformants could be obtained. Therefore, a transformation test for sorghum was performed by modifying these previously reported media.
  • a transformant in the method for treating immature embryos prior to infection with Agrobacterium, can be obtained by subjecting the embryo to centrifugation in addition to the heat treatment reported by Gurel et al. (2009: Non-Patent Document 7). Since it was confirmed by our test that it was easy, transformation was performed using immature embryos that had been heat-treated and centrifuged.
  • Co-culture medium (LS inorganic salt, 0.5 mg / L nicotinic acid, 0.5 mg / L pyridoxine hydrochloride, 1 mg / L thiamine hydrochloride, 100 mg / L myo-inositol, 20 g / L sucrose, 10 g / L glucose , 500 mg / L MES, 700 mg / L L-proline, 1.5 mg / L 2,4-D, 100 ⁇ M acetosyringone, 5 ⁇ M CuSO 4 .5H 2 O, 4.0 g / L agarose, pH 5.
  • LS inorganic salt 0.5 mg / L nicotinic acid, 0.5 mg / L pyridoxine hydrochloride, 1 mg / L thiamine hydrochloride, 100 mg / L myo-inositol, 20 g / L sucrose, 10 g / L glucose , 500 mg / L MES, 700 mg / L L-proline,
  • the modified PHI-T medium was placed in a co-culture medium (test group) in which the Mg 2+ concentration was 5.0 mM, and co-culture was performed.
  • the culture process after co-culture was performed under the same conditions for both the control and the test group. Specifically, after co-culturing for 4 days in the dark at 25 ° C., immature embryos were modified DBC3 medium (LS inorganic salt, LS inorganic salt, composition changed with reference to DBC3 medium (Wu et al. 2014: Non-Patent Document 12)).
  • immature embryos 2 weeks after inoculation were placed on a modified DBC3 medium (excluding glutamine) containing 5 mg / L glufosinate ammonium salt (PPT), and primary selection culture was performed at 25 ° C. in the dark for 1 week. .
  • the immature embryo was placed on a modified DBC3 medium containing 10 mg / L PPT (however, except for glutamine, the sorbitol amount was changed to 5.0 g / L) and subjected to secondary selective culture at 25 ° C. in the dark for 2 weeks. went.
  • the grown callus was placed on a modified DBC3 medium containing 15 mg / L PPT (except for glutamine, 0.5 mg / L BAP was added, and the amount of sorbitol was changed to 5.0 g / L).
  • the third selective culture was performed for 1 week in the dark.
  • the obtained PPT resistant callus was regenerated from a regeneration medium (LS inorganic salt, 0.5 mg / L nicotinic acid, 0.5 mg / L pyridoxine hydrochloride, 0.1 mg / L, thiamine hydrochloride, 100 mg / L myo-inositol, 20 g / L sucrose, 500 mg / L MES, 700 mg / L L-proline, 10 g / L ascorbic acid, 0.5 mg / L zeatin, 1 mg / L indole-3-acetic acid, 5 ⁇ M AgNO 3 , 5 ⁇ M CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.1 mg / L thidiazuron, 3.5 g / L gellan gum, pH 5.8), and cultured at 25 ° C.
  • LS inorganic salt 0.5 mg / L nicotinic acid, 0.5 mg / L pyridoxine hydrochloride, 0.1 mg / L, thiamine
  • Modified NAB1C1 medium (LS inorganic salt, 0.5 mg / L nicotinic acid, 0.5 mg / L) whose composition was changed with reference to NAB1C1 medium (Guoquan et al.
  • Genomic DNA was extracted from the leaves of individuals using E.Z.N.A.SP Plant DNA Kit (Omega Biotek, Doraville, USA). PCR was performed using a primer set (atggacccagaacgacgcccggccgacatc: SEQ ID NO: 1, tcagatctcggtgacgggcaggaccggacg: SEQ ID NO: 2) for amplifying genomic DNA and Bar gene as templates.
  • PCR reaction solution In a 10 ⁇ l PCR reaction solution, about 10 ng of genomic DNA as template, Tks Gflex DNA Polymerase (Takara) 0.2 ⁇ l, 2 ⁇ Gflex PCR Buffer (Takara) 5 ⁇ l, forward primer for amplifying the Bar gene (SEQ ID NO: 1) and 0.5 ⁇ M each of the reverse primer (SEQ ID NO: 2) were added, and a PCR reaction was performed with a program of 94 ° C. for 1 minute once, 98 ° C. for 10 seconds, and 68 ° C. for 30 seconds for 35 times.
  • the presence / absence of the transgene was determined by determining that an individual having an amplified band of about 500 bp by PCR was present as a transgene and an individual whose band was not amplified was regarded as having no transgene.
  • Example 8 Effect on transformation of high-N coexisting medium Materials and methods Modification of immature embryos inoculated with Agrobacterium by heat treatment and centrifugation as in Example 7 as the same control coexisting medium as in Example 7 PHI-T medium or modified PHI-T media NH 4 + and NO 3, - were plated in a total concentration of 85mM or 123mM and to test groups coexist medium 1/2 concentration LS inorganic salts other than that of, the co-culture Went. The subsequent method for selecting PPT-resistant calli, the method for regenerating an individual, and the PCR analysis method for confirming the presence or absence of gene transfer into a transformant were the same as in Example 7.
  • Example 9 Effect on transformation of high-Mg 2+ and high-N co-existing medium
  • Materials and methods Heat-treated and centrifuged as in Example 7 and immature embryos inoculated with Agrobacterium were used in the same control coexistence as in Example 7 PHI-T medium as a medium, or modified PHI-T medium, LS inorganic salt 1 ⁇ 2 amount, Mg 2+ concentration 5.0 mM, and NH 4 + and NO 3 ⁇ total concentration 85 mM
  • the cells were placed in a co-culture medium and co-cultured.
  • the subsequent method for selecting PPT-resistant calli, the method for regenerating an individual, and the PCR analysis method for confirming the presence or absence of gene transfer into a transformant were the same as in Example 7.
  • Sequence number 1 Forward primer Sequence number 2: Reverse primer

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Abstract

　本発明は、従来公知のアグロバクテリウム法に比べて効率の高い、ソルガム属の植物の遺伝子導入方法および形質転換植物の作成方法を提供することを課題とする。　本発明は、ソルガム属の植物の植物組織材料を調製する工程、アグロバクテリウム菌を接種する工程および／または共存工程において、窒素源の濃度、ならびに／または、マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンおよびナトリウムイオンから選択される無機イオンの濃度、を高めた培地を用いることを特徴とする、ソルガム属の植物の遺伝子導入方法を提供する。本発明はまた、本発明の遺伝子導入方法を用いる事を特徴とする形質転換植物の製造方法を提供する。

Description

アグロバクテリウム菌を用いた、ソルガム属植物への遺伝子導入方法およびソルガム属植物の形質転換植物の作成方法
　本発明は、アグロバクテリウム属細菌を介してソルガム属の植物へ遺伝子導入を行う方法に関する。本発明はさらに、アグロバクテリウム属細菌を介して、ソルガム属の植物の形質転換植物を作成する方法に関する。
　ソルガムは、アフリカを原産とするイネ科の短日性単子葉植物である。ソルガムは、水利用効率が高く、耐乾性や耐高温性に富み、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギに次ぐ主要穀類であり、アフリカやアジアの国々において重要な食糧となっている。また、ソルガムは糖含有量が高く、バイオエタノールの原料にもなることから、ソルガムの農業形質を改良するための技術開発も盛んに行われている。ソルガムは全ゲノムが解読され、ソルガム特有の有用農業形質に関連する遺伝子や量的遺伝子座（QTL）の解析も進んでいる。ソルガムにおける遺伝子組換え技術の開発は、ソルガムの農業形質を改良する上で重要な役割を果たすと考えられる。
