CN1191364C - 获得含有外源dna的转基因豆科植物(豆科)的方法 - Google Patents

获得含有外源dna的转基因豆科植物(豆科)的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1191364C
CN1191364C CNB97182469XA CN97182469A CN1191364C CN 1191364 C CN1191364 C CN 1191364C CN B97182469X A CNB97182469X A CN B97182469XA CN 97182469 A CN97182469 A CN 97182469A CN 1191364 C CN1191364 C CN 1191364C
Authority
CN
China
Prior art keywords
weedicide
substratum
leguminous plants
plumular axis
bud
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB97182469XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN1276015A (zh
Inventor
E·L·雷克菲霍
F·J·利马阿拉格奥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EMBRAPA-EMPRESA BRUSILEIRA DE PESQUISA AGROPECUARIA
Original Assignee
EMBRAPA-EMPRESA BRUSILEIRA DE PESQUISA AGROPECUARIA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EMBRAPA-EMPRESA BRUSILEIRA DE PESQUISA AGROPECUARIA filed Critical EMBRAPA-EMPRESA BRUSILEIRA DE PESQUISA AGROPECUARIA
Publication of CN1276015A publication Critical patent/CN1276015A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1191364C publication Critical patent/CN1191364C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Abstract

本发明涉及生产含有外源DNA的转基因豆科植物的方法，其步骤包括通过生物弹道方法将外源基因引入豆科植物胚轴的顶端分生细胞，通过在含有多发芽诱导剂的培养基中培养胚轴诱导在前一步修饰的顶端分生区细胞产生多发芽，通过在含有集中在所说豆科植物胚的顶端分生区的分子的培养基中进一步培养所说的胚轴进行转化。

