ES2223082T3 - Procedimiento para obtener plantas leguminosas transgenicas (leguminosae) que contienen adn exogeno. - Google Patents
Procedimiento para obtener plantas leguminosas transgenicas (leguminosae) que contienen adn exogeno.Info
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Abstract
Un procedimiento para seleccionar plantas leguminosas transformadas de una línea germinal, que comprende las etapas de: (a) introducir genes exógenos en células meristemáticas apicales de los ejes embrionarios de plantas leguminosas mediante el bombardeo de dichas células vegetales con un constructo de ADN que incluye una secuencia que codifica una proteína capaz de conferir tolerancia a herbicidas del grupo químico de las imidazolinonas o glifosatos; (b) inducir la formación de varios brotes a partir de las células meristemáticas apicales transformadas de la etapa (a) mediante el cultivo de dichos ejes embrionarios en un medio que contiene citocinina; y (c) seleccionar los brotes derivados de las células meristemáticas obtenidos en la etapa (b) mediante el cultivo de dichos ejes embrionarios en un medio que contiene un herbicida del grupo químico de las imidazolinonas o glifosatos a una concentración variable de 100 a 1000 nM.
Description
Procedimiento para obtener plantas leguminosas
transgénicas (leguminosae) que contienen ADN exógeno.
La presente invención se refiere al uso de
biobalística para introducir genes exógenos en un tejido vegetal y
obtener plantas leguminosas transgénicas mediante la regeneración
del tejido transformado.
El uso de técnicas de ingeniería genética para
introducir genes que son responsables de características agrónomas
de interés puede facilitar el desarrollo de nuevas variedades de
LEGUMINOSAE. La obtención de una planta transgénica requiere
procedimientos de introducción del ADN exógeno en el tejido vegetal
y la regeneración de toda la planta a partir de tal tejido
transformado genéticamente. Dependiendo de la especie que se va a
transformar se han usado varios tipos de tejido para la
introducción de un ADN exógeno, preferiblemente usándose tejido
meristemático en varios procedimientos de transformación, sobre
todo a causa de la fácil regeneración de una planta a partir de este
tipo de tejido. Se han propuesto varios procedimientos para
introducir genes exógenos en células meristemáticas apicales de
LEGUMINOSAE, entre los cuales se pueden destacar: a) el sistema de
Agrobacterium; b) un sistema relacionado con la
electroporación tisular y c) el sistema biobalístico. Varios
científicos han demostrado la introducción y la integración de ADN
exógeno en células de LEGUMINOSAE y los han descrito en diferentes
publicaciones tales como (Arag\tilde{a}o F. J. L.,
Grossi-de-Sá M. F., Almeida E. R.,
Gander E. S. Rech E. L. (1992); Particle bombardment mediated
expression of a Brazil nut methionine-rich albumin
in bean (Phaseolus vulgaris L.); Plant Molecular Biology
20:357-359. Lewis, M. F. & Bliss, F. A. (1994);
Tumor formation and beta-glucuronidase expression
in Phaseolus vulgaris L. inoculated with Agrobacterium
tumefaciens. Journal of the American Society for Horticultural
Science; 119:361-366, Dillen W. Engler G. Van
Montagu M. & Angenon G. (1995);
Electroporation-mediated ADN delivery to seedling
tissues of Phaseolus vulgaris L. (common bean), Plant cell
Reports, 15:119-124.
Sin embargo, la baja frecuencia de obtención de
tejido transformado genéticamente, la baja capacidad para regenerar
una planta fértil a partir de dicho tejido transformado, junto con
el uso de procedimientos de transformación cuya eficacia depende del
genotipo, han complicado la obtención de plantas leguminosas
transgénicas (Brasileiro A. C. M.; Arag\tilde{a}o F. J. L.; Rossi
S. Dussi D. M. A.; Barros L. M. G. Y Rech E. L. (1996).
Susceptibility of common and tepary beans to Agrobacterium
ssp. strains and improvement of Agrobacterium-mediated
transformation using microprojectile bombardment. J. Amer. Soc.
Hort. Sci. 12:810-815 y Dillen W.; Van Montagu M.
& Angenon G. (1995) Electroporation-mediated DNA
delivery to seedling tissues of Phaseolus vulgaris L.
(common bean). Plant Cell Reports 15:119-124).
Con el desarrollo del procedimiento biobalístico
para la introducción directa de genes en células vegetales al final
de la década de los ochenta (Sanford J.C. Klein T. M., Wolf E. D. y
Allen N. (1987) Delivery of substances into cell tissues using a
particle bombardment process; Journal of Particle Science and
Technology, 5:27-37), se ha obtenido un gran número
de plantas transgénicas de varias especies, incluyendo las especies
que se ha probado que son recalcitrantes a la transformación usando
otros procedimientos. Esto se debe al hecho de que se ha hecho
posible introducir y expresar genes exógenos en cualquier clase de
tejido vegetal. Por tanto, cualquier tipo de tejido que tenga una
capacidad potencial para regenerar una planta entera fértil es
adecuado para la transformación,
Sanford propuso el procedimiento biobalístico con
vistas a introducir material genético en el genoma nuclear de
plantas superiores. Desde entonces, se ha evaluado su aplicación
universal y se ha probado que es un procedimiento eficaz y sencillo
para la introducción y expresión de genes en bacterias, protozoos,
hongos, algas, insectos, plantas y tejido animal, así como orgánulos
aislados como cloroplastos y mitocondrias, según los resultados
observados por Sanford J. C., Smith F. D. y Russel J. A. (1993).