　主要穀類であるオオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネなどの単子葉植物の形質転換方法には、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などの物理化学的方法（ＤＮＡの直接導入法）とアグロバクテリウム属細菌が持つ機能を利用する生物学的方法（ＤＮＡの間接導入法）が知られている。アグロバクテリウム属細菌を介する遺伝子導入法（以下、アグロバクテリウム法）は、Ｔｉプラスミドの病原性領域（ｖｉｒ領域）における遺伝子群の発現制御等により、目的遺伝子の導入コピー数は低く保たれ、断片化されて導入されることも少ない。そのため、得られた形質転換体において目的遺伝子が高発現する個体が多く得られ、直接導入法に比べると、発現量の個体間差も少ないという大きな利点がある。
　アグロバクテリウム法は、双子葉植物の形質転換法として普遍的に用いられている。もともと、自然界におけるアグロバクテリウム属細菌の宿主は双子葉植物に限定されており、長い間、単子葉植物には寄生しないと考えられてきた。しかしながら、供試組織の検討、培地組成の改良、アグロバクテリウム菌株の選定などの詳細な研究の結果、主要穀物であるイネで初めてアグロバクテリウム属細菌を介した高効率形質転換方法が報告された（Hiei et al. 1994：非特許文献１）。その後、イネでの成功に続いて、トウモロコシ（Ishida et al. 1996：非特許文献２）、コムギ（Cheng et al. 1997：非特許文献３）、オオムギ（Tingay et al. 1997：非特許文献４）、ソルガム（Zhao et al. 2000：非特許文献５）でアグロバクテリウムを介した形質転換の成功が報告されている。
　１．アグロバクテリウム法によるソルガムの形質転換方法に関連する従来技術
　１）アグロバクテリウムを接種する植物組織
　アグロバクテリウムを接種するために用いられるソルガムの組織としては、未熟胚が用いられている（非特許文献５）。
　２）前処理
　アグロバクテリウム法による形質転換効率を向上させる方法の１つとして、形質転換をする植物材料に熱処理または遠心処理を施すことがいくつかの単子葉植物への形質転換に使われている（Hiei et al. 2006：非特許文献６）。ソルガムにおいても、アグロバクテリウムを感染させる前の未熟胚に対して、４３℃で３分間処理することによって形質転換効率が未処理区に比べて約３倍向上するという報告がされている（Gurel et al. 2009：非特許文献７）。但し、遠心処理については、ソルガムの形質転換にネガティブな結果を生じたと記されている。
　３）共存工程
　アグロバクテリウムを植物組織に接種して共存させる工程である。アグロバクテリウムを介したソルガムの形質転換では、共存培地の組成としてＭＳ無機塩を１倍量含むＭＳ培地が使われている（非特許文献５）。
　４）カルス形成工程
　カルス形成工程は、植物組織を脱分化させる工程である。
　ソルガムの組織培養工程ではフェノール化合物が過剰に産生し、カルス形成が阻害される傾向がある（Cai et al. 1987：非特許文献８）。これに対し、ＭＳ培地にＬ－プロリン及びＬ－アスパラギンを添加することによって、エンブリオジェニックカルスの増殖を促進したこと、ソルガムの培養の阻害要因となるフェノール化合物産生を抑制したことが報告されている（Elkonin et al. 1995：非特許文献９)。また、カルス形成培地の硝酸イオン濃度とリン酸イオン濃度を高くすることによって、エンブリオジェニックカルスの誘導を促し、カルスからの植物体の再分化効率も向上したことが報告されている（Elkonin et al. 2000：非特許文献１０）。ポリビニルポリピロリドン（PVPP）のカルス形成培地への添加が、アグロバクテリウム接種時のダメージによる細胞の褐変を軽減するという報告がある（Gao et.al. 2005：非特許文献１１）。
　実際にソルガムを形質転換した事例としては、カルス形成培地（レスティング培地及び選抜培地）に添加する植物成長調節物質に６－ベンジルアミノプロリン（BAP）を使用することによって、形質転換効率が改善したという報告がある（Wu et al. 2014：非特許文献１２）。
　５）再分化工程
　再分化培地に添加する植物成長調節物質の種類と濃度を最適化する試みも行われている。1 mg/L ナフタレン酢酸（NAA）、1 mg/L インドール－３－酢酸（IAA）、1 mg/L インドール－３－酪酸（IBA）、1 μmol/L 硫酸銅を含むＭＳ培地を用いることによって、発根培地に移植した再分化植物から根の再分化が促進されることが報告されている（Guoquan et al. 2013：非特許文献１３）。
　以上のように、アグロバクテリウムを介したソルガムの形質転換方法は、改良が行われ、最初の報告で２．１％（非特許文献５）であった形質転換効率が、３３％（非特許文献１２）まで上昇してきた。しかしながら、その形質転換効率は、イネやトウモロコシと比較すると、未だ十分に高いとはいえない。
　２．アグロバクテリウム属細菌を介した植物の形質転換方法における共存培地の改良
　アグロバクテリウムを介した形質転換方法において、トウモロコシでは、Ｎ６培地を希釈した共存培地を用いることによって形質転換効率が向上したという報告が複数なされている。例えば、Duらは、アグロバクテリウムを接種したトウモロコシ（A188）未熟胚のうち、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現が確認された未熟胚の割合が、Ｎ６無機塩を１倍量含むＮ６培地では７２％であったのに対し、主要無機塩を５０％、３０％、１０％に希釈したＮ６培地ではいずれも９０％以上に増加することを示した（Du et al. 2010：非特許文献１４）。
　また、トウモロコシ（Hi-II）における別の報告では、アグロバクテリウム懸濁培地、と共存培地にＮ６無機塩を１倍量含む培地を用いた時の供試カルス当たりの形質転換効率が０％であったのに対し、Ｎ６主要無機塩を１０％、５０％に希釈したアグロバクテリウム懸濁培地と共存培地を使用することによって、形質転換効率がそれぞれ４．０％、１７．５％に向上することが確認されている（Vega et al. 2008：非特許文献１５）。
　コムギにおいては、無機塩を１０％に希釈したＭＳ培地からなるアグロバクテリウム懸濁培地および共存培地を用いた場合、ＭＳ無機塩を１倍量含むＭＳ培地からなる上記培地を用いるよりもＧＵＳ遺伝子の一過性発現を示した未熟胚の割合が著しく高かったことが報告されている（Cheng et al. 1997：非特許文献１６）。このように「低無機塩培地は、数種の主要作物へのアグロバクテリウムによる導入遺伝子の一過性発現や形質転換効率向上のために一般的に用いられている（Vega et al. 2008：非特許文献１５）。」と考えられている。
　反対に、共存培地ではないが、タバコにおいて、アグロバクテリウムを接種する前の植物材料を前培養する培地に、硝酸アンモニウム濃度を増加させた培地を用いることによって、導入遺伝子の一過性発現や形質転換効率が向上したことが報告されている（Boyko et al. 2009：非特許文献１７）。また、アグロバクテリウムを接種する前の植物組織を前培養する培地に、塩化カリウムや希土類元素の塩化物を添加することにより、シロイヌナズナやタバコの形質転換効率が向上したという報告がある（Boyko et al. 2011：非特許文献１８）。
　共存培地に、抗酸化物質や銅を添加することによって、導入遺伝子の一過性発現を促進させる方法も報告されている。トウモロコシでは、抗酸化物質であるＬ－システイン（０．４ｇ／Ｌ）とジチオトレイトール（DTT）（０．４ｇ／Ｌ）をＭＳ培地、Ｎ６培地、ＬＳ培地、Ｄ培地それぞれに添加した結果、非添加区に比べて導入遺伝子の一過性発現および形質転換効率が著しく向上したとされている（非特許文献１４）。
　３．植物組織の培養に用いられる培地
　上記のＭＳ培地（ＬＳ培地）以外にも、植物組織の培養にさまざまな組成の培地が開発され、利用されている。
　Ｎ６培地は、主にイネの葯培養培地として用いられている。Ｂ５培地は、液体培養用として開発されたが、固体培地としても多くの植物組織培養に用いられている。Ｒ２培地は、Ｂ５培地を基本としてイネの懸濁培養細胞用に開発された培地である。ＣＣ培地は、トウモロコシのプロトプラストからのカルス形成培地として考案された培地である。
　下記の表は、公知の基本培地であるＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｎ６培地、Ｂ５培地、Ｒ２培地、ＣＣ培地について、窒素源としてのＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度、および各種無機イオン（マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、およびナトリウムイオン）の濃度をまとめたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Hiei et al. (1994)  The Plant Journal 6:271-282. Ishida et al. (1996)  Nature Biotechnology 14:745-750. Cheng et al. (1997)Plant Physiol. 115: 971-980. Tingay et al.(1997) Plant J. 11: 1369-1376. Zhao et. al. (2000) Plant Molecular Biology 44:789-798. Hiei et al. (2006) Plant Cell Tissue Organ Cult 87: 233-243. Gurel et.la (2009) Plant Cell Rep 28(3): 429-444. Cai et al. (1987) Plant Cell Tissue Organ Cult. 9:245-252. Elkonin et al. (1995) Maydica 40(2):153-157. Elkonin et al. (2000) Plant Cell Tissue Organ Cult 61(2):115-123. Gao et.al. (2005)Genome 48:321-333. Wu et al. (2014) In Vitro Cell Dev Biol-Plant 50: 9-18. Guoquan et al. (2013) In Vitro Cell.Dev.Biol-Plant (2013) 49(2):191-197. Du et al. (2010) African Journal of Biotechnology 9(8): 1135-1143 Vega et al.(2008)Plant Cell Reports 27(2): 297-305. Cheng et al.(1997)Plant Physiol Physiol 115: 971-980. Boyko et al. (2009)Plant Cell Reports 28: 737-757. Boyko et al. (2011)Plant Cell Reports 30: 505-518.
　本発明は、従来公知のアグロバクテリウム法と比較して効率の高い、ソルガム属の植物へ遺伝子導入を行う方法、および、ソルガム属の形質転換植物を作成する方法を提供する事を目的とする。
　本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究に努めた結果、ソルガム属の植物の植物材料を調製する工程、当該植物材料の組織へアグロバクテリウム菌を接種する工程および／または共存工程において、窒素源の濃度、ならびに／またはマグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンおよびナトリウムイオンから選択される無機イオンの濃度を、ＬＳ無機塩を１倍量含む培地よりも高めた培地を用いることにより、ソルガム属の植物において遺伝子導入効率および形質転換効率が向上することを見いだした。
　本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これらに限定されるものではない。
［態様１］
　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、マグネシウムイオンの濃度を高めた培地であって、マグネシウムイオン濃度が４．０ｍＭ以上１００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様２］
　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源の濃度を高めた培地であって、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６０ｍＭより多く２７０ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様３］
　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはマグネシウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、マグネシウムイオン濃度が２．６ｍＭ以上１００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様４］
　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはカリウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、カリウムイオン濃度が２４ｍＭ以上６５ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様５］
　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはカルシウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、カルシウムイオン濃度が５．２ｍＭ以上１０ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様６］