Description

获得含有外源DNA的 转基因豆科植物(豆科)的方法
发明领域
本发明涉及利用生物弹道将外源基因引入植物组织和通过转化的组织再生获得转基因的豆科植物
发明背景
利用遗传工程技术引入负责目的农学特性的基因可能有利于开发豆科植物新变种。转基因植物的获得需要将外源DNA引入植物组织并且从这种遗传转化组织再生整株植物。对于要转化的物种，各种类型的组织均可用来引入外源DNA，分生组织优选应用在各种转化方法中，首先是由于从这种类型的组织植物易于再生。各种工艺用来将外源基因引入豆科植物顶端分生细胞，其中指出下面几点：a)农杆菌系统；b)组织电穿孔系统和c)生物弹道系统。外源DNA引入和整合到豆科植物细胞中已由许多科学家证明和在不同的出版物上描述。例如(Aragao F.J.L.，Grossi-de-Sa M.F.，Almeida E.R，Rech E.L.(1992)；在豆子(菜豆)富含甲硫氨酸白蛋白的巴西坚果中粒子轰击介导的表达；植物分子生物学20：357-259，Lewis，M.F.& Bliss F.A.(1994)；接种有根癌农杆菌的菜豆中肿瘤形成和β-葡糖醛酸酶的表达。美国园艺科学协会杂志；119：361-366，Dillen W.Engler G，Van Montagu M.&Angenon G.(1995)；电穿孔法介导的DNA导入豆菜(普通豆)的种子组织，植物细胞通报，15：119-124)。
然而，遗传转化组织的低获取率，从所说转化组织中可育植物低的再生能力，以及所用的转化方法的效力依赖于基因型，均导致很难获得转基因的豆科植物(Brasileiro A.C.M.；Aragao F.J.L.；Rossi S.DussiD.M.A.；Barros L.M.G.；& Rech E.L.(1996)普通和宽叶菜豆对农杆菌株的敏感性和用微粒轰击改进农杆菌介导的转化。美国园艺科学学会杂志12：810-815和Dillen W.；Van Montagu M. & Angenon G.(1995)电子穿孔法介导的DNA传递进豆科(普通豆)籽苗组织中。植物细胞通报15：119-124)。
在80年代末由于生物弹道方法的开发直接将基因引入植物细胞(Sanford J.C.Klein T.M.，Wolf E.D. & Allen N.(1987)，用粒子轰击方法将物质引入细胞组织；粒子科学和技术杂志，5：27-37)已获得了大量的多种转基因植物，包括那些已证明用其他方法不能转化的物种。这就导致在任何类型植物组织中导入和表达外源基因成为可能。因此，任何类型的组织具有用合适的转化再生成一个完整的可育植物的潜能。
生物弹道(biobaListic)方法由Sanford的关于将遗传物质引入高等植物核基因组的综述所建议。从此，它应用的广泛性被推崇，并且在向细菌，后在动物，菌类、藻类、昆虫、植物和动物组织以及在分离的诸如叶绿体和线粒体的细胞器中引入和表达基因被证明是一个有效和简单的方法，这是根据由Sanford J.C，Smith F.D.和Russel J.A.(1993)的观察结果证明的，用于不同生物学应用的优化生物弹道方法，酶学方法217；413-510。更具体的文献，这儿有几个其他应用生物弹道获得转基因生物的例子，例如：英国专利5,565,346，US 5,489,520和WO96/04392，等其它文献。
以高速加速的生物弹道微粒用来在体内运输和引入核酸和其它物质到细胞和组织中(Rech E.L. & Aragao F.J.L.(1997)。生物弹道方法，在Brasileiro A.C.M. & Carneiro V.T.C.(Ed)-植物遗传转化手册：EMBRAPA/Cenargen。这种方法也称为微粒轰击法，“基因枪”法，微粒加速法等等。已开发和构建了能加速微粒(由钨或金制成)的各种系统，其中微粒包有核酸序列，速度超过每小时1500千米。所有系统都基于高能的振动波的形成以替代含有包含DNA的微粒的运载膜。振动波可以通过化学爆破(干粉枪)，在高压下氦气放电产生。以及在高电压和低电容或低电压和高电容下通过电子放电汽化水滴来形成。
那些用高压氦气和电子放电的系统已显示可制用宽光谱。加速粒子以非致死的方式穿过细胞壁和膜。随机定位于细胞器。然后在细胞液的作用下DNA从微粒中释放出来，从而发生外源DNA整合到要被修饰的生物体的基因组中(Yamashita T.lada，A. & Morikawa H.(1991)。证据表明在他们的核中超过90％表达β-葡糖醛酸酶细胞在直接粒子轰击后接收了外源基因；植物生理学。97：829-831)。
虽然生物弹道方法被有效和广泛利用，但它依赖于各种外部的和生物参数的最佳组合，这是有效地向植物组织引入异源性基因的基础。
从胚轴的顶端区域获得转基因植物，有两个必须的要求，即：1)外源基因高频地导入顶端区域细胞中，并且外源基因整合到植物基因组，和2)从所得转化细胞再生和生产可育的转基因植物。
由生物弹道方法的开发，顶端分生组织细胞原位直接转化成为可能。然而，可育转基因植物的开发与生产要求从这些转化细胞再生和生产植物。
在近几十年间，多种尝试想由商业重要的豆科植物获得再生可育植物。虽然很多进一步工作已完成，但没有得到有效的积极结果。例如：在不同豆科植物顶端和侧面分生组织复合芽的一些生物方法已经开发，然而，这些系统低存在严重缺陷。
其他某种豆科植物如花生和大豆的再生系统开发包括在高剂量2.4-D中从培养的成熟和未成熟胚中引入体细胞胚胎发生。然而，这种系统的粒子使用由于它局限于可鉴别品种从而受限制，另外事实上不想遗传变异的(体细胞无性系变异)引入也会发生，结果导致转基因植物固有的农学特性发生了变化。
因此，获得转基因豆科植物已知系统是基于顶端分生细胞的转化，通过生物弹道方法出现了转化细胞不可选择的缺陷，转基因植物低的产生率和嵌合体(带有一些转基因细胞和其他非转基因细胞的器官式组织的植物)高产生率。
从而，本发明的主题是提供获取含有外源DNA转基因豆科植物的高产率方法。并且能选择转化细胞，后者保留植物原始的农学特征。
发明概述