Optimizing the biobalistic process for different biological
application. Methods in Enzymology:217:413-510. En
la bibliografía especializada hay otros varios ejemplos del uso del
procedimiento biobalístico para la obtención de organismos
transgénicos tales como, por ejemplo, las patentes de EE. UU.
5.565.346, 5.489.520 y WO 96/04392, entre otras.
En los procedimientos biobalísticos, para llevar
e introducir ácidos nucleicos y otras sustancias en células y
tejidos in vivo (Rech E. L. y Arag\tilde{a}o F.J. L.
(1997). The ballistics process. En: Brasileiro A. C. M y Carneiro V.
T. C. (ed)_ Manual of genetic transformation of plants:
EMBRAPA/Cenargen) se usan microproyectiles acelerados a alta
velocidad. Este procedimiento también se ha denominado procedimiento
de bombardeo con microproyectiles, procedimiento de "cañón de
genes", procedimiento de aceleración de partículas, entre otros.
Se han desarrollado y construido diferentes sistemas que son capaces
de acelerar micropartículas (hechas de tungsteno o de oro),
recubiertas con secuencias de ácidos nucleicos, a velocidades
superiores a 1500 km/h^{-1}. Todos estos sistemas se basan en la
generación de una onda de choque con la suficiente energía como para
desplazar una membrana portadora que contiene las micropartículas
recubiertas con ADN. La onda de choque puede generarse mediante una
explosión química (pólvora seca), una descarga de gas helio a alta
presión, mediante vaporización de una gota de agua a través de una
descarga eléctrica a alto voltaje y baja capacitancia o a bajo
voltaje y alta capacitancia.
Se ha mostrado que esos sistemas que usan gas
helio a presión alta y descarga eléctrica tiene un amplio espectro
de uso. Las partículas aceleradas penetran a través de la pared y la
membrana celular de forma no letal, distribuyéndose al azar en los
orgánulos celulares. A continuación, el ADN se disocia de las
micropartículas mediante la acción del líquido celular y tiene lugar
el procedimiento de integración del ADN exógeno en el genoma del
organismo que se va a modificar (Yamashita T. fada, A. y Morikawa H.
(1991)-Evidence that more than 90% of
b-glucuronidase-expressing cells
after particle bombardment directly recieve the foreign gene in
their nucleus; Plant Physiol, 97:829-831).
A pesar de la eficacia y universalidad de uso del
procedimiento biobalístico, depende de la optimización de varios
parámetros físicos y biológicos, que son fundamentales para la
introducción eficaz de genes heterólogos en tejido vegetal.
Para la obtención de plantas transgénicas a
partir de la región apical de los ejes embrionarios hay dos
requerimientos esenciales, a saber: 1) introducción de genes
exógenos con frecuencias elevadas en las células de las regiones
apicales e integración de genes exógenos en el genoma de la planta,
y 2) regeneración y producción de plantas transgénicas fértiles a
partir de las células transformadas resultantes.
Con el desarrollo del procedimiento biobalístico,
la transformación directa in situ de células del meristemo
apical es posible en la actualidad. Sin embargo, el desarrollo y la
producción posterior de plantas transgénicas fértiles requiere la
regeneración y la producción de la planta a partir de las células
transformadas.
Durante las últimas décadas se han hecho varios
intentos para obtener la regeneración de plantas fértiles de
LEGUMINOSAE comercialmente importantes. Aunque se han logrado muchos
avances, todavía no se han obtenido resultados positivos
eficazmente. Por ejemplo, se han desarrollado algunas metodologías
de brotes múltiples de los meristemos apicales y laterales de
embriones en distintas LEGUMINOSAE. Sin embargo, estos sistemas
todavía presentan serias desventajas.
Otros sistemas de regeneración desarrollados para
ciertas LEGUMINOSAE, tales como cacahuetes o soja, implican la
inducción de embriogénesis somática de embriones maduros e inmaduros
cultivados a dosis elevadas de 2,4-D. Sin embargo,
el uso práctico de este sistema es limitado ya que está restringido
a determinadas variedades, además del hecho de que también se
produce la inducción de variaciones genéticas indeseadas (variación
somaclonal) con la consiguiente producción de plantas transgénicas
con cambios en sus características agrónomas inherentes.
Por tanto, los sistemas ya conocidos para la
obtención de plantas transgénicas de LEGUMINOSAE basados en la
transformación de células meristemáticas de la región apical, usando
el procedimiento biobalístico, presenta las desventajas de la
imposibilidad de seleccionar las células transformadas, bajas
frecuencias de producción de plantas transgénicas y alta frecuencia
de quimeras (plantas con un órgano o grupos de algunas células
transgénicas y otras células no transgénicas).
