MXPA00003380A - Procedimiento para obtener plantas leguminosas transgenicas (leguminosae) que contienen adn exogeno. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para producir plantas leguminosas transgénicas que contienen ADN exógeno y comprende los pasos de:a) introducir genes exógenos en células del meristemo apical del eje embriónico de plantas leguminosas mediante el método biobalístico;b) inducir el retoñamiento múltiple de las células en la región meristemática apical modificada en el paso anterior mediante el cultivo de los ejes embriónicos en un medio que contenga un inductor de retoños múltiples;y c) seleccionar las células meristemáticas de la región apical transformadas por otro cultivo de estos ejes embriónicos que contienen una molécula que se concentra en la región apical meristemática de estos embriones de plantas leguminos

Description

UN PROCESO PARA OBTENER PLANTAS LEGUMINOSAS TRANSGENICAS (LEGUMINOSAE) QUE CONTIENEN ADN EXOGENO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de la biobalística para introducir genes exógenos en el tejido vegetal y obtener plantas leguminosas transgénicas mediante la regeneración del tejido transformado .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El uso de técnicas de manipulación genética para introducir genes que son responsables para las características agronómicas de interés pueden facilitar el desarrollo de nuevas variedades de LEGUMINOSAE. La obtención de una planta transgénica requiere de métodos para introducir el ADN exógeno en el tejido vegetal y regenerar la planta completa a partir de este tejido genéticamente transformado. Dependiendo de la especie a ser transformada, diversos REF.: 119222 tipo de t jido se han utilizado para la introducción de un ADN exógeno, el tejido eristemático de preferencia se emplea en diversos procesos de transformación, sobre todo debido a la facilidad de regeneración de una planta de este tipo de tejido. Diversos procesos han sido propuestos para introducir genes exógenos en las células apicales meristemáticas de las LEGUMINOSAE, entre . s cuales las siguientes se pueden señalar: a) el sistema Agroba cteri um; b) un sistema relacionado a la electroporación de tejidos y c) el sistema biobalístico. La introducción e integración de un ADN exógeno en las células de LEGUMINOSAE se han demostrado por varios científicos y se han descrito en diferentes publicaciones tales- como (Aragao F. J. L., Grossi-de-Sá M. F., Almeida E. R., Gander E. S., Rech E. L. (1992); Particle bo bardment ediated expression of a Brazil nut methionine-rich albumin in bean { Phaseol us vulgari s L:); Plant Molecular Biology, 20: 357-359. Lewis, M. F. & Bliss, F. A. (1994); Tumor formation and beta-glucuronidase expression in Phaseol us vul gari s L inoculated with Agrobacteri um t?mefaci ens . Journal of the American Society for Horticultural Science, 119: 361-366. Dillen, W. Engler G. Van Montagu M. & Angenon G. (1995); Electroporation- ediated DNA delivery to seedling tissues of Phaseol us vulgari s L (co mon bean) , Plant cell Reports, 15: 119-124.

Sin embargo, la frecuencia de baja obtención del tejido genéticamente transformado, la baja capacidad de transformar una planta fértil a partir de este tejido transformado, junto con el uso de los métodos de transformación cuya eficiencia depende del genotipo, ha hecho difícil obtener plantas leguminosas transgénicas (Brasileiro A. C. M. : Aragáo F. J. L.; Rossi, S. Dussi D. M. A.; Barros L. M. G.; & Rech E. L. (1996) - Susceptibility of common and tepary beans to Agrobacteri um ssp . Strains and improvement of Agrobacterium-mediated transformation using microprojectile bombardment. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 12: 810-815 and Dillen W.; Van Montagu M. & Angenon G. (1995) Electroporation-mediated DNA delivery to seedling tissues of Phaseol us vulgari s L. (co mon bean) . Plant Cell Reports, 15: 119-124) .

Con el desarrollo del proceso biobalístico para la introducción directa de los genes en las células vegetales al final de la década de los 80 (Sanford J. C. Klein T. M., Wolf E. D. & Alien N. (1987) Delivery of substances into cell tissues using a particle bombard ent process; Journal od Particle Science and Technology, 5: 27-37), un gran número de plantas transgénicas de diferentes especies se ha obtenido, incluyendo aquellas especies que prueban ser recalcitrantes a la transformación mediante el uso de otros métodos. Esto es debido al hecho de que ha sido posible introducir y expresar para los genes exógenos en cualquier tipo de tejido vegetal. Por lo tanto, cualquier tipo de tejido que tiene una habilidad potencial de regenerar una planta fértil completa es adecuado para la transformación.