本发明涉及含有外源DNA的转基因豆科植物的生产方法，它包括如下步骤：
a)通过生物弹道方法将外源基因引入豆科植物胚轴顶端分生细胞；
b)通过在含有多发芽诱导子培养基中培养所说的胚轴诱导步骤
(a)中修饰的顶端分生区细胞产生多个芽；和
c)通过在含有一种分子的培养基中进一步培养所说的胚轴选择在步骤(b)中得到的顶端区域的分生细胞，其中该分子集中在所说的豆科植物胚顶端分生区。
发明详述
现在已有惊人的发现，用于转化豆科植物的生物弹道方法，即通过引入外源DNA到豆科植物顶端分生区，结合进一步的多发芽步骤和随后的转化植物选择，特别是经过使用为了这一目的的所说细胞的胚轴能使转基因植物再生和生产，其产率能有10％。这个值表明产率大小比现在已知方法所得产率(其产率约0.030％-0.050％)约高200倍。另外，本发明的方法能使转基因植物的获得时间比以前文献描述的方法时间短。
本发明所声明的方法适合于任何豆科植物如大豆、菜豆、豇豆和花生的转化、再生和选择。
按照本发明，要转化的豆科植物顶端分生细胞的胚轴在实验室以传统方法制备用于轰击(生物弹道)方法。当然，用来轰击的基因依赖于所提每种方法的具体目的，也就是说，它们将会按照试图传给转化的植物的新特征进行选择。例于，在实际中，该方法的目的是要得到耐除草剂的植物，传递如耐除草剂的基因就会被应用。
在轰击之后，胚轴与含有多发芽诱导子的培养基接触且能够在这培养基中保留一段时间以有效地保证所希望的诱导，优选的时间在16-120小时。在本发明优选的实施方案中，细胞生长素，名为6-苄氨基嘌呤(BAP)或tidiazuron(TDZ)用作多发芽诱导剂。本发明另外的优点是现在所声明的方法使多发芽能在相对短的时间内完成，因此避免了其它已知方法普遍发生的遗传变种的发生。
多发芽诱导一段时间后，胚轴应转移到另外的含有将促进转化的细胞选择的培养基中。象在轰击方法中，选择试剂将按该方法的最后目的选择。在转基因植物实例中，转基因植物是转入有耐除草剂的，选择剂将是除草剂，其植物就会发展为耐受性的。本发明方法具体使用的除草剂实例中，除草剂是草甘膦(购自Monsanto公司也称“Round up”)和从咪唑啉酮类如灭草烟(购自美国Cyanamid公司)。在选择转化的细胞步骤期间，一种分子集中在豆科植物胚顶端分生区，如上述的除草剂，例如，被通过胚轴的导管系统运输，然后集中在顶端分生区。因此，可能实现无害于胚轴的细胞的选择。
本发明能在下面给出的实施例帮助下更好的理解，其仅是说明，且描述的参数和条件不应看作本发明的限制。
实施例
轰击(生物弹道)用胚轴的制备
选自大豆、菜豆和花生的成熟豆科植物种子，在70％乙醇消毒1分钟和1.00％次氯酸钠中消毒20-30分钟。消毒的种子用无菌蒸馏水洗并在无菌水室温培养16-18小时。
然后打开种子除去胚轴。切开子叶以暴露顶端分生区。在菜豆的实例中，胚根部分也要切开而对于豆科其他植物则没必要切开胚根。
豆科中黑豆和大豆胚轴的顶端分生区在图1和2分别说明。图1A特别显示顶端分生区的顶端分生区而图1B说明用于轰击的外植体的加工，为暴露顶端分生组织除去子叶和除去胚根。
胚轴用0.1％次氯酸钠消毒10分钟且用无菌蒸馏水洗3次。然后胚轴置于含有轰击培养基的培养皿中(10-15个胚轴/皿)，所说的轰击培养基(本文后面称BM)由Murashig和Skoog(1962)培养基(本文称为MS)组成。补充了3％蔗糖，0.7％植物胶，pH5.7。胚轴排成等距离的一圈，离培养皿中心6-12mm且顶端分生区向上。
放置胚轴后，在立体显微镜下观察，顶端分生区由液体膜覆盖，因此，在轰击之前，打开培养皿盖在层流下1-2分钟，以防止顶端分生区表面液膜减少微粒穿透力且随之降低转基因表达的水平。
一旦被转化的材料放在含有BM培养基的盘中，就用目的基因进行轰击。在这个事例中，各种含有基因的载体就会产生对用过的草甘膦和灭草烟除草剂的耐受性。
微粒的制备
用来运输外源DNA到细胞的微粒是无菌和洗涤过的。称钨M10(Sylvania)或金(Aldrich，32，6585)微粒60mg，转到微离心管中，加入1.0ml，70％乙醇。混合物在剧烈搅拌且在搅拌子低速下保持15分钟。15,000g离心5分钟，上清除去和用1000μl微量移液器移去。加入1ml无菌蒸馏水且按前面的步骤在搅拌器中严格混合和离心。除去上清液，重复洗两次或更多次。
洗最后一遍后，除去上清液，微粒又悬浮在1ml的50％甘油(v/v)中。同等的甘油和蒸馏水混合，混合物高压灭菌，室温保存。
然后，外源DNA被沉积到微粒上，为了这个目的，微粒悬浮物(60mg/ml)分50μl的等份转移到微离心管中。加入5-gml DNA(1mg/μl)。混合物通过用手指搅拌试管外面部分快速匀浆(3-5秒)，加入2.5M氯化钙50μl，快速匀浆，加入0.1M(Sigmau S-0266)亚精胺20μl，它是极端吸湿和可氧化剂。
所得混合物室温下，低速搅拌10分钟，离心10秒仔细除去上清的情况下培养，加入150μl无水乙醇，然后用手指再搅拌试管外面部分。所得混合物15000g离心10秒，除去上清。进一步重复，加24μl无水乙醇，剧烈匀浆和超声1-2秒。
3.2μl溶液样品分布在事先放在膜支持物上的各载体膜的中间区。每次沉淀足以制备含有覆盖目的DNA微粒的6个转运膜。含有覆盖有DNA的微粒的圆片立即贮存在含有干燥物质(硅胶)的平板上且放在干燥器中。
豆科植物胚轴顶端分生区轰击由一个微粒加速器实现，这个加速器运用了高压氦气，如1996年Aragao等描述的一样。
实施例1：通过灭草烟除草剂选择获得转基因大豆(Glycine max. (L.)Merril)
在用覆盖有提供灭草烟耐受性的外源DNA的微粒轰击胚轴后，立刻将胚轴从轰击培养基(BM)转移到含有多发芽诱导培养基(IM)的培养皿中(MS培养基添加有22.2μl BAP，3％蔗糖，0.6％琼脂，pH5.7)。已轰击的胚轴持续浸在IM中16-24小时，不见光，27℃以便诱导多发芽。这个时期过后，胚轴转到含有除草剂的培养基(CMH)的培养皿中(SM培养基，3％蔗糖，500-1000nM的灭草烟，0.7％琼脂，pH5.7)且保存在生长箱中，27℃和16小时光周期(50umols m-2s-1)直到诱导出多个芽。