　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはナトリウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、ナトリウムイオン濃度が０．６ｍＭ以上２００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様７］
　少なくとも（ｉｉｉ）の共存工程において、窒素源の濃度、ならびに／または、マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンおよびナトリウムイオンから選択される無機イオンの濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、態様１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
［態様８］
　ソルガム属（Sorghum）の植物の、形質転換植物の作成方法であって、
　態様１ないし７のいずれか１項に記載の方法にしたがって工程（ｉ）－（ｉｉｉ）を行い、次いで、
　（ｉｖ）共存工程で培養した組織をレスティング培地で培養するレスティング工程；および
　（ｖ）上記組織を再分化培地で再分化させる工程；
を含む、前記方法。
［態様９］
　以下の形質転換向上処理：
　ａ）熱処理；
　ｂ）遠心処理；
　ｃ）加圧処理；
　ｄ）（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理；および
　ｅ）（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理；
のうちの少なくとも１つを行う、態様１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
　上記（ｉｖ）レスティング工程と、（ｖ）再分化工程の間に選抜工程を含む、態様８または９に記載の方法。
［態様１１］
　アグロバクテリウム菌が、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、ＡＧＬ０、ＡＧＬ１、およびＣ５８Ｃ１からなる群より選択される菌である、態様１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］
　ソルガム属の植物がソルガム（Sorghum bicolor）である、態様１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
　本発明により、高い効率でソルガム属の植物の遺伝子導入を行うことが可能となった。また、それにより高い効率でソルガム属の形質転換植物を作成することができる。本発明の方法により、ソルガムの形質転換した植物体を得るためのコストを削減することも可能となる。
　以下に本発明の構成を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
　本発明は、ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法を提供する。
　さらに本発明は、ソルガム属の植物の、形質転換植物の作成方法であって、（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程； 
（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
（ｉｖ）共存工程で培養した組織をレスティング培地で培養するレスティング工程；および
　（ｖ）上記組織を再分化培地で再分化させる工程；
を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法を提供する。
　本発明において使用可能な植物材料が由来する植物はソルガム属の植物である。なお、ソルガム属はモロコシ属と呼ばれることもあるが、本明細書では「ソルガム属」の呼称に統一して記載する。本明細書における「ソルガム属」の植物の例として、限定されるものではないが、ソルガム（Sorghum bicolor）を挙げることができる。
　本発明においてソルガム（S. bicolor）はとりわけ好適である。なお、本明細書において「ソルガム（S. bicolor）」と記載した場合には、「ソルガム属」の中で「ソルガム」という特定の植物種を示すものとする。またソルガム（S. bicolor）は、モロコシ、タカキビ、高粱（コウリャン）とも呼ばれることがあるがいずれも同じ植物種であり、本発明において使用可能である。
　本発明において使用可能な「植物材料」は、非限定的に、アグロバクテリウム法による植物の遺伝子導入または形質転換に供するためのソルガム属の植物の細胞、葉、根、茎、実、その他いずれかの部位の植物組織、未熟胚、完熟種子、カルスもしくは不定胚様組織（以下、本明細書においてカルス等、または単にカルスという）、または完全な植物体など植物のあらゆる態様を包含する。本発明の方法に用いる植物材料の形態として好ましいのは、未熟胚、完熟種子、およびそれらから誘導されるカルスであり、最も好ましいのは未熟胚である。
　本明細書において「未熟胚」とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚をいう。また、本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定される物ではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよいが、受粉後２日以降、好ましくは受粉後７から２４日後のものが好ましい。未熟胚は取り出した当日使用することができるが、前培養した未熟胚であってもよい。
　本明細書において「完熟種子」とは、受粉後の登熟過程が終了して種子として完熟しているものをいう。
　本明細書において「カルス」とは、無秩序に増殖する未分化状態の細胞塊をいう。カルスを得るためには、植物組織の分化した細胞をオーキシン（例えば、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ））、サイトカイニン等の植物成長調節物質を含む培地（脱分化培地という）において培養して得ることができる。このカルスを得るための処理を脱分化処理といい、またこの過程を脱分化過程という。
　本発明の方法において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地とは、当業者によく知られているＭＳ（ＬＳ）基本培地に含まれる窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度と比較して、高濃度の窒素源および／または無機イオンを含む培地をいう。高濃度とは、当該ＭＳ（ＬＳ）基本培地（Zhao, et al., 2000：非特許文献５）に含まれる窒素源および／または無機イオンの濃度よりも高いことをいう。具体的には、ＭＳ（ＬＳ）基本培地は窒素源としてＮＨ４ ＋とＮＯ３ －を含んでおり、それらの合計濃度は６０．０ｍＭである。また、ＭＳ（ＬＳ）基本培地は、１．５ｍＭのマグネシウムイオン、２０．０ｍＭのカリウムイオン、３．０ｍＭのカルシウムイオンを含む。ＭＳ（ＬＳ）基本培地はナトリウムイオンを含まない。これらＭＳ（ＬＳ）基本培地に含まれる窒素源および／または無機イオンの濃度よりも高濃度の窒素源および／または無機イオンを含む場合には、その培地は窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地である。
　本発明の方法において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地は、上記（ｉ）の植物材料の調製工程、（ｉｉ）のアグロバクテリウム菌の接種工程および（ｉｉｉ）の共存工程の少なくとも１の工程において用いられる。好ましくは、当該培地は少なくとも（ｉｉｉ）の共存工程において用いられる。
　一態様において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地は、マグネシウムイオンの濃度を高めた培地である。マグネシウムイオンの濃度を高めた培地におけるマグネシウムイオン濃度は、４．０ｍＭ以上１００ｍＭ以下、好ましくは４．８ｍＭ以上９０．４ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてマグネシウムイオン濃度の下限は４．０ｍＭ以上、４．８ｍＭ以上、および７．５ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は１００ｍＭ以下、９０．４ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５．３ｍＭ以下、４０．０ｍＭ以下から選択してもよい。マグネシウムイオン濃度の下限および上限は、上記の数値からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
　別の態様において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地は、窒素源の濃度を高めた培地である。窒素源の濃度を高めた培地におけるＮＨ４ ＋およびＮＯ３ －の合計濃度は６０ｍＭより多く２７０ｍＭ以下、好ましくは６２ｍＭ以上２７０ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてＮＨ４ ＋およびＮＯ３ －の合計濃度の下限は、６０ｍＭより多い、６２ｍＭ以上、６５ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、７５ｍＭ以上、および８０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は２７０ｍＭ以下、２６３ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２２５ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１７５ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１２５ｍＭ以下、１１５ｍＭ以下および１１２ｍＭ以下から選択してもよい。ＮＨ４ ＋およびＮＯ３ －の合計濃度の下限および上限は、上記の数値からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
　さらなる態様において、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地は、窒素源の濃度、および／または、マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンもしくはナトリウムイオンの濃度を高めた培地である。
　窒素源の濃度、および／または、マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンもしくはナトリウムイオンの濃度を高めた培地におけるＮＨ４ ＋およびＮＯ３ －の合計濃度は６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下、好ましくは６２ｍＭ以上１１２ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてＮＨ４ ＋およびＮＯ３ －の合計濃度の下限は、６０ｍＭ以上、６２ｍＭ以上、６５ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、７５ｍＭ以上、および８０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は２７０ｍＭ以下、２６３ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２２５ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１７５ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１２５ｍＭ以下、１１５ｍＭ以下および１１２ｍＭ以下から選択してもよい。上記のＮＨ４ ＋およびＮＯ３ －の合計濃度の下限および上限は、上記の数値の群からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
　窒素源の濃度および／またはマグネシウムイオンの濃度を高めた培地におけるマグネシウムイオン濃度は、２．６ｍＭ以上１００ｍＭ以下、好ましくは４．８ｍＭ以上９０．４ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてマグネシウムイオン濃度の下限は２．６ｍＭ以上、４．０ｍＭ以上、４．８ｍＭ以上、および１０．０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は１００ｍＭ以下、９０．４ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５．３ｍＭ以下から選択してもよい。上記のマグネシウムイオン濃度の下限および上限は、上記の数値の群からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
　窒素源の濃度および／またはカリウムイオンの濃度を高めた培地におけるカリウムイオン濃度は２４ｍＭ以上６５ｍＭ以下、好ましくは２４ｍＭ以上６０ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてカリウムイオン濃度の下限は、２４．０ｍＭ以上、２７．０ｍＭ以上、および３０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は７０ｍＭ以下、６５ｍＭ以下、６４．１ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５５ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、および４５ｍＭ以下から選択してもよい。上記のカリウムイオン濃度の下限および上限は、上記の数値の群からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
