DE69325389T3 - Verfahren zur stabilen Transformation von Weizen - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Transformation und Regenera tion von fruchtbarem transformiertem Weizen.
- Weizen ist eine der wichtigsten Getreideanbauten in der Welt. Obwohl er derzeit in einem weiten Bereich von Umgebungen kultiviert wird, erfolgt die am stärksten vorherrschende Produktion von Weizen in den USA, in China, Australien, Kanada, Indien und Europa.
- Der Großteil der Weizenproduktion wird als Mehl verbraucht. Brotweizen macht ca. 80 % des Gesamtverbrauchs von Weizen aus.
- Die Entwicklung eines effizienten Transformationssystems ist notwen dig für die molekulare Analyse der Genexpression in Pflanzen. In Getreidekulturpflanzen wurde diese Entwicklung durch Schwierigkeiten verlangsamt, die bei der Pflanzenregeneration und bei der Unzugänglichkeit von einkeimblättrigen Pflanzen für die Agrobacterium-vermittelte Transformation angetroffen werden. Der meiste Fortschritt, der in der Transformation von Getreidearten gemacht wurde, war in der Erzeugung von transgenem Reis und Mais. Der Fortschritt bei Weizen wurde durch die Unfähigkeit behindert, geeignete Techniken zur Regeneration von fruchtbaren Pflanzen nach der Transformation zu etablieren.
- Es gibt eine Anzahl veröffentlichter Berichte zur transienten Expression von Fremdgenen in Weizen. Jedoch involviert der einzige Bericht über stabil transformierte Weizenpflanzen von Vasil et al. (Biotechnology 10(6); 1992, 667-74) ein arbeitsintensives Verfahren, das Transformanten mit geringer Häufigkeit liefert.
- Deshalb besteht ein Bedarf an biotechnologischen Verfahren zur Entwicklung von ertragreichen, nährstoffreichen und krankheitsresistenten Weizensorten. Solche Verfahren sind notwendig zur Ergänzung der derzeit verwendeten herkömmlichen Züchtungsverfahren.
- Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur stabilen Transformation von Weizen mit Nukleinsäuresequenzen von Interesse und zur Regeneration von fruchtbaren transgenen Weizenpflanzen gerichtet. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von stabil transformierten fruchtbaren Weizenpflanzen, wobei das Verfahren wie in Anspruch 1 definiert ist.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden unreife Embryos mit Partikel bombardiert, die mit einer DNA-Sequenz von Interesse beschichtet sind, wobei die Sequenz ein dhfr-Gen umfaßt, die bombardierten Embryos werden auf Medium kultiviert, das Methotrexat enthält, um transformiertes Gewebe zu selektieren, und fruchtbare transformierte Pflanzen werden aus dem transformierten Gewebe regeneriert. Die Weizenembryos werden unter Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbombardierung transformiert, und stabil transformierte Pflanzen werden regeneriert. Das Verfahren erzeugt stabil transformierte fruchtbare Weizenpflanzen, die Nachkommenschaft erzeugen können, die stabil transformiert ist und das Fremdgen von Interesse exprimiert.
- Ein schnelles hocheffizientes Verfahren zur stabilen Transformation von Weizenembryos und Regeneration von transgenen Weizenpflanzen wird bereitgestellt. Das Verfahren involviert die stabile Transformation eines unreifen Weizenembryos und Regeneration von Weizenpflanzen aus transformierten Weizenembryos. Zusätzlich können unter Verwendung der Verfahren der Erfindung fruchtbare transgene Weizenpflanzen zur Reife mit hoher Häufigkeit kultiviert werden. Die fruchtbaren transformierten Pflanzen können transformierte Nachkommenschaft erzeugen, die das (die) Fremdgen(e) exprimiert.
- Das Verfahren involviert das Unterwerfen von unreifen Weizenembryos der Hochgeschwindigkeits-Projektilbombardierung unter Verwendung von Nukleinsäure oder insbesondere Genen von Interesse.
- Insbesondere werden Ähren von im Gewächshaus kultivierten Weizenpflanzen ca. 10 bis 16 und allgemein ca. 12 Tage nach der Blütezeit gesammelt. Körner werden von den Ähren getrennt und oberflächensterilisiert. Embryos werden dann ausgeschnitten und auf Wachstumsmedium ausplattiert. 0 bis 10 Tage nach dem Ausschneiden wird DNA auf den Embryo unter Verwendung einer Partikelbombardierungsvorrichtung übertragen. Nach der DNA-Übertragung wird der Embryo oder der sich entwickelnde Kallus ohne Selektionsdruck aufrechterhalten, und dann wird das Gewebe in Gegenwart von Selektion regeneriert.
- Es wird durchgehend in den Schritten der Erfindung erkannt, daß das Verfahren die Kultivierung von unreifen Embryos oder sich entwickelndem Kallus auf Gewebekulturmedium involviert. Allgemein nützlich im hier durchgehend beschriebenen Verfahren ist die Verwendung eines Basismediums, das Mikronährstoffe, Makronährstoffe, eine Kohlenstoffquelle, Eisen, Vitamine und Pflanzenwachstumsregulatoren umfaßt. Pflanzenwachstumsregulatoren sind fachbekannt und schließen Auxine, Cytokinine und Gibberilline ein. Solche Regulatoren können vom Schritt im Verfahren und dem besonderen verwendeten Weizen-Genotyp abhängen.
- In der Erfindung nützliche Pflanzenwachstumsregulatoren schließen diejenigen mit auxinartigen Funktionen wie IAA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T, Dicamba, p-Chlorphenoxyessigsäure und dgl. ein. Solche Regulatoren können zum maltosehaltigen Medium in einer Menge von ca. 0,5 bis ca. 100 mg/l, bevorzugt ca. 1 bis ca. 40 mg/l und am meisten bevorzugt ca. 2 bis ca. 10 mg/l gegeben werden.
- Die zu transformierenden unreifen Embryos werden mit einer Bombardierungsvorrichtung mit hoher Partikelzahl bombardiert. Die Partikelbombardierung liefert ein schnelles Transformationsverfahren. Siehe allgemein Finer et al. (1992) Plant Cell Reports 11: 323-328; Christou P. (1990), Physiologia Plantarum 79:210-212; Wang et al. (1998), Plant Molecular Biology 11:433-439; Daniell et al. (1991), Plant Cell Reports 9:615-618; Klein et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Gordon-Kamm et al. (1990), The Plant Cell 2:603-618; Oard et al. (1990) Plant Physiol. 92:334-339; Sanford J.C. (1990), Physilogia Plantarum 79:206-209; Fromm et al. (1990), Bio/Technology 8:833-839; Christou et al. (1988), Plant Physiol. 87:671-674; Sautter et al. (1991), Bio/Technology 9:1080-1085; Iida et al. (1990), Theor. Appl. Genet. 80:813-813; und Christou et al. (1991), Bio/Technology 9:957-962.
- Während mehrere Partikelbombardierungsvorrichtungen in der Literatur offenbart werden, ist eine bevorzugte Vorrichtung die Partikelkanone, die in WO 93/07256 offenbart wird, hier durch Verweis eingeführt. Eine solche offenbarte Partikelkanone kann Partikel, die genetisches Material tragen, in eine große Vielzahl von Zellen einführen. Die Kanone umfaßt:
- – einen gleitenden Block zur Beschleunigung und Ausrichtung von Partikeln, die genetisches Material tragen;
- – eine von Inertgas angetriebene Abschußvorrichtung, die zur genauen Geschwindigkeitskontrolle des gleitenden Blocks fähig ist;
- – eine Stopp/Abstreifanordnung zum Anhalten des gleitenden Blocks und Erlauben des freien Flugs der mit dem genetischen Material beschichteten Partikel auf intakte Zellen; und
- – Bedienungsschlösser und Sicherheitsmerkmale.
- Die Kanone hat einen schnellen Abschußzyklus sowie eine durchgehende Kraft und Genauigkeit der abgefeuerten Schüsse. Die Kanone liefert eine kontrollierte, reproduzierbare, einstellbare und sichere Vortriebsquelle. Ein zusätzlicher Nutzen der in WO 93/07256 offenbarten Kanone besteht darin, daß die Kanone weniger DNA für die Bombardierung als andere fachbekannte Vorrichtungen benötigt. Jedoch sind andere Vorrichtungen zur Bombardierung von Pflanzenzellen, wie zum Beispiel das mit Helium angetriebene Beschleunigungssystem (Sanford et al., Technique – J. Meth. in Cell und Molec. Biol. 3:3-16, 1991), gleichsam bevorzugt.
- Allgemein werden die Embryos wenigstens einmal beschossen. Jedoch können mehrfache Beschüsse der Embryos zur Steigerung der Transformationshäufigkeit durchgeführt werden. Somit stellt das Unterwerfen der Embryos mehrfachen Beschüssen durch mit DNA beschichtete Partikeln eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Ca. zwei Schüsse pro Transformation haben die besten Ergebnisse gezeigt.
- Die als DNA-Träger in den Bombardierungen verwendeten Partikel hatten allgemein einen Durchmesser von ca. 0,5 bis ca. 2,0 μm, insbesondere ca. 1,0 μm. Die Partikel werden mit wenigstens ca. 0,5 bis ca. 2,0 μg, bevorzugt mit ca. 1 μg DNA pro Gewicht der Partikel beschichtet. In der Erfindung nützliche Partikel sind handelsüblich. Zum Beispiel können Goldpartikel von BioRad Company verwendet werden.
- Die Partikelkanone aus WO 93/07256 erlaubt die Kontrolle des Drucks. Ein Druck im Bereich von ca. 500 bis ca. 2500 psi, bevorzugt ca. 1900 psi kann verwendet werden.
- Die Embryos können einer Plasmolysebehandlung vor der Bombardierung, nach der Bombardierung oder bevorzugt sowohl vor als auch nach der Bombardierung unterworfen werden. Die Plasmolysebehandlung kann durch Verdünnen von Embryos in einem flüssigen Medium mit hinzugegebenem Osmotikum oder durch Überführen der Embryos auf halbfestes Medium, das ein Plasmolysemittel enthält, durchgeführt werden. Allgemein kann das Osmotikum jeder Zucker wie Sorbit, Mannit, Saccharose und dgl. sein. Das Wachstumsmedium kann zusätzlich Auxin umfassen.
- Nach der Bombardierung werden die Embryos für mehrere Tage in der Dunkelheit auf Wachstumsmedium mit Auxin kultiviert. Die Embryos werden für 1 bis 10 Wochen, insbesondere 1 bis 7 Wochen kultiviert, bevor sie dem Selektionsdruck unterworfen werden.
- Eine Anzahl von Selektionsmitteln und Resistenzgenen sind fachbekannt (siehe zum Beispiel Hauptmann et al. (1988), Plant Physiol. 86; 602-606; Dekeyser et al. (1988), Plant Physiol. 90: 217-223; Eichholz et al. (1987), Somatic Cell and Molecular Genetics 13: 67-76; Meijer et al. (1991), Plant Molecular Biology 16: 807-820; und Dekeyser et al. (1989) 90: 217-223). Inhibitoren wie Aminoglycosid-Antibiotika, die mit der Translationsmaschinerie von prokaryontischen und eukaryontischen Zellen wechselwirken, können verwendet werden. Solche Inhibitoren schließen Kanamycin, G418, Hygromycin etc. ein. Solche Inhibitoren können durch Phosphorylierungsreaktionen inaktiviert werden, die durch die Produkte entweder des Tn 5 Neomycinphosphotransferase II (npt-II)-Gens oder des Hygromycin B-Resistenzgens aus E. coli vermittelt werden (siehe zum Beispiel Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2: 987-995; Waldron et al. (1985), Plant Mol. Biol. 5: 103-108; und darin zitierte Verweise).