芽长到2-3cm长时转移到培养基MSIS(MS，1％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)，条件16小时光周期(50umols m-2s-1)，27℃到能使小植物生长和生根。从茎和叶基部取1mm的一段以分析外源基因表达。表达了外源DNA的芽逐一登记且转移到一新培养瓶中。一旦小植物生根，它们就被转移到含有高压灭菌土∶蛭石(1∶1)混合物的容器中。
将小植物封在用弹性带封口的塑料袋中7天，移去弹性带且6-7天后再拿走塑料袋。小植物被转移到含有土的容器中以生产种子。
实施例2：用除草剂草甘膦获得转基因大豆(Glycine max.(L.)Merril)
在用覆盖有提供对草甘膦耐受性的外源DNA的微粒轰击胚轴后，立即将胚轴从轰击培养基(BM)转移到含有多发芽诱导培养基(IM)中(MS培养基添有22.2μl BAP，3％蔗糖，0.6％琼脂，pH5.7)。已轰击的胚轴持续浸在IM中16-24小时，不见光，27℃以诱导多发芽。这个时期过后，胚轴转移到含有除草剂的培养基(CMH)的培养皿中(SM培养基，3％蔗糖，300-1000nM的草甘膦，0.7％琼脂，pH5.7)且保持27℃，光周期16小时(50umols m-2s-1)的生长箱中直到多发芽诱导成功。
芽长到2-4cm时转移到培养基MSIS中(MS培养基1％蔗糖、0.8琼脂，pH5.7)，16小时光周期(50umols m-2s-1)，27℃以能使小植物生长和生根。从茎和叶基部取去1mm的一段以分析外源基因的表达。表达外源DNA的芽逐一登记和转移到新的培养瓶中。一旦小植物生根，他们就被转移到含有高压灭菌的土∶蛭石(1∶1)混合物的容器中。
将小植物装在用弹性带封口的塑料袋中7天。除去弹性带且6-7天后也除去塑料袋。将小植物转移到含有土的容器中以产生种子。
实施例3：通过除草剂灭草烟选择获得转基因菜豆(Phaseolus vulgaris L.)
在用覆盖有提供对灭草烟耐受性的外源DNA的微粒轰击胚轴后，立即将胚轴培养在同样的培养基中7天，温度27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以诱导多发芽。这段时期后，胚轴发芽后转入含有培养基MSBH(MS培养基添加44.2μM BAP，3％蔗糖，100-500nM灭草烟，0.8％琼脂，pH5.7)的“Magenta”型盒中，27℃，7天，16小时光周期(50umols m-2s-1)以减少多发芽总数。然后胚轴又转移到含有培养基MS3S的“Magenta”型培养箱(SM培养基添加44.2μM BAP，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)，27℃16小时光周期(50umols m-2s-1)以使多个芽伸长。两周后胚轴开始发芽。
芽长到2-4cm长就转移到培养基MSIS(MS，1％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)，16小时光周期(50umols m-2s-1)，27℃以能使小植物生长发根。从茎和叶基部取去1mm的一小段以分析外源基因的表达。表达了外源DNA的芽逐一登记后转移到新的培养瓶中。一旦小植物生根，它们就被转移到含有高压灭菌的土∶蛭石(1∶1)混合物的容器中。
小植物装在用弹性带封口的塑料袋7天。拿走弹性带，过6-7天后，塑料袋也拿走。将小植物转移到有土的容器中以产生种子。
实施例4：通过除草剂草甘膦选择获得转基因菜豆(Phaseolus vulgaris L.)
在用覆盖有提供对草甘膦耐受性的外源DNA的微粒轰击胚轴后，立即将胚轴放在同样的培养基(BM)中7天，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以诱导多发芽。过这个时期后，胚轴发芽后就转移到含有培养基MSBH的“Mogenta”型箱中(MS培养基添加有44.2μM BAP，3％蔗糖，200-1000nM Glgphosate，0.8％琼脂，pH5.7)，27℃，7天，16小时光周期(50umols m-2s-1)以减少多发芽总数。然后，胚轴又转移到含有培养基MS3S的“Magenta”型培养箱中(SM添加有44.2μM BAP，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以使多个芽伸长。两周后，胚轴开始发芽。
芽长到2-4cm长时转移培养基MSIS(MS，1％的蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)，16小时光周期(50umols m-2s-1)，27℃以使小植物生长和生根。从茎和叶的基部取出1mm长的一段以分析外源基因的表达。表达了外源DNA的芽逐一登记且转移到一新的培养瓶中。一旦小植物生根，它们就被转移到含有高压灭菌的土∶蛭石(1∶1)混合物的容器中。
小植物装在用弹性带封口的塑料袋中7天，弹性带被除去且6-7天后塑料袋也除去。小植物转移到含有土的容器中以生产种子。
实施例5：通过除草剂灭草烟选择获得转基因的豇豆(Vignia unguiculata)
用覆盖有提供对灭草烟耐受性的外源DNA的微粒轰击胚轴后，立即将胚轴放在同样的培养基(MB)中，27℃，16小时光周期(50umolsm-2s-1)中7天以诱导多发芽。过这个时期后，发芽的胚轴转移到含有培养基MSBH的“magenta”型培养箱中(MS培养基添加5-50μMBAP，3％蔗糖，100-500nM灭草烟，0.8％琼脂，pH5.7)，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)7天以减少多发芽总数。然后，胚轴再被转移到含有培养基MS3S(补充了20-50μM BAP，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7的MS)的“Magenta”型培养箱中，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以使多个芽伸长。两周后，胚轴开始发芽。