　窒素源の濃度および／またはカルシウムイオンの濃度を高めた培地におけるカルシウムイオン濃度は、５．２ｍＭ以上１０ｍＭ以下、好ましくは５．２ｍＭ以上９．６ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてカルシウムイオン濃度の下限は、５．２ｍＭ以上、５．５ｍＭ以上、および６．０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は１０ｍＭ以下、９．６ｍＭ以下、９．０ｍＭ以下、８．０ｍＭ以下、７．５ｍＭ以下、７．０ｍＭ以下、および６．９ｍＭ以下から選択してもよい。上記のカルシウムイオン濃度の下限および上限は、上記の数値の群からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
　窒素源の濃度および／またはナトリウムイオンの濃度を高めた培地におけるナトリウムイオン濃度は、０．６ｍＭ以上２００ｍＭ以下、好ましくは０．６ｍＭ以上１５０ｍＭ以下、さらに好ましくは４０．０ｍＭ以上５０．０ｍＭ以下である。あるいは、この場合においてナトリウムイオン濃度の下限は０．６ｍＭ以上、１．０ｍＭ以上、４．０ｍＭ以上、１０．０ｍＭ以上、２０．０ｍＭ以上、３０．０ｍＭ以上および４０．０ｍＭ以上から選択してもよく、そしてその上限は２００ｍＭ以下、１７５ｍＭ以下、１５０．１ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１２５ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、９０．１ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、および５０ｍＭ以下から選択してもよい。上記のナトリウムイオン濃度の下限および上限は、上記の数値の群からそれぞれ適宜選択して組み合わせることができる。
　以下、上記の本発明の方法の各工程についてさらに詳しく説明する。
　１．本発明の各工程について
　本発明の遺伝子導入方法および形質転換植物の作成方法は、アグロバクテリウム属細菌を利用する。特に明記する工程以外は、公知のアグロバクテリウム属細菌を利用した遺伝子導入方法、形質転換方法の各工程に従って行うことが可能である。
　（ｉ）植物材料を調製する工程
　工程（ｉ）においては、未熟胚、完熟種子などの植物材料を植物体または種子等から取り出す、または必要に応じてそれらから誘導されるカルスを得ることにより、遺伝子導入または形質転換に好適な植物材料を調製する。「植物材料」の定義については上述のとおりである。植物材料の調製は、ソルガム属植物の植物体から組織（これには未熟胚、完熟種子等が含まれる）を単離・採取することにより行う。また、単離・採取した組織からカルスを誘導して植物材料を調製してもよい。所望によりさらに、植物材料をアグロバクテリウムに感染させる前に培養してもよい。
　本発明において使用するソルガム属の植物の植物材料の大きさは特に限定される訳ではないが、例えば、未熟胚の場合、１．０－３．０ｍｍの大きさの物を用いることができる。
　工程（ｉ）においては、上述の通り、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地を用いることができる。
　また、工程（ｉ）においては、形質転換効率を向上させるための様々な処理がなされてもよい。このような処理としては、例えば熱処理、遠心処理、熱処理および遠心処理、ならびに加圧処理などがあげられる。このような形質転換効率を上昇させるための処理は、下記項目２．において詳細に述べる。
　（ｉｉ）植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程
　工程（ｉｉ）においては、工程（ｉ）で調製したソルガム属植物の植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する。
　本明細書で使用する「接種」とは、アグロバクテリウム菌を植物の組織に接触させることをいい、当該技術分野においては種々のアグロバクテリウム菌接種方法が公知である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウム菌を懸濁した液体培地に植物組織を加える方法、共存培地上の植物組織にアグロバクテリウム菌の懸濁液を直接滴下する方法、植物組織中にアグロバクテリウム菌の懸濁液を注入する方法、およびアグロバクテリウム菌の懸濁液中に植物組織を浸漬し減圧する方法があげられる。しかしながら、本発明の方法におけるアグロバクテリウム菌の接種方法は、これらの方法に限定されない。
　当該アグロバクテリウム菌を接種するにあたり、アグロバクテリウム菌による形質転換効率を改善するために、例えば、アセトシリンゴン、界面活性剤、多孔性セラミックス糖の種々の添加剤をアグロバクテリウム菌の懸濁液中に含ませることが可能である。
　本発明に使用可能なアグロバクテリウム菌は特に限定されず、アグロバクテリウムによる形質転換法に使用可能な、公知のいずれのアグロバクテリウム菌であってよい。本発明の好ましい態様において、アグロバクテリウム菌は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、例えばＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、ＡＧＬ０、ＡＧＬ１およびＣ５８Ｃ１等であるが、これらに限定されない。
　アグロバクテリウム菌は、アグロバクテリウム菌内のプラスミドのＴ－ＤＮＡの中に挿入された遺伝子を植物のゲノム中に導入する性質を有することが公知である。そのため、本発明で使用可能なアグロバクテリウム菌は、植物内で発現させることを意図する遺伝子をＴ－ＤＮＡ中に挿入したプラスミドを有する。そして、当該プラスミドを有するアグロバクテリウム菌を植物組織に接種することにより植物を形質転換することが可能である。これにより、組織中の植物細胞に好ましい形質が付与される。本発明において使用可能なアグロバクテリウム菌用のプラスミドは、例えば、ｐＬＣ４１、ｐＳＢ１３１、Ｕ０００９Ｂ、Ｕ００１７Ｓ、ｐＳＢ１３４、ｐＮＢ１３１、およびｐＩＧ１２１Ｈｍ等があげられるが、これらに限定されるわけではない。
　工程（ｉｉ）においては、上述の通り、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地を用いることができる。
　また、工程（ｉｉ）においては、形質転換効率を向上させるための様々な処理がなされてもよい。このような処理としては、例えば熱処理、遠心処理、熱処理および遠心処理、加圧処理、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理、ならびに硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理、などがあげられる。このような形質転換効率を上昇させるための処理は、下記項目２．において詳細に述べる。
　（ｉｉｉ）共存工程
　工程（ｉｉｉ）においては、工程（ｉｉ）においてアグロバクテリウム菌を接種した植物材料の組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程を行う。本工程は、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、アグロバクテリウム菌の共存下にて培養することにより、アグロバクテリウム菌から植物細胞へのＤＮＡの導入を確実にする工程である。
　工程（ｉｉｉ）で使用される培地は、本明細書では「共存培地」という。共存培地は、植物細胞を通常培養するために通常使用されるものでもよく、例えばＬＳ無機塩類（Linsmaier, E., and Skoog, F., (1965) Physiol. Plant, 18:100-127）を基本とする培地等が挙げられる。好ましくは、工程（ｉｉｉ）においては、上述の通り、窒素源の濃度および／または無機イオンの濃度を高めた培地を、共存培地として用いることができる。
　また、本発明で用いる共存培地中に、オーキシン類として２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、ピクローラム、ダイカンバまたは他のオーキシン類を添加することができる。あるいは、カイネチンや４ＰＵのようなサイトカイニンなど、他の植物成長調節物質を添加することもできる。
　工程（ｉｉｉ）における「培養」とは固化した共存培地の上または液体状の共存培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間で生育させることをいう。本発明において、培地の形態は、培養成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。共存培地の固化は、当該技術分野において公知の固化剤を添加することにより行うことができ、そのような固化剤としては、例えばアガロースが知られている。本発明においては、このような固化した共存培地を好適に使用することができる。
　工程（ｉｉｉ）における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは１８℃－３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、工程（ｉｉｉ）の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。工程（ｉｉｉ）の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは１日ないし７日、より好ましくは２日ないし５日である。さらに好ましくは３日ないし４日である。
　植物材料として未熟胚が用いられる場合、本発明の工程（ｉｉｉ）の共存培養において未熟胚は胚盤側を上向きに、胚軸側を培地に接するように置床して培養してもよく、または未熟胚は胚軸側を上向きに、胚盤側を下向きに培地に接するように置床して培養してもよい。好ましくは、未熟胚は胚盤側を上向きに、胚軸側を培地に接するように置床して共存培養する。
　また、工程（ｉｉｉ）においては、形質転換効率を向上させるための様々な処理がなされてもよい。このような処理としては、例えば、遠心処理、加圧処理、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理、および硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理、などがあげられる。このような形質転換効率を上昇させるための処理は、下記項目２．において詳細に述べる。
　（ｉｖ）レスティング工程
　本発明の形質転換植物の作成方法においては、上記共存工程の後にさらにレスティング工程、再分化工程を経て、形質転換植物を作成する。
　工程（ｉｖ）のレスティング工程においては、共存工程後に植物組織をレスティング培地で培養する。本工程は、共存工程の後に植物細胞からアグロバクテリウム菌を除くとともに植物細胞の増殖を行う工程である。
　工程（ｉｖ）で使用される培地は、本明細書中では「レスティング培地」という。レスティング培地は、植物細胞を培養するために通常使用されるものでよく、例えば、ＬＳ無機塩類やＮ６無機塩類（Chu, C.-C., (1978) Proc. Symp. Plant Tissue Culture., Peking: Science Press, pp. 43-50）を基本とする培地等があげられる。なお本工程におけるレスティング培地は、好ましくは抗生物質を含む。レスティング培地中に含まれる抗生物質は、下記の選抜工程で用いる選抜用の抗生物質とは異なり、アグロバクテリウムの除菌を目的とする。限定される訳ではないが、抗生物質として、好ましくはセフォタキシムおよび／またはカルベニシリン、チメンチン等を使用することができる。
　工程（ｉｖ）におけるレスティング培地中には、好ましくは、植物成長調節物質を含む。植物成長調節物質としては好ましくは、オーキシン類に属するピクローラムおよび／または２，４－Ｄ、ダイカンバが含まれる。オーキシン類は一般に植物組織を脱分化させる作用を有するために、工程（ｉｖ）および所望により続いて行われる選抜工程において、ほとんどの植物組織は一部または全部が脱分化組織（カルス）となる。本明細書で使用する、「脱分化組織」または「カルス」の用語は、分化した植物組織の一部（外植片）をオーキシンおよびサイトカイニン等の植物成長調節物質を含む培地で培養することにより得られる組織で、元来の植物組織としての形態を有さない無定形で未分化状態の細胞塊をいう。したがって、脱分化組織の状態でレスティング工程を開始する場合、および分化している植物組織がレスティング工程中または続く選抜工程中にすべてが脱分化および一部が脱分化する場合等の、脱分化組織が関係するいかなる態様も本発明の範囲内である。
　また、レスティング培地は、好ましくは糖質を含む。糖質源としては、シュークロース、グルコース、マルトースなどの糖や、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコールを用いることができる。ソルガム属ではないが、イネではシュークロース濃度やマンニトール、ソルビトール濃度を変えることによってカルス形成、および再分化効率が改善したとの報告がある（Kavi Kishor（1987）Plant Science 48:189-194）。ソルガムにおいても適宜、糖質源の種類と濃度を変えることができる。
　工程（ｉｖ）における「培養」とは、固化したレスティング培地の上または液体状のレスティング培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間で生育させることをいう。本発明において、培地の形態は、培地成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。レスティング培地の固化は、当該技術分野において公知の固化剤を添加することにより行うことができ、そのような固化剤としては、例えばアガロース等が知られている。工程（ｉｖ）における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃－３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは１日－２８日、より好ましくは７日－２１日である。
