KR20240082200A - 식물체의 재분화율 증진용 조성물 및 이의 이용 - Google Patents

식물체의 재분화율 증진용 조성물 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물체의 재분화율 증진용 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.
본 발명의 식물체의 재분화 증진용 폴리뉴클레오티드를 식물체 내에 도입한 후 재분화 유도시 식물체의 재분화율이 현저히 증가되어, 종래의 단순 호르몬 처리보다 재분화율을 크게 향상시키는바, 식물체의 재분화에 적용할 수 있다.

Description

식물체의 재분화율 증진용 조성물 및 이의 이용{A method for promoting plant regeneration through microRNA inhibition in plants}
본 발명은 식물체의 재분화율 증진용 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.
식물의 체세포를 이용한 식물 재분화 기술은 세대진전 없이 유전적으로 동일한 식물체를 대량 제작할 수 있어, 유전자가 도입되거나 교정된 생명공학 식물을 제작하기 위해 필수적인 단계이다.
종래 식물 체세포의 운명을 변화시켜, 식물체를 재분화시키기 위해 호르몬 처리 방법이 사용되어 왔다. 예를 들어, 식물체 내에서 식물 호르몬인 옥신(auxin), 사이토키닌(cytokinin) 등의 비율을 조절하여, 옥신의 비율이 높을 경우 탈분화되고 사이토키닌 비율이 높을 경우 탈분화된 세포가 다시 재분화되는 것을 이용하여 식물을 재분화시켰다.
그러나, 종래 방법으로 식물 재분화시 식물의 종과 품종에 따라 재분화율이 매우 다르며, 대부분의 경우 호르몬을 처리하더라도 내부 분자 메커니즘의 문제로 인해 재분화가 일어나지 않거나 효율이 극히 낮은 문제점이 있었다.
이에, 단순 호르몬 처리보다 식물 재분화율을 크게 향상시킬 수 있는 기술 개발이 요구되어 왔다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 식물의 microRNA 중 하나인 miR396을 억제하여 재분화율을 높일 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
1. M. Ikeuchi, et al., Annu. Rev. Plant Biol. 2019. 70:3.1-3.30. 2. F. Shirin, et al., World Journal of Agricultural Sciences 3 (1): 01-06, 2007. 3. Y. H. Lee, et al., Plant Cell Rep (2004) 23:50-58.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 식물체의 재분화율 증진용 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 숙주세포 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형질전환된, 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 숙주세포 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 식물체의 재분화율 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명의 식물체의 재분화율 증진용 조성물을 식물체에 도입하거나 처리하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화율 증진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 miR396 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 재분화율 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 miR396 억제제를 식물체에 도입하거나 처리하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화율 증진 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 식물체의 재분화율 증진용 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에서 용어, "재분화(regeneration)"는 식물 체세포의 운명을 변화시켜, 세대진전 없이 유전적으로 동일한 식물체를 대량 제작할 수 있는 기술로, 유전자가 도입되거나 교정된 생명공학 식물을 제작하기 위해 필수적인 기술이다.
종래에는 식물체를 재분화시키기 위해 호르몬 처리 방법이 사용되어 왔으나, 종래 방법으로 식물 재분화시 식물의 종과 품종에 따라 재분화율이 매우 다르며, 대부분의 경우 호르몬을 처리하더라도 내부 분자 메커니즘의 문제로 인해 재분화가 일어나지 않거나 효율이 극히 낮은 문제점이 있었다.
이에, 본 발명은 식물의 microRNA 중 하나인 miR396을 억제함으로써, 단순 호르몬 처리보다 식물 재분화율을 증진시킨 것에 의의가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재분화율 증진은 지상부(shoot)의 재분화율 증진일 수 있고, 구체적으로는 지상부 중 잎 또는 줄기 부위의 재분화율 증진일 수 있으며, 보다 구체적으로는 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl) 부위의 재분화율 증진일 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 재분화율 증진은 상기 자엽 또는 하배축으로부터의 식물 지상부의 재분화율을 증가시킨 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드와 혼용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 식물의 microRNA 중 하나인 miR396을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "microRNA" 또는 "miRNA"는 전사 후 수준에서 작용하여 표적 전사체의 절단 또는 번역 억제를 촉발하여 유전자 발현을 부정적으로 제어하는 RNA 서열이다. 식물 miRNA의 가장 잘 특성화된 역할은 잎, 꽃 및 뿌리 발달을 포함한 발달 및 비생물적 스트레스에 대한 반응으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "microRNA-396" 또는 "miR396"은 식물에서 진화적으로 보존된 miRNA 중 하나로서, 쌀, 옥수수 또는 토마토와 같은 중요한 작물을 포함하여 많은 식물 종의 GRF(Growth-regulating factor) 계열에 속하는 전사 인자 세트를 표적으로 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 토마토의 GRF는 총 13가지가 밝혀졌으며, SlGRF1 내지 SlGRF13이 존재한다.