将达到2-4cm长的芽转移到培养基MSIS(MS，1％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)中，27℃下使用16小时光周期(50umols m-2s-1)以使小植物生长并发根。从茎和叶的基部取出1mm长的片段用于分析外源基因的表达，表达外源DNA的芽逐个登记并转移到新的培养瓶中。一旦小植株生根，将它们转移进含高压灭菌土∶蛭石(1∶1)混合物的容器中。
将小植物装在用弹性带封口的塑料袋中7天。除去弹性带，6-7天后塑料袋也除去。小植物转移到含有土的容器中以生产种子。
实施例6：通过除草剂草甘膦选择获得转基因豇豆(Vignia unguiculata)
一旦用提供对草甘膦耐受性的外源DNA覆盖的微粒轰击胚轴后，立即将胚轴放在同样的培养基(BM)中培养7天，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以诱导多发芽生成。这个时期后，发芽的胚轴转移到含有培养基MSBH(MS培养基添加了5-50μM BAP，3％蔗糖，200-1000nM草甘膦，0.8％琼脂，pH5.7)的“Magenta”型箱中，7天，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以减少多发芽总数。然后，胚轴再转移到含有培养基MS3S(MS添加了20-50μM BAP，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)的“Mageata”型培养箱中，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以使多个芽伸长。两周后，胚轴开始发芽。
芽长到2-4 cm长时转移到培养基MSIS(MS，1％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)，16小时光周期(50umols m-2s-1)27℃以使小植物生长和发根。从茎到叶基部的1mm段切去以分析外源基因的表达。表达了外源DNA的芽逐个登记转移到一新的培养瓶中。一旦小植物生根，它们就被转移到含有高压灭菌土∶蛭石(1∶1)的混合物的容器中。
小植物放在用弹性带封口的塑料袋中7天。除去弹性袋和6-7天后也除去塑料袋。小植物转移到有土的容器中去生产种子。
实施例7：通过除草剂灭草烟选择获得转基因花生(Arachis hypogea L.)
用覆盖有提供对灭草烟耐受性的外源DNA的微粒轰击胚轴后，立即将胚轴放在同样的培养基(BM)中培养7天，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以诱导多发芽。过这时期后，胚轴发芽就转移到含有培养基MSBH(MS培养基添加5-50μM BAP，3％蔗糖，100-500nM的灭草烟，0.8％琼脂，pH5.7)“Magenta”型箱中培养，7天，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以减少多发芽总数。然后胚轴再转移到含有培养基MS3S(MS加上44.3μM BAP，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)的“Magenta”型培养箱中，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)培养以能使多个芽伸长。两周后胚轴开始发芽。
当芽长到2-4cm时，转移到培养基MSIS(MS，1％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)中，16小时光周期(50umols m-2s-1)，27℃以使小植物生长和生根。1mm的一段被从茎和叶的基部取出以分析外源基因的表达。表达了外源DNA的芽逐一登记且转移到新的培养瓶中。一旦小植物生根，它们就被转移到含有高压灭菌土∶蛭石(1∶1)混合物的容器中。
小植物封在用弹性带封口的塑料袋中7天。除去弹性带的6-7天后也除去塑料袋口。小植物转移到有土的容器中以产生种子。
9
用覆盖有提供对草甘膦耐受性的外源DNA的微粒轰击胚轴后，立即将胚轴放在同样的培养基(BM)中培养7天，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以诱导多个芽产生。过这个时期后，胚轴发芽就转移到含有培养基MSBH(MS培养基添加5-50μM BAP，3％蔗糖，200-1000nM的草甘膦，0.8％琼脂，pH5.7)的“Magenta”型培养箱培养7天，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以减少多发芽总数。然后胚轴再转移到含有培养基MS3S(MS添加44.3μM BAP，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)的“Magenta”型培养箱中培养，27℃，16小时光周期(50umols m-2s-1)以使多个芽伸长。两周后，胚轴开始发芽。
芽到2-4cm长就转移到培养基MSIS(MS，1％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7)中，16小时光周期(50umols m-2s-1)，27℃以使小植物生长和生根。1mm一般从茎和叶的基部取出以分析外源基因的表达。表达了外源DNA的芽逐一登记且转移到新的培养瓶中，一旦小植物生根，就转移到含有高压灭菌的土∶蛭石(1∶1)混合物的容器中。
将小植物封在用弹性带封口的塑料袋中7天。除去弹性带和6-7天后塑料袋也除去。小植物转移到含有土的容器中以生产种子。