- Zusätzlich können Selektionsmittel wie Bleomycin, Methotrexat und Phosphinothricin verwendet werden. Vorteilhafte Ergebnisse wurden unter Verwendung von Methotrexat erreicht. Methotrexat bindet an das katalytische Zentrum des Dihydrofolatreduktase-Enzyms, was zu einem Mangel an Thymidylat und anschließendem Zelltod führt (Weikheiser W.C. (1961), J. Biol. Chem. 236: 888-893). Berichte in der Literatur weisen darauf hin, daß chimäre Konstrukte, die ein bakterielles oder Mäuse-dhfr-Gen enthalten, Resistenz gegen geringe Mengen von Methotrexat in transformierten Tabak-, Rüben-, Petunien- und Reispflanzen verleihen können (siehe DeBlock et al., EMBO J. 3: 1681-1689; Brisson et al., Nature 310: 511-514; Eichholtz et al. (1987), Somatic Cell and Molecular Genetics 13: 67-76; und Dekeyser et al. (1989), Plant Physiol. 90: 217-223). Medien, die Methotrexat oder Hygromycin umfassen, sind bevorzugte Medien für den Selektionsschritt, der an der Kultivierung von transformiertem Gewebe beteiligt ist.
- Eines der Haupthindernisse für die Produktion von transformierten Weizenpflanzen waren Verfahren zur Regeneration von Pflanzen aus transformierten Geweben. Allgemein wird für die Pflanzenregeneration transformierter Kallus auf entweder einem hormonfreien Medium, das Saccharose enthält, oder einem Medium, das ein Cytokin enthält, oder einem Medium, das Auxin und Gibberillin enthält, kultiviert. Die Kalluskulturen werden in das Licht überführt. Die Pflanzenentwicklung wird auf einem hormonfreiem Medium oder Medium mit Auxin fortgesetzt. Nach der Entwicklung von Wurzeln und Schößlingen werden die Pflänzchen auf Boden übertragen und zur Reife kultiviert.
- In mehreren Stufen entlang des Prozesses wird DNA aus dem Gewebe (Kallus und Pflanze) extrahiert und zur Bestätigung der Transformation sondiert. Verfahren sind auf diesem Gebiet für die Isolation von DNA aus Kallus und Geweben sowie zur Bestätigung der Gegenwart von DNA von Interesse verfügbar. Solche Verfahren zur Bestätigung schließen die PCR-Analyse sowie die Southern-Hybridisierung ein. Siehe E.M. Southern (1975), J. Mol. Biol. 98-503 und Mullis, K.B. (1987), Meth. in Enzymology 155:335.
- Wie für einen Fachmann ersichtlich sein wird, kann jetzt, da ein Verfahren zur stabilen Transformation von Weizen bereitgestellt wurde, jedes Gen von Interesse in den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Weizenpflanze manipuliert werden, um Krankheits- und Insektenresistenzgene, Gene die Nährwert verleihen, Gene zur Verleihung von männlicher und/oder weiblicher Sterilität, Antipilz-, antibakterielle oder antivirale Gene und dgl. zu exprimieren. Gleichsam kann das Verfahren verwendet werden, um beliebige Nukleinsäure zu übertragen, um die Genexpression zu kontrollieren. Zum Beispiel könnte die zu übertragende DNA Antisense-RNA codieren.
- Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren werden transformierte Kalluslinien mit einer höheren Effizienz im Vergleich mit anderen veröffentlichten Berichten erhalten. Tatsächlich kann bis zu 50 % Effizienz beobachtet werden, wie durch PCR und/oder Southern-Analyse bestätigt. Transformationsexperimente liefern routinemäßig stabile Transformanten mit einer Häufigkeit von so viel ca. 50 % auf Basis der Anzahl von Transformanten, die pro Anzahl von Zielbeschuß erhalten werden. Außerdem erweisen sich unter Verwendung von Methotrexat-Selektion regenerierte Pflanzen als positiv für die Transformation.
- Verbesserte embryogene Kulturen von Weizen können unter Verwendung von zuvor regeneriertem Material als Quelle des Ausgangsmaterials erhalten werden. Solche verbesserten Kulturen werden als "recyclierte Linien" bezeichnet, da sie durch den Gewebekulturprozeß mehr als einmal "cycliert" sind. Das Ausgangsmaterial für diese verbesserten Kulturen kann entweder unreife Embryos sein, die direkt aus regenerierten Pflanzen erhalten werden, oder das Ausgangsmaterial kann Samen aus regenerierten Pflanzen sein, die als Quelle für unreife Embryos kultiviert werden. Die so abgeleiteten embryogenen Kulturen haben eine verbesserte Starthäufigkeit und Fruchtbarkeit von Regeneranten im Vergleich zu herkömmlichen, nicht-recyclierten Linien. Diese Verbesserungen erhöhen signifikant die Leichtigkeit und Effizienz, mit der transgener Weizen und seine Nachkommenschaft erhalten werden.
- Kurze Beschreibung der Figuren
-
1 zeigt Weizenkallus Typ II, der aus unreifen Embryos induziert ist. -
2 zeigt Weizenkallus Typ M, der aus unreifen Embryos induziert ist. - Beispiele:
- I. Herstellung von Weizenkallus, Genotyp UC703
- Weizenpflanzen des Genotyps UC703 wurden zur Blüte kultiviert und selbstbestäubt. Ähren, die Embryos mit einer Länge von 1 bis 2,5 mm enthielten, wurden aus den Pflanzen entfernt und mit 10 % Clorox-Lösung für 10 Minuten sterilisiert. Embryos wurden aus den unreifen Samen entfernt und mit der Embryoachse nach unten auf das Murashige-Skoog-Medium plaziert, das 5 oder 10 mg/l 2,4-D, 13,7 % G/V Maltose, 100 mg/l Prolin und 100 mg/l myo-Inosit enthielt, verfestigt mit 0,7-0,8 % G/V Phytagar oder 0,1-0,2 % Gelrite (Startmedium). Nach einer dreiwöchigen Kultur in der Dunkelheit bei 27°C wurde ein bevorzugter Kallus durch die Gegenwart von wohlgeformten globulären, somatischen Embryos (Kallus Typ M) erkannt, die sich auf dem Scutellum bestimmter Explantate entwickelten. Diese Kalli wurden entfernt und entweder auf MS-Medium, das 1,0 bis 5,0 mg/l 2,4-D und 2-3 % Saccharose enthielt, oder auf ein Medium plaziert, das eine reduzierte Menge (5 %) von Maltose enthielt, bevor sie auf das Saccharosemedium plaziert wurden. Das Material wurde dann jede Woche auf frischem MS-Medium, das 3 % Saccharose enthielt, subkultiviert.
- II. Genotypische Reaktion von Weizen in der Typ M Kallusinduktion
- Weizenpflanzen vom Genotyp UC703, MIT, Orofen, Yecoro rojo und Chris wurden zur Blüte kultiviert und selbstbestäubt. Unreife Embryos wurden aus Ähren entfernt und auf Murashige-Skoog-Medium, das folgendes enthielt:
1 mg/l 2,4-D plus 2 % Saccharose (1MS),
1 mg/l 2,4-D plus 2 % Maltose (1MS2M),
1 mg/l 2,4-D plus 9 % Maltose (1MS9M),
1 mg/l 2,4-D plus 13,7 % Maltose (1MS13, 7M) oder
1,0 mg/l 2,4-D plus 13,7 % Maltose (10MS13, 7M)
zur Induzierung von Typ M-Kallusbildung kultiviert. Nach drei Wochen Kultur in der Dunkelheit bei 27°C wurden die Induktionshäufigkeit (%) von Typ M-Kallus, Typ I-Kallus sowie nicht-morphogenen Strukturen aus den unreifen Embryos der untersuchten Genotypen bewertet. - III. Typ M-Kallusinduktionshäufigkeit von Weizen Genotyp UC703
- Weizenpflanzen vom Genotyp UC703 wurde zur Blüte kultiviert und selbstbestäubt. Unreife Embryos wurden aus den Ähren entfernt und mit der Embryoachse nach unten auf Murashige-Skoog-Medium (MS) plaziert, das 5 oder 10 mg/l 2,4-D und 13,7 % G/V Maltose enthielt, verfestigt mit 0,8 % Phytagar. Nach 3 Wochen Kultur in der Dunkelheit bei 27°C wurde die Typ M-Kallusinduktionshäufigkeit aus den kultivierten unreifen Embryos bewertet.
- IV. Zellvorbereitung zur Bombardierung
- Die Zellen zur Bombardierung wurden einer Plasmolysebehandlung vor und nach der Bombardierung unterworfen. Das gepackte Zellvolumen wurde gemessen, und die Zellen wurden in IMS-Flüssigmedium mit hinzugegebenem Osmotikum verdünnt: 0,4 M Sorbit für Suspensionszellen und 0,6 M Sorbit für Kalluszellen. Die Zellen wurden so verdünnt, daß das fertige gepackte Zellvolumen pro Ziel 1/20 ml für eine feine Suspension und 1/10 ml für Kallus betrug. Verdünnte Zellen wurden in einen 250 ml-Kolben gegeben, der einen Rührstab enthielt, und für mindestens 30 Minuten bis hin zu einigen Stunden gerührt. Zum Ausplattieren der Zellen wurden 2 ml aus dem Kolben abgezogen und auf einen Vakuumkolben pipetiert, auf den ein Whatman 2,5 cm-GFA-Filter gegeben worden war. Das Vakuum wurde angelegt, bis die Zellen auf dem Filter getrocknet waren. Die Filter wurden auf 60 × 15 mm-Petrischalen gegeben, die 5 ml von festem Post-Bombardierungsplasmolysemedium enthielten, das 1MS ist, das 0,2 M Sorbit für Suspensionszellen oder 0,4 M Sorbit für Kalluszellen enthält. Zwei Filter wurden auf jede Schale ausplattiert.
- V. Für die Bombardierung verwendete Vektoren
- Die folgenden Plasmide wurden für die Partikelbombardierung verwendet:
pSOG30 ist ein aus Plasmid pBl121 stammender β-Glucuronidase-(Gus)-Expressionsvektor, erworben von Clontech Laboratories, Palo Alto, Kalifornien. Intron 6 des Mais-Adh1-Gens wurde durch PCR aus Plasmid pB428 amplifiziert, beschrieben in Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81: 4125-4128 (1987), und in den BamHI-Ort von pBl121 ligiert, der zwischen dem CaMV 35S-Promotor und dem Gus-Gen ist. Eine 17 bp-Leitsequenz aus dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV), beschrieben in Lommel et al., Virology 181: 382-385 (1991) wurde in die nicht-translatierte Leitsequenz des 35S-Gus-Gens inseriert. Die fertige Genfusion enthält die Struktur 35S- Promotor-Adh1-Intron 6-MCMV-Leitsequenz-Gus-Nos-Terminator, alle im pUC19-Vektorgerüst.
pSOG35 ist ein Dihydrofolatreduktase-(dhfr)-Expressionsvektor. Dieses Konstrukt wurde abgeleitet durch Fusionieren des 35S-Promotors, Adh1-Intron 6 und der MCMV-Leitsequenz, wie oben beschrieben, an das dhfr-Gen aus Plasmid pHCO, beschrieben in Bourouis and Jarry, EMBO J. 2: 1099-1104 (1983). Die fertige Genfusion enthält die Struktur 35S-Promotor-Adh1-Intron 6-MCMV-Leitsequenz-dhfr-Nos-Terminator, alle im pUC19-Vektorgerüst.
pTG48 umfaßt das Gus-Gen unter der Kontrolle des staubbeutelspezifischen ant43D-Promotors und ein dhfr-Gen in einem pUC19-Gerüst. Es ist das Ergebnis aus der Kombination von 4 unterschiedlichen DNA-Fragmenten. Fragment 1 wurde aus pSOG35 nach Restriktionsschneiden mit HindIII und EcoRI erhalten. Das EcoRI-Ende des isolierten Fragments, das das dhfr-Gen enthält, wurde an ein SalI-Restriktionsende angepaßt. Fragment 2 bestand aus dem staubbeutelspezifischen ant43D-Promotor, isoliert aus Plasmid pCIB 31778 nach Restriktionsschneiden mit HindIII und XbaI. Plasmid pCIB 3178 wird im Detail in der europäischen Patentanmeldung Nr. 93810455.1 beschrieben, deren relevante Teile hier durch Verweis eingeführt werden, und wurde unter der Eingangs-Nr. NRRL B-18978 hinterlegt. Fragment 3 wurde aus Plasmid pSOG30 nach Restriktionsschneiden mit XbaI und EcoRI erhalten und enthielt das Gus-Gen, und Fragment 4 entsprach dem handelsüblichen Vektor pUC19, geschnitten mit SalI und EcoRI. - VI. Partikelzubereitung
- Goldpartikel (1,0 μm; von Bio-Rad) wurden durch Aufteilen in ein Mikrozentrifugenröhrchen, Zugeben von ~1 ml 100%igem Ethanol, Verwirbeln, Auszentrifugieren, Entfernen des Überstands und zweimaliges Wiederholen mit sterilem Wasser gewaschen. Nach der letzten Spülung wurde so viel Wasser wie möglich entfernt, und Polylysin-Lösung (0,02 % Polylysin + 15 mM Ammoniumacetat) wurde zur vollständigen Bedeckung der Partikel hinzugegeben. Die Partikel wurden verwirbelt, auszentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Partikel wurden über Nacht in einem Abzug mit laminarem Luftzug oder für 30 Minuten unter einem vorsichtigem Stickstoffstrom trocknen gelassen.