상기 miR396은 식물 유래일 수 있고, 일 예로, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터일 수 있다. 또한, 상기 벡터는 식물에서 발현될 수 있는 식물 발현 벡터일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 서열번호 1의 염기서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 염기서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 식물 발현 벡터는, 일 예로 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-DNA영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터 또는 pCAMBIA 벡터일 수 있다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 또한, VIGS 벡터 또는 RNAi 벡터일 수 있다. VIGS는 바이러스 벡터에 식물유전자를 도입한 후 식물체를 감염시키면, 그 도입된 유전자의 내인성 식물유전자가 발현이 억제되는 현상을 말한다. 이는 PTGS(Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로서, 전사-후(post-transcriptional), RNA 턴오버(RNA turnover) 및 뉴클레오티드 서열 특이적(nucleotide sequence-specific) 이라는 특징들을 가진다. 상기 VIGS 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자가 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
본 발명의 식물 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당될 수 있다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin) 및 글루포시네이트(glufosinate)와 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 일 예로, T7 프로모터, SP6 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 용어 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터의 사용은 바람직할 수 있으며, 이의 선택 가능성은 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(Nopaline synthase), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(Phaseolin) 터미네이터, 아그로박테리움 투머파시엔스의 옥토파인 신타아제(Octopine synthase) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 바람직할 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0000301 B1) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 전식물로 재분화하는 단계를 포함할 수 있다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 전식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 식물 세포라면 특별히 제한되지 않는다. 일 예로, 상기 식물 세포는 식물 세포, 식물 조직, 식물 기관 또는 전체 식물일 수 있다. 상기 "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함할 수 있다. 또한, 상기 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다. 상기 식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 "숙주세포"와 혼용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 숙주세포 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형질전환된, 형질전환 식물체를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주세포 및 형질전환에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 식물체는 일 예로, 토마토, 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 형질전환에 이용된 식물 세포, 식물 조직, 식물 기관 또는 전체 식물일 수 있으며, 형질전환 식물체의 종자를 포함할 수 있다.
본 출원의 형질전환 식물체는 형질전환되지 않은 야생형 식물체에 비해 재분화율이 2배 이상, 3배 이상 또는 4배 이상 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는, 상기 miR396가 재분화율이 낮은 식물체에서 발현율이 높은 것을 확인하고, 이를 억제하기 위한 폴리뉴클레오티드를 제작하여 식물체에 도입한 결과, 상기 miR396가 억제된 식물체에서 재분화율이 약 4배 이상 증가된 것을 확인하였다(도 3).
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 숙주세포 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 식물체의 재분화율 증진용 조성물을 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주세포 및 재분화에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 식물체의 재분화율 증진용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 식물체의 재분화율 증진용 조성물을 식물체에 도입하거나 처리하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화율 증진 방법을 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주세포 및 재분화에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 식물체는 식물 세포, 식물 조직, 식물 기관 또는 전체 식물일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 식물체의 재분화율 증진용 조성물은, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질전환된 숙주세포 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명의 식물체의 재분화율 증진용 조성물을 식물체에 도입하거나 처리하는 단계 이후 식물체를 재분화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 재분화 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 본 발명의 식물체의 재분화율 증진용 조성물을 식물체에 도입하거나 처리하는 경우, 식물체의 재분화율이 야생형 식물체 또는 본 발명의 식물체의 재분화율 증진용 조성물을 처리하지 않은 식물체에 비해 2배 이상, 3배 이상 또는 4배 이상 증가될 수 있다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 miR396 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 재분화율 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 miR396 억제제를 식물체에 도입하거나 처리하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화율 증진 방법을 제공한다.