Claims (9)

1.一种选择种系转化的豆科植物的方法，包括以下步骤：
(a)通过用一种DNA构建体轰击豆科植物胚轴的顶端分生组织细胞而将外源基因引入所说的植物细胞，所说的DNA构建体包含能够提供选自咪唑啉酮类或草甘膦的化学基团的除草剂耐受性的蛋白的编码序列；
(b)通过在含有细胞分裂素的培养基中培养所说的胚轴而诱导步骤(a)中的顶端分生组织转化细胞形成多个芽；和
(c)通过在含有浓度为100-1000nM，选自咪唑啉酮类或草甘膦的化学基团的除草剂的培养基上培养所说的胚轴而选择在步骤(b)中获得的分生组织细胞来源的芽。
2.权利要求1的方法，其中豆科植物选自大豆、菜豆、豇豆和花生。
3.权利要求1的方法，其中步骤(b)中使用的细胞分裂素是6-苄氨基嘌呤。
4.权利要求1的方法，其中步骤(b)中使用的细胞分裂素是tidiazuron。
5.权利要求1的方法，其中步骤(c)中使用的除草剂的浓度为500-1000nM，该除草剂选自咪唑啉酮类的化学基团，并且该豆科植物是大豆。
6.权利要求1的方法，其中步骤(c)中使用的除草剂的浓度为300-1000nM，该除草剂选自草甘膦的化学基团，并且该豆科植物是大豆。
7.权利要求1的方法，其中步骤(c)中使用的除草剂的浓度为100-500nM，该除草剂选自咪唑啉酮类的化学基团，并且该豆科植物选自菜豆、豇豆和花生。
8.权利要求1的方法，其中步骤(c)中使用的除草剂的浓度为200-1000nM，该除草剂选自草甘膦的化学基团，并且该豆科植物选自菜豆、豇豆和花生。
9.权利要求1的方法，其中作为轰击的分生组织细胞数目百分比的回收的转基因芽的频率为10％。
CNB97182469XA 1997-10-07 1997-10-07 获得含有外源dna的转基因豆科植物(豆科)的方法 Expired - Fee Related CN1191364C (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/BR1997/000053 WO1999018223A1 (en) 1997-10-07 1997-10-07 A process for obtaining transgenic leguminous plants (leguminosae) containing exogenous dna