- Für eine "vollständige" Partikelzubereitung wurden 10 mg Partikel ausgewogen und in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das einen Rührstab enthielt. 100 μl (1 μg/μl) DNA wurden hinzugegeben, gefolgt von Verwirbeln. Dann wurden 10 μl 100 mM Na2HPO4 hinzugegeben, gefolgt von Verwirbeln. 10 μl 100 mM CaCl2 wurden hinzugegeben, gefolgt von Verwirbeln. Schließlich wurden 380 μl 100%iges Ethanol hinzugegeben, gefolgt von Verwirbeln. Während die Suspension kräftig gerührt wurde, wurden 3 μl auf Kunststoffträger (Projektile) pipettiert. Die Partikel wurden auf den Trägern für wenigstens 15 Minuten vor der Bombardierung trocknen gelassen.
- VII. Bombardierung von Zellkulturen
- Die Petrischale, die die Zellfilter enthielt, wurde auf die Plattform auf dem Ständer umgedreht und über der Partikelflugöffnung zentriert. Der klare Deckel wurde über die Oberseite der Plattform plaziert. Ein Mikroprojektil wurde auf den Verschlußstift plaziert und der Verschluß geschlossen. Der "Spann"-Knopf wurde gedrückt, um das Rservoir mit der entsprechenden Menge an Heliumgas zu füllen (gewöhnlich 1800-1900 psi). Das Vakuum in der Kammer wurde auf ~27 mm eingestellt. Nachdem das Vakuum abgestellt worden war, wurden die "Spann"- und "Feuer"-Knöpfe gedrückt. Der "Spann"-Knopf wurde dann in die "Aus"-Position geschoben. Jeder Filter wurde gewöhnlich zweimal beschossen.
- VIII. Post-Bombardierungskultur und Selektion
- Nach der Bombardierung wurden die Zellen über Nacht in der Dunkelheit gehalten. Am nächsten Tag wurden die Filter aus dem Plasmolysemedium entfernt und auf 1 MS-Medium plaziert. Die Selektion wurde 7 bis 10 Tage nach der Bombardierung für Suspensionszellen und nach 14 Tagen für Kalluszellen eingesetzt. Die Zellen wurden von den Filtern abgeschabt und auf der Oberfläche von Platten ausgebreitet, die 1MS plus 2 mg/l Methotrexat enthielten. (Transformanten wurden auch durch anfängliches Selektieren mit 4 mg/l Methotrexat erhalten.) Die Platten wurden in der Dunkelheit für mehrere Wochen inkubiert. Resistente Kolonien, die nach einigen Wochen entstehen, wurden auf 1 MS + 4 mg/l Methotrexat überführt. Kolonien, die sich für ca. 3-4 Wochen weiter vermehren, werden dann auf "0,5MS"-Erhaltungsmedium überführt, das eine wäßrige Lösung von MS-Salzen, Vitaminen, Eisen, 3 % Saccharose, 0,7 % Agar und 0,5 mg/l 2,4-D ist. Das Gewebe wurde zweiwöchentlich auf diesem Medium subkultiviert, bis embryogene Strukturen erschienen oder das Gewebe zur Regeneration geeignet erschien.
- IX. Regeneration
- Gewebe wurde auf MS-Medium überführt, das entweder 3 mg/l BAP oder 1 mg/l NAA + 5 mg/l GA enthielt, und die Platten wurden in das Licht überführt. Nach 2-4 Wochen wurde Gewebe auf MS-Medium ohne Hormone überführt. Schößlinge, die erschienen, wurden in Behälter mit entweder MS-Medium ohne Hormone oder MS-Medium mit 0,5 mg/l NAA plaziert. Wenn ausreichend Wurzel- und Schößlingswachstum erfolgt war, wurden die Pflänzchen in den Boden überführt und in eine Klimakammer gesetzt.
- X. Transformantenanalyse
- Ca. 20 mg Kallusgewebe wurden für die PCR-Analyse verwendet. DNA wurde unter Verwendung eines schnellen Phenol/Chloroform:Isoamylalkohol-Verfahrens extrahiert, und 2 μl wurden pro Reaktion verwendet. Primer wurden zur Amplifikation der Region aus dem 5'-Ende des adh-Gens bis zum 3'-Ende des dhfr-Gens geschaffen.
- XI. Transformation von Weizen durch Mikroprojektilbombardierung von aus Typ M-Kallus abgeleitetem Typ II-Kallus
- Aus Typ M-Kallus abgeleiteter Typ II-Kallus wurde aus unreifen Embryos des Frühjahrsweizen vom Genotyp UC703 unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren erhalten. Die als UC703-0612 bezeichnete resultierende Kalluslinie war bröckelig, embryogen und wurde seriell in vitro vermehrt. Eine Mikroprojektilvorrichtung wurde zur Übertragung von DNA auf den Typ II-Kallus verwendet. pSOG30 und pSOG35 wurden auf Goldpartikel von Mikrometergröße kopräzipitiert und in Pflanzenzellen eingeführt.
- Zwei Wochen nach der Bombardierung wurden die Zellen auf Kallus-Erhaltungsmedium übertragen, das 4 mg/l Methotrexat enthielt. Resistente Kolonien, die sich vermehrten, wurden über einen Zeitraum von Monaten subkultiviert und dann in Abwesenheit von Methotrexat regeneriert. PCR-Analyse erfolgte an Kallusproben zur Bestätigung der Gegenwart des dhfr-Gens. Eine Kolonie, SJ3-2A, erzeugte eine T0-Pflanze (SJ3-2A-1) in vitro, die schließlich auf Boden übertragen und im Gewächshaus kultiviert wurde. Blattproben aus dieser Pflanze wurden auf Gus-Enzymaktivität unter Verwendung von Standardprotokollen (Jefferson, Plant Molecular Biology Reporter Bd. 5, Nr. 4, 1987) untersucht und waren positiv. DNA wurde aus dieser Pflanze extrahiert, und eine Southern-Analyse bestätigte die Gegenwart des dhfr-Gens.
- Pflanze SJ3-2A-1 wurde zur Reife in einem Gewächshaus kultiviert und mit Pollen vom Wildtyp aus UC703-Pflanzen bestäubt. Zwei Samen entwickelten sich, aus denen unreife Embryos ausgeschnitten und gekeimt wurden. Ein gewonnener Embryo erzeugte eine T1-Pflanze (bekannt als RE1), während der zweite gewonnene Embryo auf Kallusinduktionsmedium plaziert wurde und anschließend 10 T1-Pflanzen erzeugte, von denen zwei als RE2 und RE3 bekannt sind. Blattproben aus RE1 wurden auf Gus-Enzymaktivität untersucht und waren positiv. Eine PCR-Analyse auf Gegenwart von 35S-Promotorsequenzen erfolgte an RE1, RE2 und RE3, und alle drei Pflanzen waren positiv. Eine Southern Analyse erfolgte zur Sondierung auf Gegenwart des Gus-Gens in diesen drei Nachkommenschaftspflanzen, und alle drei waren positiv für das Gen. T1-Pflanzen RE1, RE2 und R3 (auch als RE2B) bekannt, wurden mit UC703-Pollen vom Wildtyp bestäubt, um T2-Pflanzen zu erzeugen. Viele Samen entwickelten sich auf jeder Pflanze und unreife Embryos wurden gewonnen und in vitro gekeimt. Fluorimetrische Gus-Tests wurden durchgeführt, und Transformanten wurden aus einer aufspaltenden Population identifiziert.
- XII. Transformation von Weizen durch Mikroprojektilbombardierung von unreifen Embryos und Isolation von Transformanten ohne Verwendung eines selektierbaren Markers oder Selektionsmittels
- Unreife Embryos vom Genotyp UC703 mit einer Länge von 0,75-1,5 mm wurden ausgeschnitten und auf MS-Medium, das 5 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose enthielt, mit 30 Embryos pro Platte ausplattiert.
- Zwei Plasmide wurden auf Goldpartikel von Mikrometergröße kopräzipitiert und in Pflanzenzellen durch die DuPont Biolistics-Vorrichtung unter Verwendung von Standardtechniken, wie sie im Betriebshandbuch veröffentlicht sind, eingeführt. Ein Plasmid, pCIB3089, enthält den Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotor (Nature 313:810-812, 1985), fusioniert an die cDNA aus dem Maisanthocyanin-regulatorischen Gen B-peru (Plant. Mol. Biol. 17:127-130, 1991 und Genes and Development 6:846-875, 1992), wobei Intron #2 aus dem Alkoholdehydrogenase 1-Gen (Nucleic Acid Research 12:3983-4000, 1984) zwischen dem 3'-Ende der codierenden Sequenz und 5' zur 35S-Terminatorsequenz plaziert ist. Das andere Plasmid, pCIB4436, enthält den CaMV 35S-Promotor (Nature 313:810-812, 1985), fusioniert an die cDNA aus dem Mais-Anthocyanin-regulatorischen Gen C1 (EMBO Journal 9:2517-2522, 1990; Genes and Development 5:298-309, 1991; und Genes and Development 6: 864-875, 1992), wobei Intron #9 aus dem Mais-PEP-Carboxylase-Gen (Plant Mol. Biol. 12:579-589, 1989) zwischen dem 3'-Ende der codierenden Sequenz und 5' zum 35S-Terminator plaziert ist. Zusammen funktionieren diese zwei Gene als bewertbarer Marker für die Transformation.
- Nach 22 Tagen wurden die Embryos auf Typ I-Kallusreaktion bewertet, und Kallus wurde auf ein Proliferationsmedium überführt. 20 der 49 Embryos zeigten eine Typ I-Kallusreaktion. Gewebe aus 11 der 20 reagierenden Embryos wurde auf Pflanzenregenerationsmedium ca. 1 Monat später überführt. 11 Pflanzen wurden zur Reife im Gewächshaus kultiviert, und alle Pflanzen setzten Samen an. Eine Pflanze (JN11-1800-3#1) erzeugte rötlich gefärbtes Saatgut, vermutlich verursacht durch Expression eines oder mehrerer der inserierten regulatorischen Gene. 5 DNA-Proben wurden aus dieser Pflanze erhalten, und die PCR-Analyse erfolgte zur Überprüfung auf Gegenwart des 35S-Promotors, des C1-Gens und des B-peru-Gens. Die PCR-Ergebnisse waren positiv für diese Sequenzen in drei unabhängigen Reaktionen.
