CN107105623B

CN107105623B - 使用土壤杆菌属细菌向高粱属植物导入基因的方法及高粱属植物的转化植物的制备方法

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Publication number: CN107105623B
Application number: CN201580070896.3A
Authority: CN
Inventors: 纲岛雅子
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2014-12-24
Filing date: 2015-12-24
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2035-12-24
Also published as: JP2018027020A; US20180010139A1; WO2016104583A1; CN107105623A; US10745706B2

Abstract

本发明的课题在于，提供一种比现有公知的土壤杆菌法的效率高的高粱属植物的基因导入方法及转化植物制备方法。本发明提供一种高粱属植物的基因导入方法，其特征在于，在制备高粱属植物的植物组织材料的工序、接种土壤杆菌属细菌的工序和/或共存工序中，使用提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基，所述无机离子选自镁离子、钾离子、钙离子及钠离子。本发明还提供一种转化植物的制造方法，其特征在于，使用本发明的基因导入方法。

Description

使用土壤杆菌属细菌向高粱属植物导入基因的方法及高粱属植物的转化植物的制备方法

技术领域

本发明涉及通过土壤杆菌属细菌向高粱属植物进行基因导入的方法。本发明还涉及通过土壤杆菌属细菌制备高粱属植物的转化植物的方法。

背景技术

高粱是原产于非洲的禾本科的短日照单子叶植物。高粱的水利用效率高，耐干性、耐高温性优异，是仅次于玉米、水稻、小麦、大麦的主要谷类，在非洲、亚洲诸国是重要的粮食。另外，高粱含糖量高，也是生物乙醇的原料，因此，广泛进行用于改善高粱的农业性状的技术开发。高粱的全部基因组被破译，高粱特有的与有用农业性状相关的基因、数量性状基因座(QTL)的分析也在进行。可以认为，高粱的基因重组技术的开发在改善高粱的农业性状方面发挥了重要作用。

在作为主要谷类的大麦、小麦、玉米、水稻等单子叶植物的转化方法中，已知有聚乙二醇法、电穿孔法、基因枪法等物理化学方法(DNA的直接导入法)和利用土壤杆菌属细菌具有的功能的生物学方法(DNA的间接导入法)。通过土壤杆菌属细菌的基因导入法(以下称为土壤杆菌法)通过控制Ti质粒的病原性区域(vir区域)中的基因群的表达等，目标基因的导入拷贝数保持得较低，片段化而导入的情况少。因此，在得到的转化体中，能够较多地得到目标基因高表达的个体，与直接导入法相比，具有表达量的个体间差异小这一较大的优点。

土壤杆菌法被普遍地用作双子叶植物的转化法。原本认为，自然界中的土壤杆菌属细菌的宿主限定于双子叶植物，长时间不寄生于单子叶植物。然而，通过对供试组织的研究、培养基组成的改良、土壤杆菌属细菌株的选定等详细的研究，结果是首次报告了在作为主要谷物的水稻中通过土壤杆菌属细菌的高效转化方法(Hiei et al.1994：非专利文献1)。然后，紧接着水稻中的成功，还报告了在玉米(Ishida et al.1996：非专利文献2)、小麦(Cheng et al.1997：非专利文献3)、大麦(Tingay et al.1997：非专利文献4)、高粱(Zhaoet al.2000：非专利文献5)中通过土壤杆菌进行的转化的成功。

1.基于土壤杆菌法的高粱转化方法的相关现有技术

1)接种土壤杆菌的植物组织

作为用于接种土壤杆菌的高粱组织，使用了未成熟胚(非专利文献5)。

2)前处理

作为提高基于土壤杆菌法的转化效率的方法之一，对若干种单子叶植物的转化使用了对进行转化的植物材料实施热处理或离心处理的方法(Hiei et al.2006：非专利文献6)。还报告了，在高粱中通过对使土壤杆菌感染前的未成熟胚在43℃条件下进行3分钟的处理，使转化效率比未处理区提高约3倍(Gurel et al.2009：非专利文献7)。但是，关于离心处理，记载了对高粱的转化产生了负面的结果。

3)共存工序

将土壤杆菌接种于植物组织使其共存的工序。在通过土壤杆菌进行的高粱转化中，作为共存培养基的组成，使用了含有1倍量MS无机盐的MS培养基(非专利文献5)。

4)愈伤组织形成工序

愈伤组织形成工序是使植物组织脱分化(dedifferentiation)的工序。

在高粱的组织培养工序中，过量产生酚类化合物，存在阻碍愈伤组织形成的倾向(Cai et al.1987：非专利文献8)。对此，报告了通过在MS培养基中添加L-脯氨酸及L-天冬酰胺，促进了胚性愈伤组织(embryogenic callus)的增殖、抑制了成为阻碍高粱培养的主要原因的酚类化合物的产生(Elkonin et al.1995：非专利文献9)。另外，报告了通过提高愈伤组织形成培养基的硝酸离子浓度和磷酸离子浓度，促进胚性愈伤组织的诱导，提高通过愈伤组织进行的植物体再分化的效率(Elkonin et al.2000：非专利文献10)。有向愈伤组织形成培养基添加聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)减轻由土壤杆菌接种时的损伤导致的细胞的褐变的报告(Gao et.al.2005：非专利文献11)。

作为实际上对高粱进行了转化的实例，有如下报告：在添加于愈伤组织形成培养基(静息培养基及筛选培养基)的植物生长调节物质中使用6-苄基氨基脯氨酸(BAP)，从而改善了转化效率(Wu et al.2014：非专利文献12)。

5)再分化工序

尝试了对添加于再分化培养基的植物生长调节物质的种类和浓度进行最优化。报告了通过使用包含1mg/L萘乙酸(NAA)、1mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)、1mg/L吲哚-3-丁酸(IBA)、1μmol/L硫酸铜的MS培养基，促进了由移植至生根培养基的再分化植物对根的再分化(Guoquan et al.2013：非专利文献13)。

如此地，通过土壤杆菌转化高粱的方法经过改良，从最初报告的2.1％(非专利文献5)的转化效率升高至33％(非专利文献12)。但是，与水稻、玉米相比，该转化效率仍然不能说是足够高。

2.通过土壤杆菌属细菌的植物转化方法中的共存培养基的改良

对于通过土壤杆菌的转化方法而言，有多个在玉米中通过使用将N6培养基稀释而得到的共存培养基提高了转化效率的报告。例如，Du等公开了：接种了土壤杆菌的玉米(A188)未成熟胚中，确认到GUS基因短暂表达的未成熟胚的比例在含有1倍量N6无机盐的N6培养基中为72％，与此相对，将主要无机盐稀释至50％、30％、10％的N6培养基中均增加至90％以上(Du et al.2010：非专利文献14)。

另外，在玉米(Hi-II)的其它报告中确认了：在使用土壤杆菌悬浮培养基和共存培养基中含有1倍量N6无机盐的培养基时，单位供试愈伤组织的转化效率为0％，与此相对，通过使用将N6主要无机盐稀释至10％、50％的土壤杆菌悬浮培养基和共存培养基，转化效率分别提高至4.0％、17.5％(Vega et al.2008：非专利文献15)。

对于小麦而言，报告了：在使用了由将无机盐稀释至10％的MS培养基构成的土壤杆菌悬浮培养基及共存培养基的情况下，与使用由含有1倍量MS无机盐的MS培养基构成的上述培养基相比，显示出GUS基因的短暂表达的未成熟胚的比例显著增高(Cheng etal.1997：非专利文献16)。由此可以认为，“为了提高利用土壤杆菌向多种主要作物导入基因的短暂表达、转化效率，通常使用低无机盐培养基(Vega et al.2008：非专利文献15)。”。

与此相反，报告了：虽然不是共存培养基，但对于烟草而言，通过在对接种土壤杆菌前的植物材料进行预培养的培养基中使用增加了硝酸铵浓度的培养基，提高了导入基因的短暂表达、转化效率(Boyko et al.2009：非专利文献17)。另外也有如下报告：通过在对接种土壤杆菌前的植物组织进行预培养的培养基中添加氯化钾、稀土类元素的氯化物，提高了拟南芥、烟草的转化效率(Boyko et al.2011：非专利文献18)。

还报告了通过在共存培养基中添加抗氧化物质、铜而使导入基因的短暂表达得到促进的方法。对于玉米而言，将作为抗氧化物质的L-半胱氨酸(0.4g/L)和二硫苏糖醇(DTT)(0.4g/L)分别添加在MS培养基、N6培养基、LS培养基、D培养基中，结果是与非添加区相比，显著提高了导入基因的短暂表达以及转化效率(非专利文献14)。

3.用于植物组织的培养的培养基

除了上述MS培养基(LS培养基)以外，也开发、利用了各种组成的培养基用于植物组织的培养。

N6培养基主要用作水稻的花药培养培养基。B5培养基虽然作为液体培养用途而开发，但也作为固体培养基而用于很多植物组织培养。R2培养基以B5培养基作为基础，是为了水稻的悬浮培养细胞用途而开发的培养基。CC培养基是作为从玉米的原生质体形成愈伤组织的培养基而设计的培养基。

下表是对于作为公知的基本培养基的MS培养基、LS培养基、N6培养基、B5培养基、R2培养基、CC培养基，总结了作为氮源的NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度及各种无机离子(镁离子、钾离子、钙离子及钠离子)的浓度的表。

表1

	MS	LS	N6	B5	R2	CC
							NH<sub>4</sub><sup>+</sup>，NO<sub>3</sub><sup>-</sup>总计(mM)	60.0	60.0	35.0	27.0	45.0	28.0
Mg<sup>2+</sup>(mM)	1.5	1.5	0.8	2.0	1.0	1.0
							K<sup>+</sup>(mM)	20.0	20.0	30.9	25.0	40.0	13.0
Ca<sup>2+</sup>(mM)	3.0	3.0	1.1	1.0	1.0	4.0
							Na<sup>+</sup>(mM)	0.0	0.0	0.0	1.1	2.0	0.0

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Hiei et al.(1994)The Plant Journal 6：271-282.