　また、工程（ｉｖ）においては、形質転換効率を向上させるための様々な処理がなされてもよい。このような処理としては、例えば、遠心処理、加圧処理、Ｌ－プロリン、および／またはＬ－アスパラギンを添加した培地（Elkonin, et al., 1995：非特許文献９）、硝酸イオン濃度とリン酸イオン濃度を増加させた培地（Elkonin, et al., 2000：非特許文献１０）；ポリビニルポリピロリドン（PVPP）を添加した培地（Gao, et al., 2005：非特許文献１１）；ならびに、６－ベンジルアミノプロリン（BAP）を添加した培地（Wu, et al., 2014：非特許文献１２）；をレスティング培地として用いること、などがあげられる。このような形質転換効率を上昇させるための処理は、下記項目２．において詳細に述べる。
　さらに、レスティング工程（ｉｖ）と再分化工程（ｖ）の間に選抜工程が含まれていてもよい。選抜工程は、アグロバクテリウム菌による植物の形質転換方法において一般的に行われている工程である。本発明の形質転換植物の作製方法において選抜工程は必須ではない。例えば、後に述べる形質転換向上処理をした場合には、選抜工程を経なくても目的とする形質転換体を得ることができるからである。なお、選抜工程を行う場合、以下の記載は例示のためのものであり、本発明は以下の記載により限定されるものではない。
　選抜工程は、上記工程により得られた組織から、形質転換体を導入遺伝子の有無により選抜する工程である。選抜工程で使用される培地は、本明細書中では「選抜培地」という。選抜培地として使用可能な培地は、例えば、ＬＳ無機塩類やＮ６無機塩類を基本とする培地、例えば具体的にはＭＳ培地等があげられる。
　一般的なアグロバクテリウム菌を用いた形質転換法によれば、選抜培地中には、オーキシン類、好ましくは２，４－Ｄおよび／またはピクローラム、ダイカンバが添加される。本発明においても、選抜培地が植物成長調節物質を含むのは、好ましい態様である。本選抜工程で使用されるオーキシン類は特に限定されず、好ましくは２，４－Ｄである。さらに、必要に応じて、種々の添加物を加えることが可能である。
　形質転換植物の選抜は、例えば、適当な選抜薬剤を含む選抜培地で、上記共存工程および／またはレスティング工程を経た植物を培養し、選抜薬剤に対する耐性の有無により行うことができる。選抜工程に使用可能な選抜薬剤は、当該技術分野で通常使用されるものを用いることが可能である。例えば、選抜薬剤としては、抗生物質または除草剤を使用可能である。抗生物質としては、例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、またはブラストサイジンＳ等が使用可能である。さらに、除草剤としては、例えば、フォスフィノスライシン、ビアラフォスまたはグリホセート等が使用可能である。
　本選抜工程を行うためには、アグロバクテリウム菌中のＴ－ＤＮＡ中に挿入したＤＮＡは、植物に発現させることを意図する遺伝子のみならず、例えば、選抜薬剤に対する耐性遺伝子等を含むことが必要である。このような選抜薬剤に対する耐性遺伝子は当該技術分野においては公知である。選抜工程において、例えばハイグロマイシンを含む選抜培地において選抜を行う場合、植物には、植物内で発現させることを意図する遺伝子に加え、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていることが必要である。
　あるいは、形質転換植物の選抜は、植物細胞の糖要求性に基づいて行うことが可能である。植物細胞が利用できる糖にはシュークロース、グルコースなどがあるが、マンノースは利用できないことが知られている。したがって、マンノースのみを炭素源とする培地で植物組織を培養すると、利用できる糖がないために植物組織は枯死する。糖要求性に基づく選抜はこの原理を利用するものである。即ち、この選抜方法を利用するためには、アグロバクテリウム菌中のＴ－ＤＮＡ中に挿入したＤＮＡは、植物に発現させることを意図する遺伝子のみならず、リン酸化マンノースイソメラーゼ（phosphomannose isomerase：ＰＭＩ）遺伝子を含むことが必要となる。ここで、ＰＭＩ遺伝子を導入された植物細胞は、マンノースを炭素源として利用できるようになる。したがって、上記のようなアグロバクテリウム菌により形質転換された植物組織のみが、マンノースのみを炭素源とする培地で生育することが可能となり、これにより形質転換植物組織のみを選抜することが可能となる（Negrotto, D., et al., (2000) Plant Cell Reports, 19:798-803）。このような方法は、他の糖についても行うことができる。例えば、キシロースイソメラーゼ遺伝子を導入された植物細胞は炭素源としてキシロースを利用することが可能となるため、このような方法に適用可能である。
　また、容易に検出可能な遺伝子をスクリーニングの指標として導入し、当該遺伝子の発現の有無により選抜することも可能である。このようなスクリーニングの指標となる遺伝子としては、ＧＦＰ遺伝子等があげられる。これらの遺伝子を発現する細胞・組織を検出する方法は当該技術分野において公知である。
　選抜工程は、培地の成分組成を変更して、複数回繰り返して行うことも可能である。例えば、複数回の選抜工程では、選抜薬剤の濃度を各選抜工程で上昇させることにより、薬剤選抜の確実性が増し、形質転換植物体を得られる可能性を上昇させることが可能となる。本選抜工程は、好ましくは少なくとも１回、より好ましくは２回、さらに好ましくは３回行われる。また、複数回選抜工程を行う場合には、選抜薬剤を含む培地で培養した組織のうち増殖した部分を切り取り、当該増殖部分のみを次の選抜工程に供することにより、効率よく形質転換組織を獲得することも可能である。
　選抜工程における「培養」とは、固化した選抜培地の上または液体状の選抜培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。本発明において、培地の形態は、培地成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。選抜培地の固化は、上記のように例えばアガロース等により行うことが可能である。選抜工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃－３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、例えば、２回選抜工程が行われる場合には、１次選抜は１週間、そして２次選抜は２週間の計３週間行われる。また、複数回の選抜工程全体では好ましくは２－８週間、より好ましくは３－６週間行われる。また、複数回の選抜を行う場合には、各回毎に培養期間、温度および明暗条件を変更することも可能である。
　（ｖ）再分化工程
　工程（ｖ）においては、レスティング培地で培養した組織を、必要ならば選抜した後に、再分化培地で再分化させる工程を行う。工程（ｖ）で使用される培地は、本明細書中では「再分化培地」という。再分化培地には、オーキシンやサイトカイニンを適宜添加してもよい。
　再分化培地としては、例えば、ＬＳ無機塩類やＮ６無機塩類を基本とする培地、例えば具体的にはＭＳ培地等があげられる。
　再分化培地は選抜薬剤を含んでもよい。再分化工程（ｖ）において使用可能な選抜薬剤は、選抜工程において定義したものと同様である。しかしながら、再分化工程において必ずしも選抜工程で用いた選抜薬剤と同じ選抜薬剤を用いなくともよい。その場合には、植物にはアグロバクテリウム菌から、２種類以上の選抜薬剤に対する耐性遺伝子が導入されている必要がある。
　本発明における「再分化」とは、全部または一部が脱分化していた植物組織が、再び元の植物組織または植物体の性質を獲得することをいう。共存工程および／または選抜工程中にオーキシン類を使用すると、植物組織の全部または一部が脱分化する。したがって、再分化工程に供することにより、脱分化組織が再分化し、完全な形質転換植物体を得ることが可能となる。
　再分化工程における「培養」とは、固化した再分化培地の上または液体状の再分化培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。本発明において、培地の形態は、培地成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。再分化培地の固化は、上記のように例えばアガロース等により行うことが可能である。再分化工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃－３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、再分化工程の培養は好ましくは１６－２４時間／日の照明下で行われるが、これに限定されない。再分化工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは７日－５６日、より好ましくは１４日－４２日である。
　また、再分化工程（ｖ）においては、形質転換効率を向上させるための様々な処理がなされてもよい。このような処理としては、例えば、１ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ　ＩＡＡ、１ｍｇ／Ｌ　ＩＢＡ、１μｍｏｌ／Ｌ　硫酸銅を含むＭＳ培地（非特許文献１３）や０．５ｍｇ／Ｌ　ゼアチン、　１ｍｇ／Ｌ　インドール－３－酢酸（IAA）、０．１ｍｇ／Ｌ　チジアズロンを含む改良ＭＳ培地(非特許文献１２)を再分化培地として用いることなどがあげられる。このような形質転換効率を上昇させるための処理は、下記項目２．において詳細に述べる。
　２．形質転換向上処理
　また本発明の遺伝子導入方法と形質転換植物の作成方法において、以下に述べる形質転換向上処理を行ってもよい。本明細書において、「形質転換向上処理」とは、形質転換効率の向上を達成するための処理をいう。また、本明細書において「形質転換向上処理」とは、遺伝子導入効率を向上させる処理、カルス形成率を向上させる処理、および／または、再分化効率を向上させる処理を包含する概念である。
　このような形質転換向上処理としては、限定されるものではないが、例えば以下のａ）ないしｋ）のいずれか１つの処理、あるいはこれらの組み合わせが含まれる。
　ａ）熱処理；
　ｂ）遠心処理；
　ｃ）加圧処理；
　ｄ）熱処理及び遠心処理；
　ｅ）アグロバクテリウム菌の接種時および／または共存工程において銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理；
　ｆ）アグロバクテリウム菌の接種時および／または共存工程において硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理；
　ｇ）レスティング工程において、Ｌ－プロリンおよび／またはＬ－アスパラギンを添加した培地を用いる処理；
　ｈ）レスティング工程において、硝酸イオン濃度とリン酸イオン濃度を増加させた培地を用いる処理；
　ｉ）レスティング工程において、ポリビニルポリピロリドン（PVPP）を添加した培地を用いる処理；
　ｊ）レスティング工程または再分化工程において、６－ベンジルアミノプロリン（BAP）を添加した培地を用いる処理；ならびに
　ｋ）再分化工程において、１ｍｇ／Ｌ　ナフタレン酢酸（NAA）、１ｍｇ／Ｌ　インドール－３－酢酸（IAA）、１ｍｇ／Ｌ　インドール－３－酪酸（IBA）、１μｍｏｌ／Ｌ　硫酸銅を含むＭＳ培地を用いる処理。
　ｌ）再分化工程において、０．５ｍｇ／Ｌ　ゼアチン、　１ｍｇ／Ｌ　インドール－３－酢酸（IAA）、０．１ｍｇ／Ｌ　チジアズロンを含む改良ＭＳ培地を用いる処理。
　上記ａ）ないしｋ）の処理のうち、ａ）ないしｅ）はいずれも遺伝子導入効率を向上させる効果があり、ｂ）、ｅ）ないしｉ）はカルス形成率を向上させる効果があり、ｅ）、ｈ）およびｋ）は再分化効率を向上させる効果がある。ｊ）は、遺伝子導入効率、カルス形成率、または再分化効率のいずれの段階に効果があるのかについてまだ確認されていないが、結果として形質転換効率を向上させる効果がある。一態様において、本発明の方法についてｊ）の処理は必ずしも含めなくてよい。別の態様において、本発明の方法についてｊ）の処理は再分化工程において行う。
　熱処理は、例えばWO 1998/054961に記載の方法を用いて行うことができる。熱処理は本発明の工程（ｉ）または（ｉｉ）において行うことができる。例えば、植物材料をアグロバクテリウム菌と接触させる前に熱処理を行う場合、３３℃ないし６０℃、好ましくは３７℃ないし５２℃で、５秒間ないし２４時間、好ましくは１分間ないし２４時間、処理する。
　遠心処理は、例えばWO 2002/012520に記載の方法を用いて行うことができる。遠心処理は本発明の工程（ｉ）ないし（ｉｖ）のいずれかの工程において行うことができる。植物材料をアグロバクテリウム菌と接触させる前に遠心処理を行う場合の条件は、例えば、１００Ｇないし２５万Ｇ、好ましくは、５００Ｇないし２０万Ｇ、更に好ましくは１０００Ｇないし１５万Ｇの遠心加速度で、１秒間ないし４時間、更に好ましくは１秒間ないし２時間処理することであってもよい。また、遠心処理を共存工程の後に行う場合の条件は、例えば、１００Ｇ－２５万Ｇ、５００Ｇ－２０万Ｇ、好ましくは１０００Ｇ－１５万Ｇ、最も好ましくは１１００Ｇ－１１万Ｇ程度の遠心加速度範囲で、１秒以上、好ましくは１秒間ないし４時間、より好ましくは１秒間ないし２時間、さらに好ましくは１秒間ないし１０分間、処理することであってもよい。遠心処理の時間は、遠心加速度に応じて適宜選択される。遠心処理時間は、遠心加速度が大きい場合には極く短い時間、例えば１秒以下でも遺伝子導入効率を有意に向上させることができる。一方、遠心加速度が小さい場合には、遠心処理を長く行うことにより遺伝子導入効率を有意に向上させることができる。なお、適切な遠心処理条件は、ルーチンな実験により容易に設定することができる。
　加圧処理は、例えばWO 2005/017169に記載の方法を用いて行うことができる。加圧処理は本発明の工程（ｉ）ないし（ｉｖ）のいずれかの工程において行うことができる。加圧処理は、限定されるわけではないが、好ましくは１．７気圧ないし１０気圧の範囲、より好ましくは２．４気圧ないし８気圧の範囲で行われる。
　熱処理および遠心処理は、例えばWO 2002/012521に記載の方法を用いて行う事ができる。熱処理および遠心処理の条件は、上述の熱処理および遠心処理についてそれぞれ記載した条件を採用しうる。
　アグロバクテリウム菌の接種時および／または共存工程において銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理は、例えばWO 2005/017152に記載の方法を用いて行うことができる。当該処理は本発明の工程（ｉｉ）または（ｉｉｉ）において行うことができる。当該処理は、例えば、銅イオンを含む金属塩を１μＭないし５０μＭ、好ましくは１μＭないし１０μＭの濃度で含む培地を用いて行い得る。金属塩は、例えば硫酸銅またはグルコン酸銅であってもよい。