- Zur Analyse der T1-Generation wurden 57 unreife Embryos aus diesen PCR-positiven Pflanzen ausgeschnitten, gekeimt und analysiert. Darunter waren 41 T1-Pflanzen PCR-positiv für sowohl das B-peru als auch das C1-Gen. 22 aus Saatgut stammende T1-Pflanzen wurden auch als PCR-positiv für diese Gene festgestellt. Eine Southern-Analyse erfolgte an den Elternpflanzen und 3 PCR-positiven T1-Nachkommen. Alle waren positiv für B-peru und negativ für C1 gemäß dieser Analyse. Die T2-Generation wurde im Gewächshaus zur Saatguterzeugung kultiviert.
- XIII. Transformation von Weizen durch Mikroprojektilbombardierung von unreifen Embryos unter Verwendung eines Plasmolyseschrittes mit hoher Saccharosekonzentration vor der Genübertragung
- Unreife Embryos (0,75-1,0 mm Länge) des Weizen-Genotyps UC703 wurden auf Murashige-Skoog-Medium (Physiologia Plantarum 15: 473-497, 1962) ausplattiert, das 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose enthielt. 20 Embryos wurden auf jede Platte mit Medium plaziert. 3 Tage später wurden die unreifen Embryos auf das gleiche Medium übertragen, das jedoch zusätzlich 15 % Saccharose enthielt, um das Gewebe vor der Genübertragung zu plasmolysieren.
- Die Plasmide pAct1-D (The Plant Cell 2:163-171, 1990) und pSOG35 wurden auf Goldpartikeln von Mikrometergröße unter Verwendung von Standardverfahren präzipitiert. Jede Platte mit Embryos wurde zweimal mit der Heliumvorrichtung DuPont Biolistic unter Verwendung eines Berstdrucks von 900 psi beschossen. Insgesamt vier Zielplatten wurden unter Verwendung des Standardtiters mit 80 mesh bombardiert, und vier Platten wurden ohne das eingebaute Gitter beschossen. Ca. 4 Stunden nach der Bombardierung wurden die Embryos zurück auf Murashige-Skoog-Medium, das 3 % Saccharose enthielt, überführt. Ca. einen Monat später wurden die Embryo-Explantate mit sich entwickelndem embryogenem Kallus auf Regenerationsmedium überführt (Murashige-Skoog + 1 mg/l NAA, 5 mg/l GA), das ferner 2 mg/l Methotrexat als Selektionsmittel enthielt. Nach ca. 1 Monat wurden sich entwickelnde Schößlinge auf als "GA7s" bekannte größere sterile Behälter übertragen, die halbkonzentrierte Murashige-Skoog-Salze, 2 % Saccharose und 2 mg/l Methotrexat enthielten.
- DNA wurde aus vier wie beschrieben isolierten und kultivierten Pflanzen extrahiert. Die PCR-Analyse auf Gegenwart des 35S-Promotors zeigte, daß zwei Pflanzen positiv waren. Diese transgenen Pflanzen wurden als SJ30-44 und SJ30-121 bezeichnet. Die Pflanze SJ30-121 wurde auf Gus-Aktivität untersucht und erwies sich als stark positiv. Die Pflanzen wurden auf Erde zur Vermehrung im Gewächshaus übertragen. Fruchtbare transformierte Pflanzen wurden erhalten.
- XIV. Transformation von Weizen durch Mikroporjektilbombardierung von unreifen Embryos unter Verwendung eines Plasmolyseschrittes mit hoher Maltose-Konzentration vor der Genübertragung
- Unreife Embryos (0,75-1,0 mm Länge) vom Genotyp UC703 wurden auf Murashige-Skoog-Medium ausplattiert, das 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose enthielt. Nach ca. 4 Stunden wurden die Embryos mit der Embryoachse nach unten auf Platten ausplattiert, die Murashige-Skoog-Medium mit 15 % Maltose, 3 % Saccharose und 3 mg/l 2,4-D enthielten, überschichtet mit einem auf Filterpapier geträgerten Block von Agarose, der die gleichen Komponenten enthielt. Man ließ die Embryos für 2-3 Stunden vor der Bombardierung plasmolysieren.
- DNA als pAct1-D (The Plant Cell 2: 163-171, 1990) und pSOG35 wurde auf Goldpartikel von μm-Größe unter Verwendung von Standardverfahren präzipitiert. Vier Zielplatten mit 20 Embryos pro Ziel wurden zweimal mit der Heliumvorrichtung DuPont Biolistics unter Verwendung eines Berstdrucks von 1100 psi beschossen. Die Platten wurden mit einem Gitter mit 80 mesh zwischen dem Trägerstand und dem Ziel beschossen. Die Ziele wurden nach der Bombardierung bei 26°C für 24 Stunden in die Dunkelheit gestellt, bevor die Blöcke mit den Embryos auf Platten gelegt wurden, die Murashige-Skoog-Medium mit 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose enthielten. Die individuellen Embryos wurden von den Platten entfernt und direkt auf frisches Medium der gleichen Zusammensetzung nach weiteren 48 Stunden plaziert.
- Ca. 6 Wochen nach der Genübertragung wurde das reagierende Gewebe auf Murashige-Skoog-Medium mit 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose mit 0,2 mg/l Methotrexat für einen 3-wöchigen Zeitraum plaziert. Das Gewebe wurde dann auf ein Regenerationsmedium plaziert, das Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l Zeatinribosid und 1 mg/l Methotrexat umfaßte. Nach 2 Wochen wurden sich regenerierende Pflänzchen in als "GA7s" bezeichnete sterile Behälter mit halbkonzentrierten Murashige-Skoog-Salzen, 2 % Saccharose, 1 mg/l NAA und entweder 4 oder 8 mg/l Methotrexat plaziert.
- DNA wurde aus Blattgewebe von 4 Pflanzen extrahiert, die aus zwei unterschiedlichen Zielplatten stammten, und eine PCR wurde auf Gegenwart des dhfr-Gens durchgeführt. Alle vier waren positiv für die Gegenwart des dhfr. Zwei der Pflanzen wurden in das Gewächshaus zur Vermehrung überführt.
- XV. Entwicklung von verbesserten embryogenen Kulturen von Weizen unter Verwendung von zuvor regeneriertem Material als Kulturquelle
- Zur Verwendung von regenerierten Pflanzen als Ausgangsmaterial für solche verbesserten Kulturen wurden Pflanzen aus dem oben beschriebenen Maltose-induzierten bröckeligen Kallus auf einem Murashige-Skoog-Medium mit 3 mg/l BAP und 3 % Saccharose regeneriert. Dieser Maltose-induzierte bröckelige Kallus war eine mit UC703-0612 markierte Typ II-Zellkultur, aufgetaut aus Gefrierkonservierung und plaziert auf ein Erhaltungsmedium (Murashige-Skoog-Medium + 1 mg/l 2,4-D + 3 % Saccharose) vor der Regeneration. Für die Embryokultur wurden Weizenähren aus den regenerierten Pflanzen gesammelt, mit 10 % Clorox-Lösung für 10 min sterilisiert und mehrmals mit sterilem Wasser gespült. Unreife Embryos mit einer Größe von 1-2 mm wurden aus Karyopsen unter einem Seziermikroskop entfernt und auf einem Murashige-Skoog-Medium mit entweder 5 oder 10 mg/l 2,4-D und 13,7 g/l Maltose oder auf einem Murashige-Skoog-Medium mit 2 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose kultiviert. Dieser neu induzierte bröckelige Kallus, jetzt recycliert, wurde auf Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose zur Erhaltung oder für Bombardierungsexperimente überführt. Die obige Pflanzenregeneration und der Kallusinduktionsprozeß wurden dann zur Erzeugung zukünftiger Generationen von bröckeligem Kallus wiederholt. Als Kontrolle wurden Embryos aus Pflanzen vom Wildtyp gesammelt und auf dem gleichen Maltosemedium kultiviert. Die Induktionshäufigkeit eines bröckeligen und embryogenen Kallus aus den Embryos wurde aufgezeichnet und ist nachfolgend gezeigt.
- Zur Verwendung von Saatgut, das aus regenerierten Pflanzen als Ausgangsmaterial stammte, wurde eine Typ II-Zellkultur (UC703-0612), die aus einem auf maltosehaltigem Medium kultivierten Embryo erzeugt wurde, aus der Gefrierkonservierung aufgetaut und auf ein Erhaltsmedium plaziert (Murashige-Skoog-Medium + 1 mg/l 2,4-D + 3 % Saccharose). Der Kallus wurde dann auf ein Medium, das Murashige-Skoog-Basissalze und 3 mg/l 6-BAP enthielt, zur Pflanzenregeneration gegeben. Samen wurden aus den regenerierten Pflanzen geerntet und dann im Boden gekeimt. Zur Embryokultur wurden Weizenähren aus den aus dem Saatgut stammenden Pflanzen gesammelt, mit 10 % Clorox-Lösung für 10 min sterilisiert und mehrmals mit sterilem Wasser gespült. Unreife Embryos mit einer Größe von 1-2 mm wurden aus Karyopsen unter einem Seziermikroskop entfernt und auf einem Murashige-Skoog-Medium mit 2 oder 10 mg/l 2,4-D und 13,7 g/l Maltose oder auf einem MS-Medium mit 2 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose kultiviert. Der induzierte bröckelige Kallus wurde auf ein MS-Medium mit 1 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose zum Erhalt oder für Bombardierungsexperimente übertragen.
- Als Kontrolle wurden Embryos aus Pflanzen vom Wildtyp gesammelt und auf dem gleichen Maltosemedium kultiviert. Die Induktionshäufigkeiten eines bröckeligen und embryogenen Kallus aus den Embryos wurden aufgezeichnet und sind nachfolgend gezeigt.
- XVI. Transformation von Weizen unter Verwendung einer recyclierten embryogenen Kultur
- Eine mit 0612RC bezeichnete recyclierte embryogene Kalluslinie wurde wie im obigen Beispiel beschrieben entwickelt. Kallus wurde zur Bombardierung durch Rühren und Plasmolyse für 2-3 Stunden in flüssigem Murashige-Skoog-Medium, das 1 mg/l 2,4-D, 3 % Saccharose und 0,6 M Sorbit enthielt, in einem Verhältnis von 1 Teil Zellen auf 16 Teile Medium vorbereitet. Jedes Ziel wurde unter Verwendung einer Vakuumfiltervorrichtung präpariert, um 3 ml der Zellmischung an Glasfaserfilter zu befestigen, die dann auf festes Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l 2,4-D, 3 % Saccharose und 0,4 M Sorbit plaziert wurden.
- DNA aus Plasmid pTG48 (ant43/Gus/35Sdhfr) wurde auf Goldpartikel von Mikrometergröße unter Verwendung von 0,1 M CaCl2 und 0,1 M NaH2PO4 präzipitiert.
- Jedes Ziel wurde zweimal mit der in WO 93/07256 beschriebenen Mikroprojektilvorrichtung unter Verwendung eines Gasdrucks von 1900 psi beschossen. Nach der Genübertragung wurden die Filter und Zellen aus dem Sorbitmedium entfernt und auf Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose ca. 24 Stunden später plaziert und für 17 Tage kultiviert, bevor sie auf das gleiche Medium, aber mit 1 mg/l Methotrexat, plaziert wurden. Der Selektionsgrad wurde auf 2 mg/l Methotrexat 17 Tage später erhöht.
- Ca. 7 Wochen später wurden Kolonien aus den ursprünglichen Selektionsplatten auf frisches Medium entfernt, das 1 mg/l Methotrexat enthielt. Die Kolonien wurden als positiv für die Gegenwart des dhfr-Gens durch PCR identifiziert. Das Gewebe wurde vereinigt und bei einer reduzierten 2,4-D-Konzentration (0,5 mg/l) gehalten, um die somatische Embryoreifung zu unterstützen. Pflänzchen wurden unter Verwendung von Murashige-Skoog-Medium mit 5 mg/l GA und 1 mg/l NAA regeneriert. Etwas Gewebe wurden durch Plazieren auf Osmorafts in flüssigem Mursashige-Skoog-Medien mit 3 % Saccharose und 10 mg/l Zeatin regeneriert. Pflänzchen wurden auf als "GA7s" bezeichnete sterile Behälter, die halbkonzentrierte Murashige-Skoog-Salze, 2 % Saccharose und 0,5 mg/l NAA enthielten, ca. 20 Wochen nach der Bombardierung überführt. Die Pflänzchen wurden in das Gewächshaus zur Vermehrung überführt. 5 Pflanzen wurden durch Southern-Analysen analysiert, und die Gegenwart des dhfr-Gens wurde bestätigt.