상기 miR396 및 재분화는 전술한 바와 같다.
상기 miR396 억제제는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 조성물일 수 있다.
구체적으로, 상기 miR396 억제제는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질전환된 숙주세포 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 miR396 억제제를 식물체에 도입하거나 처리하는 경우, 식물체의 재분화율이 야생형 식물체 또는 본 발명의 miR396 억제제를 처리하지 않은 식물체에 비해 2배 이상, 3배 이상 또는 4배 이상 증가될 수 있다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 식물체의 재분화 증진용 폴리뉴클레오티드를 식물체 내에 도입한 후 재분화 유도시 식물체의 재분화율이 현저히 증가되어, 종래의 단순 호르몬 처리보다 재분화율을 크게 향상시키는바, 식물체의 재분화에 적용할 수 있다.
도 1은 Sweet King(SK)과 Super Doterang(SD) 품종의 재분화율을 비교한 결과이다. 도 1의 (A)는 SK와 SD 품종의 기간별 재분화 사진이며, 사이토키닌으로 벤질아미노퓨린(Benzylaminopurine, BA) 및 제아틴(zeatin)을 사용하였고, DAI(days after incubation)는 사이토키닌을 포함하는 배지에서의 배양 일수이다. 도 1의 (B)는 SK의 재분화율(위)와 SD의 재분화율(아래)에 대한 그래프이며, 도 1의 (C)는 재분화된 식물에서 뿌리가 재생되는 효율에 관한 그래프이다.
도 2는 식물 재분화에 관여하는 유전자 분석에 관한 도이다. 도 2의 (a) 및 (b)는 SK 품종과 SD 품종에서의 DEGs(Differentially Expressed Genes) 분석 결과이며, 도 2의 (c) 및 (d)는 SD 품종에서의 분석 결과이다. 도 2의 (e) 내지 (h)는 앞선 분석 결과에 따른 공통 유전자를 분류한 결과이다.
도 3은 DEGs의 상류조절인자 선별에 관한 도이다. 도 3(a) 및 (b)는 miRNA 분석 결과, 재분화에 관여하는 상류조절인자 9가지를 선별한 결과이다. 도 3(c) 내지 도 3(e)는 해당 9가지 miRNA와 연관된 유전자들 중 전사인자에 해당하는 10가지를 선별한 결과이다. 도 3(f)는 SK와 SD 품종의 배양기간에 따른 SlGRF 발현 양을 비교한 결과이며, 도 3(g)는 SK와 SD 품종의 하배축(hypocotyl)을 배양한 뒤 배양 기간에 따라 SK와 SD 품종 내 miR396(Sly-miR396a)의 양을 비교한 결과이다(Student's t-test, *P < 0.05).
도 4은 STTM-miR396(STTM 396a) 도입에 의한 SK 품종의 재분화율을 확인한 결과이다. 도 4의 (a)는 공벡터가 도입된 SK 품종(EV)과 STTM-miR396가 삽입된 SK 품종(STTM 396a)의 자엽 절편체를 재분화시킨 후 12주째 배양한 사진이다. 도 4의 (b)는 12주까지의 재분화율 변화에 대한 그래프이며, 통계적으로 유의미한 경우 *표시를 하였다(Student's t-test, *P < 0.05 ; **P < 0.01).
도 5는 STTM-miR396을 도입한 뒤 재분화된 SK 품종에서 STTM-miR396 RNA 발현양을 qPCR을 통해 분석한 결과이다. W는 야생형 SK 품종을 의미하며, E는 공벡터를 도입한 뒤 재분화된 식물체를 의미한다.
도 6은 STTM-miR396 및 공벡터를 도입한 경우의 9가지 SlGRF의 발현양을 비교한 그래프이다(Student's t-test, *P < 0.05 ; **P < 0.01). 이 때, C는 CIM 배지를 의미하며, S은 SIM 배지를 의미한다.
도 7은 STTM-miR396 도입에 따른 유전자 편집 식물의 재분화율과 관련된 도이다. (a)는 Cas9-gRNA 벡터와 STTM-miR396 벡터의 형질전환에 대한 모식도이며, (b)는 도입된 벡터에 따른 재분화율에 관한 그래프이다. (b)의 Edited는 유전자 편집된 식물체의 비율이다. (c)는 유전자 편집된 식물체의 표현형이다.