　アグロバクテリウム菌の接種時および／または共存工程において硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理は、例えば、Zhao, Z.-Y., et al., (2001) Mol. Breed., 8:323-333; 非特許文献２；および／またはIshida, Y., et al., (2003) Plant Biotechnology, 20:57-66に記載の方法を用いて行う事ができる。当該処理は、本発明の工程（ｉｉ）または（ｉｉｉ）において行う事ができる。当該処理は、例えば硝酸銀を１μＭないし５０μＭ、好ましくは１μＭないし１０μＭの濃度で含む培地を用いて行い得る。
　レスティング工程において、以下：Ｌ－プロリンおよび／またはＬ－アスパラギンを添加した培地を用いる処理；硝酸イオン濃度とリン酸イオン濃度を増加させた培地を用いる処理；ポリビニルポリピロリドン（PVPP）を添加した培地を用いる処理；および、６－ベンジルアミノプロリン（BAP）を添加した培地を用いる処理；は、それぞれ例えば非特許文献９、１０、１１及び１２に記載の方法を用いて行うことができる。当該処理は本発明の工程（ｉｖ）において行うことができる。それぞれの物質の添加量は上述の非特許文献を参照して、当業者が適宜決定することができる。
　再分化工程において、１ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ　ＩＡＡ、１ｍｇ／Ｌ　ＩＢＡ、１μｍｏｌ／Ｌ　硫酸銅を含むＭＳ培地を用いる処理は、例えば非特許文献１３に記載の方法を用いて行うことができる。また、０．５ｍｇ／Ｌ　ゼアチン、　１ｍｇ／Ｌ　インドール－３－酢酸（IAA）、０．１ｍｇ／Ｌ　チジアズロンを含む改良ＭＳ培地を用いる処理は、例えば非特許文献１２に記載の方法を用いて行うことができる。当該処理は本発明の工程（ｖ）において行うことができる。
　当業者は、これらの形質転換向上処理を適切なタイミング・条件で行う事ができる。また、これらを適宜組み合わせることは、形質転換効率向上のために一層好ましい。
　３．本発明の方法による効果とその確認方法
　本明細書において形質転換とは、導入した目的遺伝子が核ゲノムに組み込まれ安定的に発現している植物を得る工程をいう。本発明の形質転換植物の作成方法により、高い効率でソルガム属植物の形質転換を行うことができる。よって植物の形質転換効率の向上が達成される。
　形質転換工程は、具体的には、対象植物の細胞内への目的遺伝子の導入、遺伝子が導入された細胞を含む組織からのカルス形成、遺伝子が核ゲノムに組み込まれたカルスの再分化、といった工程を経る。
　本明細書において遺伝子導入とは、対象植物の細胞内に目的遺伝子を導入することをいう。本発明の遺伝子導入方法により、高い効率でソルガム属植物に遺伝子導入を行うことが可能となる。また、それにより高い効率でソルガム属の形質転換植物を作成することができる。
　さらには、カルス形成率や再分化効率の向上によっても、植物の形質転換効率の向上が可能となる。
　すなわち本明細書において「形質転換効率が高い」とは、高い効率で目的遺伝子が植物細胞へ導入されること（遺伝子導入効率が高い）、目的遺伝子が導入された植物組織からから高い効率でカルスが形成されること（カルス形成率が高い）、目的遺伝子が組み込まれたカルスから高い効率で再分化が起こること（再分化効率が高い）、を包含する概念である。また本明細書において「形質転換効率が向上する」とは、目的遺伝子の植物細胞への導入効率が向上すること、目的遺伝子が導入された植物組織からのカルス形成率が向上すること、目的遺伝子が組み込まれたカルスからの再分化効率が向上すること、を包含する概念である。
　本発明の形質転換植物の作成方法により、植物の形質転換効率の再現性が高い、形質転換の実験毎のバラツキが少ない、安定して形質転換植物を獲得できる、などの有利な効果も得ることができる。これらの効果も広義においては、上記の「形質転換効率が高い」、および「形質転換効率が向上する」、という概念に包含される。
　対象植物が形質転換されたか否かを決定するためのより確実な方法は、例えば、サザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲによる植物染色体への導入遺伝子の組み込み、および後代植物での導入遺伝子の発現確認（後代への遺伝）などである。サザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲは広く知られた方法により行うことができ、例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. (2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) に記載される方法により行われる。また、後代植物における発現の確認はＧＵＳ遺伝子などのレポーター遺伝子の発現や除草剤抵抗性遺伝子などの選抜マーカー遺伝子の発現を調査する方法により実行可能である。具体的には非特許文献２に記載されているが、これに限定されるものではない。
　植物細胞に遺伝子導入がされたか否かは、遺伝子導入組織の一過性発現を観察することにより決定することができる。一過性発現とは、植物細胞の核内へ移行した目的遺伝子が、植物細胞のタンパク発現機構を利用して、ある一定期間発現する現象である。一過性発現の後、核内に移行した目的遺伝子のうちの一部が核ゲノムに組み込まれ、目的遺伝子が組み込まれた細胞は形質転換細胞として、目的遺伝子を安定的に発現し始める。
　一過性発現は公知の種々の方法により確認することができる。例えば、導入する遺伝子にＧＵＳ（β－グルクロニダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子あるいはＧＦＰ遺伝子などのレポーター遺伝子を利用し、簡便な公知の方法でこれらのレポーター遺伝子の発現部位を目視することにより確認することが可能である。
　遺伝子導入効率は、例えば、目視により一過性発現を段階的にスコアリングすることにより評価することができる。例えば、後述の実施例のように、レスティング工程における未熟胚の胚盤組織のＧＵＳ遺伝子の発現を、青色を呈するスポットが０個の未熟胚はスコア０、１－１０個の未熟胚はスコア１、１１－４０個の未熟胚はスコア２、４１個から胚盤の１／３未満が青色を呈した未熟胚はスコア３、胚盤の１／３以上１／２未満が青色を呈した未熟胚はスコア４、胚盤の１／２以上が青色を呈した未熟胚はスコア５とした６段階で評価してもよい。
　また遺伝子導入効率は、当業者に一般に使用されている計算方法によっても決定することができる。例えば、遺伝子導入された植物組織数を、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織数で除することにより算出することが可能である。
　カルス形成率については、例えば、目視によりカルスが形成されたか否かを段階的に評価して平均値をとってもよい。例えば、後述の実施例のように未熟胚からのカルス形成を１（胚盤の半分以上がカルス化）、０．５（胚盤の一部がカルス化）、０（カルス形成なし）の３段階で評価してもよい（後述の実施例におけるカルス形成指数）。あるいは、カルスが形成された数を、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織数で除することにより算出してもよい。
　以下、実施例によって本発明を説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲の記載に基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能である。
　実施例１：高窒素共存培地の遺伝子導入に対する効果
　材料および方法
　開花後１４－２３日目のソルガム（品種：Tx430）の未熟胚を無菌的に採取し、アグロバクテリウム懸濁培地（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／Ｌ　ニコチン酸、０．５ｍｇ／Ｌ　ピリドキシン塩酸、１ｍｇ／Ｌ　チアミン塩酸、１００ｍｇ／Ｌ　ミオ－イノシトール、１ｇ／Ｌ　カザミノ酸、１．５ｍｇ／Ｌ　２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、６８．５ｇ／Ｌ　シュークロース、３６ｇ／Ｌ　グルコース、ｐＨ５．２；非特許文献５を参照）で１回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるための前処理（１５，０００ｒｐｍ（２０，０００×ｇ）、１０分間の遠心処理および４３℃、３分間の熱処理）を行った。１００μＭ　アセトシリンゴンを含むアグロバクテリウム懸濁培地に約１．０×１０９　ｃｆｕ／ｍＬでアグロバクテリウムを懸濁し接種源とした。アグロバクテリウム菌株には、WO 2014/157541 A1のpLC41GWHのＴ－ＤＮＡ領域を、トウモロコシユビキチンプロモーターおよびイントロンで制御されヒマのカタラーゼイントロンが介在したＧＵＳ遺伝子（Ｐｕｂｉ－Ｉｕｂｉ－ＩＧＵＳ－Ｔｎｏｓ）、およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターで制御されたＢａｒ遺伝子（Ｐ３５Ｓ－bar-T35S）を有するＴ－ＤＮＡに改変したバイナリーベクター、およびWO 2014/157541 A1のブースターベクターを有するＥＨＡ１０５（pLC41 GUS-Bar::pVGW7）を使用した。前処理した未熟胚に接種源を加え、５分間室温で静置した。ＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／Ｌ　ニコチン酸、０．５ｍｇ／Ｌ　ピリドキシン塩酸、１ｍｇ／Ｌ　チアミン塩酸、１００ｍｇ／Ｌ　ミオ－イノシトール、７００ｍｇ／Ｌ　Ｌ－プロリン、１．５ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ、２０ｇ／Ｌ　シュークロース、１０ｇ／Ｌ　グルコース、５００ｍｇ／Ｌ　ＭＥＳ、１００μＭ　アセトシリンゴン、５μＭ　ＡｇＮＯ３、５μＭ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、８ｇ／Ｌ　寒天、ｐＨ５．８；非特許文献５を参照、ただしアスコルビン酸は除いた）、またはＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が２２－３６２ｍＭであり、それ以外のＬＳ無機塩を１／５濃度とした上記共存培地に、アグロバクテリウムを接種した未熟胚を胚盤側が上になるように置床した。ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が２２－３６２ｍＭである培地は、ＮＨ４ＮＯ３を添加することによって調整した。２５℃、暗黒下で２日間培養した後、未熟胚をレスティング培地（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／Ｌ　ニコチン酸、０．５ｍｇ／Ｌ　ピリドキシン塩酸、１ｍｇ／Ｌ　チアミン塩酸、１００ｍｇ／Ｌ　ミオ－イノシトール、１ｇ／Ｌ　カザミノ酸、３ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ、３０ｇ／Ｌ　マルトース、７．５ｇ／Ｌ　ソルビトール、７．８μＭ　ＣｕＳＯ４．Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ／Ｌ　チメンチン、３．５ｇ／Ｌ　ゲランガム、ｐＨ５．８）に置床し、２５℃、暗黒下で培養した。
　レスティング培地に置床後３日間培養した後、未熟胚を０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含む０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で１度洗浄し、１．０ｍＭ　５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロン酸（X-gluc）を含むリン酸緩衝液に浸潤した。２８℃で２４時間反応させた後、顕微鏡下で観察し、青色を呈する胚盤組織の範囲を調査した。青色を呈するスポットが０個の未熟胚はスコア０、１－１０個の未熟胚はスコア１、１１－４０個の未熟胚はスコア２、スポットが４１個以上で胚盤の１／３未満が青色を呈した未熟胚はスコア３、胚盤の１／３以上１／２未満が青色を呈した未熟胚はスコア４、胚盤の１／２以上が青色を呈した未熟胚はスコア５とした。１試験区６－８未熟胚を使用し、試験は２回行った。
　結果
　対照培地であるＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地(対照区)を用いた時より、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６２ｍＭ－２６２．１ｍＭであり、それ以外のＬＳ無機塩を１／５濃度とした共存培地を用いた時の方が、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現の平均スコアは高かった（試験区3ないし5）。よって、低無機塩培地であっても、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６２ｍＭ以上２６２．１ｍＭ以下の培地を用いることによって、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の導入効率が向上することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例２：高Ｍｇ ２＋ 共存培地の遺伝子導入に対する効果
　材料および方法
　対照のＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地、またはＭｇ２＋濃度が０．６－１５０．４　ｍＭ　であり、それ以外のＬＳ無機塩を１／５濃度とした試験区共存培地に、実施例１と同様に処理した未熟胚を置床し、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現を評価した。Ｍｇ２＋濃度が０．６－１５０．４ｍＭである培地は、ＭｇＳＯ４を添加することによって調整した。１試験区６－７未熟胚を使用し、試験は２回行った。