- Alle in dieser Beschreibung genannten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind indikativ für das fachliche Können der Fachleute, an die sich diese Erfindung richtet. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden hier durch Verweis in dem gleichen Ausmaß eingeführt, als ob jede individuelle Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als durch Verweis eingeführt angegeben wäre.
- Obwohl die vorhergehende Erfindung in einem gewissen Detail zur Veranschaulichung und als Beispiel für die Zwecke der Verständnisklarheit beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß gewisse Veränderungen und Modifikationen im Umfang der anhängenden Ansprüche durchgeführt werden können.
- Alle in dieser Beschreibung genannten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind indikativ für das fachliche Können der Fachleute, an die sich diese Erfindung richtet. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden hier durch Verweis in dem gleichen Ausmaß eingeführt, als ob jede individuelle Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als durch Verweis eingeführt angegeben wäre.
- Obwohl die vorhergehende Erfindung in einem gewissen Detail zur Veranschaulichung und als Beispiel für die Zwecke der Verständnisklarheit beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß gewisse Veränderungen und Modifikationen im Umfang der anhängenden Ansprüche durchgeführt werden können.
Claims (13)
- Verfahren zur Herstellung von stabil transformierten fruchtbaren Weizenpflanzen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst. (a) Ausschneiden eines unreifen Embryos aus einer Weizenpflanze; (b) Ausplattieren des ausgeschnittenen unreifen Embryos auf Wachstumsmedium; (c) Bombardieren des ausgeschnittenen und ausplattierten unreifen Embryos mit einer DNA-Sequenz von Interesse 0 bis 10 Tage nach dem Ausschneiden; (d) Halten des Embryos oder sich entwickelnden Kallus für 1 bis 10 Wochen in der Dunkelheit auf Wachstumsmedium mit Auxin ohne Selektionsdruck; und (e) Regenerieren von fruchtbaren transformierten Pflanzen daraus in Gegenwart von Selektion.
- Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Bombardieren das Unterwerfen des unreifen Embryos mehrfachen Schüssen mit Partikeln umfasst, die mit DNA überzogen sind.
- Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das Verfahren ferner eine Plasmolysebehandlung vor der Bombardierung umfasst.
- Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das Verfahren ferner eine Plasmolysebehandlung nch der Bombardierung umfasst.
- Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das Verfahren ferner eine Plasmolysebehandlung sowohl vor als auch nach der Bombardierung umfasst.
- Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die DNA-Sequenz von Interesse ein Resistenzgen umfasst.
- Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die DNA-Sequenz von Interesse ein Gen, das Nährwert, männliche und/oder weibliche Sterilität verleiht, oder ein Antipilz-, antibakterielles oder antivirales Gen umfasst.
- Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die DNA-Sequenz von Interesse ein Gen umfasst, das Antisense-RNA codiert.
- Verfahren gemäss Anspruch 6, worin die DNA-Sequenz von Interesse ein Krankheits- oder Insektenresistenzgen umfasst.
- Verfahren gemäss Anspruch 6, worin das Resistenzgen das Neomycinphosphotransferase II-(npt-II)-Gen oder das Hygromycin B-Resistenzgen ist.
- Verfahren gemäss Anspruch 6, worin die DNA-Sequenz von Interesse eine Dihydrofolatreduktase (dhfr) codierende Sequenz umfasst.
- Verfahren gemäss Anspruch 11, worin das dhfr-Gen ein bakterielles Gen ist.
- Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 12, worin die in Schritt (e) erhaltene fruchtbare transformierte Pflanze das Gen von Interesse spezifisch in Staubbeuteln exprimiert.
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Families Citing this family (253)
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US6605712B1 (en) * | 1990-12-20 | 2003-08-12 | Arch Development Corporation | Gene transcription and ionizing radiation: methods and compositions |
US5610042A (en) * | 1991-10-07 | 1997-03-11 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for stable transformation of wheat |
US7262055B2 (en) | 1998-08-25 | 2007-08-28 | Gendaq Limited | Regulated gene expression in plants |
US7285416B2 (en) | 2000-01-24 | 2007-10-23 | Gendaq Limited | Regulated gene expression in plants |
US5631152A (en) * | 1994-10-26 | 1997-05-20 | Monsanto Company | Rapid and efficient regeneration of transgenic plants |
CZ86798A3 (cs) | 1996-06-21 | 1999-03-17 | Monsanto Company | Fertilní transgenní rostlina pšenice, způsob její přípravy, buňky a semena této rostliny |
US5773269A (en) * | 1996-07-26 | 1998-06-30 | Regents Of The University Of Minnesota | Fertile transgenic oat plants |
US6002068A (en) * | 1996-12-19 | 1999-12-14 | Novartis Finance Corporation | Methods for conferring insect resistance to a monocot using a perioxidase coding sequence |
US6872871B2 (en) * | 1998-02-02 | 2005-03-29 | Odyssey Thera Inc. | Mapping molecular interactions in plants with protein fragments complementation assays |
US7102056B1 (en) | 1997-04-29 | 2006-09-05 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for plant transformation and regeneration |
US6235529B1 (en) * | 1997-04-29 | 2001-05-22 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for plant transformation and regeneration |
MX257801B (en) | 1997-06-02 | 2008-06-10 | Syngenta Participations Ag | Plant transformation methods |
WO1999015003A1 (en) * | 1997-09-24 | 1999-04-01 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for transformation of cereals using cultured shoot meristematic tissue |
US6642437B1 (en) | 1997-09-30 | 2003-11-04 | The Regents Of The University Of California | Production of proteins in plant seeds |
US6060315A (en) * | 1997-12-01 | 2000-05-09 | Lockheed Martin Energy Research Corporation | Method for facilitating the introduction of material into cells |
US6153811A (en) | 1997-12-22 | 2000-11-28 | Dekalb Genetics Corporation | Method for reduction of transgene copy number |
IL137972A0 (en) | 1998-02-20 | 2001-10-31 | Zeneca Ltd | Hybrid seed production |
US5973227A (en) * | 1998-05-06 | 1999-10-26 | University Of Saskatchewan | Flax transformation |
US20050086718A1 (en) | 1999-03-23 | 2005-04-21 | Mendel Biotechnology, Inc. | Plant transcriptional regulators of abiotic stress |
US7897843B2 (en) | 1999-03-23 | 2011-03-01 | Mendel Biotechnology, Inc. | Transcriptional regulation of plant biomass and abiotic stress tolerance |
EP1231830A4 (de) | 1999-11-10 | 2005-05-11 | Univ Washington | Zusammensetzungen und verfahren zur modulation der pflanzlichen zellteilung |
EP1950306A1 (de) | 1999-11-17 | 2008-07-30 | Mendel Biotechnology, Inc. | Umweltstress-Toleranzgene |
DK1230345T3 (da) | 1999-11-17 | 2008-10-13 | Mendel Biotechnology Inc | Tolerancegener for miljömæssig stress-påvirkning |
US6812028B1 (en) * | 1999-12-10 | 2004-11-02 | University Of Guelph | Embryogenesis and plant regeneration from microspores |
US6580019B1 (en) | 2000-03-09 | 2003-06-17 | Dekalb Genetics Corporation | Non-reciprocal recombination-mediated transgene deletion in transgenic plants |
US6750379B2 (en) | 2000-03-09 | 2004-06-15 | Dekalb Genetics Corporation | Homologous recombination-mediated transgene alterations in plants |
US6806399B1 (en) * | 2000-04-19 | 2004-10-19 | Carmel-Haifa University Economic Corporation Ltd. | Pollen-mediated method for transformation of maize, tomato or melon |
US7468475B2 (en) | 2000-06-16 | 2008-12-23 | Schmuelling Thomas | Method for modifying plant morphology, biochemistry and physiology |
US6995016B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-02-07 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food | Process for inducing direct somatic embryogenesis in immature scutella cells of pooideae, and rapidly regenerating fertile plants |
WO2002015675A1 (en) | 2000-08-22 | 2002-02-28 | Mendel Biotechnology, Inc. | Genes for modifying plant traits iv |
FR2815969B1 (fr) | 2000-10-30 | 2004-12-10 | Aventis Cropscience Sa | Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique |
MXPA03008001A (es) | 2001-03-06 | 2004-10-15 | Dow Chemical Co | Celula vegetal que tiene funcion de adicion de cadena de azucar tipo animal. |
US7326549B2 (en) | 2001-03-19 | 2008-02-05 | Cargill, Incorporated | Myo-inositol oxygenases |
US20040242523A1 (en) * | 2003-03-06 | 2004-12-02 | Ana-Farber Cancer Institue And The Univiersity Of Chicago | Chemo-inducible cancer gene therapy |
ES2380007T3 (es) * | 2001-04-06 | 2012-05-07 | The University Of Chicago | Inducción por agentes quimioterapéuticos de la actividad del promotor Egr-1 en la terapia génica |
US8034791B2 (en) | 2001-04-06 | 2011-10-11 | The University Of Chicago | Activation of Egr-1 promoter by DNA damaging chemotherapeutics |
WO2002095002A2 (en) | 2001-05-22 | 2002-11-28 | University Of Chicago | N4 virion single-stranded dna dependent rna polymerase |
NZ529597A (en) | 2001-05-30 | 2005-12-23 | Chromos Molecular Systems Inc | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes |
WO2003038112A2 (en) | 2001-10-26 | 2003-05-08 | Baylor College Of Medicine | A composition and method to alter lean body mass and bone properties in a subject |
MXPA04005713A (es) * | 2001-12-11 | 2005-06-06 | Baylor College Medicine | Complemento de la hormona de liberacion de la hormona de crecimiento para tratar sujetos cronicamente enfermos. |
US20060009409A1 (en) * | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
US20030166282A1 (en) * | 2002-02-01 | 2003-09-04 | David Brown | High potency siRNAS for reducing the expression of target genes |
JP2005515780A (ja) * | 2002-02-01 | 2005-06-02 | セクイター インコーポレイテッド | 二本鎖オリゴヌクレオチド |
KR101138631B1 (ko) | 2002-05-22 | 2012-04-26 | 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 | 진균 기원의 지방산 데사투라제 |
US20040248094A1 (en) * | 2002-06-12 | 2004-12-09 | Ford Lance P. | Methods and compositions relating to labeled RNA molecules that reduce gene expression |
AU2003247582A1 (en) | 2002-06-20 | 2004-01-06 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Plastid division and related genes and proteins, and methods of use |
CA2501188C (en) | 2002-07-15 | 2012-05-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combinatorial protein library screening by periplasmic expression |
GB0217033D0 (en) | 2002-07-23 | 2002-08-28 | Delta Biotechnology Ltd | Gene and polypeptide sequences |
US20040029275A1 (en) * | 2002-08-10 | 2004-02-12 | David Brown | Methods and compositions for reducing target gene expression using cocktails of siRNAs or constructs expressing siRNAs |
KR20120002613A (ko) | 2002-08-12 | 2012-01-06 | 제네렉스, 인코포레이티드 | 폭스바이러스 및 암과 관련된 방법 및 조성물 |