En consecuencia, el objetivo de la presente
invención es proporcionar un procedimiento con una frecuencia de
producción elevada para la obtención de plantas leguminosas
transgénicas que contienen un ADN exógeno y que permita la selección
de las células transformadas; esto último manteniendo las
características agrónomas de las plantas a partir de las cuales se
han originado.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para producir plantas leguminosas transgénicas que
contienen ADN, que comprende las etapas de:
- a)
- introducir genes exógenos en células del meristemo apical del eje embrionario de plantas leguminosas mediante el procedimiento biobalístico;
- b)
- inducir la aparición de varios brotes de las células en la región meristemática apical modificada en la etapa (a) mediante el cultivo de dichos ejes embrionarios en un medio que contiene un inductor de varios brotes; y
- c)
- seleccionar las células meristemáticas de la región apical como se han obtenido en la etapa (b) mediante posterior cultivo de dichos ejes embrionarios en un medio que contiene una molécula que se concentra en la región meristemática apical de dicho embrión leguminoso.
Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que un
procedimiento biobalístico para transformar plantas leguminosas
mediante la introducción de un ADN exógeno en su región
meristemática apical, asociado con más etapas de múltiples brotes y
posterior selección de las plantas transformadas usando para este
propósito, específicamente, los ejes embrionarios de dichas células,
permite la regeneración y la producción de plantas transgénicas con
una frecuencia de producción del orden del 10%. Este valor
representa una magnitud de aproximadamente 200 veces las frecuencias
obtenidas mediante los procedimientos conocidos en la actualidad,
que son del orden de 0,03%-0,05%. Además, el procedimiento de la
presente invención permite la obtención de plantas transgénicas en
un periodo de tiempo más corto que los descritos en la técnica
anterior.
El procedimiento reivindicado en la actualidad es
adecuado para la transformación, la regeneración y la selección de
cualquier planta leguminosa tal como las plantas de soja, judías,
fríjol caupí y cacahuetes.
Según la presente invención, los ejes
embrionarios de las células meristemáticas apicales de plantas
leguminosas que se van a transformar se preparan en laboratorios de
un modo convencional para el procedimiento de bombardeo
(biobalístico).Por supuesto, los genes que se van a usar para el
bombardeo dependerán del objetivo específico de cada procedimiento
en cuestión, es decir, se escogerán de acuerdo con la característica
nueva que se desea impartir a la planta transformada. Por ejemplo,
en el caso en el que el objetivo del procedimiento sea obtener
plantas resistentes a herbicidas, se usarán genes que impartan tal
resistencia a herbicidas.
Tras el bombardeo, los ejes embrionarios se
ponen en contacto con un medio de cultivo que contiene un inductor
de múltiples brotes y deberían mantenerse en este medio durante un
periodo de tiempo suficiente para garantizar la inducción deseada,
preferiblemente durante un periodo variable de 16 a 120 horas. En
una forma de realización preferida de la invención, se usan
citocininas, a saber, 6-bencilaminopurina (BAP) o
tidiazurón (TDZ), como agentes inductores de múltiples brotes. Otra
ventaja de la presente invención es que el procedimiento
reivindicado permite que el periodo de múltiples brotes se complete
en un periodo de tiempo relativamente corto, evitando, por tanto,
que se produzcan variaciones genéticas que son habituales en otros
procedimientos conocidos.
Después del periodo de inducción de múltiples
brotes, los ejes embrionarios deben transferirse a otro medio de
cultivo que contenga el agente que inducirá la selección de las
células transformadas. Al igual que en el procedimiento de
bombardeo, el agente de selección se escogerá según los objetivos
finales del procedimiento. En el caso de plantas transgénicas que se
transforman con genes que impartan resistencia a herbicidas, el
agente de selección será el herbicida frente al que la planta
debería haber desarrollado resistencia. Entre los ejemplos de
herbicidas particularmente utilizables en el procedimiento de la
invención se encuentran el herbicida glifosato (comercializado por
Monsanto Company y denominado "Round Up") y los herbicidas
seleccionados de la familia de las imidazolinonas tales como
Imazapyr (comercializado por American Cyanamid Company). Durante la
etapa de selección de las células transformadas, una molécula que se
concentra en la región meristemática apical del embrión leguminoso,
tal como los herbicidas citados anteriormente, por ejemplo, se
transporta a través del sistema vascular del eje embrionario,
concentrándose después en la región meristemática apical. De este
modo, es posible llevar a cabo la selección de células sin provocar
efectos nocivos en el eje embrionario.
La invención se puede entender mejor con la ayuda
de los siguientes ejemplos, que son puramente ilustrativos, y los
parámetros y condiciones descritos no deben considerarse como
limitantes de la invención.
Semillas maduras de LEGUMINOSAE seleccionadas del
grupo compuesto por soja, judías y cacahuetes se desinfectaron en
etanol al 70% durante 1 minuto y en hipoclorito sódico al 1,0%
durante 20-30 minutos. Las semillas desinfectadas se
lavaron con agua destilada estéril y se incubaron durante
16-18 horas en agua destilada estéril a temperatura
ambiente.
A continuación, las semillas se abrieron para
extraer el eje embrionario. Se cortaron las hojas primarias para
exponer la región del meristemo apical. En el caso de las judías,
también se cortó la porción radicular, mientras que en las otras
LEGUMINOSAE no fue necesario cortar la porción radicular.
En las figuras 1 y 2 se ilustran, respectivamente
las regiones meristemáticas apicales LEGUMINOSAE del eje embrionario
de judías pintas y de soja. La figura 1 A muestra de forma
específica la región meristemática apical de la región meristemática
apical, mientras que la figura 1B demuestra el procedimiento de
explante para el bombardeo, con la eliminación de las hojas
primarias para exponer el meristemo apical y permitir la retirada de
la radícula.
Los ejes del embrión se desinfectaron en
hipoclorito sódico al 0,1% durante 10 minutos y se lavaron 3 veces
en agua destilada estéril. Después, los ejes embrionarios se
colocaron en las placas de cultivo que contenían el medio de
bombardeo (10-15 ejes/placa), estando dicho medio de
bombardeo (en lo sucesivo denominado MB) compuesto por un medio de
Murashig y Skoog (1962), aquí denominado MS, complementado con 3% de
sacarosa, 0,7% de fitagel, a pH 5,7. Los ejes se dispusieron en un
círculo, equidistante en 6-12 mm del centro de la
placa y con una región del meristemo apical dirigido hacia
arriba.
Después de colocar los ejes del embrión, con un
estereomicroscopio se observó que la región meristemática estaba
cubierta con una película líquida y, por tanto, la cubierta de la
placa se abrió en flujo laminar durante 1-2 minutos,
justo antes del bombardeo, para impedir que la película líquida de
la superficie meristemática reduzca la penetración de las
micropartículas y, en consecuencia, que reduzca el nivel de
expresión del gen introducido.
Una vez que el material que se va a transformar
se ha colocado en la placa que contiene el medio de bombardeo MB, se
bombardeó con el gen de interés. En este caso, se usaron varios
vectores que contenían los genes que crean resistencia a los
herbicidas glifosato e Imizapyr.
Se esterilizaron y lavaron las micropartículas
responsables de transportar el ADN exógeno al interior de las
células. Se pesaron 60 mg de micropartículas de tungsteno M10
(Sylvania) o de oro (Aldrich, 32, 658-5), se
transfirieron a un tubo de microcentrífuga en el cual se añadió 1,0
ml de etanol al 70%. La mezcla se agitó enérgicamente y se mantuvo
en agitación durante 15 minutos a la velocidad más baja del
agitador. Durante 5 minutos se centrifugaron a 15.000 g y el
sobrenadante se extrajo y se desechó con la ayuda de una micropipeta
de 1.000 \mul. Se añadió 1 ml de agua destilada y se mezcló
enérgicamente en un agitador y se centrifugó como en la etapa
anterior. Se desechó el sobrenadante y se repitió la operación de
lavado dos veces más.
Tras el último lavado, se desechó el sobrenadante
y se volvieron a suspender las micropartículas en 1 ml de glicerol
al 50% (v/v). Se mezclaron glicerol y agua destilada a partes
iguales, la mezcla se esterilizó con autoclave y se guardó a
temperatura ambiente.
A continuación, se precipitó el ADN exógeno
encima de las micropartículas y, con este propósito, una parte
alícuota de 50 \mul de la suspensión de micropartículas (60 mg/ml)
se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Se añadieron de 5 a 8 ml
de ADN (1 mg/\mul). La mezcla se homogeneizó rápidamente
(3-5 segundos) mediante la agitación de la parte
externa del tubo con ayuda de los dedos. Se añadieron 50 \mul de
CaCl_{2} 2,5M, se homogeneizó con rapidez y se añadieron 20 \mul
de espermidina 0,1M (Sigma S-0266), que es un
reactivo extremadamente higroscópico y oxidable.
La mezcla resultante se incubó a temperatura
ambiente en condiciones de agitación suave durante 10 minutos, se
centrifugó durante 10 segundos y se eliminó el sobrenadante
cuidadosamente. Se añadieron 150 \mul de etanol absoluto y,
después, se volvió a agitar la parte externa del tubo con la ayuda
de los dedos. La mezcla resultante se centrifugó a 15.000 g durante
10 segundos y se eliminó el sobrenadante. La etapa anterior se
repitió añadiendo 24 \mul de etanol absoluto, se homogeneizó
enérgicamente y se sometió a ultrasonidos durante
1-2 segundos.
Después, se distribuyeron muestras de 3,2 \mul
de la solución en la región central de cada membrana portadora
previamente colocada en un soporte de membrana. Cada precipitación
fue suficiente para preparar 6 membranas portadoras que contenían
micropartículas cubiertas con el ADN de interés. Los discos que
contenían las micropartículas cubiertas con ADN se apilaron
inmediatamente en una placa con material de secado (gel de sílice) y
se colocaron en un desecador.
El bombardeo de la región meristemática apical
del eje embrionario de las plantas leguminosas se llevó a cabo con
un acelerador de micropartículas, que usa una presión elevada de gas
helio, como describen Arag\tilde{a}o y col. 1996.
Inmediatamente después del bombardeo del eje
embrionario con las micropartículas cubiertas con un ADN exógeno que
imparte resistencia a Imazapyr, los ejes embrionarios se
transfirieron desde el medio de bombardeo (MB) a placas de cultivo
que contenían medio inductor de múltiples brotes (MI) (medio MS
complementado con 22,2 \mul de BAP, 3% de sacarosa, 0,6% de agar,
pH 5,7). Los ejes embrionarios bombardeados se mantuvieron
sumergidos en el MI durante 16-24 horas en
condiciones de oscuridad, a 27ºC, para inducir los múltiples brotes.
Tras este periodo, los ejes embrionarios se transfirieron a placas
con medio de cultivo con herbicida (MCH) (medio MS, 3% de sacarosa,
500-1000 nM de Imazapyr, 0,7% de agar, pH 5,7) y se
mantuvieron en una cámara de crecimiento a una temperatura de 27ºC
con un fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1})
hasta la inducción de los múltiples brotes.
Los disparos que alcanzaron una longitud de
2-4 cm se transfirieron a un medio de cultivo MS1S
(MS, 1% de sacarosa, 0,8% de agar, pH 5,7), con un fotoperiodo de 16
horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) a 27ºC, para permitir el
crecimiento y arraigo de las plántulas. De las bases del tallo y la
hoja se extrajo una sección de 1 mm para el análisis de la expresión
del gen exógeno. Los brotes que expresaban el ADN exógeno se
registraron de forma individual y se transfirieron a un nuevo frasco
de cultivo. Una vez que las plántulas habían arraigado se
transfirieron a vasos con sustrato esterilizado en autoclave: mezcla
de vermiculita (1:1).
Las plántulas se cubrieron con una bolsa de
plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días. La banda
elástica se retiró y, después de 6-7 días también se
quitó la bolsa de plástico. Las plántulas se transfirieron a vasos
con sustrato para la producción de semillas.
Inmediatamente después del bombardeo del eje de
los ejes embrionarios con las micropartículas cubiertas con un ADN
exógeno que imparte resistencia a glifosato, los ejes embrionarios
se transfirieron del medio de bombardeo (MB) a placas de cultivo con
medio inductor de múltiples brotes (MI) (medio MS complementado con
22, 2\mul de BAP, 3% de sacarosa, 0,6% de agar, pH 5,7). Los ejes
embrionarios bombardeados permanecieron sumergidos en el medio MI
durante 16-24 horas en condiciones de oscuridad, a
27ºC, para inducir múltiples brotes. Después de este periodo, los
ejes embrionarios se transfirieron a placas con medio ce cultivo que
contenía herbicida (MCH) (medio MS, 3% de sacarosa,
300-1000 nM de glifosato, 0,7% de agar, pH 5,7) y se
mantuvieron en una cámara de crecimiento a una temperatura de 27ºC
con un fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1})
hasta la inducción de múltiples brotes.
Los disparos que alcanzaron una longitud de
2-4 cm se transfirieron a un medio de cultivo MS1S
(MS, 1% de sacarosa, 0,8% de agar, pH 5,7), con un fotoperiodo de 16
horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) a 27ºC, para permitir el
crecimiento y arraigo de las plántulas. De las bases del tallo y la
hoja se extrajo una sección de 1mm para el análisis de la expresión
del gen exógeno. Los brotes que expresaban el ADN exógeno se
registraron de forma individual y se transfirieron a un nuevo frasco
de cultivo. Una vez que las plántulas habían arraigado se
transfirieron a vasos con sustrato esterilizado en autoclave: mezcla
de vermiculita (1:1).
Las plántulas se cubrieron con una bolsa de
plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días. La banda
elástica se retiró y, después de 6-7 días también se
quitó la bolsa de plástico. Las plántulas se transfirieron a vasos
con sustrato para la producción de semillas.
Inmediatamente después del bombardeo del eje de
los ejes embrionarios con las micropartículas cubiertas con un ADN
exógeno que imparte resistencia a Imazapyr, los ejes embrionarios se
cultivaron en el mismo medio de cultivo (MB) durante 7 días a una
temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles
m^{-2}s^{-1}) para la inducción de los múltiples brotes. Después
de este periodo, los ejes embrionarios que germinaron se
transfirieron a una caja de tipo "Magenta" que contenía el
medio de cultivo MSBH (medio MS complementado con BAP 44,2 \muM,
3% de sacarosa, 100-500 nM de Imazapyr, 0.8% de
agar, pH 5,7), durante 7 días a una temperatura de 27ºC con un
fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}), para
reducir el número total de múltiples brotes. Después, los ejes
embrionarios se transfirieron de nuevo a la caja de cultivo de tipo
"Magenta" que contienen el medio de cultivo MS3S (MS
complementado con BAP 44,2 \muM, 3% de sacarosa, 0,8% de agar, pH
5,7) a una temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50
\mumoles m^{-2}s^{-1}) para permitir la elongación de los
múltiples brotes. Después de dos semanas, los ejes del embrión
comenzaron a emitir brotes.
Los brotes que alcanzaron una longitud de
2-4 cm se transfirieron a un medio de cultivo MS1S
(MS, 1% de sacarosa, 0,8% de agar, pH 5,7), con un fotoperiodo de 16
horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) a 27ºC, para permitir el
crecimiento y arraigo de las plántulas. De las bases del tallo y la
hoja se extrajo una sección de 1 mm para el análisis de la expresión
del gen exógeno. Los brotes que expresaban el ADN exógeno se
registraron de forma individual y se transfirieron a un nuevo frasco
de cultivo. Una vez que las plántulas habían arraigado se
transfirieron a vasos con sustrato esterilizado en autoclave: mezcla
de vermiculita (1:1).
Las plántulas se cubrieron con una bolsa de
plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días. La banda
elástica se retiró y, después de 6-7 días también se
quitó la bolsa de plástico. Las plántulas se transfirieron a vasos
con sustrato para la producción de semillas.
Inmediatamente después del bombardeo de los ejes
embrionarios con las micropartículas cubiertas con un ADN exógeno
que imparte resistencia a glifosato, los ejes embrionarios se
cultivaron en el mismo medio de cultivo (MB) durante 7 días a una
temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles
m^{-2}s^{-1}) para inducir varios brotes. Después de este
periodo, los ejes embrionarios que germinaron se transfirieron a una
caja de tipo "Magenta" que contenía el medio de cultivo MSBH
(medio MS complementado con 44,2 \muM de BAP, 3% de sacarosa,
200-1000 nM de glifosato, 0,8% de agar, pH 5,7),
durante 7 días a una temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16
horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) para reducir el número total
de los varios brotes. Después, los ejes embrionarios se
transfirieron de nuevo a la caja de cultivo de tipo "Magenta"
que contenía el medio de cultivo MS3S (MS complementado con 44,2
\muM de BAP, 3% de sacarosa, 0,8% de agar, pH 5,7) a una
temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles
m^{-2}s^{-1}) para permitir la elongación de los diversos
brotes. Después de dos semanas, los ejes de los embriones comenzaron
a emitir brotes.
Los brotes que alcanzaron una longitud de
2-4 cm se transfirieron a un medio de cultivo MS1S
(MS, 1% de sacarosa, 0,8% de agar, pH 5,7), con un fotoperiodo de 16
horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) a 27ºC, para permitir el
crecimiento y arraigo de las plántulas. De las bases del tallo y la
hoja se extrajo una sección de 1 mm para el análisis de la expresión
del gen exógeno. Los brotes que expresaban el ADN exógeno se
registraron de forma individual y se transfirieron a un nuevo frasco
de cultivo. Una vez que las plántulas habían arraigado se
transfirieron a vasos con sustrato esterilizado en autoclave: mezcla
de vermiculita (1:1).
Las plántulas se cubrieron con una bolsa de
plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días. La banda
elástica se retiró y, después de 6-7 días también se
quitó la bolsa de plástico. Las plántulas se transfirieron a vasos
con sustrato para la producción de semillas.
Inmediatamente después del bombardeo de los ejes
embrionarios con las micropartículas cubiertas con un ADN exógeno
que imparte resistencia a Imapazyr, los ejes embrionarios se
cultivaron en el mismo medio de cultivo (MB) durante 7 días a una
temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles
m^{-2}s^{-1}) para inducir varios brotes. Después de este
periodo, los ejes embrionarios que germinaron se transfirieron a una
caja de tipo "Magenta" que contenía el medio de cultivo MSBH
(medio MS complementado con 5-50 \muM de BAP, 3%
de sacarosa, 100-500 nM de IMAZAPYR, 0,8% de agar,
pH 5,7), durante 7 días a una temperatura de 27ºC con un fotoperiodo
de 16 horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) para reducir el número
total de los varios brotes. Después, los ejes embrionarios se
transfirieron de nuevo a la caja de cultivo de tipo "Magenta"
que contenía el medio de cultivo MS3S (SM complementado con
20-50 \muM de BAP, 3% de sacarosa, 0,8% de agar,
pH 5,7) a una temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50
\mumoles m^{-2}s^{-1}) para permitir la elongación de los
diversos brotes. Después de dos semanas, los ejes de los embriones
comenzaron a emitir brotes.
Los brotes que alcanzaron una longitud de
2-4 cm se transfirieron a un medio de cultivo MS1S
(MS, 1% de sacarosa, 0,8% de agar, pH 5,7), con un fotoperiodo de 16
horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) a 27ºC, para permitir el
crecimiento y arraigo de las plántulas. De las bases del tallo y la
hoja se extrajo una sección de 1 mm para el análisis de la expresión
del gen exógeno. Los brotes que expresaban el ADN exógeno se
registraron de forma individual y se transfirieron a un nuevo frasco
de cultivo. Una vez que las plántulas habían arraigado se
transfirieron a vasos con sustrato esterilizado en autoclave: mezcla
de vermiculita (1:1).
Las plántulas se cubrieron con una bolsa de
plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días. La banda
elástica se retiró y, después de 6-7 días también se
quitó la bolsa de plástico. Las plántulas se transfirieron a vasos
con sustrato para la producción de semillas.
Inmediatamente después del bombardeo de los ejes
embrionarios con las micropartículas cubiertas con un ADN exógeno
que imparte resistencia a glifosato, los ejes embrionarios se
cultivaron en el mismo medio de cultivo (MB) durante 7 días a una
temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles
m^{-2}s^{-1}) para inducir varios brotes. Después de este
periodo, los ejes embrionarios que germinaron se transfirieron a una
caja de tipo "Magenta" que contenía el medio de cultivo MSBH
(medio MS complementado con 5-50 \muM de BAP, 3%
de sacarosa, 200-1000 nM de glifosato, 0,8% de agar,
pH 5,7), durante 7 días a una temperatura de 27ºC con un fotoperiodo
de 16 horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) para reducir el número
total de los varios brotes. Después, los ejes embrionarios se
transfirieron de nuevo a la caja de cultivo de tipo "Magenta"
que contenía el medio de cultivo MS3S (SM complementado con
20-50 \muM de BAP, 3% de sacarosa, 0,8% de agar,
pH 5,7) a una temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50
\mumoles m^{-2}s^{-1}) para permitir la elongación de los
diversos brotes. Después de dos semanas, los ejes de los embriones
comenzaron a emitir brotes.
Los brotes que alcanzaron una longitud de
2-4 cm se transfirieron a un medio de cultivo MS1S
(MS, 1% de sacarosa, 0,8% de agar, pH 5,7), con un fotoperiodo de 16
horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) a 27ºC, para permitir el
crecimiento y arraigo de las plántulas. De las bases del tallo y la
hoja se extrajo una sección de 1mm para el análisis de la expresión
del gen exógeno. Los brotes que expresaban el ADN exógeno se
registraron de forma individual y se transfirieron a un nuevo frasco
de cultivo. Una vez que las plántulas habían arraigado se
transfirieron a vasos con sustrato esterilizado en autoclave: mezcla
de vermiculita (1:1).
Las plántulas se cubrieron con una bolsa de
plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días. La banda
elástica se retiró y, después de 6-7 días también se
quitó la bolsa de plástico. Las plántulas se transfirieron a vasos
con sustrato para la producción de semillas.
Inmediatamente después del bombardeo de los ejes
embrionarios con las micropartículas cubiertas con un ADN exógeno
que imparte resistencia a Imazapyr, los ejes embrionarios se
cultivaron en el mismo medio de cultivo (MB) durante 7 días a una
temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles
m^{-2}s^{-1}) para inducir varios brotes. Después de este
periodo, los ejes embrionarios que germinaron se transfirieron a una
caja de tipo "Magenta" que contenía el medio de cultivo MSBH
(medio MS complementado con 5-50 \muM de BAP, 3%
de sacarosa, 100-500 nM de IMAZAPYR, 0,8% de agar,
pH 5,7), durante 7 días a una temperatura de 27ºC con un fotoperiodo
de 16 horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) para reducir el número
total de los varios brotes. Después, los ejes embrionarios se
transfirieron de nuevo a la caja de cultivo de tipo "Magenta"
que contenía el medio de cultivo MS3S (MS complementado con 44,3
\muM de BAP, 3% de sacarosa, 0,8% de agar, pH 5,7) a una
temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles
m^{-2}s^{-1}) para permitir la elongación de los diversos
brotes. Después de dos semanas, los ejes de los embriones comenzaron
a emitir brotes.
Los brotes que alcanzaron una longitud de
2-4 cm se transfirieron a un medio de cultivo MS1S
(MS, 1% de sacarosa, 0,8% de agar, pH 5,7), con un fotoperiodo de 16
horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) a 27ºC, para permitir el
crecimiento y arraigo de las plántulas. De las bases del tallo y la
hoja se extrajo una sección de 1 mm para el análisis de la expresión
del gen exógeno. Los brotes que expresaban el ADN exógeno se
registraron de forma individual y se transfirieron a un nuevo frasco
de cultivo. Una vez que las plántulas habían arraigado se
transfirieron a vasos con sustrato esterilizado en autoclave: mezcla
de vermiculita (1:1).
Las plántulas se cubrieron con una bolsa de
plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días. La banda
elástica se retiró y, después de 6-7 días también se
quitó la bolsa de plástico. Las plántulas se transfirieron a vasos
con sustrato para la producción de semillas.
Inmediatamente después del bombardeo de los ejes
embrionarios con las micropartículas cubiertas con un ADN exógeno
que imparte resistencia a glifosato, los ejes embrionarios se
cultivaron en el mismo medio de cultivo (MB) durante 7 días a una
temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles
m^{-2}s^{-1}) para inducir varios brotes. Después de este
periodo, los ejes embrionarios que germinaron se transfirieron a una
caja de tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MSBH
(medio MS complementado con 5-50 \muM de BAP, 3%
de sacarosa, 200-1000 nM de glifosato, 0,8% de agar,
pH 5,7), durante 7 días a una temperatura de 27ºC con un fotoperiodo
de 16 horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) para reducir el número
total de los varios brotes. Después, los ejes embrionarios se
transfirieron de nuevo a la caja de cultivo de tipo "Magenta"
que contenía el medio de cultivo MS3S (SM complementado con 44,3
\muM de BAP, 3% de sacarosa, 0,8% de agar, pH 5,7) a una
temperatura de 27ºC con un fotoperiodo de 16 horas (50 \mumoles
m^{-2}s^{-1}) para permitir la elongación de los diversos
brotes. Después de dos semanas, los ejes de los embriones comenzaron
a emitir brotes.
Los brotes que alcanzaron una longitud de
2-4 cm se transfirieron a un medio de cultivo MS1S
(MS, 1% de sacarosa, 0,8% de agar, pH 5,7), con un fotoperiodo de 16
horas (50 \mumoles m^{-2}s^{-1}) a 27ºC, para permitir el
crecimiento y arraigo de las plántulas. De las bases del tallo y la
hoja se extrajo una sección de 1 mm para el análisis de la expresión
del gen exógeno. Los brotes que expresaban el ADN exógeno se
registraron de forma individual y se transfirieron a un nuevo frasco
de cultivo. Una vez que las plántulas habían arraigado se
transfirieron a vasos con sustrato esterilizado en autoclave: mezcla
de vermiculita (1:1).
Las plántulas se cubrieron con una bolsa de
plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días. La banda
elástica se retiró y, después de 6-7 días también se
quitó la bolsa de plástico. Las plántulas se transfirieron a vasos
con sustrato para la producción de semillas.
Claims (10)
1. Un procedimiento para seleccionar plantas
leguminosas transformadas de una línea germinal, que comprende las
etapas de:
- a)
- introducir genes exógenos en células meristemáticas apicales de los ejes embrionarios de plantas leguminosas mediante el bombardeo de dichas células vegetales con un constructo de ADN que incluye una secuencia que codifica una proteína capaz de conferir tolerancia a herbicidas del grupo químico de las imidazolinonas o glifosatos;
- b)
- inducir la formación de varios brotes a partir de las células meristemáticas apicales transformadas de la etapa (a) mediante el cultivo de dichos ejes embrionarios en un medio que contiene citocinina; y
- c)
- seleccionar los brotes derivados de las células meristemáticas obtenidos en la etapa (b) mediante el cultivo de dichos ejes embrionarios en un medio que contiene un herbicida del grupo químico de las imidazolinonas o glifosatos a una concentración variable de 100 a 1000 nM.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la concentración del herbicida del grupo químico de las
imidazolinonas o glifosatos varía de 200 a 1000 nM.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que la planta leguminosa se selecciona
del grupo que comprende soja, judías, fríjol caupí y cacahuete.
4. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la citocinina usada en la etapa
(b) es 6-bencilaminopurina.
5. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la citocinina usada en la etapa
(b) es tidiazurón.
6. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la planta leguminosa es la planta de soja, el herbicida usado
en la etapa (c) se selecciona del grupo químico de imidazolinonas, y
la concentración del herbicida varía de aproximadamente 500 a 1000
nM.
7. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la planta leguminosa es soja, el herbicida usado en la etapa
(c) se selecciona del grupo químico de glifosatos, y la
concentración del herbicida varía de aproximadamente 300 a 1000
nM.
8. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la planta leguminosa se selecciona de entre judía, fríjol
caupí y cacahuete, el herbicida usado en la etapa (c) se selecciona
del grupo químico de imidazolinonas, y la concentración del
herbicida varía de aproximadamente 100 a 500 nM.
9. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la planta leguminosa es soja, el herbicida usado en la etapa
(c) se selecciona del grupo químico de glifosatos, y la
concentración del herbicida varía de aproximadamente 200 a 1000
nM.
10. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la frecuencia de brotes
transgénicos recuperados como un porcentaje de meristemos
bombardeados es de aproximadamente el 10%.
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Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4940835A (en) * | 1985-10-29 | 1990-07-10 | Monsanto Company | Glyphosate-resistant plants |
| US5378824A (en) * | 1986-08-26 | 1995-01-03 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase |
| US5015580A (en) | 1987-07-29 | 1991-05-14 | Agracetus | Particle-mediated transformation of soybean plants and lines |
| US5565346A (en) * | 1988-07-27 | 1996-10-15 | Calgene, Inc. | Transformation and regeneration system for legumes |
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| US5589583A (en) * | 1990-01-11 | 1996-12-31 | Monsanto Company | Plant promoter |
| CA2036935A1 (en) * | 1990-02-26 | 1991-08-27 | Paul Christou | Plant transformation process with early identification of germ line transformation events |
| WO1992004449A1 (en) | 1990-08-31 | 1992-03-19 | Monsanto Company | Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| US5633435A (en) * | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| CA2071767A1 (en) | 1991-06-20 | 1992-12-21 | Praveen K. Saxena | Hyperproduction of shoots during in vitro regeneration of plant |
| FR2736929B1 (fr) | 1995-07-19 | 1997-08-22 | Rhone Poulenc Agrochimie | Sequence adn isolee pouvant servir de zone de regulation dans un gene chimere utilisable pour la transformation des plantes |
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