　結果
　Ｍｇ２＋のみを高濃度にした試験区培地ではＭｇ２＋濃度が４．８ｍＭ－９０．４ｍＭである時、対照の培地よりもＧＵＳ一過性発現の平均スコアは高くなった（試験区9ないし11）。したがって、高Ｍｇ２＋共存培地は、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の導入効率を向上させることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例３：高Ｍｇ ２＋ および高Ｎ共存培地の遺伝子導入に対する効果
　材料および方法
　対照のＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地、またはＭｇ２＋濃度が０．６－１５０．４ｍＭかつＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６２．０ｍＭであり、それ以外のＬＳ無機塩を１／５濃度とした試験区共存培地に、実施例１と同様に処理した未熟胚を置床し、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現を評価した。Ｍｇ２＋濃度が０．６－１５０．４ｍＭである培地は、ＭｇＳＯ４を添加することによって、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６２．０ｍＭである培地は、ＮＨ４ＮＯ３を添加することによって調整し、作成した。１試験区８未熟胚を使用し、試験は２回行った。
　結果
　試験区共存培地の高窒素条件では、Ｍｇ２＋濃度が２．６ｍＭ－９０．４ｍＭである時、対照の培地と比較してＧＵＳ一過性発現の平均スコアは著しく高くなった（試験区14ないし17）。高Ｍｇ２＋高Ｎ共存培地は、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の導入効率を顕著に向上させることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例４：高Ｋ ＋ および／または高Ｎ共存培地の遺伝子導入に対する効果
　材料および方法
　対照のＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地、またはＫ＋濃度が８．０－２０４．４ｍＭであり、それ以外のＬＳ無機塩を１／５濃度とした共存培地、または上記Ｋ＋を含みさらにＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６２．０ｍＭとなるように調整した１／５ＬＳ無機塩の共存培地に、実施例１と同様に処理した未熟胚を置床し、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現を評価した。Ｋ＋濃度が８．０－２０４．４ｍＭである培地は、Ｋ２ＳＯ４を添加することによって調整し、作成した。１試験区につき６－７未熟胚を使用し、試験は４回行った。
　結果
　試験区共存培地の高窒素条件においてＫ＋濃度が２４．０ｍＭ－６４．１ｍＭである時、対照の培地よりＧＵＳ一過性発現の平均スコアは著しく高くなった(試験区20,21)。高Ｋ＋高Ｎ共存培地は、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の導入効率を向上させることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例５：高Ｃａ ２＋ および／または高Ｎ共存培地の遺伝子導入に対する効果
　材料および方法
　ＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地、またはＣａ２＋濃度が１．２－９．６ｍＭであり、それ以外のＬＳ無機塩を１／５濃度とした共存培地、または上記Ｃａ２＋を含みさらにＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６２．０ｍＭとなるように調整した１／５ＬＳ無機塩の共存培地に、実施例１と同様に処理した未熟胚を置床し、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現を評価した。Ｃａ２＋濃度が１．２－９．６　ｍＭである培地は、ＣａＳＯ４を添加することによって調整した。１試験区６－７未熟胚を使用し、試験は２回行った。
　結果
　試験区培地の高窒素条件でＣａ２＋濃度が５．２ｍＭ－９．６ｍＭである時、対照の培地よりＧＵＳ一過性発現の平均スコアは顕著に高くなった(試験区24ないし26)。よって、高Ｃａ２＋高Ｎ共存培地は、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の導入効率を著しく向上させることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　実施例６：高Ｎａ ＋ および／または高Ｎ共存培地の遺伝子導入に対する効果
　材料および方法
　ＬＳ無機塩を１倍量含む共存培地、またはＮａ＋濃度が０．６－２５０．０ｍＭでありＬＳ無機塩を１／５濃度とした共存培地、または上記Ｎａ＋を含みさらにＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６２．０ｍＭとなるように調整した１／５ＬＳ無機塩の共存培地に、実施例１と同様に処理した未熟胚を置床し、ＧＵＳ遺伝子の一過性発現を評価した。Ｎａ＋濃度が０．６－２５０．０ｍＭである培地は、Ｎａ２ＳＯ４を添加することによって調整し、作成した。１試験区につき６－７未熟胚を使用し、試験は２回行った。
　結果
　試験区培地の高窒素条件では、Ｎａ＋濃度が０．６ｍＭ－１５０．１ｍＭである時、対照の培地よりＧＵＳ一過性発現の平均スコアは高くなった（試験区27ないし32）。よって、高Ｎａ＋共存培地、および高Ｎａ＋高Ｎ共存培地は、ソルガム未熟胚への外来遺伝子の導入効率を向上させることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　実施例７：高Ｍｇ ２＋ 共存培地の形質転換に対する効果
　材料および方法
　ソルガムの形質転換体作出に対する高Ｍｇ２＋および／または高Ｎ共存培地の効果を検証するために、カルス誘導培地および再分化培地にZhao et al.（2000：非特許文献５）およびWu et al.（2014：非特許文献１２）の培地を適用して実施したが、全く形質転換体を得ることができなかった。このため、これら既報の培地を改変することによって、ソルガムの形質転換試験を行なった。
　また、アグロバクテリウムを感染させる前の未熟胚の処理方法においても、Gurel et al.(2009：非特許文献７)が報告している熱処理に加え、遠心処理を施すことによって形質転換体が得やすくなることを我々の試験で確認したため、熱処理および遠心処理を行った未熟胚を用いて形質転換を実施した。
　前処理（７，５００ｒｐｍ（５，０００× ｇ）、１分間の遠心処理および４３℃、３分間の熱処理）を行った未熟胚に実施例１と同様に接種源（但し、アグロバクテリウム懸濁培地のｐＨは５．８）を加えた後、既報の共存培地　ＰＨＩ－Ｔ培地（Wu et al.（2014：非特許文献１２）)を参考にして組成を変更した改変ＰＨＩ－Ｔ培地（対照区共存培地）（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／Ｌ　ニコチン酸、０．５ｍｇ／Ｌ　ピリドキシン塩酸塩、１ｍｇ／Ｌ　チアミン塩酸塩、１００ｍｇ／Ｌ　ミオ－イノシトール、２０ｇ／Ｌ　シュークロース、１０ｇ／Ｌ　グルコース、５００ｍｇ／Ｌ　ＭＥＳ、７００ｍｇ／Ｌ　Ｌ－プロリン、１．５ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ、１００μＭ　アセトシリンゴン、５μＭ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、４．０ｇ／Ｌ　アガロース、ｐＨ５．８）、または改変ＰＨＩ－Ｔ培地のＭｇ２＋濃度を５．０ｍＭとした共存培地（試験区）に置床し、共存培養を行った。共存培養後の培養工程は、対照および試験区とも同一条件において行った。具体的には、２５℃、暗黒下で４日間共存培養した後、未熟胚をＤＢＣ３培地（Wu et al. 2014：非特許文献１２）を参考に組成を変更した改変ＤＢＣ３培地（ＬＳ無機塩、１．０ｍｇ／Ｌ　チアミン塩酸塩、０．２５ｇ／Ｌ　ミオ－イノシトール、３０ｇ／Ｌ　マルトース、２．５ｇ／Ｌ　ソルビトール、１．０ｇ／Ｌ　カゼイン、７００ｍｇ／Ｌ　Ｌ－プロリン、０．７５ｇ／Ｌ　グルタミン、１．０ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ、５μＭ　ＡｇＮＯ３、７．６μＭ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ／Ｌ　チメンチン、３．５ｇ／Ｌ　ゲランガム、ｐＨ５．８）に置床し、２５℃、暗黒下で培養した。そして、接種２週間後の未熟胚を５ｍｇ／Ｌ　グルホシネートアンモニウム塩（ＰＰＴ）を含む改変ＤＢＣ３培地（但し、グルタミンを除く）へ置床し、２５℃、暗黒下で１週間１次選抜培養を行った。次に、未熟胚を１０ｍｇ／Ｌ　ＰＰＴを含む改変ＤＢＣ３培地（但し、グルタミンを除き、ソルビトール量を５．０ｇ／Ｌに変更）へ置床し、２５℃、暗黒下で２週間２次選抜培養を行った。続いて、増殖したカルスを１５ｍｇ／Ｌ　ＰＰＴを含む改変ＤＢＣ３培地（ただし、グルタミンを除き、０．５ｍｇ／Ｌ　ＢＡＰを添加、さらにソルビトール量を５．０ｇ／Ｌに変更）へ置床し、２５℃、暗黒下で１週間３次選抜培養を行った。
　得られたＰＰＴ耐性カルスを、再分化培地（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／Ｌ　ニコチン酸、０．５ｍｇ／Ｌ　ピリドキシン塩酸塩、０．１ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩、１００ｍｇ／Ｌ　ミオ－イノシトール、２０ｇ／Ｌ　シュークロース、５００ｍｇ／Ｌ　ＭＥＳ、７００ｍｇ／Ｌ　Ｌ－プロリン、１０ｇ／Ｌ　アスコルビン酸、０．５ｍｇ／Ｌ　ゼアチン、　１ｍｇ／Ｌ　インドール－３－酢酸、５μＭ　ＡｇＮＯ３、５μＭ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ　チジアズロン、３．５ｇ／Ｌ　ゲランガム、ｐＨ５．８）へ置床し、２５℃、３５μｍｏｌ－２ｓ-1明条件で１ヶ月間培養した。再分化した幼植物をＮＡＢ１Ｃ１培地（Guoquan et al. (2013：非特許文献１３)）を参考に組成を変更した改変ＮＡＢ１Ｃ１培地（ＬＳ無機塩、０．５ｍｇ／Ｌ　ニコチン酸、０．５ｍｇ／Ｌ　ピリドキシン塩酸塩、０．１ｍｇ／Ｌ　チアミン塩酸塩、１００ｍｇ／Ｌ　ミオ－イノシトール、２０ｇ／Ｌ　シュークロース、５００ｍｇ／Ｌ　ＭＥＳ、７００ｍｇ／Ｌ　Ｌ－プロリン、１０ｇ／Ｌ　アスコルビン酸、１ｍｇ／Ｌ　１－ナフタレン酢酸、１ｍｇ／Ｌ　インドール－３－酢酸、１ｍｇ／Ｌ　インドール-３-酪酸、３．５ｇ／Ｌ　ゲランガム、ｐＨ５．８）へ移植し、２５℃、３５μｍｏｌ－２ｓ-1明条件でさらに１ヶ月間培養した。
　ＰＰＴ耐性カルスから再分化した個体の葉から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、導入遺伝子の有無をＰＣＲで確認した。ゲノムＤＮＡの抽出は、個体の葉からE.Z.N.A.SP Plant DNA Kit（Omega Biotek, Doraville, USA)を用いて行った。鋳型としてゲノムＤＮＡ、Ｂａｒ遺伝子を増幅するためのプライマーセット（atggacccagaacgacgcccggccgacatc：配列番号１、tcagatctcggtgacgggcaggaccggacg：配列番号２）を用いてＰＣＲを行った。１０μｌのＰＣＲ反応液中に、鋳型としてゲノムＤＮＡ　約１０ｎｇ、Tks Gflex DNA Polymerase（Takara社）　０．２μｌ、２×Gflex PCR Buffer（Takara社）５μｌ、Ｂａｒ遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（配列番号１）、およびリバースプライマー（配列番号２）各０．５μＭを添加し、９４℃　１分を１回、９８℃　１０秒、６８℃　３０秒を３５回のプログラムでＰＣＲ反応を行った。
　導入遺伝子の有無の判定は、ＰＣＲによって約５００ｂｐのバンドが増幅した個体を導入遺伝子有り、バンドが増幅しなかった個体を導入遺伝子無しとすることによって行った。
　結果
　試験区３４の高Ｍｇ２＋共存培地を用いて共存培養を行った未熟胚からは、１７．６％の効率で形質転換体が得られたのに対し、対照の共存培地を用いた場合は形質転換体が得られなかった。これにより、実施例２で認められた高Ｍｇ２＋共存培地によるソルガム未熟胚への外来遺伝子の導入効率を向上させる効果は、その後の形質転換体作出効率にも寄与した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例８：高Ｎ共存培地の形質転換に対する効果
　材料および方法
　実施例７と同様に熱処理および遠心処理を行い、アグロバクテリウムを接種した未熟胚を、実施例７と同じ対照共存培地である改変ＰＨＩ－Ｔ培地、または改変ＰＨＩ－Ｔ培地のＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が８５ｍＭまたは１２３ｍＭとしそれ以外のＬＳ無機塩を１／２濃度とした試験区共存培地に置床し、共存培養を行った。以降のＰＰＴ耐性カルスを選抜する方法や、個体を再生させる方法、形質転換体への遺伝子導入の有無を確認するためのＰＣＲ解析方法は、実施例７と同様とした。
　結果
　ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が８５ｍＭまたは１２３ｍＭとした高Ｎの試験区（試験区３５及び３６）共存培地を用いて共存培養を行った未熟胚からは、それぞれ８％の効率で形質転換体が得られたのに対し、対照共存培地を用いた場合は、４％の効率であった。これにより、実施例１で認められた高Ｎ共存培地によるソルガム未熟胚への外来遺伝子の導入効率を向上させる効果は、その後の形質転換体作出効率にも寄与した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　実施例９：高Ｍｇ ２＋ および高Ｎ共存培地の形質転換に対する効果