WO2004022707A2 (en) * | 2002-09-03 | 2004-03-18 | The Regents Of The University Of California | Method and compositions for transformation and regeneration of maize |
DK1546336T3 (da) | 2002-09-18 | 2012-04-10 | Mendel Biotechnology Inc | Polynukleotider og polypeptider i planter. |
EP1641927B1 (de) | 2003-02-18 | 2015-07-08 | Baylor College of Medicine | Induzierte aktivierung in dendritischen zellen |
TW200424214A (en) * | 2003-04-21 | 2004-11-16 | Advisys Inc | Plasmid mediated GHRH supplementation for renal failures |
US7655833B2 (en) | 2003-05-29 | 2010-02-02 | Brookhaven Science Associates, Llc | ADS genes for reducing saturated fatty acid levels in seed oils |
JP4923171B2 (ja) | 2003-06-30 | 2012-04-25 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション | 分枝酵素の活性を改変した小麦、ならびにそれから得たデンプンおよびデンプン含有品 |
WO2006023869A2 (en) | 2004-08-24 | 2006-03-02 | Monsanto Technology Llc | Adenylate translocator protein gene non-coding regulatory elements for use in plants |
AU2005299492B2 (en) | 2004-10-21 | 2011-09-01 | Venganza, Inc. | Methods and materials for conferring resistance to pests and pathogens of plants |
EP2302055B1 (de) | 2004-11-12 | 2014-08-27 | Asuragen, Inc. | Verfahren und Zusammensetzungen, die miRNAs und miRNAa-inhibitorischen Molekülen verbunden sind |
CN100362104C (zh) | 2004-12-21 | 2008-01-16 | 华中农业大学 | 利用水稻转录因子基因OsNACx提高植物抗旱耐盐能力 |
AR053269A1 (es) | 2005-05-16 | 2007-04-25 | Monsanto Technology Llc | Plantas y semillas de maiz con mejoramiento de asparagina y proteina |
WO2006125065A2 (en) | 2005-05-18 | 2006-11-23 | The Board Of Trustees Operating Michigan State University | Resistance to soybean aphid in early maturing soybean germplasm |
EP2422615B1 (de) | 2005-07-29 | 2014-06-18 | Targeted Growth, Inc. | Dominant-negative KRP-Proteinmutante als Schutz gegen die Hemmung von aktivem Cyclin-CDK-Komplex durch Wildtyp-KRP |
WO2007030668A2 (en) * | 2005-09-07 | 2007-03-15 | Jennerex Biotherapeutics Ulc | Systemic treatment of metastatic and/or systemically-disseminated cancers using gm-csf-expressing poxviruses |
US20070059833A1 (en) * | 2005-09-07 | 2007-03-15 | Maxcyte, Inc. | Use of Nucleases to Improve Viability and Enhance Transgene Expression in Transfected Cells |
US8980246B2 (en) | 2005-09-07 | 2015-03-17 | Sillajen Biotherapeutics, Inc. | Oncolytic vaccinia virus cancer therapy |
CN102839191A (zh) | 2005-12-15 | 2012-12-26 | 目标栽培公司 | 通过在早期胚胎发育期间生长和/或发育相关基因的转基因过量表达来增加种子大小和种子数目 |
US7663020B2 (en) * | 2006-01-11 | 2010-02-16 | Agrinomics Llc | Generation of plants with altered oil content |
EP2368569A3 (de) | 2006-01-18 | 2012-05-02 | University Of Chicago | Zusammensetzungen und Verfahren im Zusammenhang mit Proteinen des Staphylococcus-Bakteriums |
US7868228B2 (en) | 2006-01-31 | 2011-01-11 | Monsanto Technology Llc | Phosphopantetheinyl transferases from bacteria |
US7820883B2 (en) * | 2006-03-15 | 2010-10-26 | Dow Agrosciences Llc | Resistance to auxinic herbicides |
CA2647984A1 (en) | 2006-03-31 | 2008-01-31 | Reliance Life Sciences Pvt Ltd | Direct regeneration of plantlets in jatropha curcas |
US7977535B2 (en) | 2006-07-12 | 2011-07-12 | Board Of Trustees Of Michigan State University | DNA encoding ring zinc-finger protein and the use of the DNA in vectors and bacteria and in plants |
CA2658952A1 (en) | 2006-07-27 | 2008-01-31 | Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Cellular receptor for antiproliferative factor |
CN105769931B (zh) | 2006-09-15 | 2021-04-27 | 渥太华医院研究机构 | 溶瘤弹状病毒 |
PL2121935T3 (pl) | 2006-09-25 | 2011-12-30 | Schmuelling Thomas | Transkrypcyjne represory szlaków sygnałowych cytokinin i ich zastosowanie |
US8691210B2 (en) * | 2006-10-19 | 2014-04-08 | David M Spencer | Methods and compositions for generating an immune response by inducing CD40 and pattern recognition receptors and adaptors thereof |
BRPI0717474A2 (pt) | 2006-10-20 | 2014-03-11 | Arizona Board Of Regentes For And On Behalf Of Arizona State University | Cianobactéria modificada |
CA2669920C (en) | 2006-11-15 | 2016-05-10 | Agrigenetics, Inc. | Generation of plants expressing an imq polypeptide and having altered protein, fiber or oil content |
WO2008061157A2 (en) | 2006-11-15 | 2008-05-22 | Agrigenetics, Inc. | Generation of plants with altered protein, fiber, or oil content |
CA2988382A1 (en) * | 2006-11-15 | 2008-05-22 | Agrigenetics, Inc. | Generation of plants with altered protein, fiber, or oil content |
WO2008061153A2 (en) | 2006-11-15 | 2008-05-22 | Agrigenetics, Inc. | Generation of plants with altered protein, fiber, or oil content |
US8030541B2 (en) * | 2006-11-15 | 2011-10-04 | Dow Agrosciences Llc | Generation of plants with altered protein, fiber, or oil content |
CA2671264C (en) | 2006-11-30 | 2015-11-24 | Research Development Foundation | Improved immunoglobulin libraries |
US7563943B2 (en) * | 2006-12-15 | 2009-07-21 | Agrinomics Llc | Generation of plants with altered oil, protein, or fiber content |
WO2008076834A2 (en) * | 2006-12-15 | 2008-06-26 | Agrinomics Llc | Generation of plants with altered oil, protein, or fiber content |
EP2120531A4 (de) * | 2006-12-15 | 2010-08-25 | Agrinomics Llc | Erzeugung von pflanzen mit verändertem öl-, protein- oder fasergehalt |
US7790954B2 (en) * | 2006-12-15 | 2010-09-07 | Agrigenetics, Inc. | Generation of plants with altered oil, protein, or fiber content |
CN101600341A (zh) * | 2006-12-15 | 2009-12-09 | 农业经济有限责任公司 | 具有改变的油、蛋白或纤维含量的植物的生产 |
KR20080084528A (ko) | 2007-03-15 | 2008-09-19 | 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. | 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료 |
US8629245B2 (en) | 2007-05-01 | 2014-01-14 | Research Development Foundation | Immunoglobulin Fc libraries |
BRPI0813098A2 (pt) * | 2007-06-18 | 2014-11-11 | Agrinomics Llc | Geração de plantas com teor alterado de óleo, proteína ou fibra |
AU2008292897B2 (en) | 2007-08-31 | 2015-01-22 | University Of Chicago | Methods and compositions related to immunizing against staphylococcal lung diseases and conditions |
BRPI0906429B1 (pt) | 2008-01-10 | 2021-08-03 | Research Development Foundation | Método de identificação de uma infecção por e. chaffeensis em um indivíduo, uso de um ou mais polipeptídeo sintético e kit |
MX356866B (es) | 2008-01-25 | 2018-06-18 | Multivir Inc | Biomarcadores p53. |
ES2587395T3 (es) | 2008-06-04 | 2016-10-24 | Cellular Dynamics International, Inc. | Procedimientos para la producción de células IPS usando un enfoque no vírico |
CN102171348A (zh) | 2008-08-12 | 2011-08-31 | 细胞动力国际有限公司 | 产生ips细胞的方法 |
WO2010022089A2 (en) | 2008-08-18 | 2010-02-25 | University Of Maryland, Baltimore | Derivatives of apf and methods of use |
CA2738031C (en) * | 2008-09-22 | 2022-11-29 | Baylor College Of Medicine | Methods and compositions for generating an immune response by inducing cd40 and pattern recognition receptor adapters |
AU2009302582A1 (en) | 2008-10-06 | 2010-04-15 | University Of Chicago | Compositions and methods related to bacterial Eap, Emp, and/or AdsA proteins |
WO2010045324A1 (en) | 2008-10-14 | 2010-04-22 | Monsanto Technology Llc | Utilization of fatty acid desaturases from hemiselmis spp. |
US9133475B2 (en) | 2008-11-26 | 2015-09-15 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Aphid resistant soybean plants |
WO2010068738A1 (en) | 2008-12-10 | 2010-06-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Mek mutations conferring resistance to mek inhibitors |
US8362318B2 (en) | 2008-12-18 | 2013-01-29 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Enzyme directed oil biosynthesis in microalgae |
WO2010084488A1 (en) | 2009-01-20 | 2010-07-29 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Mir-21 promoter driven targeted cancer therapy |
WO2010096510A2 (en) | 2009-02-17 | 2010-08-26 | Edenspace Systems Corporation | Tempering of cellulosic biomass |
WO2011127032A1 (en) | 2010-04-05 | 2011-10-13 | University Of Chicago | Compositions and methods related to protein a (spa) antibodies as an enhancer of immune response |
WO2011005341A2 (en) | 2009-04-03 | 2011-01-13 | University Of Chicago | Compositions and methods related to protein a (spa) variants |
US8748381B2 (en) | 2009-04-28 | 2014-06-10 | Vanderbilt University | Compositions and methods for the treatment of disorders involving epithelial cell apoptosis |
WO2010138971A1 (en) | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Edenspace Systems Corporation | Plant gene regulatory elements |
DK2548950T3 (en) | 2009-06-05 | 2017-12-11 | Cellular Dynamics Int Inc | Reprogramming of T cells and hematopoietic cells |
WO2011025826A1 (en) | 2009-08-26 | 2011-03-03 | Research Development Foundation | Methods for creating antibody libraries |
CN107303302A (zh) | 2009-09-14 | 2017-10-31 | 希拉金股份有限公司 | 溶瘤牛痘病毒组合癌症疗法 |
US8937214B2 (en) | 2009-10-23 | 2015-01-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for expression of transgenes in plants |
CA2836117C (en) | 2009-12-10 | 2017-08-15 | Ottawa Hospital Research Institute | Oncolytic rhabdovirus |
US9328335B2 (en) | 2009-12-30 | 2016-05-03 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Method to produce acetyldiacylglycerols (ac-TAGs) by expression of an acetyltransferase gene isolated from Euonymus alatus (burning bush) |
WO2011100508A2 (en) | 2010-02-12 | 2011-08-18 | Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Methods and compositions related to glycoprotein-immunoglobulin fusions |
EP2538943B1 (de) | 2010-02-25 | 2016-03-30 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Braf-mutationen für resistenz gegen braf-inhibitoren |
WO2011108930A1 (en) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | Interna Technologies Bv | A MiRNA MOLECULE DEFINED BY ITS SOURCE AND ITS DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES IN DISEASES OR CONDITIONS ASSOCIATED WITH EMT |
WO2011126976A1 (en) | 2010-04-07 | 2011-10-13 | Vanderbilt University | Reovirus vaccines and methods of use therefor |
WO2011133512A1 (en) | 2010-04-19 | 2011-10-27 | Research Development Foundation | Rtef-1 variants and uses thereof |
AU2011255481B2 (en) | 2010-05-19 | 2014-09-11 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Altered leaf morphology and enhanced agronomic properties in plants |
WO2011146862A1 (en) | 2010-05-21 | 2011-11-24 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Methods for inducing selective apoptosis |
ES2873933T3 (es) | 2010-06-09 | 2021-11-04 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Una mutación de MEK1 que confiere resistencia a inhibidores de RAF y de MEK |
US8691574B2 (en) | 2010-06-15 | 2014-04-08 | Cellular Dynamics International, Inc. | Generation of induced pluripotent stem cells from small volumes of peripheral blood |
CA2802087A1 (en) | 2010-06-15 | 2011-12-22 | Cellular Dynamics International, Inc. | A compendium of ready-built stem cell models for interrogation of biological response |
WO2012003474A2 (en) | 2010-07-02 | 2012-01-05 | The University Of Chicago | Compositions and methods related to protein a (spa) variants |
EP2591106A1 (de) | 2010-07-06 | 2013-05-15 | InteRNA Technologies B.V. | Mirna und ihre diagnostischen und therapeutischen verwendungen für mit melanomen assoziierte erkrankungen oder leiden oder für mit dem aktivierten braf-pfad assoziierte erkrankungen oder leiden |
JP5897002B2 (ja) | 2010-07-07 | 2016-04-13 | セルラー ダイナミクス インターナショナル, インコーポレイテッド | プログラミングによる内皮細胞の産生 |
JP5936218B2 (ja) | 2010-08-04 | 2016-06-22 | セルラー ダイナミクス インターナショナル, インコーポレイテッド | 不死化b細胞のリプログラミング |
US9095540B2 (en) | 2010-09-09 | 2015-08-04 | The University Of Chicago | Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens |
CA2849382C (en) | 2010-09-22 | 2021-02-16 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Therapeutic applications of smad7 for the treatment of oral mucositis |
US9045549B2 (en) | 2010-11-03 | 2015-06-02 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Transcription factors for modification of lignin content in plants |
BR112013017096A2 (pt) | 2011-01-04 | 2020-09-01 | Jennerex Inc. | composição e métodos de indução de resposta citotóxica dependente de complemento mediado por anticorpo específico de tumor em animal tendo tumor, de geração de anticorpos in vivo, de inibição do crescimento ou morte de célula de câncer, para tratar indivíduo com câncer, para adaptar de terapia de câncer para indivíduo com câncer e para identificar antígeno específico de tumor |
EP2474617A1 (de) | 2011-01-11 | 2012-07-11 | InteRNA Technologies BV | MIR zur Behandlung von Neoangiogenese |
US8952132B2 (en) | 2011-02-07 | 2015-02-10 | Research Development Foundation | Engineered immunoglobulin FC polypeptides |
US9574179B2 (en) | 2011-02-08 | 2017-02-21 | Cellular Dynamics International, Inc. | Hematopoietic precursor cell production by programming |
WO2012136653A1 (en) | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Novvac Aps | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus |
US8901371B2 (en) | 2011-05-06 | 2014-12-02 | The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. | Compositions and methods for improved plant feedstock |
US8945588B2 (en) | 2011-05-06 | 2015-02-03 | The University Of Chicago | Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides |
US9920327B2 (en) | 2011-06-02 | 2018-03-20 | The Regents Of The University Of California | Plants with elevated levels of glucan |
WO2012167382A1 (en) | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. | Compositions and methods for glioblastoma treatment |
WO2013005211A2 (en) | 2011-07-05 | 2013-01-10 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Boron complexing plant materials and uses thereof cross-reference to related applications |
JP2014520551A (ja) | 2011-07-11 | 2014-08-25 | セルラー ダイナミクス インターナショナル, インコーポレイテッド | 細胞のリプログラミング方法およびゲノムの改変方法 |
CN103906535B (zh) | 2011-08-15 | 2017-07-14 | 芝加哥大学 | 与葡萄球菌蛋白a的抗体相关的组合物和方法 |
US20130101664A1 (en) | 2011-08-18 | 2013-04-25 | Donald W. Kufe | Muc1 ligand traps for use in treating cancers |
US9273102B2 (en) | 2011-10-12 | 2016-03-01 | Niels Iversen Møller | Peptides derived from Campylobacter jejuni and their use in vaccination |
WO2013095132A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Interna Technologies B.V. | Mirna for treating head and neck cancer |
JP6251730B2 (ja) | 2012-04-26 | 2017-12-20 | ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴThe University Of Chicago | 黄色ブドウ球菌(staphylococcusaureus)疾患の間にコアグラーゼ活性を中和する抗体に関連した組成物および方法 |
JP6670106B2 (ja) | 2012-04-26 | 2020-03-18 | ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴThe University Of Chicago | ブドウ球菌コアグラーゼ抗原およびその使用方法 |
EP2880167B1 (de) | 2012-07-31 | 2018-04-18 | The Board of Regents of The University of Texas System | Verfahren und zusammensetzungen zur in-vivo-induktion der bildung von pankreas-beta-zellen |
PT3622810T (pt) | 2012-09-24 | 2024-04-03 | Seminis Vegetable Seeds Inc | Métodos e composições para prolongar a vida útil de produtos vegetais |
CA2887825A1 (en) | 2012-10-23 | 2014-05-01 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Engineered igg fc domains |
EP3800256A1 (de) | 2012-11-06 | 2021-04-07 | InteRNA Technologies B.V. | Kombination zur therapeutischen verwendung bei krankheiten oder zuständen im zusammenhang mit melanomen oder bei krankheiten oder zuständen im zusammenhang mit dem aktivierten b-raf-signalweg |
US10253329B2 (en) | 2013-01-04 | 2019-04-09 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Sources of aphid resistance in soybean plants |
WO2014116721A1 (en) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Geminiviral vector for expression of rituximab |
EP2958994B1 (de) | 2013-02-21 | 2019-05-29 | Turnstone Limited Partnership | Impfstoffzusammensetzung |
AU2014218807A1 (en) | 2013-02-22 | 2015-09-03 | Cellular Dynamics International, Inc. | Hepatocyte production via forward programming by combined genetic and chemical engineering |
WO2014134144A1 (en) | 2013-02-28 | 2014-09-04 | The General Hospital Corporation | Mirna profiling compositions and methods of use |
WO2014132137A2 (en) | 2013-03-01 | 2014-09-04 | Université De Genève | Transgenic cell selection |
CN105358704B (zh) | 2013-03-08 | 2020-01-03 | 科罗拉多大学董事会 | Ptd-smad7治疗剂 |
US9434935B2 (en) | 2013-03-10 | 2016-09-06 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Modified caspase polypeptides and uses thereof |
CN105209065B (zh) | 2013-03-14 | 2020-07-31 | 贝里坤制药股份有限公司 | 控制t细胞增殖的方法 |
ES2791598T3 (es) | 2013-06-05 | 2020-11-05 | Bellicum Pharmaceuticals Inc | Métodos para inducir apoptosis parcial utilizando polipéptidos de caspasa |
CN105636614A (zh) | 2013-09-09 | 2016-06-01 | 菲格内有限责任公司 | 用于软骨细胞或软骨型细胞再生的基因治疗 |
WO2015070050A1 (en) | 2013-11-08 | 2015-05-14 | Baylor Research Institute | Nuclear loclization of glp-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure |
EP3065775B1 (de) | 2013-11-08 | 2020-09-30 | The Board of Regents of the University of Texas System | Vh4-antikörper gegen und neuron und astrozyt der grauen substanz |
WO2015082536A1 (en) | 2013-12-03 | 2015-06-11 | Evaxion Biotech Aps | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus |
US10392629B2 (en) | 2014-01-17 | 2019-08-27 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Increased caloric and nutritional content of plant biomass |
MX2016009954A (es) | 2014-01-29 | 2017-02-23 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Anticuerpos contra el dominio extracelular de muc1-c (muc1-c/ecd). |
WO2015123561A2 (en) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | University Of Utah Research Foundation | Methods and compositions for inhibiting retinopathy of prematurity |
CA2937750A1 (en) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Methods for activating t cells using an inducible chimeric polypeptide |
EP3110836A1 (de) | 2014-02-25 | 2017-01-04 | Research Development Foundation | Sty-peptide zur hemmung von angiogenese |
MX367917B (es) | 2014-03-07 | 2019-09-11 | Pioneer Hi Bred Int | Metodos y sistemas para extraer embriones monocotiledoneos. |
US20170107486A1 (en) | 2014-04-21 | 2017-04-20 | Cellular Dynamics International, Inc. | Hepatocyte production via forward programming by combined genetic and chemical engineering |
AR100874A1 (es) | 2014-06-16 | 2016-11-09 | Consejo Nac De Investig Científicas Y Técnicas (Conicet) | Genes quiméricos y proteínas de resistencia oxidativa, y plantas transgénicas que incluyen los mismos |
AU2015312117A1 (en) | 2014-09-02 | 2017-03-02 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Costimulation of chimeric antigen receptors by Myd88 and CD40 polypeptides |
CN108064298A (zh) | 2014-09-11 | 2018-05-22 | 马罗内生物创新公司 | 铁杉下色杆菌(chromobacterium subtsugae)基因组 |
US10189880B2 (en) | 2014-11-03 | 2019-01-29 | Leiden University Medical Center | T cell receptors directed against Bob1 and uses thereof |
CA2974716A1 (en) | 2014-11-12 | 2016-05-19 | Nmc, Inc. | Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same |
EP3218002B1 (de) | 2014-11-13 | 2020-08-19 | Evaxion Biotech ApS | Aus acinetobacter baumannii abgeleitete peptide und deren verwendung bei der impfung |
US20160175359A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Methods for controlled activation or elimination of therapeutic cells |
WO2016113252A2 (en) | 2015-01-12 | 2016-07-21 | Evaxion Biotech Aps | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting klebsiella pneumoniae |
EP3250675A1 (de) | 2015-01-28 | 2017-12-06 | SABIC Global Technologies B.V. | Verfahren und zusammensetzungen zum hocheffizienten herstellung von biokraftstoff und/oder biomasse |
EP3256490A1 (de) | 2015-02-09 | 2017-12-20 | Research Development Foundation | Manipulierte immunglobulin-fc-polypeptide mit verbesserter komplementaktivierung |
EP3259346A4 (de) | 2015-02-20 | 2018-07-11 | Baylor College of Medicine | P63-inaktivierung zur behandlung von herzinsuffizienz |
AU2016230828B2 (en) | 2015-03-10 | 2020-10-22 | ACADEMISCH ZIEKENHUIS LEIDEN (h.o.d.n. LUMC) | T-cell receptors directed against the preferentially expressed antigen of melanoma and uses thereof |
EP4116316A1 (de) | 2015-07-04 | 2023-01-11 | Evaxion Biotech A/S | Proteine und nukleinsäuren, die in impfstoffen gegen pseudomonas aeruginosa nützlich sind |
US10526408B2 (en) | 2015-08-28 | 2020-01-07 | Research Development Foundation | Engineered antibody FC variants |
AU2016342179B2 (en) | 2015-10-20 | 2022-08-18 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Multi-lineage hematopoietic precursor cell production by genetic programming |
TW202344686A (zh) | 2015-10-30 | 2023-11-16 | 美國加利福尼亞大學董事會 | 從幹細胞產生t細胞之方法及使用該t細胞之免疫療法 |
LT3370733T (lt) | 2015-11-02 | 2021-10-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cd40 aktyvinimo ir imuninės kontrolės taškų blokados būdai |
CN108884159A (zh) | 2015-11-07 | 2018-11-23 | 茂体外尔公司 | 用于癌症治疗的包含肿瘤抑制基因治疗和免疫检查点阻断的组合物 |
JP6987068B2 (ja) | 2015-11-09 | 2021-12-22 | ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアThe Children’S Hospital Of Philadelphia | 癌マーカーおよび治療標的としてのグリピカン2 |
US10946084B2 (en) | 2016-02-22 | 2021-03-16 | Evaxion Biotech Aps | Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting Staphylococcus aureus |
EP3436049B1 (de) | 2016-03-31 | 2022-01-12 | Baylor Research Institute | Angiopoietin-ähnliches protein 8 (angptl8) |
WO2017216384A1 (en) | 2016-06-17 | 2017-12-21 | Evaxion Biotech Aps | Vaccination targeting ichthyophthirius multifiliis |
WO2017220787A1 (en) | 2016-06-24 | 2017-12-28 | Evaxion Biotech Aps | Vaccines against aearomonas salmonicida infection |
EP3478325A4 (de) | 2016-07-01 | 2020-01-15 | Research Development Foundation | Eliminierung von proliferierenden zellen aus stammzellbasierten transplantaten |
WO2018015575A1 (en) | 2016-07-22 | 2018-01-25 | Evaxion Biotech Aps | Chimeric proteins for inducing immunity towards infection with s. aureus |