El proceso biobalístico es propuesto por Sanford en vista de introducir el material genético en el genoma nuclear de las plantas superiores. Desde entonces se ha apreciado su aplicación universal, y ha sido probado como un proceso simple y efectivo para la introducción y expresión de los genes en bacterias, protozoarios, hongos, algas, insectos, tejido animal y vegetal, así como organelos aislados tales como plastos y mitocondrias, según los resultados observados por Sanford J. C, Smith F. D. & Russel J. A. (1993). Optimizing the Biobalistic process for different biological application. Methods in Enzimology, 217: 413-510. En la literatura especializada hay varios ejemplos más sobre el uso de la biobalística para la obtención de organismos transgénicos tales como, por ejemplo, en las patentes de E. U. A. 5,565,346, 5,489,520 y WO 96/04392, entre otros.

En la biobalística se utilizan microproyectiles acelerados a alta velocidad para transportar e introducir los ácidos nucleicos y otras sustancias en las células y tejidos in vivo (Rech E. L. &' Aragáo F. J. L. (1997). The balistics process - In: Brasileiro A. C. M. & Carneiro V. T. C. (Ed) - Manual of genetic transformation of plants: EMBRAPA/Cenargen. Este proceso se ha llamado también el método de bombardeo con microproyectiles, o sea, el método de "pistola de genes", el método de aceleración de partículas, entre otros. Se han desarrollado y construido diferentes sistemas que son capaces de acelerar las micropartículas (hechas de tungsteno u oro) , recubiertos con secuencias de ácidos nucleicos a velocidades mayores de 1,500 km/h-1. Todos estos sistemas se basan en la generación de una onda de choque con suficiente energía para desplazar una membrana portadora que contenga las micropartículas recubiertas con ADN. La onda de choque se puede generar mediante una explosión química (pólvora seca) , una descarga de gas de helio bajo alta presión, mediante la evaporación de una gota de agua a través de una descarga eléctrica con un alto voltaje y una baja capacitancia, o un bajo voltaje y una alta capacitancia.

Aquellos sistemas que utilizan gas de helio bajo alta presión y una descarga eléctrica han mostrado un amplio espectro de utilización. Las partículas aceleradas penetran la pared y membrana celular de una manera no letal, emplazándose de manera aleatoria en los organelos celulares. Luego, el ADN se disocia de las micropartículas mediante la acción de un líquido celular, y el proceso de integrar el ADN exógeno en el genoma del organismo a ser modificado toma lugar (Yamashita T. Iada & Morikawa H. (1991) - Evidencia de que más del 90% de las células que expresan para el gen de glucuronidasa, luego del bombardeo de partículas, reciben directamente al gen foráneo en su núcleo; Plant Physiol., 97: 829-831) .

A pesar de la eficiencia y universalidad de la utilización del proceso biobalístico, depende de la optimización de diversos parámetros físicos y biológicos, que son fundamentales para la introducción efectiva de los genes heterólogos en un tejido vegetal.

Para la obtención de plantas transgénicas a partir de la región apical del eje embriónico, existen dos requerimientos escenciales, particularmente: 1) introducción de genes exógenos con altas frecuencias en las células de las regiones apicales, e integración de los genes exógenos en el genoma vegetal, y 2) regeneración y producción de plantas transgénicas fértiles a partir de las células transformadas resultantes.

Con el desarrollo del proceso biobalístico la transformación directa in situ de las células del meriste o apical es ahora posible. Sin embargo, el desarrollo y producción adicional de plantas transgénicas fértiles requiere de la regeneración y producción de la planta a partir de las células transformadas.

Durante las últimas décadas se han hecho varios intentos de obtener la regeneración de plantas fértiles de LEGUMINOSAE comercialmente importantes aunque se han logrado muchos avances, aún no se han obtenido resultados efectivamente positivos. Por ejemplo, se han desarrollado algunas metodologías con retoños múltiples de los meristemos apicales y laterales de los embriones en diferentes LEGUMINOSAE. Sin embargo, estos sistemas aún presentan serias desventajas.

Otros sistemas de regeneración desarrollados para ciertas LEGUMINOSAE tales como los cacahuates y soya, involucran la inducción de la embriogénesis somática a partir de embriones maduros e inmaduros cultivados a altas dosis de 2, 4-D. Sin embargo, el uso práctico de este sistema está limitado ya que está restringido a variedades determinadas, además del hecho de que la inducción de variaciones genéticas indeseadas (variación somaclonal) también ocurre con la subsecuente producción de plantas transgénicas con sus características argonómicas inherentes cambiadas.

De este modo, los sistemas ya conocidos para la obtención de plantas transgénicas de LEGUMINOSAE basados en la transformación de las células meristemáticas de la región apical, mediante el uso del proceso biobalístico presentan las desventajas de la imposibilidad de seleccionar las células transformadas, frecuencia de baja producción de plantas transgénicas y alta frecuencia de quimeras (plantas con un órgano o grupos de algunas células transgénicas y otras células no transgénicas) .