　材料および方法
　実施例７と同様に熱処理および遠心処理を行い、アグロバクテリウムを接種した未熟胚を、実施例７と同じ対照共存培地であるＰＨＩ－Ｔ培地、または改変ＰＨＩ－Ｔ培地をＬＳ無機塩を１／２倍量含みＭｇ２＋の濃度が５．０ｍＭ、かつＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が８５ｍＭとした試験区共存培地に置床し、共存培養を行った。以降のＰＰＴ耐性カルスを選抜する方法や、個体を再生させる方法、形質転換体への遺伝子導入の有無を確認するためのＰＣＲ解析方法は、実施例７と同様とした。
　結果
　高Ｍｇ２＋および高Ｎの試験区共存培地を用いて共存培養を行った未熟胚からは、１５％の効率で形質転換体が得られたのに対し、ＬＳ無機塩を１倍量含む対照区共存培地を用いた場合は、５％の効率であった。これによって、実施例３で観察された高Ｍｇ２＋および高Ｎ共存培地によるソルガム未熟胚への外来遺伝子の導入効率を向上させる効果は、その後の形質転換体作出効率にも寄与した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 　さらに、接種前に未熟胚に対して、遠心及び熱処理を行っていない未熟胚を用いた場合についても試験した。この場合であっても、高Ｍｇ２＋および／または高Ｎ共存培地の形質転換に対する効果が確認できた（データは示さない）。
　配列番号１：フォワードプライマー
　配列番号２：リバースプライマー

Claims (12)

  1. 　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
    　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
    　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
    　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
    を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、マグネシウムイオンの濃度を高めた培地であって、マグネシウムイオン濃度が４．０ｍＭ以上１００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
  2. 　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
    　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
    　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
    　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
    を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源の濃度を高めた培地であって、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６０ｍＭより多く２７０ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
  3. 　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
    　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
    　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
    　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
    を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはマグネシウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、マグネシウムイオン濃度が２．６ｍＭ以上１００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
  4. 　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
    　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
    　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
    　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
    を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはカリウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、カリウムイオン濃度が２４ｍＭ以上６５ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
  5. 　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
    　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
    　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
    　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
    を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはカルシウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、カルシウムイオン濃度が５．２ｍＭ以上１０ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
  6. 　ソルガム属（Sorghum）の植物の、植物材料の組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
    　（ｉ）上記植物材料を調製する工程；
    　（ｉｉ）当該植物材料の組織にアグロバクテリウム菌を接種する工程；および
    　（ｉｉｉ）当該アグロバクテリウム菌を接種した組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程；
    を行うことを含み、ここで、上記（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、窒素源および／またはナトリウムイオンの濃度を高めた培地であって、ＮＨ４ ＋とＮＯ３ －の合計濃度が６０ｍＭ以上２７０ｍＭ以下であり、ナトリウムイオン濃度が０．６ｍＭ以上２００ｍＭ以下である前記培地を用いることを特徴とする、前記方法。
  7. 　少なくとも（ｉｉｉ）の共存工程において、窒素源の濃度、ならびに／または、マグネシウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンおよびナトリウムイオンから選択される無機イオンの濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　ソルガム属（Sorghum）の植物の、形質転換植物の作成方法であって、
    　請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法にしたがって工程（ｉ）－（ｉｉｉ）を行い、次いで、
    　（ｉｖ）共存工程で培養した組織をレスティング培地で培養するレスティング工程；および
    　（ｖ）上記組織を再分化培地で再分化させる工程；
    を含む、前記方法。
  9. 　以下の形質転換向上処理：
    　ａ）熱処理；
    　ｂ）遠心処理；
    　ｃ）加圧処理；
    　ｄ）（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いる処理；および
    　ｅ）（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の工程において、硝酸銀の濃度を高めた培地を用いる処理；
    のうちの少なくとも１つを行う、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　上記（ｉｖ）レスティング工程と、（ｖ）再分化工程の間に選抜工程を含む、請求項８または９に記載の方法。
  11. 　アグロバクテリウム菌が、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、ＡＧＬ０、ＡＧＬ１、およびＣ５８Ｃ１からなる群より選択される菌である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　ソルガム属の植物がソルガム（Sorghum bicolor）である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110972941A (zh) * 2019-12-07 2020-04-10 平顶山学院 一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005017152A1 (ja) * 2003-08-13 2005-02-24 Japan Tobacco Inc. 銅イオンの添加により植物の形質転換効率を向上させる方法
WO2007148819A1 (ja) * 2006-06-23 2007-12-27 Japan Tobacco Inc. 植物形質転換用コスミドベクター及びその利用法
WO2008105509A1 (ja) * 2007-02-28 2008-09-04 Japan Tobacco Inc. 選抜工程を経ないアグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
WO2011013764A1 (ja) * 2009-07-29 2011-02-03 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、コムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法、コムギ属の植物の形質転換植物の作成方法
JP2011120496A (ja) * 2009-12-09 2011-06-23 National Institute Of Agrobiological Sciences イネ科植物の形質転換効率向上方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6369298B1 (en) * 1997-04-30 2002-04-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Agrobacterium mediated transformation of sorghum
FI104907B (fi) * 1997-09-18 2000-04-28 Univ Helsinki Licensing Rypsin Agrobacterium-välitteinen transformaatio
US7511198B2 (en) * 2004-05-20 2009-03-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize multidrug resistance-associated protein polynucleotides and methods of use
JP4661178B2 (ja) * 2004-11-17 2011-03-30 日本製紙株式会社 植物体の生産方法
EP3078748B1 (en) * 2009-12-30 2021-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for the introduction and regulated expression of genes in plants

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005017152A1 (ja) * 2003-08-13 2005-02-24 Japan Tobacco Inc. 銅イオンの添加により植物の形質転換効率を向上させる方法
WO2007148819A1 (ja) * 2006-06-23 2007-12-27 Japan Tobacco Inc. 植物形質転換用コスミドベクター及びその利用法
WO2008105509A1 (ja) * 2007-02-28 2008-09-04 Japan Tobacco Inc. 選抜工程を経ないアグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
WO2011013764A1 (ja) * 2009-07-29 2011-02-03 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、コムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法、コムギ属の植物の形質転換植物の作成方法
JP2011120496A (ja) * 2009-12-09 2011-06-23 National Institute Of Agrobiological Sciences イネ科植物の形質転換効率向上方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASUMOTO, MIYAO: "7. Agrobacterium-mediated transformation of rice", LOW TEMPERATURE SCIENCE, vol. 67, 2009, pages 641 - 647, ISSN: 1880-7593 *

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