WO2018035429A1 (en) | 2016-08-18 | 2018-02-22 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Peptides that inhibit syndecan-1 activation of vla-4 and igf-1r |
CA3034739A1 (en) | 2016-08-22 | 2018-03-01 | Biolumic Limited | System, device and methods of seed treatment |
AU2017319702A1 (en) | 2016-09-02 | 2019-04-11 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions involving interleukin-6 receptor alpha-binding single chain variable fragments |
CN110050061A (zh) | 2016-10-05 | 2019-07-23 | 富士胶片细胞动力公司 | 从具有MeCP2破坏的诱导多能干细胞生成成熟谱系 |
MX2019003689A (es) | 2016-10-05 | 2019-08-22 | Fujifilm Cellular Dynamics Inc | Metodos para diferenciacion dirigida de citoblastos pluripotentes a células inminitarias homocigotas de antígenos leucocitarios humanos. |
RU2646108C1 (ru) * | 2016-12-07 | 2018-03-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН | Способ получения трансгенных растений пшеницы с использованием биобаллистики |
AU2017375958A1 (en) | 2016-12-12 | 2019-07-04 | Multivir Inc. | Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases |
US11718648B2 (en) | 2017-01-05 | 2023-08-08 | Evaxion Biotech A/S | Vaccines targeting Pseudomonas aeruginosa |
CA3055396A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-13 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Hppd variants and methods of use |
BR112019018175A2 (pt) | 2017-03-07 | 2020-04-07 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | molécula, célula, planta, sementes, polipeptídeos recombinantes, método para produzir um polipeptídeo, planta, método para controlar ervas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade |
EP3612557B1 (de) | 2017-04-18 | 2022-01-19 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Antigenspezifische immuneffektorzellen |
WO2018208849A1 (en) | 2017-05-09 | 2018-11-15 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Methods to augment or alter signal transduction |
WO2019038594A2 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Biolumic Limited | TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY |
AU2018358016A1 (en) | 2017-11-03 | 2020-05-07 | Interna Technologies B.V. | MiRNA molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation |
EP3710014A1 (de) | 2017-11-14 | 2020-09-23 | Henry Ford Health System | Zusammensetzungen zur verwendung bei der behandlung und vorbeugung von kardiovaskulären störungen infolge von zerebrovaskulären verletzungen |
BR112020013715A2 (pt) | 2018-01-05 | 2020-12-01 | Ottawa Hospital Research Institute | vetores de vaccinia modificados |
WO2019145399A1 (en) | 2018-01-24 | 2019-08-01 | Evaxion Biotech Aps | Vaccines for prophylaxis of s. aureus infections |
KR20200135986A (ko) | 2018-03-19 | 2020-12-04 | 멀티비르 인코포레이티드 | 종양 억제인자 유전자 치료 및 cd122/cd132 작용제를 포함하는 암 치료를 위한 방법 및 조성물 |
JP2021519587A (ja) | 2018-03-30 | 2021-08-12 | ユニバーシティ オブ ジュネーブ | マイクロrna発現構築物及びその使用 |
US20220000932A1 (en) | 2018-09-28 | 2022-01-06 | Henry Ford Health System | Use of extracellular vesicles in combination with tissue plasminogen activator and/or thrombectomy to treat stroke |
US20220111031A1 (en) | 2018-10-22 | 2022-04-14 | Evaxion Biotech Aps | Vaccines targeting M. catharrhalis |
WO2020171889A1 (en) | 2019-02-19 | 2020-08-27 | University Of Rochester | Blocking lipid accumulation or inflammation in thyroid eye disease |
WO2020174044A1 (en) | 2019-02-27 | 2020-09-03 | Evaxion Biotech Aps | Vaccines targeting h. influenzae |
US20210069242A1 (en) | 2019-04-18 | 2021-03-11 | Dmitry Dmitrievich Genkin | Reprogramming of polymorphonuclear leukocytes |
WO2021016062A1 (en) | 2019-07-19 | 2021-01-28 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Chimeric antigen receptors containing glypican 2 binding domains |
CN115175680A (zh) | 2019-10-18 | 2022-10-11 | 加利福尼亚大学董事会 | Plxdc激活剂及其用于治疗血管病症的用途 |
WO2021113644A1 (en) | 2019-12-05 | 2021-06-10 | Multivir Inc. | Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer |
EP4087593A1 (de) | 2020-01-06 | 2022-11-16 | Evaxion Biotech A/S | Impfstoffe, die gegen neisseria gonorrhoeae gerichtet sind |
JP2023537558A (ja) | 2020-05-27 | 2023-09-04 | アンチオン バイオサイエンシーズ エスアー | 目的の抗原にcar t細胞をリダイレクトするためのアダプター分子 |
WO2021243256A1 (en) | 2020-05-29 | 2021-12-02 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Retinal pigmented epithelium and photoreceptor dual cell aggregates and methods of use thereof |
WO2021243203A1 (en) | 2020-05-29 | 2021-12-02 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Bilayer of retinal pigmented epithelium and photoreceptors and use thereof |
WO2022053130A1 (en) | 2020-09-09 | 2022-03-17 | Sid Alex Group, S.R.O. | Antago-mir-155 for treatment of v-src, c-src-tyrosine kinase-induced cancers |
WO2022133169A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Century Therapeutics, Inc. | Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity |
JP2024508088A (ja) | 2021-02-09 | 2024-02-22 | ユニバーシティ オブ ヒューストン システム | 全身送達及び抗腫瘍活性の向上のための腫瘍溶解性ウイルス |
US20240122865A1 (en) | 2021-02-19 | 2024-04-18 | Pfizer Inc. | Methods of Protecting RNA |
WO2022216963A1 (en) | 2021-04-08 | 2022-10-13 | Janssen Biotech, Inc. | Materials and methods for enhanced stem-cell like memory t cell engineering |
MX2023013079A (es) | 2021-05-03 | 2023-11-16 | Astellas Inst For Regenerative Medicine | Metodos de generacion de celulas maduras del endotelio corneal. |
KR20240005887A (ko) | 2021-05-07 | 2024-01-12 | 아스텔라스 인스티튜트 포 리제너러티브 메디슨 | 성숙한 간세포를 발생시키는 방법 |
EP4347796A1 (de) | 2021-05-26 | 2024-04-10 | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | Verfahren zur verhinderung des schnellen silencing von genen in pluripotenten stammzellen |
EP4366762A1 (de) | 2021-07-05 | 2024-05-15 | Evaxion Biotech A/S | Impfstoffe gegen neisseria gonorrhoeae |
WO2023081813A1 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Zip cytokine receptors |
WO2023081894A2 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Pre-effector car-t cell gene signatures |
WO2023089556A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Pfizer Inc. | Reducing risk of antigen mimicry in immunogenic medicaments |
GB2614309A (en) | 2021-12-24 | 2023-07-05 | Stratosvir Ltd | Improved vaccinia virus vectors |
WO2023144779A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Pfizer Inc. | Coronavirus antigen variants |
US20230295661A1 (en) | 2022-03-16 | 2023-09-21 | University Of Houston System | Persistent hsv gene delivery system |
WO2023213393A1 (en) | 2022-05-04 | 2023-11-09 | Evaxion Biotech A/S | Staphylococcal protein variants and truncates |
GB202206507D0 (en) | 2022-05-04 | 2022-06-15 | Antion Biosciences Sa | Expression construct |
WO2023240109A1 (en) | 2022-06-07 | 2023-12-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Multispecific molecules for modulating t-cell activity, and uses thereof |
WO2023240182A1 (en) | 2022-06-08 | 2023-12-14 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Disruption of kdm4a in t cells to enhance immunotherapy |
US20240010742A1 (en) | 2022-06-10 | 2024-01-11 | Research Development Foundation | Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof |
US20240003871A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Ipsc-derived astrocytes and methods of use thereof |
WO2024059787A1 (en) | 2022-09-16 | 2024-03-21 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Disruption of asxl1 in t cells to enhance immunotherapy |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4801545A (en) * | 1983-05-19 | 1989-01-31 | Plant Genetics, Inc. | Enhanced somatic embryogenesis using maltose |
US5036006A (en) * | 1984-11-13 | 1991-07-30 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
GB8611818D0 (en) * | 1986-05-15 | 1986-06-25 | Shell Int Research | Plant generation method |
EP0331083A3 (de) * | 1988-03-02 | 1990-11-28 | Schweizerische Eidgenossenschaft Eidgenössische Technische Hochschule (Eth) | Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen |
DK0397413T3 (da) * | 1989-05-12 | 1994-02-14 | Pioneer Hi Bred Int | Partikelkanon |
EP0814166A3 (de) * | 1989-08-09 | 1998-05-13 | DeKalb Genetics Corporation | Methoden und Zusammensetzungen für die Herstellung von stabil-transformierten, fruchtbaren monokotyledonen Pflanzen und Zellen dafür |
EP0442174A1 (de) * | 1990-02-13 | 1991-08-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Stabile Transformation von Pflanzenzellen |
DK0558676T3 (da) * | 1990-11-23 | 2000-09-25 | Aventis Cropscience Nv | Fremgangsmåde til transformering af enkimbladede planter |
AU2515592A (en) * | 1991-08-23 | 1993-03-16 | University Of Florida | A novel method for the production of transgenic plants |
US5610042A (en) * | 1991-10-07 | 1997-03-11 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for stable transformation of wheat |
AU2781892A (en) * | 1991-10-07 | 1993-05-03 | Ciba-Geigy Ag | Particle gun for introducing dna into intact cells |
IL101119A0 (en) * | 1992-03-03 | 1992-11-15 | Univ Ramot | Transgenic wheat |
-
1993
- 1993-11-01 US US08/147,261 patent/US5610042A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-13 WO PCT/US1993/012085 patent/WO1994013822A2/en active IP Right Grant
- 1993-12-13 DK DK94903608T patent/DK0674715T4/da active
- 1993-12-13 AU AU57493/94A patent/AU688297B2/en not_active Expired
- 1993-12-13 EP EP94903608A patent/EP0674715B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-13 ES ES94903608T patent/ES2134925T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-13 CA CA002151127A patent/CA2151127C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-13 DE DE69325389T patent/DE69325389T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-13 AT AT94903608T patent/ATE181364T1/de not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-03-06 US US08/812,215 patent/US5955362A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-08-23 GR GR990402132T patent/GR3031054T3/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0674715A1 (de) | 1995-10-04 |
EP0674715B1 (de) | 1999-06-16 |
EP0674715B2 (de) | 2006-10-11 |
ES2134925T3 (es) | 1999-10-16 |
AU688297B2 (en) | 1998-03-12 |
CA2151127A1 (en) | 1994-06-23 |
US5610042A (en) | 1997-03-11 |
ES2134925T5 (es) | 2007-06-01 |
DK0674715T3 (da) | 1999-11-29 |
DE69325389D1 (de) | 1999-07-22 |
AU5749394A (en) | 1994-07-04 |
CA2151127C (en) | 2008-03-25 |
DE69325389T2 (de) | 1999-11-25 |
WO1994013822A2 (en) | 1994-06-23 |
DK0674715T4 (da) | 2007-02-19 |
ATE181364T1 (de) | 1999-07-15 |
WO1994013822A3 (en) | 1994-09-15 |
US5955362A (en) | 1999-09-21 |
GR3031054T3 (en) | 1999-12-31 |
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Owner name: SYNGENTA PARTICIPATIONS AG, BASEL, CH |
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Representative=s name: PFENNING MEINIG & PARTNER GBR, 80339 MUENCHEN |
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8366 | Restricted maintained after opposition proceedings |