Es, por lo tanto, el objetivo de la presente invención proporcionar un proceso con una producción de alta frecuencia para la obtención de plantas leguminosas transgénicas que contengan un ADN exógeno y que permita la selección de las células transformadas, lo último que mantenga las características agronómicas de las plantas de las cuales se han originado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un proceso para producir plantas leguminosas transgénicas que contengan ADN exógeno, que comprende los pasos de: a) introducir genes exógenos en las células del meristemo apical del eje embriónico de las plantas leguminosas mediante el método biobalístico; b) inducir el retoñamiento múltiple de las células en la región apical meristemática modificada en el paso (a) al cultivar a este eje embriónico en un medio que contiene un inductor de retoñamiento múltiple; y c) seleccionar a las células meristemáticas de la región apical como se obtienen en el paso (b) mediante otro cultivo de este eje embriónico que contenga una molécula que se concentra en la región apical meristemática de estos embriones leguminosos .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se encuentra de manera sorprendente que ahora un proceso biobalístico para transformar a las plantas leguminosas al introducirles un ADN exógeno en su región apical meristemática, asociado con otros pasos de retoños múltiples y selección subsecuente de las plantas tansformadas, al utilizar, para este propósito, de manera específica el eje embriónico de estas células, permite la regeneración y producción de las plantas transgénicas con una frecuencia de ' producción del orden del 10%. Este valor representa una magnitud de aproximadamente 200 veces tan alta como las frecuencias obtenidas con el proceso conocido hasta la fecha, que es del orden del 0.03%-0.05%. Además, el proceso de la presente invención permite la obtención de las plantas transgénicas en un periodo de tiempo más corto que aquellos descritos en la técnica anterior.

El proceso como se reivindica ahora es adecuado para la transformación, regeneración y selección de cualquier planta leguminosa tal como la soya, frijoles, semilla de caupí y cacahuates.

Según la presente invención, el eje embriónico de las células meristemáticas apicales de las plantas leguminosas a ser transformadas se prepara en laboratorios en una manera convencional para el proceso de bombardeo (biobalístico) . Desde luego, los genes a ser utilizados para el bombardeo dependen del objetivo específico de cada proceso en cuestión, esto es, se escogen en conformidad con la nueva característica que uno desea impartir a la planta transformada. Por ejemplo, en el caso en donde el objetivo del proceso es obtener plantas resistentes a los herbicidas, se utilizan los genes que imparten tal resistencia a los herbicidas .

Luego del bombardeo, el eje embriónico se pone luego en contacto con un medio de cultivo que tiene un inductor de retoñamiento múltiple y debe mantenerse en este medio durante un periodo de tiempo suficiente para garantizar la inducción deseada, de preferencia durante un periodo en una gama desde 16 a 120 horas. En una modalidad preferida de la invención, las citocininas, a saber la 6-benzilaminopurina (BAP) ó la tidiazurona (TDZ) , se utilizan como un agente inductor de retoños múltiples. Una ventaja adicional de la presente invención es que el proceso ahora reivindicado permite que el retoñamiento múltiple comúnmente sea durante un periodo de tiempo relativamente corto, de esta manera evitando la ocurrencia de variaciones genéticas que son cxomunes en otros procesos conocidos.

Luego del periodo de la inducción de retoñamiento múltiple, el eje embriónico debe de transferirse a un medio de cultivo adicional que contenga el agente que promueve la selección de las células transformadas. Como en el proceso de bombardeo, el agente de selección se escoge según los objetivos finales del proceso. En el caso de las plantas transgénicas que se transforman con genes que imparten resistencia a los herbicidas, el agente de selección será el herbicida al cual la planta debe haber desarrollado resistencia. Los ejemplos de herbicidas que son particularmente útiles en el proceso de la invención es el herbicida Glyphosate (que se vende por Monsanto Company y se llama "Round up") y los herbicidas seleccionados a partir de la familia de las imidazolinonas tales como Imazapyr (que se vende por American Cyanamid Company) . Durante el paso para seleccionar las células transformadas, una molécula que se concentra en la región meristemática apical de los embriones leguminosos, tales como los herbicidas anteriormente mencionados, por ejemplo, se transporta a través del sistema vascular del eje embriónico y luego se concentra en la región meristemática apical. De esta forma, es posible llevar a cabo la selección de las células sin los efectos nocivos al eje embriónico.

La invención se puede entender mejor con la ayuda de los ejemplos dados a continuación, que son meramente ilustrativos, y los parámetros y condiciones descritos no deben apreciarse como limitantes de la invención.

Ejemplos Preparación del Eje Embriónico para el Bombardeo (Biobalístico) Se desinfectan semillas maduras de LEGUMINOSAE seleccionadas a partir del grupo que consiste de soya, frijol y cacahuates, en etanol al 70% durante 1 minuto e hipoclorito de sodio al 1.0% durante 20-30 minutos. Las semillas desinfectadas se lavan con agua destilada estéril y se incuban a temperatura ambiente durante 16-18 horas en agua destilada estéril.

Luego las semillas se abren para removerles el eje embriónico. Las hojas primarias se cortan para así exponer la región del meristemo apical. En el caso de los frijoles, la porción radical también se corta mientras que para las otras LEGUMINOSAE no hay necesidad de cortar la porción radical.

Las regiones meristemáticas apicales de las LEGUMINOSAE del eje e briónico de frijoles negros y de la soya se ilustran en las Figuras 1 y 2, respectivamente. La Figura 1 A demuestra de manera específica la región meristemática apical mientras que la Figura B muestra el proceso de explante para el bombardeo con la remoción de las hojas primarias a fin de exponer el meristemo apical y permitir la remoción de la radícula.

El eje de los embriones se desinfectó en hipoclorito de sodio al 0.1% durante un minuto y se lavó 3 veces en agua destilada estéril. Luego los ejes embriónicos se pusieron en placas de cultivo que contienen el medio de bombardeo (10-15 ejes/placas), este medio de bombardeo (a partir de este punto se llama BM) consiste de un medio de Murashig y Skoog (1962), y se refiere aquí como MS, suplementado con 3% de sucrosa, 0.7% de fitagel, a un pH de 5.7. los ejes se conformaron en un círculo equidistante de 6-12 mm a partir del centro de la placa y con una región del meristemo apical dirigido hacia arriba.

Luego de colocar el eje embriónico, se observa, bajo un estereomicroscopio, que la región meristemática esté cubierta con una película líquida y por lo tanto, que el recubrimiento de la placa se abra bajo un flujo laminar durante 1-2 minutos, justo antes del bombardeo, a fin de prevenir que el líquido de la película líquida de la superficie meristemática reduzca la penetración de las micropartículas y, consecuentemente, reduzca el nivel de expresión para el gen introducido.

Una vez que el material a ser transformado ha sido colocado en la placa que contiene el medio de bombardeo BM, se bombardea con el gen de interés. En este caso, se utilizan diversos vectores que contienen genes que crean resistencia a los herbicidas Glysophate e Imazapyr.

Preparación de las Micropartículas Las micropartículas responsables para transportar el ADN exógeno hacia las células se esterilizan y lavan. Se pesan 60 mg de micropartículas de tungsteno MÍO (Sylvánia) u oro (Aldrich, 32,658-5) y se transfieren a un tubo de microcentrifugación, a las cuales se les agrega 1.0 ml de etanol al 70%. La mezcla se agita vigorosamente bajo agitación durante 15 minutos a la velocidad más baja del agitador. Se centrifugan 15,000 g durante 5 minutos y el sobrenadante se remueve y se desecha con la ayuda de una micropipeta de 1,000 µl. se agrega 1 ml de agua destilada estéril y se mezcla vigorosamente en un agitador y se centrifuga como en el paso precedente. El sobrenadante se desecha y la operación de lavado se repite 2 veces más.

Luego del último lavado el sobrenadante se desecha y las micropartículas se suspenden de nuevo en 1 ml de glicerol al 50% (v/v) . se mezclan partes iguales de glicerol y agua destilada, la mezcla se pone en autoclave y se mantiene a temperatura ambiente.

Luego el ADN exógeno se precipita hacia las micropartículas y, para este propósito, una parte alícuota de 50µl de la suspensión de micropartículas (60mg/ml) se transfiere a un tubo de microcentrifugación. Se agregan de 5 a 8 ml de ADN (lmg/µl) . La mezcla se homogeneiza rápidamente (durante 3-5 segundos) al agitar la parte externa del tubo con ayuda de los dedos. Se agregan 50µl de CaCl2 2.5M, se homogeneiza rápidamente y se agregan 20µl de espermidina O.lM (Sigma S-0266) , el cual es un reactivo oxidable extremadamente higroscópico.

La mezcla resultante se incuba a temperatura ambiente bajo una agitación lenta durante 10 minutos, se centrifuga durante 10 segundos y el sobrenadante se remueve cuidadosamente. Se agregan 150 µl de etanol absoluto, y luego la parte externa del tubo se agita de nuevo con la ayuda de los dedos. La mezcla resultante se centrifuga a 15,000 g durante 10 segundos, el sobrenadante se remueve. El paso precedente se repite, agregando 24 µl de etanol absoluto, después se homogeneiza vigorosamente y se somete a un tratamiento por sonicación durante 1-2 segundos.

Luego se distribuyen muestras de 3.2 µl de la solución en la región central de cada membrana portadora previamente colocada en el soporte membranal. Cada precipitación es suficiente para preparar 6 membranas portadoras que contienen micropartículas recubiertas con el ADN de interés. Los discos que contienen las micropartículas recubiertas con ADN se almacenan inmediatamente en una placa que contiene un material absorbente (gel de sílice) y se coloca en un evaporador.

El bombardeo de la región meristemática apical del eje embriónico de las plantas leguminosas se llevó a cabo con un acelerador de micropartículas que utiliza una alta presión de gas de helio, como se describe en Arag©o et al - 1996.

Ejemplo 1: Obtención de plantas transgénicas de soya { Glycine max. (L.) Merril), mediante la selección con el herbicida Imazapyr Inmediatamente después del bombardeo del eje embriónico con las micropartículas recubiertas con el ADN exógeno que imparte resistencia al Imazapyr, el eje embriónico se transfiere del medio de bombardeo (BM) a las placas de cultivo que contienen un medio de inducción de retoñamiento múltiple (IM) (medio MS suplementado con 22.2 µl de BAP, 3% de sucrosa, 0.6% de agar, a un pH de 5.7) . El eje embriónico bombardeado permanece sumergido en el IM durante 16-24 horas en condiciones de obscuridad, a 27°C a fin de inducir el retoñamiento múltiple. Luego de que pasa este periodo de tiempo, el eje embriónico se transfiere a placas con el medio de cultivo que contiene el herbicida (CMH) (medio SM, 3% de sucrosa, 500-1000 nM de Imazapyr, 0.7% de agar, a un pH de 5.7) y se mantiene en una cámara de crecimiento a una temperatura de 27°C durante 16 horas de fotoperiodo (50 umoles m-2s-l) hasta la inducción del retoñamiento múltiple.

Los retoños que alcanzan 2-4 cm de longitud se transfieren al medio de cultivo MS1S (MS, 1% de sucrosa, 0.8% de agar, pH 5.7), durante un fotoperiodo durante 16 horas (50µmoles nf s_1) a 27°C para permitir que las plantitas crezcan y echen raíces. Se remueve una sección de 1 mm a partir de la base del tallo y hoja para el análisis de la expresión de un gen exógeno. Los retoños que expresan para un ADN exógeno se registran individualmente y se transfieren a una nueva matraz de cultivo. Una vez que las plantitas han echado raíces, se transfieren a contenedores que contienen tierra esterilizada en autoclave: mezcla (1:1) de vermiculita.

Las plantitas se cubren con una bolsa de plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días . La banda elástica se retira y luego de 6-7 días la bolsa de plástico también se retira. Las plantitas se transfieren a contenedores que contienen tierra para la producción de semillas.

Ejemplo 2: Obtención de plantas transgénicas de soya { Glycine max . (L.) Merril), con el herbicida Glyphosate Inmediatamente después del bombardeo del eje embriónico con las micropartículas recubiertas con un ADN exógeno que imparte resistencia al Glyphosate, el eje embriónico se transfiere del medio de bombardeo (BM) .a placas de cultivo que contiene un medio de inducción múltiple de retoños (IM) (medio MS suplementado con 22.2µl de BAP, 3% de sucrosa, 0.6% de agar, a un pH de 5.7). El eje embriónico bombardeado permanece sumergido en el IM durante 16-24 horas en condiciones de obscuridad, a 27°C a fin de inducir el retoñamiento múltiple. Luego de que pasa este periodo de tiempo, el eje embriónico se transfiere a placas con el medio de cultivo que contiene el herbicida (CMH) (medio SM, 3% de sucrosa, 300-1000 nM de Glyphosate, 0.7% de agar, a un pH de 5.7) y se mantiene en una cámara de crecimiento a una temperatura de 27 °C durante 16 horas de fotoperiodo (50µmoles m"2s_1) hasta la inducción de retoños múltiples.

Los retoños que alcanzan de 2-4 cm de longitud se transfieren a un medio de cultivo MS1S (MS, 1% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante un fotoperiodo de 16 horas (50 µmoles m"2s_1) a 27°C para permitir que las plantitas crezcan y enraizen. Se remueve una sección de 1 mm a partir de la base del tallo y hoja para el análisis de la expresión para un gen exógeno. Los retoños que expresan para el ADN exógeno se registran individualmente y se transfieren a una nueva matraz de cultivo. Una vez que las plantitas han enraizado, se transfieren a contenedores que contienen tierra esterilizada en autoclave: mezcla (1:1) de vermiculita.

Las plantitas se recubren con una bolsa de plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días. La banda elástica se remueve y luego de 6 a 7 días la bolsa de plástico también se remueve. Las plantitas se transfieren a contenedores de tierra para la producción de semillas.

Ejemplo 3: Obtención de plantas transgénicas de frijol { Phaseol us vulgaris L.), mediante la selección con el herbicida Imazapyr Inmediatamente después del bombardeo del eje embriónico con las micropartículas recubiertas con el ADN exógeno que imparte resistencia al Imazapyr, el eje embriónico se cultiva en el mismo medio de cultivo (BM) durante 7 días a una temperatura de 27°C durante 16 horas de fotoperiodo (50µmoles m~2s_1) para inducir retoños múltiples. Luego de este periodo, el eje embriónico que germina se transfiere a una caja tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MSBH (medio MS suplementado con 44.2µm de BAP, 3% de sucrosa, 100-500 nM de Imazapyr, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante 7 días a una temperatura de 27 °C durante 16 horas de fotoperiodo (50 µmoles m_2s"1) para reducir el número total de retoños múltiples. Luego el eje embriónico se transfiere otra vez a la caja de cultivo tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MS3S (MS suplementado con 44.2 µm de BAP, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7) a una temperatura de 27°C durante 16 horas de fotoperiodo ( 50 µmoles m"2s_1) para permitir la elongación de los retoños múltiples. Luego de dos semanas los ejes de los embriones comienzan a producir retoños.

Los retoños que alcanzan 2-4 cm de longitud se transfieren a un medio de cultivo MS1S (SM, 1% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante un fotoperiodo de 16 horas (50 µmoles m"2s_:L) a 27°C para permitir que las plantitas crezcan y enraizen. Una sección de 1 mm se remueve de la base del tallo y hoja para el análisis de la expresión para un gen exógeno. Los retoños que expresan para un ADN exógeno se registran individualmente y se transfieren a una nueva matraz de cultivo. Una vez que las plantitas han enraizado, se transfieren a contenedores que contienen tierra esterilizada en autoclave: mezcla (1:1) de vermiculita.

Las plantitas se cubren con una bolsa de plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días. La banda elástica se retira y luego de 6-7 días la bolsa de plástico también se retira. Las plantitas se transfieren a contenedores que contienen tierra para la producción de semillas.

Ejemplo 4: Obtención de plantas transgénicas de frijol { Phaseolus vulgaris L.) , mediante la selección con el herbicida Glyphosate Inmediatamente después del bombardeo del eje embriónico con las micropartículas recubiertas con el ADN exógeno que imparte resistencia al Glyphosate, el eje embriónico se cultiva en el mismo medio de cultivo (BM) durante 7 días a una temperatura de 27 °C durante 16 horas de fotoperiodo (50µmoles m"2s""1) para inducir retoños múltiples. Luego de este periodo, el eje embriónico que germina se transfiere a una caja tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MSBH (medio MS suplementado con 44.2µm de BAP, 3% de sucrosa, 200-1000 nM de Glyphosate, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante 7 días a una temperatura de 27 °C durante 16 horas de fotoperiodo (50 µmoles ?rf2s_1) para reducir el número total de retoños múltiples. Luego, el eje embriónico se transfiere otra vez a la caja de cultivo tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MS3S (MS suplementado con 44.2 µm de BAP, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7) a una temperatura de 27°C durante 16 horas de fotoperiodo ( 50 µmoles m"2s"1) para permitir la elongación de los retoños múltiples. Luego de dos semanas los ejes de los embriones comienzan a producir retoños.

Los retoños que alcanzan de 2-4 cm de longitud se transfieren a un medio de cultivo MS1S (MS, 1% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante un fotoperiodo de 16 horas (50 µmoles m~2s_1) a 27°C para permitir que las plantitas crezcan y enraizen. Una sección de 1 mm se remueve de la base del tallo y hoja para el análisis de la expresión para un gen exógeno. Los retoños que expresan para un ADN exógeno se registran individualmente y se transfieren a una nueva matraz de cultivo. Una vez que las plantitas han enraizado, se transfieren a contenedores que contienen tierra esterilizada en autoclave: mezcla (1:1) de vermiculita.

Las plantitas se cubren con una bolsa de plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días . La banda elástica se retira y luego de 6-7 días la bolsa de plástico también se retira. Las plantitas se transfieren a contenedores que contienen tierra para la producción de semillas.

Ejemplo 5: Obtención de plantas transgénicas de semillas de caupí ( Vi gnia ungui cula ta ) , a través de la selección con el herbicida Imazapyr Inmediatamente después del bombardeo del eje embriónico con las micropartículas recubiertas con el ADN exógeno que imparte resistencia al Imazapyr, el eje embriónico se cultiva en el mismo medio de cultivo (MB) durante 7 días a una temperatura de 27°C durante 16 horas de fotoperiodo (50µmoles m"2s_1) para inducir retoños múltiples. Luego de este periodo, el eje embriónico que germina se transfiere a una caja tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MSBH (medio MS suplementado con 5-50 µM de BAP, 3% de sucrosa, 100-500 nM de IMAZAPYR, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante 7 días a una temperatura de 27°C durante 16 horas de fotoperiodo (50 µmoles m~2s_1) para reducir el número total de retoños múltiples. Luego el eje embriónico se transfiere otra vez a la caja de cultivo tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MS3S (MS suplementado con 20-50 µm de BAP, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7) a una temperatura de 27°C durante 16 horas de fotoperiodo ( 50 µmoles m"2s_1) para permitir la elongación de los retoños múltiples. Luego de dos semanas los ejes de los embriones comienzan a producir retoños.

Los retoños que alcanzan de 2-4 cm de longitud se transfieren a un medio de cultivo MS1S (MS, 1% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante un fotoperiodo de 16 horas (50 µmoles m"2s_1) a 27°C para permitir que las plantitas crezcan y enraizen. Una sección de 1 mm se remueve de la base del tallo y hoja para el análisis de la expresión para un gen exógeno. Los retoños que expresan para un ADN exógeno se registran individualmente y se transfieren a una nueva matraz de cultivo. Una vez que las plantitas han enraizado, se transfieren a contenedores que contienen tierra esterilizada en autoclave: mezcla (1:1) de vermiculita.

Las plantitas se cubren con una bolsa de plástico sellada con una banda elástica durante 7 días. La banda elástica se retira y luego de 6-7 días la bolsa de plástico también se retira. Las plantitas se transfieren a contenedores que contienen tierra para la producción de semillas.

Ejemplo 6: Obtención de plantas transgénicas de caupí { Vignia ungui cula ta ) , a través de la selección con el herbicida Glyphosate Inmediatamente después del bombardeo del eje embriónico con las micropartículas recubiertas con el ADN exógeno que imparte resistencia al Glyphosate, el eje e briónico se cultiva en el mismo medio de cultivo (BM) durante 7 días a una temperatura de 27°C durante 16 horas de fotoperiodo (50µmoles m"2s"1) para inducir retoños múltiples. Luego de este periodo, el eje embriónico que germina se transfiere a una caja tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MSBH (medio MS suplementado con 5-50µm de BAP, 3% de sucrosa, 200-1000 nM de Glyphosate, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante 7 días a una temperatura de 27°C durante 16 horas de fotoperiodo (50 µmoles m"2s_1) para reducir el número total de retoños múltiples. Luego el eje embriónico se transfiere otra vez a la caja de cultivo tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MS3S (MS suplementado con 20-50 µM de BAP, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7) a una temperatura de 27 °C durante 16 horas de fotoperiodo ( 50 µmoles m"2s-1) para permitir la elongación de los retoños múltiples. Luego de dos semanas los ejes de los embriones comienzan a producir retoños.

Los retoños que alcanzan 2-4 cm de longitud se transfieren a un medio de cultivo MS1S (MS, 1% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante un fotoperiodo de 16 horas (50 µmoles ?rf2s_:L) a 27°C para permitir que las plantitas crezcan y enraizen. Una sección de 1 mm se remueve de la base del tallo y hoja para el análisis de la expresión para un gen exógeno.

Los retoños que expresan para un ADN exógeno se registran individualmente y se transfieren a una nueva matraz de cultivo. Una vez que las plantitas han enraizado, se transfieren a contenedores que contienen tierra esterilizada en autoclave: mezcla (1:1) de vermiculita.

Las plantitas se cubren con una bolsa de plástico sellada con una banda elástica durante 7 días. La banda elástica se retira y luego de 6-7 días la bolsa de plástico también se retira. Las plantitas se transfieren a contenedores que contienen tierra para la producción de semillas.

Ejemplo 7: Obtención de plantas transgénicas de cacahuates {Arachi s hypogea L.), a través de la selección con el herbicida Imazapyr Inmediatamente después del bombardeo del eje embriónico con las micropartículas recubiertas con el ADN exógeno que imparte resistencia al Imazapyr, el eje embriónico se cultiva en el mismo medio de cultivo (BM) durante 7 días a una temperatura de 27 °C durante 16 horas de fotoperiodo (50µmoles m"2s"1) para inducir retoños múltiples. Luego de este periodo, el eje embriónico que germina se transfiere a una caja tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MSBH (medio MS suplementado con 5-50µm de BAP, 3% de sucrosa, 100-500nM de Imazapyr, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante 7 días a una temperatura de 27 °C durante 16 horas de fotoperiodo (50 µmoles m"2s~1) para reducir el número total de retoños múltiples. Luego el eje embriónico se transfiere otra vez a la caja de cultivo tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MS3S (SM suplementado con 44.3 µM de BAP, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7) a una temperatura de 2 °C durante 16 horas de fotoperiodo ( 50 µmoles m"2s~1) para permitir la elongación de los retoños múltiples. Luego de dos semanas, los ejes de los embriones comienzan a producir retoños.

Los retoños que alcanzan de 2-4 cm de longitud se transfieren a un medio de cultivo MS1S (MS, 1% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante un fotoperiodo de 16 horas (50 µmoles m"2s_1) a 27°C para permitir que las plantitas crezcan y enraizen. Una sección de 1 mm se remueve de la base del tallo y hoja para el análisis de la expresión para un gen exógeno. Los retoños que expresan para un ADN exógeno se registran individualmente y se transfieren a una nueva matraz de cultivo. Una vez que las plantitas han enraizado, se transfieren a contenedores que contienen tierra esterilizada en autoclave: mezcla (1:1) de vermiculita.

Las plantitas se cubren con una bolsa de plástico sellada con una banda elástica durante 7 días. La banda elástica se retira y luego de 6-7 días la bolsa de plástico también se retira. Las plantitas se transfieren a contenedores que contienen tierra para la producción de semillas.

Ejemplo 8: Obtención de plantas transgénicas de cacahuates {Arachi s hypogea L.), mediante la selección con el herbicida basado en Glyphosate Inmediatamente después del bombardeo del eje embriónico con las micropartículas recubiertas con el ADN exógeno que imparte resistencia al Glyphosate, el eje embriónico se cultiva en el mismo medio de cultivo (BM) durante 7 días a una temperatura de 27 °C durante 16 horas de fotoperiodo (50µmoles m"2s_1) para inducir retoños múltiples. Luego de este periodo, el eje embriónico que germina se transfiere a una caja tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MSBH (medio MS suplementado con 5-50 uM de BAP, 3% de sucrosa, 200-1000 nM de Glyphosate, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante 7 días a una temperatura de 27°C durante 16 horas de fotoperiodo (50 µmoles m~2s_1) para reducir el número total de retoños múltiples. Luego el eje embriónico se transfiere otra vez a la caja de cultivo tipo "Magenta" que contiene el medio de cultivo MS3S (SM suplementado con 44.3 uM de BAP, 3% dé sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7) a una temperatura de 27°C durante 16 horas de fotoperiodo ( 50 µmoles m"2s_1) para permitir la elongación de los retoños múltiples. Luego de dos semanas, los ejes de los embriones comienzan a producir retoños.

Los retoños que alcanzan de 2-4 cm de longitud se transfieren a un medio de cultivo MS1S (MS, 1% de sucrosa, 0.8% de agar, a un pH de 5.7), durante un fotoperiodo de 16 horas (50 µmoles m"2s_1) a 27 °C para permitir que las plantitas crezcan y enraizen. Una sección de 1 mm se remueve de la base del tallo y hoja para el análisis de la expresión para un gen exógeno. Los retoños que expresan para un ADN exógeno se registran individualmente y se transfieren a ur:¡ nueva matraz de cultivo. Una vez que las plantitas han enraizado, se transfieren a contenedores que contienen tierra esterilizada en autoclave: mezcla (1:1) de vermiculita.

Las plantitas se cubren con una bolsa de plástico cerrada con una banda elástica durante 7 días. La banda elástica se retira y luego de 6-7 días la bolsa de plástico también se retira. Las plantitas se transfieren a contenedores que contienen tierra para la producción de semillas.

DECLARACIÓN QUE INCLUYE PROCESO Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de ia presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecec'-\ se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un proceso para producir plantas leguminosas transgénicas que contienen ADN exógeno, caracterizado porque comprende los pasos de: a) introducir genes exógenos en células del meristemo apical del eje embriónico de plantas leguminosas mediante el método biobalístico; b) inducir el retoñamiento múltiple de las células en la región meristemática apical modificada en el paso (a) mediante el cultivo de este eje embriónico en un inductor de retoñamiento múltiple; y c) seleccionar las células meristemáticas de la región apical como se obtiene en el paso (b) mediante otro cultivo de este eje embriónico que contiene una molécula que se concentra en la región apical meristemática de estos embriones de plantas leguminosas. Un proceso en conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente inductor de retoños múltiples es una citocinina. Un proceso en conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la citocinina es 6-benzilamino purina. Un proceso en conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la citocinina es tidiazurona. Un proceso en conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de selección del paso (c) es una molécula que se concentra en la región apical meristemática de estos embriones leguminosos . Un proceso en conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la planta leguminosas se selecciona a partir del grupo que consiste de soya, frijoles, semilla de caupí, y cacahuates. UN PROCESO PARA OBTENER PLANTAS LEGUMINOSAS TRANSGENICAS (LEGUMINOSAE) QUE CONTIENEN ADN EXOGENO RESUMEN La presente invención se refiere a un proceso para producir plantas leguminosas transgénicas que contienen ADN exógeno y comprende los pasos de: a) introducir genes exógenos en células del meristemo apical del eje embriónico de plantas leguminosas mediante el método biobalístico; b) inducir el retoñamiento múltiple de las células en la región meristemática apical modificada en el paso anterior mediante el cultivo de los ejes embriónicos en un medio que contenga un inductor de retoños múltiples; y c) seleccionar las células meristemáticas de la región apical transformadas por otro cultivo de estos ejes embriónicos que contienen una molécula que se concentra en la región apical meristemática de estos embriones de plantas leguminosas.