非专利文献2：Ishida et al.(1996)Nature Biotechnology 14：745-750.

非专利文献3：Cheng et al.(1997)Plant Physiol.115：971-980.

非专利文献4：Tingay et al.(1997)Plant J.11：1369-1376.

非专利文献5：Zhao et.al.(2000)Plant Molecular Biology 44：789-798.

非专利文献6：Hiei et al.(2006)Plant Cell Tissue Organ Cult 87：233-243.

非专利文献7：Gurel et.la(2009)Plant Cell Rep 28(3)：429-444.

非专利文献8：Cai et al.(1987)Plant Cell Tissue Organ Cult.9：245-252.

非专利文献9：Elkonin et al.(1995)Maydica 40(2)：153-157.

非专利文献10：Elkonin et al.(2000)Plant Cell Tissue Organ Cult 61(2)：115-123.

非专利文献11：Gao et.al.(2005)Genome 48：321-333.

非专利文献12：Wu et al.(2014)In Vitro Cell Dev Biol-Plant 50：9-18.

非专利文献13：Guoquan et al.(2013)In Vitro Cell.Dev.Biol-Plant(2013)49(2)：191-197.

非专利文献14：Du et al.(2010)African Journal of Biotechnology 9(8)：1135-1143

非专利文献15：Vega et al.(2008)Plant Cell Reports 27(2)：297-305.

非专利文献16：Cheng et al.(1997)Plant Physiol Physiol 115：971-980.

非专利文献17：Boyko et al.(2009)Plant Cell Reports 28：737-757.

非专利文献18：Boyko et al.(2011)Plant Cell Reports 30：505-518.

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于，提供一种与比现有公知的土壤杆菌法的效率高的进行对高粱属植物导入基因的方法及制备高粱属的转化植物的方法。

解决课题的方法

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，在制备高粱属植物的植物材料的工序、向该植物材料的组织接种土壤杆菌属细菌的工序和/或共存工序中，使用氮源的浓度和/或选自镁离子、钾离子、钙离子及钠离子的无机离子的浓度比含有1倍量LS无机盐的培养基高的培养基，由此在高粱属的植物中提高基因导入效率及转化效率。

本发明优选通过以下记载的方式来实施，但并不限定于此。

[方式1]

一种对高粱属(Sorghum)植物的植物材料的组织进行基因导入的方法，其特征在于，包括：

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

(iii)将该接种了土壤杆菌属细菌的组织在该土壤杆菌属细菌存在下进行培养的共存工序；

在所述(i)、(ii)和/或(iii)工序中，使用提高了镁离子浓度的培养基，所述培养基的镁离子浓度为4.0mM以上且100mM以下。

[方式2]

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

在所述(i)、(ii)和/或(iii)工序中，使用提高了氮源浓度的培养基，所述培养基的NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度大于60mM且为270mM以下。

[方式3]

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

在所述(i)、(ii)和/或(iii)工序中，使用提高了氮源和/或镁离子的浓度的培养基，所述培养基的NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为60mM以上且270mM以下，镁离子浓度为2.6mM以上且100mM以下。

[方式4]

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

在所述(i)、(ii)和/或(iii)工序中，使用提高了氮源和/或钾离子的浓度的培养基，所述培养基的NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为60mM以上且270mM以下，钾离子浓度为24mM以上且65mM以下。

[方式5]

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

在所述(i)、(ii)和/或(iii)工序中，使用提高了氮源和/或钙离子的浓度的培养基，所述培养基的NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为60mM以上且270mM以下，钙离子浓度为5.2mM以上且10mM以下。

[方式6]

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

在所述(i)、(ii)和/或(iii)工序中，使用提高了氮源和/或钠离子的浓度的培养基，所述培养基的NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为60mM以上且270mM以下，钠离子浓度为0.6mM以上且200mM以下。

[方式7]

根据方式1～6中任一项所述的方法，其特征在于，至少在(iii)共存工序中使用提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基，所述无机离子选自镁离子、钾离子、钙离子及钠离子。

[方式8]

一种高粱属(Sorghum)植物的转化植物制备方法，其中，

按照方式1～7中任一项所述的方法进行工序(i)～(iii)，接下来包含：

(iv)在静息培养基中对共存工序中培养的组织进行培养的静息工序；以及

(v)在再分化培养基中使所述组织再分化的工序。

[方式9]

根据方式1～8中任一项所述的方法，其中，进行以下的转化提高处理中的至少一项：

a)热处理；

b)离心处理；

c)加压处理；

d)在(ii)和/或(iii)工序中使用提高了含铜离子的金属盐的浓度的培养基的处理；以及

e)在(ii)和/或(iii)工序中使用提高了硝酸银的浓度的培养基的处理。

[方式10]

根据方式8或9所述的方法，其中，在所述(iv)静息工序与(v)再分化工序之间包括筛选工序。

[方式11]

根据方式1～10中任一项所述的方法，其中，土壤杆菌属细菌为从由LBA4404、EHA101、EHA105、AGL0、AGL1及C58C1组成的组中选出的细菌。

[方式12]

根据方式1～11中任一项所述的方法，其中，高粱属植物为高粱(Sorghumbicolor)。

发明效果

根据本发明，能够以高效率进行高粱属植物的基因导入。而且，由此能够以高效率制备高粱属的转化植物。通过本发明的方法，还可以降低用于得到高粱转化后的植物体的成本。

具体实施方式

以下对本发明的构成进行具体说明，但本发明并不限定于此。在本说明书中只要没有特别定义，则涉及本发明而使用的科学用语及技术用语具有本领域技术人员通常所理解的意思。

本发明提供一种对高粱属(Sorghum)植物的植物材料的组织进行基因导入的方法，该方法包括：

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

其中，在所述(i)、(ii)和/或(iii)工序中，使用提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基。

本发明还提供一种高粱属植物的转化植物制备方法，该方法包括：

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；

(v)在再分化培养基中使上述组织再分化的工序；

在本发明中，能够使用的植物材料的来源植物为高粱属植物。需要说明的是，高粱(ソルガム)属也被称为モロコシ属，但在本说明书中统称为“高粱属”。作为本说明书中的“高粱属”的植物的例子，可以列举高粱(Sorghum bicolor)，但并不限定于此。

在本发明中，特别优选高粱(S.bicolor)。需要说明的是，在本说明书中，记载为“高粱(S.bicolor)”的情况表示“高粱属”中的“高粱”这一特定的植物品种。另外，高粱(S.bicolor)虽然也被称为モロコシ、タカキビ、高粱(コウリャン)，但均为相同的植物品，能够在本发明使用。

在本发明中，能够使用的“植物材料”非限制性地包括：供于利用土壤杆菌法进行植物的基因导入或转化的高粱属植物的细胞、叶、根、茎、果实、其它任意部位的植物组织、未成熟胚、成熟种子、愈伤组织或不定胚样组织(adventious embryo)(以下，在本说明书中称为愈伤组织等，或者简称为愈伤组织)、或者完整的植物体等植物的所有形态。作为本发明的方法所使用的植物材料的形态，优选为未成熟胚、成熟种子及由它们诱导的愈伤组织，最优选的是未成熟胚。

在本说明书中，“未成熟胚”是指受粉后的籽粒灌浆(登熟，grain filling)过程中的未成熟种子的胚。另外，供于本发明方法的未成熟胚的阶段(成熟期)没有特别限定，可以是受粉后的任意时期采集的未成熟胚，可以是受粉后2天以后的未成熟胚，优选为受粉后7～24天后的未成熟胚。未成熟胚可以在取出的当天使用，也可以是预培养的未成熟胚。