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1276015A CN1276015A (zh) 2000-12-06
CN1191364C true CN1191364C (zh) 2005-03-02

Family

ID=4066043

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB97182469XA Expired - Fee Related CN1191364C (zh) 1997-10-07 1997-10-07 获得含有外源dna的转基因豆科植物(豆科)的方法

Country Status (14)

Country Link
US (2) US6753458B1 (zh)
EP (1) EP1019516B1 (zh)
CN (1) CN1191364C (zh)
AT (1) ATE268821T1 (zh)
AU (1) AU4545497A (zh)
BR (1) BR9714887A (zh)
CA (1) CA2305576C (zh)
DE (1) DE69729489T2 (zh)
DK (1) DK1019516T3 (zh)
ES (1) ES2223082T3 (zh)
MX (1) MX229419B (zh)
PT (1) PT1019516E (zh)
WO (1) WO1999018223A1 (zh)
ZA (1) ZA992218B (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5914451A (en) * 1998-04-06 1999-06-22 Monsanto Company Efficiency soybean transformation protocol
CN1309715A (zh) * 1999-03-19 2001-08-22 巴西农业研究公司 一种在棉花、咖啡、可可、香蕉或葡萄分生组织区选择转基因细胞的方法
US7098386B1 (en) * 2005-04-20 2006-08-29 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, Na Cowpea cultivar 92-674
US7098387B1 (en) * 2005-04-20 2006-08-29 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, Na Cowpea cultivar 95-104
MX2011003266A (es) 2008-09-26 2011-07-20 Basf Agrochemical Products Bv Mutantes de acetohidroxiacido sintasa resistentes a herbicidas y metodos de uso.
UA112969C2 (uk) 2010-08-03 2016-11-25 Сібас Юс Ллс Рослина, стійка до одного або більше ррх-інгібуючих гербіцидів, яка містить мутантний ген протопорфіриноген ix оксидази (ррх)
US20120122223A1 (en) 2010-08-03 2012-05-17 Cibus Us Llc Mutated protoporphyrinogen ix oxidase (ppx) genes
EP2734035A4 (en) 2011-07-22 2015-03-25 Basf Plant Science Co Gmbh PLANT CONVERSION METHOD
CN105358696A (zh) 2013-03-14 2016-02-24 希博斯美国有限公司 突变的丙二烯氧合酶2(aos2)基因
KR102339732B1 (ko) 2013-03-15 2021-12-15 시버스 유에스 엘엘씨 올리고뉴클레오타이드 매개 유전자 보수를 사용한 표적화된 유전자 변형의 효율을 증가시키기 위한 방법 및 조성물
US9957515B2 (en) 2013-03-15 2018-05-01 Cibus Us Llc Methods and compositions for targeted gene modification
JP6777549B2 (ja) 2014-03-14 2020-10-28 サイバス ユーエス エルエルシー オリゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復を使用した標的遺伝子修飾の効率を高めるための方法および組成物
WO2017138986A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 Cibus Us Llc Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
CN111819285A (zh) 2018-01-09 2020-10-23 希博斯美国有限公司 防碎基因和突变
CN113106118B (zh) * 2021-05-14 2023-05-12 浙江大学 一种利用草甘膦筛选豇豆遗传转化体的方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4940835A (en) * 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
US5378824A (en) * 1986-08-26 1995-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5015580A (en) * 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5565346A (en) * 1988-07-27 1996-10-15 Calgene, Inc. Transformation and regeneration system for legumes
JPH03187381A (ja) * 1989-11-17 1991-08-15 Agracetus Inc グルタミンシンテターゼインヒビター耐性に関するダイズ植物の遺伝子操作方法
US5589583A (en) 1990-01-11 1996-12-31 Monsanto Company Plant promoter
CA2036935A1 (en) * 1990-02-26 1991-08-27 Paul Christou Plant transformation process with early identification of germ line transformation events
CA2088661C (en) 1990-08-31 2001-12-18 Gerard F. Barry Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5633435A (en) * 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
CA2071767A1 (en) * 1991-06-20 1992-12-21 Praveen K. Saxena Hyperproduction of shoots during in vitro regeneration of plant
FR2736929B1 (fr) * 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn isolee pouvant servir de zone de regulation dans un gene chimere utilisable pour la transformation des plantes