도 8은 도 7의 (c)에서 확인한 식물체의 생어 시퀀싱 결과이다.
도 9는 재분화 효율이 낮은 다른 토마토 품종에서 STTM-miR396(STTM 396a) 도입 효과 확인한 결과이다. 도 9의 (A)는 광복(Gwangbok), 신홍광(Sinhonggwang), 미니토마토(Minitomato) 품종의 자엽 절편체에 아그로박테리움을 이용하여 STTM-miR396 또는 공벡터(EV)를 도입한 뒤 옥신과 사이토키닌이 포함된 배지에 배양하여 재분화 효율을 분석한 결과이다. 이는 4~6주 배양 과정에서 줄기 재분화가 나타난 절편의 개수를 비율로 나타냈다. 도 9의 (B)는 배양 4주째의 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 식물 품종간 재분화율 비교
식물 품종간 재분화율을 비교하기 위해, 토마토 품종 중 Sweet King(SK)과 Super Doterang(SD) 품종을 대상으로 사이토키닌인 벤질아미노퓨린(Benzylaminopurine, BA) 및 제아틴(zeatin) 하에서 재분화율을 비교하였다.
구체적으로, 6일령 SK 및 SD 품종의 식물체로부터 자엽(cotyledon) 및 하배축(hypocotyl) 부위를 절제하고, 이를 1.5 ㎎/ℓ 제아틴 또는 1.5 ㎎/ℓ 벤질아미노퓨린(BA)을 포함하는 MS 기본 배지에 치상하고 42일 동안 22-28℃의 광 조건에서 배양하여 사이토키닌 처리 하에서의 재분화를 유도하였다.
배양 기간별 자엽 및 하배축의 재분화율을 분석한 결과, SK 품종이 SD 품종보다 재분화율이 낮은 것을 확인하였다(도 1A-B).
또한, 재분화 유도한 자엽 및 하배축에서 뿌리 재생 효율을 분석한 결과, SK 품종의 하배축(hypo)에서는 BA 및 제아틴 처리시 모두 뿌리 재생 효율이 100%이었으며, 자엽(cotyl)에서는 제아틴 처리시에 뿌리 재생 효율이 100%이었다(도 1C). 반면, SD 품종의 하배축(hypo) 및 자엽(cotyl)에서는 BA 및 제아틴 처리시 모두 뿌리 재생 효율이 80% 이상이었다.
실시예 2. 식물 재분화에 관여하는 타겟 miRNA 선별
상기 실시예 1에서 SK 품종이 SD 품종보다 재분화율이 낮은 것을 확인한 바, 이에 관여하는 핵심 분자를 확인하기 위해, 두 품종에 대한 재분화 기간별 전사체 분석을 진행하였다.
실시예 2-1. 식물 재분화에 관여하는 유전자 분석
SK 품종과 SD 품종의 재분화를 위한 배양 기간동안 DEGs(differentially expressed genes)를 분석한 결과, 도 2(a)와 같이 총 6가지의 클러스터를 확인하였다.
그 중 클러스터 2(C2)와 클러스터 3(C3)에 있는 유전자는 재분화의 음성 조절자 그룹 1(NG1; a putative negative regulator group 1)으로, 클러스터 1(C1)과 클러스터 5(C5)에 있는 유전자는 양성 조절자 그룹 1(PG1; putative positive regulator group 1)으로 분류했다. PG1의 경우, 재분화 동안 SK에서 SD보다 평균 발현 수준이 낮은 유전자이며, NG1의 경우, 재분화 동안 SK에서 SD보다 평균 발현 수준이 높은 유전자에 해당한다(도 2(a) 및 2(b)).
또한, 재분화율이 높은 SD 품종에서 발현되는 수준을 기준으로 다시 한 번, DEGs를 분류하였다. 그 결과, 도 2c와 같이 총 5가지의 클러스터를 확인하였다. SD 품종에서 재분화 중 평균 발현 수준이 높은 유전자는 양성 조절자 그룹 2(PG2; putative positive regulator group 2)로, 평균 발현 수준이 낮은 유전자는 음성 조절자 그룹 2(NG2; putative negative regulator group 2)으로 분류하였다. 구체적으로 PG2에는 도 2(c) 및 2(d)의 C2와 C3가 속하며, NG2에는 C1이 속한다.
상기와 같이 분류된 PG1과 PG2를 비교한 결과, 1030개의 공통되는 유전자가 선별되었으며(도 2(e)), 이를 양성 조절자 그룹 3(PG3; putative positive regulator group 3)로 분류하였다(도 2(f)). 마찬가지로 NG1과 NG2를 비교하여, 876개의 공통되는 유전자를 선별하였고(도 2(g)), 이를 음성 조절자 그룹 3(NG 3; putative negative regulator group 3)로 분류하였다(도 2(h)).
실시예 2-2. 식물 재분화에 관여하는 miRNA 분석
전사체 분석을 통하여, 재분화와 관련된 후보 유전자를 특정하였으나, 유전자군이 너무 다양하여, 이러한 DEGs의 상류조절인자를 찾았다. 해당 상류조절인자를 찾기 위해 miRNA 시퀀싱을 진행했다.
분석 결과, SK 품종과 SD 품종에서 서로 다른 풍부도를 보이는 28가지의 miRNA를 선별하였고, 이를 MG1(miRNA group 1)으로 분류하였다.
또한 SD 품종에서 재분화가 유도되기 전과 후의 miRNA를 분석하여, 발현양의 차이를 보이는 48가지의 miRNA를 MG2(miRNA group 2)로 분류하였다.
상기 MG1과 MG2에 공통적으로 존재하는 9가지의 miRNA를 MG3(miRNA group 3)로 분류하였다(도 3(a)). 공통되는 9가지의 miRNA는 도 3(b)와 같다.
실시예 2-3. 타겟 miRNA 선별
다음으로, MG3의 miRNA의 타겟이 PG3 또는 NG3에 속하는지 확인하였다. 그 결과 PG3와 NG3에 MG3의 타겟이 되는 유전자가 각각 41개와 27개임을 확인했고, 해당 유전자를 바탕으로 Gene ontology (GO) 분석을 진행하였다(도 3(c) 및 3(d)).
분석 결과, 도 3(e)와 같이 PG3에 속하는 10개의 유전자가 유의미한 상관관계를 보였고, 특히 해당 10개의 유전자는 모두 GRF를 암호화하는 유전자로 확인되었다. 또한, 이러한 GRF는 도 3(f)와 같이 배양 12일에서 18일 사이 SD에서 다량으로 발현되었으나, SK에서는 발현양이 거의 변하지 않음이 확인되었다.
이러한 GRF를 표적으로 하는 miRNA는 miR396에 해당함을 확인했다.
실시예 3. SK 품종과 SD 품종의 재분화 과정 상의 miR396 발현양 측정
다음으로, SK와 SD 품종의 하배축을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하고, 배양 기간별로 식물체 내에서 발현되는 miR396의 양을 비교하였다(도 3(g)).
구체적으로, SK와 SD 품종의 총 RNA를 RNA 추출 키트(miRNeasy kits, Qiagen)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하고, 이를 이용하여 cDNA (complementary DNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 miR396을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍[miR396_qF(서열번호 3), miR396_qR(서열번호 4)]을 이용하여 qPCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 10초; 60℃에서 15초; 및 72℃에서 1초를 한 사이클로 하여 총 35회 반복 수행하였다. 배양 0일째를 기준으로 하여 배양 기간별로 상대적인 miR396 발현량을 측정하였다.
그 결과, 배양 시작 후 42일째까지 재분화율이 낮은 SK 품종이 재분화율이 높은 SD 품종보다 miR396의 발현이 더 높게 유지되는 것을 확인하였다.
실시예 4. STTM-miR396 도입에 의한 재분화율 확인
실시예 4-1. STTM-miR396 도입에 의한 SK 품종 재분화율
상기 실시예 1 내지 3에서 식물체 내에서 발현되는 miR396는 식물체의 재분화율을 낮추는 것으로 확인된 바, miR396을 억제할 수 있는 STTM-miR396를 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 형질전환 방법으로 SK 품종의 자엽에 도입하였다.
구체적으로, STTM-miR396(서열번호 1)는 miR396(서열번호 2)이 식물 내부의 타겟 유전자와 결합하지 못하도록 상기 타겟 유전자와 유사한 서열을 포함하는 RNA 서열로 설계되었다. STTM-miR396를 코딩하는 DNA 단편을 pH2GW7 벡터에 삽입하고, 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) GV3101에 도입하였다. 형질전환된 아그로박테리움을 100㎎/ℓ 스펙티노마이신(spectinomycin), 25㎎/ℓ 젠타마이신(gentamicin) 및 100μM 아세토시링곤(acetosyringone)을 포함하는 YEP 배지에서 배양하였다. 배양액을 원심분리한 후, MS 기본 배지로 OD600 값이 0.5-0.6가 되도록 희석하였다. 배양 현탁액을 100μM 아세토시링곤을 포함하는 MS 액체 배지와 혼합한 후, 이를 6일령 SK 품종에서 절단한 0.5-1.0 cm 크기의 자엽 절편체(explant)에 20분 동안 접종하였다. 이후, 상기 실시예 1의 배지에서 48시간 동안 암 조건에서 공동 배양하였다.
제작한 형질전환 SK 자엽 절편체를 1.5mg/L BA, 0.5mg/L IBA(Indole-3-butyric acid), 5mg/L 하이그로마이신(hygromycin) 및 500mg/L 세포탁심(cefotaxime)이 포함된 배지에서 배양하였다. 2주 간격으로 배지를 교체하며, 12주간 배양하여 재분화율을 분석하였다. STTM-miR396이 삽입되지 않은 공벡터가 도입된 SK 품종의 잎(EV)을 비교군으로 하였다.
그 결과, 옥신과 사이토키닌이 포함된 배지에서 12주까지 배양할 경우, 공벡터가 도입된 SK 자엽 절편체(EV)는 약 7%의 재분화율을 나타낸 반면, STTM-miR396가 도입된 SK 자엽 절편체(STTM 396a)는 동일 기간에 약 28%의 재분화율을 나타내어, STTM-miR396 도입시 식물체의 재분화율이 약 4배 증가함을 확인하였다(도 4).
실시예 4-2. STTM-miR396 도입에 의한 STTM-miR396 및 SlGRF 발현 여부 확인
다음으로, 상기와 동일한 방법으로 STTM-miR396을 도입한 뒤 재분화된 SK 자엽 절편체에서 STTM-miR396 RNA 발현 여부를 분석하였다.
구체적으로, STTM-miR396을 도입한 뒤 재분화된 SK 자엽 절편체 20개체에서 총 RNA를 TRIzol 용액(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하고, 이를 주형으로 하여 프라이머 쌍[STTM396_qF(서열번호 5), STTM396_qR(서열번호 6)]을 이용하여 qPCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 10초; 60℃에서 15초; 및 72℃에서 15초를 한 사이클로 하여 총 40회 반복 수행하였다. 배양 0일째를 기준으로 하여 배양 기간별로 상대적인 STTM-miR396 발현량을 측정하였다. 아무런 처리를 하지 않은 SK 자엽 절편체(W) 및 STTM-miR396이 삽입되지 않은 공벡터가 도입된 SK 자엽 절편체(E)를 비교군으로 하였다(도 5). 동일한 방법으로 SlGRF의 발현 여부 역시 분석하였다(도 6).
그 결과, STTM-miR396을 도입한 뒤 재분화된 SK 자엽 절편체 20개체 중 98%에서 STTM-miR396이 발현되며, SlGRF2, SlGRF5, SlGRF6, SlGRF8, SlGRF10, 및 SlGRF12의 발현 수준이 유의미하게 증가함을 확인하였다.
이를 통해 STTM-miR396가 도입된 경우, miR396이 억제되고, SlGRF의 발현이 증가함으로써 재분화가 촉진되었음을 확인하였다.
실시예 5. STTM-miR396 도입 시 유전자 편집 식물의 재분화율 확인
STTM-miR396가 재분화율을 증가시킨다는 점을 바탕으로 효율적인 유전자 편집 식물의 생성을 위해, 유전자 편집 및 STTM-miR396의 도입을 함께 진행하였다.
구체적으로, Cas9-gRNA 벡터와 STTM-mi369a를 과발현하는 pH2GW7 벡터를 함께 SK 품종에 형질전환하였다(도 7(a)). 이 때 Cas9-gRNA 벡터는 pHAtC를 사용했으며, AarI 제한효소를 이용하여 서열번호 7로 정의되는 gRNA를 삽입하였고, 피토엔 불포화효소(phytoene desaturase) 유전자 위치(SlPDS)를 표적으로 한다.
형질전환을 통해 Cas9과 STTM-miR396의 도입여부에 따른 4가지 실험군을 제작하였다. 즉, Cas9과 STTM-miR396이 모두 도입된 Cas9+STTM396a+, Cas9만 도입된 Cas9+STTM396a-, STTM-miR396만 도입된 Cas9-STTM396a+, 및 Cas9과 STTM-miR396이 모두 도입되지 않은 Cas9-STTM396a-를 대상으로 재분화율을 비교하였다.
Cas9+STTM396a+ 및 Cas9+STTM396a-의 재분화율은 각각 47.8% 및 21.7%로 약 2.2배의 차이를 가짐을 확인하였다(도 7(b)).
CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집의 표적인 SIPDS 영역을 PCR로 증폭한 후 ICE tool(https://ice.synthego.com)을 이용하여 생어 시퀀싱을 진행하였다. 그 결과, Cas9+STTM396a+의 72.7%는 SIPDS 유전자좌에서 유전자 편집이 이뤄진 것으로 확인되었다. 이러한 SIPDS 유전자 편집 시 도 7(c)와 같은 표현형을 가지며, 생어 시퀀싱 결과는 도 8과 같았다.
이를 통해 STTM-miR396를 도입하여 miR396를 억제하면 기존의 재분화율이 낮은 토마토 유전자형에서 유전자 편집 식물을 효율적으로 생성할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 재분화율이 낮은 다른 품종에서의 STTM-miR396 도입에 의한 재분화율 확인
상기 실시예 2 및 도 4에서 재분화율이 낮은 품종인 SK에서 STTM-miR396을 도입한 뒤 재분화율이 4배이상 증가한 것을 확인하였다.
이러한 결과가 다른 품종에서도 동일하게 적용되는지 알아보고자, 재분화율이 낮은 다른 토마토의 품종에서 실험하였다.
이 때, 선택된 품종은 재분화율이 낮은 광복(Gwangbok), 신홍광(Sinhonggwang), 미니토마토(Minitomato) 품종으로, 세 가지 품종에서 자엽 절편체에 STTM-miR396를 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 형질전환 방법으로 SK 품종의 자엽에 도입하였다. 그 후, 옥신과 사이토키닌이 포함된 배지에서 6주까지 배양하였다. 구체적인 형질전환 방법 및 배양 방법은 상기 실시예 2와 같다.
그 결과, 각 품종에서 공벡터가 도입된 자엽 절편체(EV)와 STTM-miR396을 도입된 자엽 절편체의 재분화율은 품종에 따라 약 2.3배에서 4.2배 상승된 것을 확인하였다(도 9).
본 실시예에서 확인된 바와 같이 miR396을 억제하는 STTM-miR396을 식물체 내에 도입한 후 재분화 유도시 식물체의 재분화율이 약 2배 내지 4배 증가되어, 종래의 단순 호르몬 처리보다 재분화율을 크게 향상시키는바, 식물체의 재분화에 적용할 수 있다. 나아가, 유전자 편집 식물에도 이를 적용하여, 기존의 재분화율이 낮은 품종의 유전자 편집 시 재분화율을 향상시킬 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 식물체의 재분화율 증진용 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 식물체 지상부의 재분화율을 증진시키는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 식물 유래의 miR396을 억제하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 식물 유래의 miR396은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  6. 제1항의 폴리뉴클레오티드 및 제5항의 벡터 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형질전환된 숙주세포.
  7. 제1항의 폴리뉴클레오티드 및 제5항의 벡터 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형질전환된, 형질전환 식물체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 형질전환되지 않은 야생형 식물체에 비해 재분화율이 2배 이상 증가된 것인, 형질전환 식물체.
  9. 제1항의 폴리뉴클레오티드 및 제5항의 벡터 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 식물체의 재분화율 증진용 조성물.
  10. 제9항의 조성물을 식물체에 도입하거나 처리하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화율 증진 방법.
  11. miR396 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 재분화율 증진용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 miR396 억제제는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  13. miR396 억제제를 식물체에 도입하거나 처리하는 단계를 포함하는, 식물체의 재분화율 증진 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 miR396 억제제는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 조성물인 것인, 방법.
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