在本说明书中，“成熟种子”是指受粉后的籽粒灌浆过程结束作为种子完全成熟。

在本说明书中，“愈伤组织”是指无序增殖的未分化状态的细胞块。为了得到愈伤组织，可以将植物组织的分化后的细胞在含有生长素(例如，2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D))、细胞分裂素等植物生长调节物质的培养基(称为脱分化培养基)中进行培养而得到。用于获得该愈伤组织的处理称为脱分化处理，并且将该过程称为脱分化过程。

在本发明的方法中，提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基是指，与本领域技术人员熟知的MS(LS)基本培养基所含的氮源浓度和/或无机离子浓度相比，含有高浓度的氮源和/或无机离子的培养基。高浓度是指高于该MS(LS)基本培养基(Zhao,et al.,2000：非专利文献5)中含有的氮源和/或无机离子的浓度。具体而言，在MS(LS)基本培养基中，作为氮源，含有NH₄ ⁺和NO₃ ^-，它们的总浓度为60.0mM。而且，MS(LS)基本培养基含有1.5mM的镁离子、20.0mM的钾离子、3.0mM的钙离子。MS(LS)基本培养基不含有钠离子。在含有比这些MS(LS)基本培养基所含的氮源和/或无机离子的浓度高浓度的氮源和/或无机离子时，该培养基为提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基。

在本发明的方法中，提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基可以在上述(i)植物材料制备工序、(ii)土壤杆菌属细菌接种工序及(iii)共存工序中的至少1个工序中使用。优选该培养基至少在(iii)共存工序中使用。

在一个方式中，提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基是提高了镁离子浓度的培养基。提高了镁离子浓度的培养基中的镁离子浓度为4.0mM以上且100mM以下，优选为4.8mM以上且90.4mM以下。或者，在该情况下，镁离子浓度的下限可以选自4.0mM以上、4.8mM以上及7.5mM以上，而且其上限可以选自100mM以下、90.4mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下、45.3mM以下、40.0mM以下。镁离子浓度的下限及上限可以从上述数值的组中分别适当选择并进行组合。

在另一方式中，提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基是提高了氮源浓度的培养基。提高了氮源浓度的培养基中的NH₄ ⁺及NO₃ ^-的总浓度为大于60mM且270mM以下，优选为62mM以上且270mM以下。或者，在该情况下，NH₄ ⁺及NO₃ ^-的总浓度的下限可以选自大于60mM、62mM以上、65mM以上、70mM以上、75mM以上及80mM以上，而且其上限可以选自270mM以下、263mM以下、250mM以下、225mM以下、200mM以下、175mM以下、150mM以下、125mM以下、115mM以下及112mM以下。NH₄ ⁺及NO₃ ^-的总浓度的下限及上限可以从上述数值的组中分别适当选择并进行组合。

在另一方式中，提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基是提高了氮源浓度和/或提高了镁离子、钾离子、钙离子或钠离子的浓度的培养基。

提高了氮源浓度和/或提高了镁离子、钾离子、钙离子或钠离子的浓度的培养基中的NH₄ ⁺及NO₃ ^-的总浓度为60mM以上且270mM以下，优选为62mM以上且112mM以下。或者，在该情况下，NH₄ ⁺及NO₃ ^-的总浓度的下限可以选自60mM以上、62mM以上、65mM以上、70mM以上、75mM以上及80mM以上，而且其上限可以选自270mM以下、263mM以下、250mM以下、225mM以下、200mM以下、175mM以下、150mM以下、125mM以下、115mM以下及112mM以下。上述NH₄ ⁺及NO₃ ^-的总浓度的下限及上限可以从上述数值的组中分别适当选择并进行组合。

提高了氮源浓度和/或镁离子浓度的培养基中的镁离子浓度为2.6mM以上且100mM以下，优选为4.8mM以上且90.4mM以下。或者，在该情况下，镁离子浓度的下限可以选自2.6mM以上、4.0mM以上、4.8mM以上及10.0mM以上，而且其上限可以选自100mM以下、90.4mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下、50mM以下、45.3mM以下。上述镁离子浓度的下限及上限可以从上述数值的组中分别适当选择并进行组合。

提高了氮源浓度和/或钾离子浓度的培养基中的钾离子浓度为24mM以上且65mM以下，优选为24mM以上且60mM以下。或者，在该情况下，钾离子浓度的下限可以选自24.0mM以上、27.0mM以上及30mM以上，而且其上限可以选自70mM以下、65mM以下、64.1mM以下、60mM以下、55mM以下、50mM以下及45mM以下。上述钾离子浓度的下限及上限可以从上述数值的组中分别适当选择并进行组合。

提高了氮源浓度和/或钙离子浓度的培养基中的钙离子浓度为5.2mM以上且10mM以下，优选为5.2mM以上且9.6mM以下。或者，在该情况下，钙离子浓度的下限可以选自5.2mM以上、5.5mM以上及6.0mM以上，而且其上限可以选自10mM以下、9.6mM以下、9.0mM以下、8.0mM以下、7.5mM以下、7.0mM以下及6.9mM以下。上述钙离子浓度的下限及上限可以从上述数值的组中分别适当选择并进行组合。

提高了氮源浓度和/或钠离子浓度的培养基中的钠离子浓度为0.6mM以上且200mM以下，优选为0.6mM以上且150mM以下，进一步优选为40.0mM以上且50.0mM以下。或者，在该情况下，钠离子浓度的下限可以选自0.6mM以上、1.0mM以上、4.0mM以上、10.0mM以上、20.0mM以上、30.0mM以上及40.0mM以上，而且其上限可以选自200mM以下、175mM以下、150.1mM以下、150mM以下、125mM以下、100mM以下、90.1mM以下、90mM以下、80mM以下、70mM以下、60mM以下及50mM以下。上述钠离子浓度的下限及上限可以从上述数值的组中分别适当选择并进行组合。

以下，进一步详细地对上述本发明方法的各工序进行说明。

1.关于本发明的各工序

本发明的基因导入方法及转化植物制备方法利用土壤杆菌属细菌。除了特别明确记载的工序以外，可以按照公知的利用了土壤杆菌属细菌的基因导入方法、转化方法中的各工序来进行。

(i)制备植物材料的工序

在工序(i)中，从植物体或种子等中取出未成熟胚、成熟种子等植物材料，或者根据需要得到由它们诱导的愈伤组织，由此制备适于基因导入或转化的植物材料。“植物材料”的定义如上所述。植物材料的制备通过从高粱属植物的植物体分离/采集组织(其中包含未成熟胚、成熟种子等)来进行。另外，可以由分离/采集的组织诱导愈伤组织，制备植物材料。根据希望，还可以在感染土壤杆菌前对植物材料进行培养。

在本发明中，对于使用的高粱属植物的植物材料的大小没有特别限定，例如，在未成熟胚的情况下，可以使用1.0～3.0mm大小的植物材料。

在工序(i)中，如上所述，可以使用提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基。

另外，在工序(i)中，可以进行用于使转化效率提高的各种处理。作为这样的处理，可以列举例如：热处理、离心处理、热处理及离心处理、以及加压处理等。这样的用于使转化效率提高的处理在下述项目2.中详细叙述。

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于植物材料的组织的工序

在工序(ii)中，将土壤杆菌属细菌接种于工序(i)中制备的高粱属植物的植物材料的组织。

本说明书中使用的“接种”是指使土壤杆菌属细菌与植物组织接触，在该技术领域中，各种土壤杆菌属细菌接接方法是公知的。作为该方法，可以列举例如：在悬浮有土壤杆菌属细菌的液体培养基中加入植物组织的方法、向共存培养基上的植物组织直接滴加土壤杆菌属细菌的悬浮液的方法、向植物组织中注入土壤杆菌属细菌的悬浮液的方法、以及将植物组织浸渍于土壤杆菌属细菌的悬浮液中并减压的方法。然而，本发明方法中的土壤杆菌属细菌的接种方法并不限定于这些方法。

在接种该土壤杆菌属细菌时，为了改善利用土壤杆菌属细菌的转化效率，例如，可以使土壤杆菌属细菌的悬浮液中含有乙酰丁香酮(acetosyringone)、表面活性剂、多孔性陶瓷糖等各种添加剂。

对于本发明中可以使用的土壤杆菌属细菌没有特别限定，可以是能够用于基于土壤杆菌的转化法的、公知的任意土壤杆菌属细菌。在本发明的优选方式中，土壤杆菌属细菌为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如，LBA4404、EHA101、EHA105、AGL0、AGL1及C58C1等，但并不限定于此。

土壤杆菌属细菌具有将插入土壤杆菌属细菌内质粒的T-DNA中的基因导入植物基因组中的性质是公知的。因此，本发明中可以使用的土壤杆菌属细菌具有将想要在植物内表达的基因插入T-DNA中的质粒。因此，能够通过将具有该质粒的土壤杆菌属细菌接种于植物组织来对植物进行转化。由此，可以对组织中的植物细胞赋予优选的性状。在本发明中可以使用的土壤杆菌属细菌用质粒可以列举例如：pLC41、pSB131、U0009B、U0017S、pSB134、pNB131及pIG121Hm等，但并不限定于此。

在工序(ii)中，如上所述，可以使用提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基。

另外，在工序(ii)中，可以实施用于提高转化效率的各种处理。作为这样的处理，可以列举例如：热处理、离心处理、热处理及离心处理、加压处理、使用提高了含铜离子的金属盐的浓度的培养基的处理、以及使用提高了硝酸银浓度的培养基的处理等。这样的用于提高转化效率的处理在下述项目2.中详细叙述。

(iii)共存工序

在工序(iii)中进行共存工序，所述共存工序是在该土壤杆菌属细菌的存在下对工序(ii)中接种了土壤杆菌属细菌的植物材料的组织进行培养。本工序通过在土壤杆菌属细菌共存下对接种了土壤杆菌属细菌的植物组织进行培养，从而可靠地将DNA从土壤杆菌属细菌导入植物细胞。

工序(iii)中使用的培养基在本说明书中称为“共存培养基”。共存培养基可以是为了对植物细胞进行一般的培养而通常使用的培养基，可以列举例如：以LS无机盐类(Linsmaier,E.,and Skoog,F.,(1965)Physiol.Plant,18：100-127)作为基础的培养基等。优选在工序(iii)中，如上所述，可以将提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基用作共存培养基。

另外，在本发明所使用的共存培养基中，作为生长素类，可以添加2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、毒莠定(picloram)、麦草畏(dicamba)或其它生长素类。或者也可以添加激动素(kinetin)、4PU这样的细胞分裂素等其它植物生长调节物质。

工序(iii)中的“培养”是指将植物组织植入固化后的共存培养基上或液体状的共存培养基中等，在适当的温度、明暗条件及时间的条件下使其生长发育。在本发明中，对于培养基的形态没有特别限定，只要培养成分可充分地供给至植物组织即可。共存培养基的固化可以通过添加该技术领域中公知的固化剂来进行，作为这样的固化剂，已知例如琼脂糖。在本发明中，可以优选使用这样固化后的共存培养基。

工序(iii)中的培养温度可以适当选择，优选为18℃～35℃，进一步优选在25℃条件下进行。另外，工序(iii)的培养优选在暗处进行，但并不限定于此。工序(iii)的培养时间也可以适当选择，优选为1天～7天，更优选为2天～5天，进一步优选为3天～4天。

作为植物材料，在使用未成熟胚的情况下，在本发明的工序(iii)的共存培养中，可以以使盾片(scutellum)侧向上、使胚轴侧与培养基接触的方式将未成熟胚植入并进行培养，或者可以以使胚轴侧向上、使盾片侧向下与培养基接触的方式将未成熟胚植入并进行培养。优选以使盾片侧向上、使胚轴侧与培养基接触的方式将未成熟胚植入并进行共存培养。

另外，在工序(iii)中，可以实施用于提高转化效率的各种处理。作为这样的处理，可以列举例如：离心处理、加压处理、使用提高了含铜离子的金属盐的浓度的培养基的处理、以及使用提高了硝酸银浓度的培养基的处理等。这样的用于提高转化效率的处理在下述项目2.中详细叙述。

(iv)静息工序

在本发明的转化植物制备方法中，在上述共存工序后进一步经过静息工序、再分化工序制备转化植物。

在工序(iv)静息工序中，在共存工序后用静息培养基对植物组织进行培养。本工序是在共存工序之后从植物细胞中除去土壤杆菌属细菌并进行植物细胞增殖的工序。

在工序(iv)中使用的培养基在本说明书中称为“静息培养基”。静息培养基可以是通常用于培养植物细胞的培养基，可以列举例如：以LS无机盐类、N6无机盐类(Chu,C.-C.,(1978)Proc.Symp.Plant Tissue Culture.,Peking：Science Press,pp.43-50)为基础的培养基等。需要说明的是，本工序中的静息培养基优选包含抗生素。静息培养基中包含的抗生素的目的在于，除去土壤杆菌，与下述筛选工序中使用的筛选用抗生素不同。作为抗生素，没有限定，优选可以使用头孢噻肟和/或羧苄青霉素、特美汀(timentin)等。

工序(iv)中的静息培养基中优选含有植物生长调节物质。作为植物生长调节物质，优选包含属于生长素类的毒莠定和/或2,4-D、麦草畏。生长素类通常具有使植物组织脱分化的作用，因此，在工序(iv)及根据希望随后进行的筛选工序中，基本上植物组织的一部分或全部成为脱分化组织(愈伤组织)。本说明书中使用的“脱分化组织”或“愈伤组织”用语是指，将分化后的植物组织的一部分(外植体)在含有生长素及细胞分裂素等植物生长调节物质的培养基中培养而得到的组织，是不具有作为原本的植物组织的形态的无定形的未分化状态的细胞块。因此，在脱分化组织的状态下开始静息工序的情况下、以及正在分化的植物组织在静息工序中或接下来的筛选工序中全部脱分化及一部分脱分化的情况下等，与脱分化组织相关的任意形态均在本发明的范围内。

另外，静息培养基优选含有糖质。作为糖质源，可以使用蔗糖、葡萄糖、麦芽糖等糖、甘露醇、山梨糖醇等糖醇。虽然不是高粱属，但在水稻中有如下报告：通过改变蔗糖浓度、甘露醇、山梨糖醇浓度而改善了愈伤组织形成及再分化效率(Kavi Kishor(1987)PlantScience 48：189-194)。在高粱中也可以适当改变糖质源的种类和浓度。

工序(iv)中的“培养”是指将植物组织植入固化后的静息培养基上或液体状的静息培养基中等，在适当的温度、明暗条件及时间的条件下使其生长发育。在本发明中，对于培养基的形态没有特别限定，只要培养成分充分地供给至植物组织即可。静息培养基的固化可以通过添加该技术领域中公知的固化剂来进行，作为这样的固化剂，已知例如琼脂糖等。工序(iv)中的培养温度可以适当选择，优选为20℃～35℃，进一步优选在25℃条件下进行。另外，本工序的培养优选在暗处进行，但并不限定于此。本工序的培养时间也可以适当选择，优选为1天～28天，更优选为7天～21天。

另外，在工序(iv)中，可以实施用于提高转化效率的各种处理。作为这样的处理，可以列举例如：离心处理；加压处理；使用添加了L-脯氨酸和/或L-天冬酰胺的培养基(Elkonin,et al.,1995：非专利文献9)、增加了硝酸离子浓度和磷酸离子浓度的培养基(Elkonin,et al.,2000：非专利文献10)、添加了聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)的培养基(Gao,et al.,2005：非专利文献11)以及添加了6-苄基氨基脯氨酸(BAP)的培养基(Wu,et al.,2014：非专利文献12)作为静息培养基的处理等。这样的用于提高转化效率的处理在下述项目2.中详细叙述。

另外，在静息工序(iv)与再分化工序(v)之间还可以包含筛选工序。筛选工序是在利用土壤杆菌属细菌进行的植物转化方法中通常进行的工序。在本发明的转化植物制备方法中，筛选工序不是必须的。这是由于，例如在进行后面叙述的转化提高处理的情况下，即使不经过筛选工序，也可以得到作为目标的转化体。需要说明的是，在进行筛选工序的情况下，以下记载用于示例，本发明并不限定于以下记载。

筛选工序是从由上述工序得到的组织中按照有无导入基因而筛选转化体的工序。筛选工序中使用的培养基在本说明书中称为“筛选培养基”。可以用作筛选培养基的培养基可以列举例如：以LS无机盐类、N6无机盐类作为基础的培养基，例如可以具体列举MS培养基等。

根据通常的使用了土壤杆菌属细菌的转化法，在筛选培养基中添加生长素类，优选添加2,4-D和/或毒莠定、麦草畏。在本发明中也优选筛选培养基包含植物生长调节物质的方式。本筛选工序中使用的生长素类没有特别限定，优选为2,4-D。另外，根据需要，可以加入各种添加物。

转化植物的筛选例如，可以在含有适当筛选药剂的筛选培养基中对经过了上述共存工序和/或静息工序的植物进行培养，根据有无对筛选药剂的耐受性来进行。能够用于筛选工序的筛选药剂可以使用该技术领域中通常使用的筛选药剂。例如，作为筛选药剂，可以使用抗生素或除草剂。作为抗生素，例如，可以使用潮霉素、卡那霉素或杀稻瘟素S等。另外，作为除草剂，例如，可以使用膦丝菌素(phosphinothricin)、双丙氨膦或草甘膦(glyphosate)等。

为了进行本筛选工序，土壤杆菌属细菌中的T-DNA中插入的DNA不仅需要包含想要在植物中表达的基因，还需要包含例如对筛选药剂的耐受性基因等。这样的对筛选药剂的耐受性基因在该技术领域中是公知的。在筛选工序中，例如，在含有潮霉素的筛选培养基中进行筛选的情况下，不仅需要向植物导入想要在植物内表达的基因，还需要导入潮霉素耐受性基因。

或者，转化植物的筛选可以基于植物细胞的糖要求性来进行。已知植物细胞能够利用的糖有蔗糖、葡萄糖等，但不能利用甘露糖。因此，在仅以甘露糖作为碳源的培养基中培养植物组织时，植物组织会因没有可利用的糖而枯死。基于糖要求性的筛选利用该原理。即，为了利用该筛选方法，在土壤杆菌属细菌中的T-DNA中插入的DNA不仅需要包含想要在植物中表达的基因，还需要包含磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase：PMI)基因。这里，导入了PMI基因的植物细胞变得能够利用甘露糖作为碳源。因此，只有上述这样的利用土壤杆菌属细菌进行了转化的植物组织能够在仅以甘露糖作为碳源的培养基中生长发育，由此可以仅对转化植物组织进行筛选(Negrotto,D.,et al.,(2000)Plant CellReports,19：798-803)。对于其它糖，也可以进行这样的方法。例如，导入了木糖异构酶基因的植物细胞能够利用木糖作为碳源，可以适用于这样的方法。

另外，也可以导入能够容易检测的基因作为筛查指标，根据有无该基因的表达来进行筛选。作为这样的成为筛查指标的基因，可以列举GFP基因等。检测表达这些基因的细胞/组织的方法在该技术领域中是公知的。

筛选工序可以改变培养基的成分组成，多次反复进行。例如，在多次筛选工序中，通过在各筛选工序中使筛选药剂的浓度升高，能够增加药剂筛选的可靠性，可以增加得到转化植物体的可能性。本筛选工序优选至少进行1次，更优选进行2次，进一步优选进行3次。另外，在进行多次筛选工序时，将在含有筛选药剂的培养基中培养后的组织中增殖的部分切下，仅将该增殖部分供于接下来的筛选工序，由此也能够高效地获得转化组织。

筛选工序中的“培养”是指将植物组织植入固化后的筛选培养基上或液体状的筛选培养基中等，在适当的温度、明暗条件及时间的条件下使其生长发育。在本发明中，对于培养基的形态没有特别限定，只要培养成分可充分地供给至植物组织即可。筛选培养基的固化可以如上所述通过例如琼脂糖等来进行。筛选工序中的培养温度可以适当选择，优选为20℃～35℃，进一步优选在25℃条件下进行。另外，本工序的培养优选在暗处进行，但并不限定于此。本工序的培养时间也可以适当选择，例如，在进行2次筛选工序的情况下，1次筛选为1周，然后2次筛选为2周，总计进行3周。另外，多次筛选工序总体优选进行2～8周，更优选进行3～6周。另外，在进行多次筛选的情况下，可以在各次中改变培养时间、温度及明暗条件。

(v)再分化工序

在工序(v)中，在根据需要进行筛选后，在再分化培养基中进行使静息培养基中培养的组织再分化的工序。工序(v)中使用的培养基在本说明书中称为“再分化培养基”。再分化培养基中可以适当添加生长素、细胞分裂素。

作为再分化培养基，可以列举例如：以LS无机盐类、N6无机盐类作为基础的培养基，例如可以具体列举MS培养基等。

再分化培养基可以含有筛选药剂。在再分化工序(v)中，可使用的筛选药剂与筛选工序中的定义相同。但是，再分化工序中不一定使用与筛选工序中所用的筛选药剂相同的筛选药剂。在这样的情况下，需要由土壤杆菌属细菌向植物导入针对2种以上筛选药剂的耐受性基因。

本发明中的“再分化”是指全部或一部分脱分化后的植物组织再次获得原本植物组织或植物体的性状。在共存工序和/或筛选工序中使用生长素类时，植物组织的全部或一部分发生脱分化。因此，通过供于再分化工序，脱分化组织进行再分化，可以得到完整的转化植物体。

再分化工序中的“培养”是指将植物组织植入固化后的再分化培养基上或液体状的再分化培养基中等，在适当的温度、明暗条件及时间的条件下使其生长发育。在本发明中，对于培养基的形态没有特别限定，只要培养成分可充分地供给至植物组织即可。再分化培养基的固化可以如上所述通过例如琼脂糖等来进行。再分化工序中的培养温度可以适当选择，优选为20℃～35℃，进一步优选在25℃条件下进行。另外，再分化工序的培养优选在16-24小时/天的照明下进行，但并不限定于此。再分化工序的培养时间也可以适当选择，优选为7天～56天，更优选为14天～42天。

另外，在再分化工序(v)中，可以实施用于提高转化效率的各种处理。作为这样的处理，可以列举例如：使用含有1mg/L NAA、1mg/L IAA、1mg/L IBA、1μmol/L硫酸铜的MS培养基(非专利文献13)、含有0.5mg/L玉米素、1mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/L苯基噻二唑脲的改良MS培养基(非专利文献12)作为再分化培养基等。这样的用于提高转化效率的处理在下述项目2.中详细叙述。

2.转化提高处理

另外，在本发明的基因导入方法和转化植物制备方法中，也可以进行以下所述的转化提高处理。在本说明书中，“转化提高处理”是指用于实现提高转化效率的处理。另外，在本说明书中，“转化提高处理”是指包括使基因导入效率提高的处理、使愈伤组织形成率提高的处理和/或使再分化效率提高的处理的概念。

作为这样的转化提高处理，没有限定，例如，可以包含以下a)～k)中的任一种处理或它们的组合。

a)热处理；

b)离心处理；

c)加压处理；

d)热处理及离心处理；

e)在土壤杆菌属细菌接种时和/或共存工序中使用提高了含铜离子的金属盐的浓度的培养基的处理；

f)在土壤杆菌属细菌接种时和/或共存工序中使用提高了硝酸银浓度的培养基的处理；

g)在静息工序中使用添加了L-脯氨酸和/或L-天冬酰胺的培养基的处理；

h)在静息工序中使用增加了硝酸离子浓度和磷酸离子浓度的培养基的处理；

i)在静息工序中使用添加了聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)的培养基的处理；

j)在静息工序或再分化工序中使用添加了6-苄基氨基脯氨酸(BAP)的培养基的处理；以及

k)在再分化工序中使用含有1mg/L萘乙酸(NAA)、1mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)、1mg/L吲哚-3-丁酸(IBA)、1μmol/L硫酸铜的MS培养基的处理。

l)在再分化工序中使用含有0.5mg/L玉米素、1mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/L苯基噻二唑脲的改良MS培养基的处理。

在上述a)～k)的处理中，a)～e)均具有使基因导入效率提高的效果，b)、e)～i)具有使愈伤组织形成率提高的效果，e)、h)及k)具有使再分化效率提高的效果。对于j)而言，虽然尚未确认是否在基因导入效率、愈伤组织形成率或再分化效率的任一阶段具有效果，但在结果上具有使转化效率提高的效果。在一个方式中，对于本发明的方法，可以不必包含j)处理。在其它方式中，对于本发明的方法，在再分化工序中进行j)处理。

热处理例如可以使用WO1998/054961中记载的方法来进行。热处理可以在本发明的工序(i)或(ii)中进行。例如，在使植物材料与土壤杆菌属细菌接触前进行热处理的情况下，在33℃～60℃、优选为37℃～52℃、5秒钟～24小时、优选为1分钟～24小时的条件下进行处理。

离心处理例如可以使用WO2002/012520中记载的方法来进行。离心处理可以在本发明的工序(i)～(iv)中的任意工序中进行。在使植物材料与土壤杆菌属细菌接触前进行离心处理时的条件例如可以为：以100G～25万G、优选以500G～20万G、进一步优选以1000G～15万G的离心加速度，处理1秒钟～4小时、进一步优选处理1秒钟～2小时。另外，在共存工序后进行离心处理时的条件例如可以为：以100G-25万G、500G-20万G、优选以1000G-15万G、最优选以1100G-11万G左右的离心加速度范围，处理1秒钟以上，优选处理1秒钟～4小时，更优选处理1秒钟～2小时，进一步优选处理1秒钟～10分钟。离心处理的时间可以根据离心加速度来适当选择。在离心加速度大的情况下，离心处理时间即使为极短的时间，例如为1秒钟以下，也能够明显地提高基因导入效率。另一方面，在离心加速度小的情况下，可以通过长时间进行离心处理来明显地提高基因导入效率。需要说明的是，适当的离心处理条件可以通过常规的实验来容易地设定。

加压处理可以使用例如WO2005/017169中记载的方法来进行。加压处理可以在本发明的工序(i)～(iv)中的任意工序中进行。对于加压处理并没有限定，优选在1.7大气压～10大气压的范围内进行，更优选在2.4大气压～8大气压的范围内进行。

热处理及离心处理可以使用例如WO2002/012521中记载的方法来进行。热处理及离心处理的条件可以采用上述热处理及离心处理中分别记载的条件。

在土壤杆菌属细菌接种时和/或共存工序中，使用提高了含铜离子的金属盐的浓度的培养基的处理可以使用例如WO2005/017152中记载的方法来进行。该处理可以在本发明的工序(ii)或(iii)中进行。该处理例如可以使用以1μM～50μM的浓度、优选以1μM～10μM的浓度含有含铜离子的金属盐的培养基来进行。金属盐例如可以为硫酸铜或葡糖酸铜。

在土壤杆菌属细菌接种时和/或共存工序中，使用提高了硝酸银浓度的培养基的处理可以使用例如Zhao,Z.-Y.,et al.,(2001)Mol.Breed.,8：323-333；非专利文献2；和/或Ishida,Y.,et al.,(2003)Plant Biotechnology,20：57-66中记载的方法来进行。该处理可以在本发明的工序(ii)或(iii)中进行。该处理例如可以使用以1μM～50μM的浓度、优选以1μM～10μM的浓度含有硝酸银的培养基来进行。

在静息工序中，可以分别使用例如非专利文献9、10、11及12中记载的方法来进行以下各处理：使用添加了L-脯氨酸和/或L-天冬酰胺的培养基的处理；使用增加了硝酸离子浓度和磷酸离子浓度的培养基的处理；使用添加了聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)的培养基的处理；以及使用添加了6-苄基氨基脯氨酸(BAP)的培养基的处理。该处理可以在本发明的工序(iv)中进行。对于各物质的添加量，本领域技术人员可以参考上述非专利文献来适当确定。

在再分化工序中，使用包含1mg/L NAA、1mg/L IAA、1mg/L IBA、1μmol/L硫酸铜的MS培养基的处理可以使用例如非专利文献13中记载的方法来进行。另外，使用包含0.5mg/L玉米素、1mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/L苯基噻二唑脲的改良MS培养基的处理可以使用例如非专利文献12中记载的方法来进行。该处理可以在本发明的工序(v)中进行。

本领域技术人员可以在适当的时机/条件下进行这些转化提高处理。另外，从转化效率提高方面考虑，进一步优选适当组合上述处理。

3.本发明方法的效果及其确认方法

在本说明书中，转化是指获得导入的目标基因被整合至核基因组并稳定地表达的植物的工序。根据本发明的转化植物制备方法，能够高效率地进行高粱属植物的转化。因此，可实现植物的转化效率提高。

转化工序具体而言经过如下过程：目标基因导入对象植物的细胞内、由包含导入了基因的细胞的组织形成愈伤组织、基因整合至核基因组后的愈伤组织的再分化。

在本说明书中，基因导入是指将目标基因导入对象植物的细胞内。根据本发明的基因导入方法，能够以高效率向高粱属植物进行基因导入。而且，可以由此以高效率制备高粱属的转化植物。

另外，随着愈伤组织形成率、再分化效率的提高，也可以提高植物的转化效率。

即，在本说明书中，“转化效率高”是指包括以下情况的概念：目标基因被高效率导入植物细胞(基因导入效率高)、以高效率由导入了目标基因的植物组织形成愈伤组织(愈伤组织形成率高)、以高效率由整合了目标基因的愈伤组织发生再分化(再分化效率高)。另外，在本说明书中，“转化效率提高”是指包括以下情况的概念：提高目标基因向植物细胞的导入效率、提高导入了目标基因的植物组织的愈伤组织形成率、提高整合了目标基因的愈伤组织的再分化效率。

根据本发明的转化植物制备方法，能够得到以下有利的效果：植物的转化效率的重现性高、每次转化实验的偏差小、可以稳定地获得转化植物等。这些效果也在广义上包含在上述的“转化效率高”及“转化效率提高”的概念中。

用于确定对象植物是否发生了转化的更可靠的方法有例如：利用Southern杂交法、PCR进行导入基因向植物染色体的整合、以及在后代植物中确认导入基因的表达(遗传给后代)等。Southern杂交(Southern hybridization)法、PCR可以通过通常公知的方法来进行，例如，可以通过Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3rd ed.(2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)中记载的方法来进行。另外，后代植物中表达的确认可以通过对GUS基因等报道基因的表达、除草剂抗性基因等筛选标记基因的表达进行调查的方法来实施。具体记载于非专利文献2，但并不限定于此。

是否向植物细胞中进行了基因导入可以通过观察基因导入组织的短暂表达来确定。短暂表达是指如下现象：转移至植物细胞的核内的目标基因利用植物细胞的蛋白质表达机制在某一段期间内进行表达。在短暂表达后，转移至核内的目标基因中的一部分被整合至核基因组，整合了目标基因的细胞形成转化细胞，开始稳定地表达目标基因。

短暂表达可以通过公知的各种方法来确认。例如，在待导入的基因中利用GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)基因、荧光素酶基因或GFP基因等报道基因，通过简便的公知方法对这些报道基因的表达部位进行肉眼观察，由此可以进行确认。

基因导入效率例如可以通过用肉眼观察对短暂表达进行分级打分来评价。例如，如下面叙述的实施例，将静息工序中未成熟胚的盾片组织的GUS基因表达分为以下6级进行评价：呈现蓝色的点为0个的未成熟胚设为分数0；1～10个的未成熟胚设为分数1；11～40个的未成熟胚设为分数2；41个～盾片的小于1/3呈现蓝色的未成熟胚设为分数3；盾片的1/3以上且小于1/2呈现蓝色的未成熟胚设为分数4；盾片的1/2以上呈现蓝色的未成熟胚设为分数5。

另外，基因导入效率可以根据本领域技术人员通常使用的计算方法来确定。例如，可以通过将进行了基因导入的植物组织数除以接种了土壤杆菌属细菌的植物组织数来进行计算。

对于愈伤组织形成率，例如可以通过肉眼观察是否形成了愈伤组织而进行分级评价并求出平均值。例如，如下面叙述的实施例，可以将由未成熟胚形成愈伤组织分为1(盾片的半数以上愈伤组织化)、0.5(盾片的一部分愈伤组织化)、0(未形成愈伤组织)这3级进行评价(下面叙述的实施例中的愈伤组织形成指数)。或者，可以通过将形成了愈伤组织数除以接种了土壤杆菌属细菌的植物组织数来进行计算。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行说明，但实施例用于例证而不限定本发明。本发明的范围基于权利要求书的记载来判断。另外，本领域技术人员基于本说明书的记载可以容易地进行修改、变更。

实施例1：高氮共存培养基对基因导入的效果

材料及方法

无菌采集开花后第14～23天的高粱(品种：Tx430)的未成熟胚，并用土壤杆菌悬浮培养基(LS无机盐、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇、1mg/L盐酸维生素B1、100mg/L肌醇(myo-inositol)、1g/L酪蛋白氨基酸、1.5mg/L2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、68.5g/L蔗糖、36g/L葡萄糖、pH5.2；参照非专利文献5)进行1次洗净。进行用于提高基因导入效率的前处理(15000rpm(20000×g)、10分钟的离心处理及43℃、3分钟的热处理)。以约1.0×10⁹cfu/mL将土壤杆菌悬浮于含有100μM乙酰丁香酮的土壤杆菌悬浮培养基中作为接种源。土壤杆菌属细菌株使用了具有在T-DNA进行了改变的双元载体及WO2014/157541A1的加强载体(booster vector)的EHA105(pLC41GUS-Bar::pVGW7)，所述双元载体具有由玉米泛素启动子及内含子控制WO2014/157541A1的pLC41GWH的T-DNA区域且包夹有蓖麻的过氧化氢酶内含子的GUS基因(Pubi-Iubi-IGUS-Tnos)、以及以花椰菜花叶病毒35S启动子控制的Bar基因(P35S-bar-T35S)。向前处理后的未成熟胚加入接种源，在室温条件下静置5分钟。在含有1倍量LS无机盐的共存培养基(LS无机盐、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇、1mg/L盐酸维生素B1、100mg/L肌醇、700mg/L L-脯氨酸、1.5mg/L 2,4-D、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、500mg/LMES、100μM乙酰丁香酮、5μM AgNO₃、5μM CuSO₄·5H₂O、8g/L寒天、pH5.8；参照非专利文献5，但除去了抗坏血酸)中、或者在NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为22～362mM且除此以外的LS无机盐设为1/5浓度的上述共存培养基中，以盾片侧朝上的方式植入接种了土壤杆菌的未成熟胚。NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为22～362mM的培养基通过添加NH₄NO₃来调整。在25℃、黑暗中培养2天后，将未成熟胚植入静息培养基(LS无机盐、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇、1mg/L盐酸维生素B1、100mg/L肌醇、1g/L酪蛋白氨基酸、3mg/L 2,4-D、30g/L麦芽糖、7.5g/L山梨糖醇、7.8μM CuSO₄.H₂O、150mg/L特美汀、3.5g/L吉兰糖胶(gellan gum)、pH5.8)，在25℃、黑暗中进行培养。

植入静息培养基后培养3天，然后用含有0.1％的Triton X-100的0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)将未成熟胚洗净1次，浸润于含有1.0mM的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)的磷酸缓冲液。在28℃条件下反应24小时后，在显微镜下进行观察，调查了呈现蓝色的盾片组织的范围。呈现蓝色的点为0个的未成熟胚设为分数0，1～10个的未成熟胚设为分数1、11～40个的未成熟胚设为分数2，点为41个以上且盾片的小于1/3呈现蓝色的未成熟胚设为分数3，盾片的1/3以上且小于1/2呈现蓝色的未成熟胚设为分数4，盾片的1/2以上呈现蓝色的未成熟胚设为分数5。1个试验区使用6～8个未成熟胚，进行了2次试验。

结果

与使用作为对照培养基的含有1倍量LS无机盐的共存培养基(对照区)时相比，使用NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为62mM～262.1mM且除此以外的LS无机盐设为1/5浓度的共存培养基时，GUS基因的短暂表达的平均分数高(试验区3～5)。因此可以确认，即使是低无机盐培养基，通过使用NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为62mM以上且262.1mM以下的培养基，可提高外来基因向高粱未成熟胚的导入效率。

表2

实施例2：高Mg²⁺共存培养基对基因导入的效果

材料及方法

将与实施例1同样地进行了处理的未成熟胚植入对照的含有1倍量LS无机盐的共存培养基、或者Mg²⁺浓度为0.6～150.4mM且除此以外的LS无机盐设为1/5浓度的试验区共存培养基，对GUS基因的短暂表达进行了评价。Mg²⁺浓度为0.6～150.4mM的培养基通过添加MgSO₄来进行调整。1个试验区使用6～7个未成熟胚，进行了2次试验。

结果

对于仅将Mg²⁺设为高浓度的试验区培养基而言，在Mg²⁺浓度为4.8mM～90.4mM时，GUS短暂表达的平均分数比对照培养基高(试验区9～11)。因此，明确了高Mg²⁺共存培养基使外来基因向高粱未成熟胚的导入效率提高。

表3

实施例3：高Mg²⁺及高N共存培养基对基因导入的效果

材料及方法

将与实施例1同样地进行了处理的未成熟胚植入对照的含有1倍量LS无机盐的共存培养基、或者Mg²⁺浓度为0.6～150.4mM且NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为62.0mM、并且除此以外的LS无机盐设为1/5浓度的试验区共存培养基，对GUS基因的短暂表达进行了评价。Mg²⁺浓度为0.6～150.4mM的培养基通过添加MgSO₄来调整制备，NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为62.0mM的培养基通过添加NH₄NO₃来调整制备。1个试验区使用8个未成熟胚，进行了2次试验。

结果

对于试验区共存培养基的高氮条件而言，Mg²⁺浓度为2.6mM～90.4mM时，GUS短暂表达的平均分数比对照培养基显著增高(试验区14～17)。明确了高Mg²⁺高N共存培养基使外来基因向高粱未成熟胚的导入效率显著提高。

表4

实施例4：高K⁺和/或高N共存培养基对基因导入的效果

材料及方法

将与实施例1同样地进行了处理的未成熟胚植入对照的含1倍量LS无机盐的共存培养基、或者K⁺浓度为8.0～204.4mM且除此以外的LS无机盐设为1/5浓度的共存培养基、或者含有上述K⁺且将NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度调整为62.0mM的1/5LS无机盐的共存培养基，对GUS基因的短暂表达进行了评价。K⁺浓度为8.0～204.4mM的培养基通过添加K₂SO₄来制备。1个试验区使用6～7个未成熟胚，进行了4次试验。

结果

在试验区共存培养基的高氮条件下，K⁺浓度为24.0mM～64.1mM时，GUS短暂表达的平均分数比对照培养基显著增高(试验区20、21)。明确了高K⁺高N共存培养基使外来基因向高粱未成熟胚的导入效率提高。

表5

实施例5：高Ca²⁺和/或高N共存培养基对基因导入的效果

材料及方法

将与实施例1同样地进行了处理的未成熟胚植入含有1倍量LS无机盐的共存培养基、或者Ca²⁺浓度为1.2～9.6mM且除此以外的LS无机盐设为1/5浓度的共存培养基、或者含有上述Ca²⁺且NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度调整为62.0mM的1/5LS无机盐的共存培养基，对GUS基因的短暂表达进行了评价。Ca²⁺浓度为1.2～9.6mM的培养基通过添加CaSO₄进行调整。1个试验区使用6～7个未成熟胚，进行了2次试验。

结果

在试验区培养基的高氮条件下Ca²⁺浓度为5.2mM～9.6mM时，GUS短暂表达的平均分数比对照培养基显著增高(试验区24～26)。由此，明确了高Ca²⁺高N共存培养基使外来基因向高粱未成熟胚的导入效率显著提高。

表6

实施例6：高Na+和/或高N共存培养基对基因导入的效果

材料及方法

将与实施例1同样地进行了处理的未成熟胚植入含有1倍量LS无机盐的共存培养基、或者Na⁺浓度为0.6～250.0mM且LS无机盐设为1/5浓度的共存培养基、或者含有上述Na⁺且NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度调整为62.0mM的1/5LS无机盐的共存培养基，对GUS基因的短暂表达进行了评价。Na⁺浓度为0.6～250.0mM的培养基通过添加Na₂SO₄来调整、制备。1个试验区使用6～7个未成熟胚，进行了2次试验。

结果

对于试验区培养基的高氮条件而言，在Na⁺浓度为0.6mM～150.1mM时，GUS短暂表达的平均分数比对照培养基高(试验区27～32)。因此，明确了高Na⁺共存培养基及高Na⁺高N共存培养基使外来基因向高粱未成熟胚的导入效率提高。

表7

实施例7：高Mg²⁺共存培养基对转化的效果

材料及方法

为了验证高Mg²⁺和/或高N共存培养基对制备高粱转化体的效果，在愈伤组织诱导培养基及再分化培养基中应用了Zhao et al.(2000：非专利文献5)及Wu et al.(2014：非专利文献12)的培养基来实施，但完全不能得到转化体。因此，对这些已报道的培养基进行了改变，进行了高粱的转化试验。

另外，在使土壤杆菌感染前的未成熟胚的处理方法中，由于在我们的试验中确认了通过除了实施Gurel et al.(2009：非专利文献7)报告的热处理以外还进行离心处理，易于获得转化体，因此使用进行了热处理及离心处理的未成熟胚实施了转化。

与实施例1同样地向进行了前处理(7500rpm(5000×g)、1分钟离心处理及43℃、3分钟热处理)的未成熟胚加入接种源(其中，土壤杆菌悬浮培养基的pH为5.8)，然后植入参考已报道的共存培养基PHI-T培养基(Wu et al.(2014：非专利文献12))对组成进行了变更的改变PHI-T培养基(对照区共存培养基)(LS无机盐、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L吡哆醇盐酸盐、1mg/L维生素B1盐酸盐、100mg/L肌醇、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、500mg/L MES、700mg/L L-脯氨酸、1.5mg/L 2,4-D、100μM乙酰丁香酮、5μM CuSO₄·5H₂O、4.0g/L琼脂糖、pH5.8)、或者改变PHI-T培养基的Mg²⁺浓度设为5.0mM的共存培养基(试验区)，进行了共存培养。对照及试验区均在相同条件下进行了共存培养后的培养工序。具体而言，在25℃、黑暗中共存培养4天，然后将未成熟胚植入参考DBC3培养基(Wu et al.2014：非专利文献12)对组成进行了变更的改变DBC3培养基(LS无机盐、1.0mg/L维生素B1盐酸盐、0.25g/L肌醇、30g/L麦芽糖、2.5g/L山梨糖醇、1.0g/L酪蛋白、700mg/L L-脯氨酸、0.75g/L谷氨酰胺、1.0mg/L 2,4-D、5μM AgNO₃、7.6μM CuSO₄·5H₂O、150mg/L特美汀、3.5g/L吉兰糖胶、pH5.8)，并在25℃、黑暗中进行培养。然后，将接种2周后的未成熟胚植入含有5mg/L草铵膦(glufosinate-ammonium)(PPT)的改变DBC3培养基(其中，除去谷氨酰胺)，在25℃、黑暗中进行了1周1次筛选培养。接着，将未成熟胚植入含有10mg/L PPT的改变DBC3培养基(其中，除去谷氨酰胺，且将山梨糖醇量变更为5.0g/L)，在25℃、黑暗中进行了2周2次筛选培养。接着，将增殖的愈伤组织植入含有15mg/L PPT的改变DBC3培养基(其中，除去谷氨酰胺，且添加0.5mg/L BAP，并将山梨糖醇量变更为5.0g/L)，在25℃、黑暗中进行了1周3次筛选培养。

将得到的PPT耐受性愈伤组织植入再分化培养基(LS无机盐、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L吡哆醇盐酸盐、0.1mg/L、维生素B1盐酸盐、100mg/L肌醇、20g/L蔗糖、500mg/L MES、700mg/L L-脯氨酸、10g/L抗坏血酸、0.5mg/L玉米素、1mg/L吲哚-3-乙酸、5μM AgNO₃、5μM CuSO₄·5H₂O、0.1mg/L苯基噻二唑脲、3.5g/L吉兰糖胶、pH5.8)，在25℃、35μmol^-2s^-1明亮条件下培养1个月。将再分化的幼株植物植入参考NAB1C1培养基(Guoquan et al.(2013：非专利文献13))对组成进行了变更的改变NAB1C1培养基(LS无机盐、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L吡哆醇盐酸盐、0.1mg/L维生素B1盐酸盐、100mg/L肌醇、20g/L蔗糖、500mg/L MES、700mg/L L-脯氨酸、10g/L抗坏血酸、1mg/L 1-萘乙酸、1mg/L吲哚-3-乙酸、1mg/L吲哚-3-丁酸、3.5g/L吉兰糖胶、pH5.8)，在25℃、35μmol^-2s^-1明亮条件下再培养1个月。

使用由PPT耐受性愈伤组织再分化后的个体的叶中提取出的基因组DNA，通过PCR确认了有无导入基因。基因组DNA的提取由个体的叶使用E.Z.N.A.SP Plant DNA Kit(Omega Biotek,Doraville,USA)来进行。作为模板，使用用于扩增基因组DNA、Bar基因的引物集(atggacccagaacga cgcccggccgacatc：序列号1、tcagatctcggtgacgggcaggaccggacg：序列号2)进行了PCR。在10μl的PCR反应液中，作为模板，添加基因组DNA约10ng、Tks GflexDNA Polymerase(Takara公司)0.2μl、2×Gflex PCR Buffer(Takara公司)5μl、用于扩增Bar基因的正向引物(序列号1)及反向引物(序列号2)各0.5μM，以94℃1分钟1次、98℃10秒钟、68℃30秒钟35次的程序进行了PCR反应。

有无导入基因的判定通过如下方式进行：通过PCR将约500bp条带扩增了的个体作为有导入基因的情况，将条带未扩增的个体作为无导入基因的情况。

结果

由使用试验区34的高Mg²⁺共存培养基进行了共存培养的未成熟胚以17.6％的效率得到了转化体，与此相对，使用了对照共存培养基的情况未获得转化体。由此，实施例2中确认的高Mg²⁺共存培养基所带来的使外来基因向高粱未成熟胚的导入效率提高的效果也有助于提高其后的转化体制备效率。

表8

实施例8：高N共存培养基对转化的效果

材料及方法

与实施例7同样地进行热处理及离心处理，将接种了土壤杆菌的未成熟胚植入与实施例7相同的作为对照共存培养基的改变PHI-T培养基、或者改变PHI-T培养基的NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度设为85mM或123mM且除此以外的LS无机盐设为1/2浓度的试验区共存培养基，进行了共存培养。此后的筛选PPT耐受性愈伤组织的方法、使个体再生的方法、用于确认对转化体有无基因导入的PCR分析方法与实施例7相同。

结果

由使用NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度设为85mM或123mM的高N试验区(试验区35及36)共存培养基进行了共存培养的未成熟胚分别以8％的效率获得了转化体，与此相对，使用了对照共存培养基的情况为4％的效率。由此，实施例1中确认的高N共存培养基所带来的使外来基因向高粱未成熟胚的导入效率提高的效果也有助于提高其后的转化体制备效率。

表9

实施例9：高Mg²⁺及高N共存培养基对转化的效果

材料及方法

与实施例7同样地进行热处理及离心处理，将接种了土壤杆菌的未成熟胚植入与实施例7相同的作为对照共存培养基的PHI-T培养基、或者将改变PHI-T培养基设为含有1/2倍量LS无机盐、Mg²⁺浓度为5.0mM且NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为85mM的试验区共存培养基，进行了共存培养。此后的筛选PPT耐受性愈伤组织的方法、使个体再生的方法、用于确认对转化体有无基因导入的PCR分析方法与实施例7相同。

结果

由使用高Mg²⁺及高N的试验区共存培养基进行了共存培养的未成熟胚以15％的效率得到了转化体，与此相对，使用了含有1倍量LS无机盐的对照区共存培养基的情况为5％的效率。由此，实施例3中观察到的高Mg²⁺及高N共存培养基所带来的使外来基因向高粱未成熟胚的导入效率提高的效果也有助于提高其后的转化体制备效率。

表10

另外，对于使用了在接种前未对未成熟胚进行离心及热处理的未成熟胚的情况也进行了试验。在该情况下也能够确认到高Mg2+和/或高N共存培养基对转化的效果(未示出数据)。

序列号1：正向引物

序列号2：反向引物。

序列表

<110> 日本烟草产业株式会社(JAPAN TOBACCO INC.)

<120> 使用土壤杆菌属细菌向高粱属植物导入基因的方法及高粱属植物的转化植物的制备方法

<130> FA0392-15183

<150> JP 2014-259772

<151> 2014-12-24

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 1

atggacccag aacgacgccc ggccgacatc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 2

tcagatctcg gtgacgggca ggaccggacg 30

Claims

1.一种对高粱属植物的植物材料的组织进行基因导入的方法，其特征在于，包括：

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

至少在所述(iii)工序中，以1倍浓度-1/5浓度的LS培养基为基本培养基，使用提高了镁离子浓度的培养基，

所述LS培养基含有1.5mM的镁离子、20.0mM的钾离子、3.0mM的钙离子，

所述提高了镁离子浓度的培养基的镁离子浓度为4.0mM以上且100mM以下。

2.一种对高粱属植物的植物材料的组织进行基因导入的方法，其特征在于，包括：

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

至少在所述(iii)工序中，以1倍浓度-1/5浓度的LS培养基为基本培养基，使用提高了氮源和镁离子的浓度的培养基，

所述提高了氮源和镁离子的浓度的培养基的NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为60mM以上且270mM以下，镁离子浓度为2.6mM以上且100mM以下。

3.一种对高粱属植物的植物材料的组织进行基因导入的方法，其特征在于，包括：

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

至少在所述(iii)工序中，以1倍浓度-1/5浓度的LS培养基为基本培养基，使用提高了氮源和钾离子的浓度的培养基，

所述提高了氮源和钾离子的浓度的培养基的NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为60mM以上且270mM以下，钾离子浓度为24mM以上且65mM以下。

4.一种对高粱属植物的植物材料的组织进行基因导入的方法，其特征在于，包括：

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

至少在所述(iii)工序中，以1倍浓度-1/5浓度的LS培养基为基本培养基，使用提高了氮源和钙离子的浓度的培养基，

所述提高了氮源和钙离子的浓度的培养基的NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为60mM以上且270mM以下，钙离子浓度为5.2mM以上且10mM以下。

5.一种对高粱属植物的植物材料的组织进行基因导入的方法，其特征在于，包括：

(i)制备所述植物材料的工序；

(ii)将土壤杆菌属细菌接种于该植物材料的组织的工序；以及

至少在所述(iii)工序中，以1倍浓度-1/5浓度的LS培养基为基本培养基，使用提高了氮源和钠离子的浓度的培养基，

所述提高了氮源和钠离子的浓度的培养基的NH₄ ⁺和NO₃ ^-的总浓度为60mM以上且270mM以下，钠离子浓度为0.6mM以上且200mM以下。

6.一种高粱属植物的转化植物制备方法，其中，

按照权利要求1～5中任一项所述的方法进行工序(i)～(iii)，接下来包含：

(v)在再分化培养基中使所述组织再分化的工序。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，进行以下的转化提高处理中的至少一项：

a)热处理；

b)离心处理；

c)加压处理；

e)在(ii)和/或(iii)工序中使用提高了硝酸银浓度的培养基的处理。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，在所述(iv)静息工序与(v)再分化工序之间包括筛选工序。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，土壤杆菌属细菌为从由LBA4404、EHA101、EHA105、AGL0、AGL1及C58C1组成的组中选出的细菌。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，高粱属植物为高粱。