Also Published As

Publication number Publication date
AU4545497A (en) 1999-04-27
DE69729489D1 (de) 2004-07-15
CA2305576C (en) 2007-05-01
MXPA00003380A (es) 2001-09-01
MX229419B (es) 2005-07-25
EP1019516A1 (en) 2000-07-19
PT1019516E (pt) 2004-09-30
ES2223082T3 (es) 2005-02-16
ATE268821T1 (de) 2004-06-15
WO1999018223A1 (en) 1999-04-15
BR9714887A (pt) 2000-08-08
EP1019516B1 (en) 2004-06-09
CA2305576A1 (en) 1999-04-15
ZA992218B (en) 1999-12-29
DE69729489T2 (de) 2005-06-30
CN1276015A (zh) 2000-12-06
US6753458B1 (en) 2004-06-22
DK1019516T3 (da) 2004-09-27
US20040268444A1 (en) 2004-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1191364C (zh) 获得含有外源dna的转基因豆科植物(豆科)的方法
AU2001279510B2 (en) Method for genetic transformation of woody trees
CA2424314C (en) Enhanced selection of genetically modified pine embryogenic tissue
CN1198655A (zh) 棉花植株的转化
HU216646B (hu) Eljárás Medicago Sativa regenerálására és idegen DNS expresszálására
CN1230547C (zh) 生产和转化木薯原生质体的方法
AU2001279510A1 (en) Method for genetic transformation of woody trees
AU2002214566A1 (en) Enhanced selection of genetically modified pine embryogenic tissue
CA2811096A1 (en) Enhanced selection of genetically modified pine embryogenic tissue
CN1149918C (zh) 农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法
Anuradha et al. Cyclic somatic embryogenesis of elite Indian cassava variety H-226
CN104871972B (zh) 有效控制西瓜不定芽水渍化现象发生的高频再生体系建立方法
Chai et al. Recent advances in transgenic orchid production
Rathore et al. Cotton (Gossypium hirsutum L.)
CN110305894B (zh) 一种快速高效的楸遗传转化方法
Sharma et al. Chickpea (Cicer arietinum L.)
CN109042297B (zh) 一种玉米自交系sl1303幼胚转化方法
Gupta Advances in biotechnology of conifers
Masanga et al. An optimized protocol for high frequency regeneration of selected groundnut (Arachis hypogaea L) varieties from East Africa using cotyledons
Simmonds Genetic transformation of soybean with biolistics
WO1997042332A2 (en) Genetically transformed cassava cells and regeneration of transgenic cassava plants
CN1309715A (zh) 一种在棉花、咖啡、可可、香蕉或葡萄分生组织区选择转基因细胞的方法
RU2278162C2 (ru) Способ получения генетически модифицированных растений сахарной свеклы с использованием agrobacterium tumefaciens
Sharma et al. Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of transformants of Brassica juncea
Sando et al. A novel method for regenerating plants from mesophyll protoplasts of Arabidopsis thaliana line WS

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20050302

Termination date: 20161007

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee