ES2134925T5 - Metodos para la transformacion estable de trigo. - Google Patents
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Abstract
Método para producir plantas de trigo fértiles transformadas de manera estable, comprendiendo dicho método: (a) escindir un embrión inmaduro de una planta de trigo; (b) preparar una placa Petri de dicho embrión inmaduro escindido en un medio de crecimiento; (c) bombardear dicho embrión inmaduro escindido y en la placa Petri con una secuencia de DNA de interés de 0 a 10 días después de la escisión; (d) mantener el embión o callus en desarrollo durante 1 a 10 semanas en la oscuridad en medio de crecimiento con o sin presión de selección; (e) regenerar a partir del mismo plantas transformadas fértiles en presencia de selección.
Description
Métodos para la transformación estable de
trigo.
La presente invención trata de la transformación
y regeneración de trigo fértil transformado.
El trigo es una de las cosechas más importantes
en el mundo. Mientras que normalmente crece en un amplio rango de
ambientes, la mayor producción de trigo se produce en U.S.A., China,
Australia, Canadá, India y Europa.
La mayoría de la producción de trigo se consume
en forma de harina. El trigo utilizado para el pan corresponde al
80% del consumo total de trigo.
Es necesario el desarrollo de un sistema de
transformación eficiente para el análisis molecular de la expresión
de genes en las plantas. En cosechas de plantas de cereales, este
desarrollo ha sido ralentizado por dificultades encontradas en la
regeneración de las plantas y en la insusceptibilidad de las
monocotilideneas a la transformación mediada por
Agrobacterium. La mayoría de los progresos que se han hecho
en la transformación de cereales ha sido produciendo arroz y maíz
transgénicos. El progreso del trigo se ha visto impedido por la
incapacidad de establecer técnicas apropiadas para la regeneración
de plantas fértiles después de su transformación.
Hay un gran número de informes publicados sobre
la expresión transitoria de genes exógenos de trigo. Sin embargo,
el único estudio de plantas de trigo transformadas estables en Vasil
et al. (Biotechnology 10 (6), 1992, 667-74)
implica un método laborioso que produce plantas transformadas a una
baja frecuencia.
Así, se necesitan métodos biotecnológicos para
el desarrollo de variedades de trigo de elevada producción, de
elevado valor nutricional y resistentes a enfermedades. Dichos
métodos son necesarios para complementar el cultivo tradicional
actualmente en uso.
La presente invención está enfocada hacia un
método para la transformación estable de trigo con secuencias de
ácidos nucleicos de interés y la regeneración de plantas de trigo
transgénicas fértiles. En particular trata de un método para
producir plantas estables de trigo fértiles transformadas, siendo
dicho método como se define en la reivindica-
ción 1.
ción 1.
En un modo de realización preferente de la
invención, los embriones inmaduros se bombardean con partículas
recubiertas con secuencias de DNA de interés cuya secuencia
comprende un gen dhfr, los embriones bombardeados se hacen crecer
en un medio que contiene metotrexato para seleccionar tejido
transformado y plantas fértiles transformadas y regeneradas de
dicho tejido transformado. Los embriones de trigo se transforman
usando microproyectiles bombardeados a alta velocidad y se
regeneran plantas estables transformadas. El método produce plantas
estables de trigo fértil transformadas, capaces de producir
progenie que está transformada establemente y que expresa el gen
exógeno de interés.
Se proporciona un método rápido y de elevada
eficacia para la transformación estable de los embriones de trigo y
para la regeneración de plantas de trigo transgénicas. El método
implica la transformación estable de un embrión inmaduro de trigo y
la regeneración de plantas de trigo desde embriones de trigo.
Además, usando los métodos de la invención, plantas transgénicas de
trigo fértiles pueden crecer hasta madurar con alta frecuencia. Las
plantas transformadas fértiles, son capaces de producir progenie
transformada que expresa el gen(genes)
exógeno(s).
El método implica someter a embriones inmaduros
de trigo a bombardeo con proyectiles de alta velocidad usando ácido
nucleico o en particular genes de interés.
Particularmente las espigas que crecen en
plantas de trigo de invernadero se recogen alrededor de 10 a 16,
generalmente alrededor de 12 días después de la florescencia. Las
semillas se separan de las espigas y de la superficie esterilizada.
Posteriormente se escinden los embriones y se cultivan en Placas
Petri en medio de crecimiento. De 0 a 10 días después de la
escisión, se transfiere el DNA al embrión usando un dispositivo de
bombardeo de partículas. Después de la transferencia de DNA el
embrión o callus en desarrollo se mantiene sin selección de presión
y entonces el tejido se regenera en presencia de selección.
Se distingue a través de los pasos de la
invención que el método implica el crecimiento de embriones
inmaduros o callus en desarrollo, en un medio de cultivo celular.
Es generalmente útil durante todo el método aquí descrito, el uso
de un medio basal que comprende micronutrientes, macronutrientes,
una fuente de carbono, hierro, vitaminas y reguladores de
crecimiento de plantas. Los reguladores de crecimiento de plantas
son conocidos en el estado de la técnica e incluyen auxinas,
citokininas y giberilinas. Dichos reguladores pueden depender del
paso en el procedimiento y del genotipo de trigo utilizado en
particular.
Los reguladores de crecimiento de las plantas
útiles en la invención incluyen aquellos con funciones como las de
auxina, tales como IAA, NAA, 2,4-D,
2,4,5-T dicamba, ácido
p-clorofenoxiacético y similares. Dichos
reguladores pueden añadirse al medio que contiene maltosa con un
nivel de aproximadamente 0.5 mg/l a aproximadamente 100 mg/l,
preferentemente de aproximadamente 1 mg/l a aproximadamente 40
mg/l, y más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente
10 mg/l.
Los embriones inmaduros para ser transformados
son bombardeados con un dispositivo de bombardeo de elevado número
de partículas. El bombardeo de partículas ofrece un método rápido de
transformación. Véase, generalmente, Finer et al. (1992)
Plant Cell Reports 11:323-328; Christou P (1990)
Physiologia Plantarum 79:210-212; Wang et
al. (1988) Plant Molecular Biology 11:433-439;
Daniell et al. (1991) Plant Cell Reports
9:615-619; Klein et al. (1988) Proc. Natl.
Acad. Se¡. USA 85:4305-4309; Klein et al.
(1987) Nature 327:70-73; Gordon-Kamm
et al. (1990) The Plant Cell 2:603-618; Oard
et al. (1990) Plant Physiol. 92:334-339;
Sanford JC (1990) Plysiologia Plantarum 79:206-209;
Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833-839
Christou et al. (1988) Plant Physiol
87:671-674; Sautter et al. (1991)
Bio/Technology 9:1080-1085; Iida et al.
(1990) Theor. Appl. Genet. 80:813-816; y Christou
et al. (1991) Bio/Technology 9:957-962.
Mientras que varios de los dispositivos de
bombardeo de partículas están descritos en la literatura, un
dispositivo preferido es la pistola de partículas descrita en WO
93/07256 incorporada aquí como referencia. Dicha pistola de
partículas descrita es capaz de introducir partículas que llevan
material genético en una amplia variedad de células. La pistola
comprende:
\bullet un bloque volador para acelerar y
dirigir las partículas que llevan material genético;
\bullet un gas inerte que dirige el
dispositivo lanzador capaz de controlar exactamente la velocidad
del bloque
\bullet un arreglo de parada/liberación
para parar el bloque volador y permitir vuelo libre de las
partículas recubiertas con material genético hacia células
intactas; y
\bullet seguros concomitantes y artículos
de seguridad.
La pistola tiene un ciclo de disparo rápido así
como una fuerza consistente y precisión de los disparos. La pistola
proporciona una fuente de propulsión segura, controlada,
reproducible y ajustable. Un beneficio adicional de la pistola se
describe en WO 93/07256 en la que la pistola requiere menos DNA para
bombardear que otros dispositivos conocidos en el estado de la
técnica. Sin embargo, otros dispositivos para bombardear células de
plantas como por ejemplo el sistema de aceleración por helio
(Sandford et al., Technique-J. Meth. in Cell
und Molec. Biol. 3:3-16, 19991) son igualmente
preferidos.
Generalmente los embriones se disparan al menos
una vez. Sin embargo, se pueden realizar múltiples disparos a los
embriones, para aumentar la frecuencia de transformación. Así
sometiendo a los embriones a múltiples disparos de partículas
recubiertas con DNA constituye un modo de realización preferente de
la invención. Se ha demostrado que producen mejores resultados
alrededor de dos disparos por transformación.
Las partículas usadas como portadoras de DNA en
los bombardeos eran generalmente de aproximadamente 0.5 a
aproximadamente 20 micrómetros de diámetro, más específicamente
aproximadamente 1.0 micrómetros. Las partículas están recubiertas
con al menos de aproximadamente 0.5 \mug a aproximadamente 2.0
\mug, preferentemente con aproximadamente 1 \mug DNA por peso
de las partículas. Las partículas útiles en la invención se pueden
obtener comercialmente. Por ejemplo, se pueden utilizar partículas
de oro de la compañía BioRad.
La pistola de partículas de WO 93/07256 permite
el control de la presión. Se puede utilizar una presión con valores
de aproximadamente 500 psi a aproximadamente 2500 psi,
preferiblemente aproxima5damente 1900 psi.
Los embriones pueden ser sometidos a un
tratamiento de plamolisis antes del bombardeo, después del
bombardeo, o preferentemente ambos, antes y después del bombardeo.
El tratamiento de plasmolisis puede realizarse por dilución de los
embriones en un medio líquido con un agente osmótico añadido o por
transferir embriones a medios semisolidos con agentes
plasmoliticos. Generalmente los osmóticos pueden ser cualquier
azúcar, tales como sorbitol, manitol, sacarosa y similares. El
medio de crecimiento puede comprender adicionalmente auxina.
Después de bombardear, los embriones se hacen
crecer durante varios días en la oscuridad en un medio de
crecimiento con auxina. Los embriones se hacen crecer durante de 1
a 10 semanas, más específicamente de 1 a 7 semanas, antes de ser
sometidos a selección de presión.
Un número de agentes selectivos y genes
resistentes son conocidos en el estado de la técnica. (Véase, por
ejemplo, Hauptmann et al. (1988) Plant Physiol. 86:
602-606; Dekeyser et al. (1988) Plant
Physiol. 90:217-223; Eichholtz et al. (1987)
Somatic Cell and Molecular Genetics 13: 67-76;
Meijer et al. (1991) Plant Molecular Biology
16:807-820; y Dekeyser et al. (1989)
90:217-223). Se pueden utilizar inhibidores tales
como antibióticos aminoglicosidados que interfieren con la
maquinaria de traducción de células eucariotas y procariotas. Dichos
inhibidores incluyen kanamicina, G418, higromicina, etc... Dichos
inhibidores pueden ser inactivados por reacciones de fosforilación
mediadas por los productos del gen Tn 5 neomicin fosfotransferasa II
(npt-II) o el gen de resistencia a higromicina B de
E. coli (véase, por ejemplo, Herrera-Estrella
et al. (1983) EMBO J 2:987-995; Waldron
et al. (1985) Plant Mol Biol 5: 103-108; y
las referencias citadas en ellos).
Adicionalmente, se pueden utilizar agentes
selectivos tales como bleomicina, metotrexato y fosfinotricina. Se
han conseguido resultados favorables utilizando metotrexato. El
metotrexato se une al sitio catalítico de la enzima
hidrofolatoreductasa, resultando una deficiencia de timidilato y por
consecuente la muerte celular. (Weikheiser, WC (1961) J Biol Chem
236: 888-893). Los informes encontrados en la
literatura indican que constructos quiméricos que contienen un gen
bacteriano o de ratón dhfr, pueden conferir resistencia a
niveles bajos de metotrexato en plantas de tabaco, nabo, petunia y
maíz transformados. (Véase, DeBlock et al. EMBO J
3:1681-1689; Brisson et al. Nature
310:511-514; Eichholtz et al. (1987) Somatic
Cell and Molecular Genetics 13:67-76; y Dekeyser
et al. (1989) Plant Physiol. 90:217-223). Se
prefieren medios que comprenden metotrexato o higromicina como
medios para el paso selectivo de crecimiento de tejido
transformado.
Uno de los mayores obstáculos a la producción de
plantas de trigo transformadas han sido los métodos para
regeneración de plantas de tejidos transformados. Generalmente para
la regeneración de plantas, se hace crecer el callus transformado
en o un medio libre de hormonas que contiene sacarosa, en un medio
que contiene una citokina o en un medio que contiene auxina y
giberelina. Los cultivos de callus son transferidos a la luz. El
desarrollo de plantas se continua en un medio libre de hormonas o un
medio con auxina. Después del desarrollo de las raíces y disparos,
las plántulas se transfieren al suelo y crecen hasta hacerse
maduras.
En diferentes fases del proceso, se extrae DNA
del tejido (callus y plantas) y se prueba para confirmar la
transformación. Los métodos para aislar el DNA del callus y tejidos
así como para confirmar la presencia de DNA de interés, se pueden
encontrar en el estado de la técnica. Dichos métodos para confirmar
incluyen análisis PCR tanto como hibridación Southern. Véase
Southern, EM (1975) J Mol Biol 98:503 y Mullis, KB (1987) Meth in
Enzymology 155:335.
Como será evidente para un experto en la
materia, ahora que se ha proporcionado un método para la
transformación estable del trigo, cualquier gen de interés puede
utilizarse en los métodos de la invención. Por ejemplo, una planta
de trigo puede expresar enfermedades y genes de resistencia a
insectos, genes que confieren valor nutricional, genes que
confieren esterilidad femenina o masculina, antifúngicos,
antibacterianos o genes antivirales y similares. Asimismo, el
método puede ser utilizado para transferir cualquier ácido nucleico
para controlar la expresión de genes. Por ejemplo, el DNA a
transferir puede codificar RNA antisentido.
Utilizando los métodos aquí descritos, las
líneas de callus transformadas se obtienen con una elevada eficacia
comparada con otros informes publicados. De hecho puede encontrarse
hasta un 50% de eficacia tal y como confirma el análisis PCR y/o
Southern. Experimentos de transformación rutinarios producen
transformantes estables a una frecuencia tal alta como
aproximadamente 50% basada en el número de transformantes obtenidos
por número de disparos diana. Asimismo, por la utilización de
selección de metotrexato, plantas regeneradas dan positivo para
transformación.
Cultivos embriogenéticos mejorados de trigo
pueden obtenerse usando previamente material regenerado como fuente
de material de partida. Dichos cultivos mejorados se conocen como
"líneas recicladas" desde que son "cicladas" a través del
proceso de cultivo de tejido más de una vez. El material de partida
para estos cultivos mejorados puede ser bien embriones inmaduros
obtenidos directamente de plantas regeneradas, o bien el material de
partida que puede ser semillas de plantas regeneradas que han
crecido como una fuente de embriones inmaduros. Los cultivos
embriogenéticos así derivados han mejorado la frecuencia de
iniciación y la fertilidad de los regenerantes si lo comparamos a
las líneas no recicladas tradicionales. Estas mejoras aumentan
significativamente la facilidad y eficacia con que el trigo
transgénico y su progenie pueden obtenerse.
La figura 1 muestra callus tipo II de trigo
inducido de embriones inmaduros.
La figura 2 muestra callus tipo M de trigo
inducido de embriones inmaduros.
Plantas de trigo de genotipo UC703 se hacen
crecer hasta floración y autopolinización. Las espigas que contienen
embriones de longitud entre 1 y 2.5 mm se quitaron de las plantas y
fueron esterilizadas con una solución de Clorox al 10% durante 10
minutos. Los embriones se retiraron de las semillas inmaduras y se
situaron con el eje hacia abajo en el medio de Murashige y Skoog
que contiene de 5 a 10 mg/l de 2,4-D, 13.7% p/v de
maltosa, 100 mg/l de prolina y 100 mg/l de
mio-inositol solidificado con
0.7-0.8% p/v de fitagar o 0.1-0.2%
de gelrite (medio de iniciación). Después de un cultivo de tres
semanas en la oscuridad a 27ºC, se reconoce un callus preferido por
la presencia de embriones somáticos (callus tipo M) globulares bien
formados que se desarrollan en el órgano escutiforme de algunas
plantas. Estos calli fueron retirados y situados o en un medio MS
que contiene de 1.0 a 5.0 mg/l de 2,4-D y
2-3% de sacarosa o en un medio que contiene un bajo
nivel de maltosa (5%) antes de situarla en el medio de sacarosa. El
material se subcultiva cada semana en medio MS fresco que contiene
3% de sacarosa.
Plantas de trigo de genotipo UC703, MIT, Orofen,
Yecoro rojo y Chris se hacen crecer hasta floración y
autopolinización. Los embriones inmaduros se retiran de las espigas
y se cultivan en un medio Murashige y Skoog que contiene:
1 mg/l de 2,4-D mas 2% de
sacarosa (1MS),
1 mg/l de 2,4-D mas 2% de
maltosa (1MS2M),
1 mg/l de 2,4-D mas 9% de
maltosa (1MS9M),
1 mg/l de 2,4-D mas 13.7% de
maltosa (1MS13.7M), o
10 mg/l de 2,4-D mas 13.7% de
maltosa (10MS13.7M)
para inducir la formación de callus
tipo M. Después de tres semanas de cultivo en la oscuridad a 27ºC,
tanto la frecuencia de inducción (%) de callus tipo M, callus tipo
I, como las estructuras no morfogénicas de los embriones inmaduros
de los genotipos sometidos a ensayo se
contabilizaron.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Plantas de trigo de genotipo UC703 se hacen
crecer hasta floración y autopolinización. Se retiran los embriones
inmaduros de las espigas y se sitúan con el eje del embrión hacia
abajo en el medio de Murashige y Skoog (MS) que contiene de 5 a 10
mg/l de 2,4-D y 13.7% p/v de maltosa solidificada
con 0.8% de fitagar. Después de tres semanas de cultivo en la
oscuridad a 27ºC, la frecuencia de inducción de callus tipo M de los
embriones inmaduros cultivados se contabiliza.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio
1
| Frecuencia de inducción de callus tipo M: 52% |
\newpage
Medio
2
| Frecuencia de inducción de callus tipo M: 44% |
A las células para el bombardeo se le hace un
tratamiento de plasmolisis antes y después del bombardeo. Se mide
el volumen de empaquetamiento celular y las células se diluyen en
medio MS 1 líquido con un agente osmótico añadido: sorbitol 0.4 M
para células en suspensión y sorbitol 0.6 M para células callus. Las
células se diluyeron de tal forma que el volumen final celular por
diana era de 1/20 ml para una suspensión fina y de 1/10 ml para
callus. Las células diluidas se disponen en un matraz de 250 ml que
contiene una varilla de agitación y se agita durante un mínimo de
30 minutos, hasta algunas horas. Para preparar placas Petri con las
células, se aíslan 2 ml del matraz y se pipetea en la parte
superior de un matraz de vacío al que se le coloca un filtro
Whatman 2.5 cm GFA. Se aplica el vacío hasta que las células se
secan en el filtro. Los filtros se sitúan en placas Petri de 60 x
15 mm que contienen 5 ml de medio sólido de plasmolisis posterior al
bombardeo, que contiene MS 1, sorbitol 0.2 M para células en
suspensión, o sorbitol 0.4 M para células callus. Se prepararon
placas Petri con dos filtros en cada disco.
Para el bombardeo de partículas se usan los
siguientes plásmidos:
pSOG30 es un vector de expresión de una
\beta-glucuronidasa (Gus) derivada del plásmido
pB1121, comprada a los Laboratorios Clontech, Palo Alto,
California. El intron 6 del gen Adh1 del maíz, se amplifica por PCR
del plasmido pB428, descrito en Bennetzen et al. Proc. Natl.
Acad. Sci., USA 81: 4125-4128 (1987) y ligado al
sitio BamH1 de pB1121, que está entre el promotor CaMV 35S y el gen
Gus. Un virus de maíz clorótico moteado de 17bp (MCMV) líder,
descrito en Lommel et al., Virology
181:382-385 (1991), se inserta en el gen líder
35S-Gus no traducido. La fusión del gen final
contiene la estructura: promotor 35S-intron 6 de
Adh1-lider
MCMV-Gus-terminador Nos, todos en
la espina dorsal del vector pUC19.
pSOG35 es un vector de expresión de
dihidrofolatoreductasa (dhfr). Este constructo se deriva de fusionar
el promotor 35S, el intron 6 Adh 1, y MCMV lider descrito
anteriormente al gen dhfr del plásmido pHCO, descrito en Bourouis y
Jarry, EMBO J. 2:1099-1104 (1983). La fusión del gen
final contiene la estructura: promotor 35S-intron 6
de Adhl-MCMV
lider-dhfr-terminador Nos, todos en
la espina dorsal del vector pUC19.
pTG48 comprende el gen Gus bajo control
del promotor de la antera especifica ant43D y un gen dhfr en la
espina dorsal de pUC19. Es el resultado de la combinación de cuatro
fragmentos diferentes de DNA. El fragmento 1 se obtiene de pSOG35
después un corte de restricción con HindIII y EcoRI. El terminal
EcoRI del fragmento aislado que contiene el gen dhfr se adaptó a un
final de restricción SalI. El fragmento 2 consistente en un
promotor de la antera específica ant43D aislada del plásmido pCIB
3178 después un corte de restricción con HindIII y XbaI. El
plásmido pCIB 3178 está descrito con detalle en la solicitud de
patente europea No 93810455.1 donde se incorporan las partes más
relevantes por referencia y fueron depositadas con el no de acceso
NRRL B-18978. El fragmento 3 fue obtenido del
plásmido pSOG30 después un corte de restricción con XbaI y EcoRI y
contiene el gen Gus, y el fragmento 4 corresponde al vector pUC19
cortado con SalI y EcoRI que se puede adquirir comercialmente.
Las partículas de oro (1.0 \mum; de
Bio-Rad) se lavaron introduciendo alicuotas en un
tubo de microcentrífuga, añadiendo aproximadamente 1 ml de etanol
100%, sometiéndolo a movimiento vortical, precipitando, retirando
el sobrenadante, y repitiendo dos veces con agua estéril. Después
del último lavado, se retira cuanta agua sea posible y se añade
solución de polilisina (0.02% de polilisina + acetato de amonio 15
mM) para poder sumergir completamente las partículas. Las
partículas se someten a movimiento vortical, se centrifugan, y se
retira el sobrenadante. Las partículas se dejan secar durante la
noche en una campana de flujo laminar durante 30 minutos, bajo una
corriente suave de nitrógeno.
Para una preparación "completa" de las
partículas, se pesan 10 mg de partículas y se colocan en un tubo de
microcentrífuga que contiene una varilla de agitación. Se añaden 100
\mul (1 \mug/\mul) de DNA, seguido de movimiento vortical. A
continuación, se añaden 10 \mul de Na_{2}HPO_{4} 100 mM,
seguido de movimiento vortical. Se añaden 10 \mul de CaCl_{2}
100 mM seguido de movimiento vortical. Finalmente se añaden 380
\mul de etanol 100%, seguido de movimiento vortical. Mientras se
agita vigorosamente la suspensión, se pipetean 3 \mul dentro de
voladores de plástico (proyectiles). Las partículas se dejan secar
dentro de los voladores al menos durante 15 minutos antes de
bombardear.
Las placas Petri que contienen los filtros
celulares se invierten sobre la plataforma en la cima de la etapa y
se centran sobre la apertura de vuelo de partículas. La tapadera
transparente se sitúa sobre el borde superior de la plataforma. Se
coloca un microproyectil dentro de la recámara y se cierra. El botón
de "armar" se empuja para llenar el reservorio con la cantidad
adecuada de gas de helio (normalmente 1800-1900
psi). El vacío en la cámara se llevó hasta aproximadamente 27 mm.
Después de apagar el vacío, se empujan los botones de "armar"
y "disparar". El botón de "armar" se empuja hacia de
posición de "apagado". Cada filtro se dispara normalmente dos
veces.
Después del bombardeo las células se mantienen
en la oscuridad durante la noche. Al día siguiente, los filtros se
retiran del medio de plasmolisis y se colocan en un medio MS1. Se
realiza la selección a los 7-10 días después del
bombardeo para células en suspensión y después de 14 días para
células callus. Las células se rascan de los filtros y se extienden
en la superficie de placas que contienen MS1 más 2 mg/l de
metotrexato. (Los transformantes se obtienen inicialmente por
selección con 4 mg/l de metotrexato). Las placas se incuban en la
oscuridad durante varias semanas. Las colonias resistentes que
aparecen después de unas semanas se transfieren a MS1 + 4 mg/1 de
metotrexato. Las colonias que continúan la proliferación durante
aproximadamente 3-4 semanas se transfieren a un
medio de mantenimiento "MS 0.5", que es una solución acuosa de
sales de MS, vitaminas, hierro, sacarosa al 3%, agar al 0.7%, 0.5
mg/l de 2,4-D. El tejido se subcultiva en este medio
bisemanalmente hasta que aparezcan las estructuras embriogenéticas
o tejidos que parezcan susceptibles de regeneración.
El tejido se transfiere a un medio MS que
contiene o 3 mg/l de BAP o 1 mg/l de NAA + 5 mg/l de GA, y las
placas se sitúan a la luz. Después de 2-4 semanas,
el tejido se transfiere a un medio MS sin hormonas. Los disparos
que aparecen se sitúan en contenedores bien con medio MS sin
hormonas o bien con medio MS con 0.5 mg/l de NAA. Cuando han
crecido suficientes raíces y brotes, las plantulas se trasplantan al
suelo y se sitúan en un fitotron.
Se utiliza alrededor de 20 mg de tejido callus
para el análisis PCR. El DNA se extrae usando un método rápido de
fenol/cloroformo:isoamil alcohol y se usan 2 \mul por reacción.
Los primers se diseñaron para amplificar la región del extremo 5'
del gen adh al extremo 3' del gen dhfr.
El callus tipo II derivado de callus tipo M se
obtiene de embriones inmaduros de genotipo UC703 de trigo de
primavera usando los métodos descritos anteriormente. La línea de
callus resultante, llamada UC703-0612, es friable,
embriogenética, y se propagan en serie, in vitro. Un
dispositivo de microproyectil se utiliza para llevar el DNA al
callus tipo II. pSOG30 y pSOG35 se co-precipitan en
partículas micrométricas de oro y se introducen en células de
plantas.
Dos semanas después del bombardeo, se
transfieren las células a un medio de mantenimiento de callus que
contiene 4 mg/l de metotrexato. Las colonias resistentes que
proliferan se subcultivan durante un periodo de meses y luego se
regeneran en ausencia de metotrexato. El análisis PCR se hace en
muestras de callus para confirmar la presencia del gen dhfr. Una
colonia SJ3-2A, produce una planta T_{0}
(SJ3-2A-1) in vitro que se
transfiere eventualmente al suelo y crece en un invernadero. Las
muestras de hojas de esta planta se ensayan para la actividad de la
enzima Gus utilizando protocolos estándares (Jefferson, Plant
Molecular Biology Reporter Vol. 5 No. 4, 1987) y son positivas. Se
extrae el DNA de esta planta y el análisis Southern confirma la
presencia de gen dhfr.
La planta
SJ3-2A-1 se hace crecer hasta la
madurez en un invernadero y se poliniza con polen de tipo salvaje
de plantas UC703. Se desarrollan dos semillas, cuyos dos embriones
inmaduros se escinden y germinan. Un embrión recuperado produce una
planta T_{1}, (conocido como RE1), mientras que el segundo embrión
recuperado se sitúa en medio inductor de callus y consecuentemente
produce diez plantas T_{1}, dos de las cuales se conocen como RE2
y RE3. Las muestras de hojas de RE1 se ensayan para la actividad
enzimática de Gus y es positivo. El análisis PCR para la presencia
de secuencias promotoras 35S se hacen sobre RE1, RE2, y RE3 y las
tres plantas son positivas. El análisis Southern se hace para
probar la presencia del gen y de la Gus en estas tres plantas
progenie, y las tres son positivas para el gen. Las plantas RE1, RE2
y RE3 T_{1}(también conocidas como RE2B) se polinizan con
polen de tipo salvaje UC703 para producir plantas T2. Se recuperan
muchas semillas desarrolladas en cada planta y embriones inmaduros,
y se germinan in vitro. Se hacen ensayos fluorimétricos Gus
y los tranformantes se identifican de una población segregada.
Los embriones inmaduros de genotipo UC703,
0.75-1.5 mm de longitud, se escinden y se preparan
placas Petri en medio MS que contiene 5 mg/l de
2,4-D y sacarosa al 3%, 30 embriones por placa.
Se co-precipitan dos plásmidos
en partículas de oro de tamaño micrométrico y se introducen en
células de plantas por el dispositivo de Dupont Biolistics usando
técnicas estándar, según se publica en los manuales de operación.
Un plásmido, pCIB3089, contiene el promotor del virus mosaico de
coliflor 35S (Nature 313:810-812) fusionado al DNAc
del gen regulador de antocianos de maíz B-peru
(Plant. Mol. Biol. 17:127-130, 1991 y Genes and
Development 6:864-875, 1992), con el intron no 2
del gen alcohol deshidrogenasa 1 (Nucleic Acid Research
12:3983-4000, 1984) situado entre el extremo 3' de
la secuencia codificante y 5' a la secuencia terminal 35S. El otro
plásmido, pCIB4436, contiene el promotor CaMV 35S (Nature
313:810-812, 1985) fusionado con el DNAc del gen C1
regulador de los antocianos de maíz (EMBO Journal
9:2517-2522, 1990; Genes and Development
5:298-309, 1991, y Genes and Development
6:864-875, 1992), con el intron no 9 del gen
PEP-carboxilasa de maíz (Plant Mol. Biol.
12:579-589, 1989) situado entre el extremo 3' de la
secuencia codificante y 5' al terminador 35S. Juntos estos dos genes
pueden contar como un marcador de transformación.
Después de 22 días, se contabilizan los
embriones para repuesta de callus tipo I y el callus se transfiere
a un medio de proliferación. Veinte de noventa y cuatro embriones
muestran una respuesta de callus tipo I. El tejido de once de los
veinte embriones que responden se transfiere a medio de regeneración
de plantas aproximadamente un mes después. Once plantas se hacen
crecer hasta madurez en un invernadero y todas las plantas producen
semillas. Una planta (JN11-1800-3#1)
produce semillas coloreadas de rojo, presumiblemente debido a la
expresión de uno o más genes reguladores insertados. Se obtienen
cinco muestras de DNA de esta planta y se hace un análisis PCR para
comprobar la presencia del promotor 35S, el gen C1 y el gen
B-peru. Los resultados del PCR son positivos para
estas secuencias en tres reacciones independientes.
Para analizar la generación T_{1}, se
escinden, germinan y analizan cincuenta y siete embriones inmaduros
de dicho PCR positivo. De estos, cuarenta y una plantas T_{1} son
PCR positivas para ambos genes, B-peru y C1.
Veintidós plantas derivadas de semillas T_{1} también se encuentra
que son PCR positivas para estos genes. Se hace el análisis
Southern en los parentales y tres progenies T_{1} PCR positivas.
Todos según este análisis son positivos para B-peru
y negativos para C1. La generación T2 se hace crecer en un
invernadero para producir semillas.
Embriones inmaduros (de 0.75 a 1.0 mm de
longitud) de genotipo UC703 de trigo se cultivan en placas Petri en
un medio Murashige y Skoog (Physiologia Plantarum 15:
473-497, 1962) que contiene 3 mg/l de
2,4-D y sacarosa al 3%. Se preparan placas Petri
con veinte embriones en cada placa de medio. Tres días más tarde los
embriones inmaduros se transfieren al mismo medio, pero conteniendo
adicionalmente 15% de sacarosa para plasmolizar el tejido antes del
suministro del gen.
Los plásmidos pAct1-D (The Plant
Cell 2:163-171, 1990) y pSOG35 se hacen precipitar
sobre partículas de tamaño micométrico de oro utilizando
procedimientos estándares. Se dispara dos veces a cada placa de
embriones con el dispositivo de helio de DuPont Biolistics
utilizando una presión de estallido de 900 psi. Se bombardean un
total de cuatro placas diana utilizando la pantalla estándar de 80
mesh y se disparan cuatro placas sin la pantalla. Aproximadamente
cuatro horas después del bombardeo se transfieren otra vez los
embriones a medio Murashige y Skoog que contiene sacarosa al 3%.
Aproximadamente un mes después, el explante de embrión con el
callus embriogenético en desarrollo se transfieren a un medio de
regeneración (Murashige y Skoog + 1 mg/l de NAA, 5 mg/l de GA), que
posteriormente contiene como agente de selección 2 mg/l de
metotrexato. Después de aproximadamente un mes, los brotes
desarrollados se transfieren a contenedores estériles más grandes
conocidos como "GA7s" que contiene sales de fuerza media de
Murashige y Skoog, sacarosa al 2% y 2 mg/l de metotrexato.
Se extrae DNA de cuatro plantas aisladas y
hechas crecer como se ha descrito. El análisis PCR para la presencia
de promotor 35S nos demuestra que dos plantas son positivas. Estas
plantas transgénicas se marcan SJ30-44 y
SJ30-121. Se hace el ensayo para la actividad de Gus
para las plantas SJ30-121 y resulta ser fuertemente
positiva. Las plantas se transfieren al suelo para su propagación en
el invernadero. Se obtienen plantas transformadas fértiles.
Se cultivan en placas Petri embriones inmaduros
(0.75-1.0 mm de longitud) de genotipo UC703 en medio
Murashige y Skoog que contiene 3 mg/l de 2,4-D y
sacarosa al 3%. Después de aproximadamente cuatro horas los
embriones se cultiva en Placas Petri con el eje del embrión hacia
abajo en las placas que contienen medio Murashige y Skoog con
maltosa al 15%, sacarosa al 3% y 3 mg/l de 2,4-D
cubierto con un papel de filtro que sostiene una gruesa capa de
agarosa que contiene los mismos componentes. Los embriones se dejan
plasmolizar durante 2-3 horas antes del
bombardeo.
Se hace precipitar DNA de
pAct1-D (The Plant Cell 2:163-171,
1990) y pSOG35 sobre partículas de oro de tamaño micrométrico
utilizando procedimientos estándares. Cuatro placas diana con veinte
embriones por diana se disparan dos veces con el dispositivo de
helio de DuPont Biolostics utilizando una presión de estallido de
1100 psi. Las placas se disparan con una pantalla de 80 mesh
situada entre la plataforma portadora y la diana. Las dianas se
sitúan en la oscuridad a 26ºC durante 24 horas después del bombardeo
antes de que las capas con los embriones se sitúen en las placas
que contienen medio Murashige y Skoog con 3 mg/l de
2,4-D y sacarosa al 3%. Los embriones individuales
se retiran de las capas y se sitúan directamente en un medio fresco
de la misma composición durante otras 48 horas.
Aproximadamente 6 semanas después del suministro
del gen, el tejido resultante se sitúa en medio Murashige y Skoog
con 3 mg/l de 2,4-D y sacarosa al 3% con 0.2 mg/l de
metotrexato durante un periodo de 3 semanas. El tejido se sitúa
entonces en un medio regenerativo que comprende medio Murashige y
Skoog con 1 mg/l de ribosida zeatina y 1 mg/l de metotrexato.
Después de 2 semanas, las plantulas regeneradas se sitúan en
contenedores estériles llamados "GA7s" con sales de Murashige
y Skoog de fuerza media, sacarosa al 2%, 1 mg/l de NAA y 4 o 8 mg/l
de metotrexato.
El DNA se extrae del tejido de las hojas de
cuatro plantas derivadas de dos placas diana diferentes y se realiza
un PCR para la presencia de gen dhfr. Los cuatro son positivos para
la presencia de dhfr. Dos de las plantas se mandan al invernadero
para su propagación.
Para usar plantas regeneradas como material de
partida para estos cultivos mejorados de plantas se regeneran del
callus friable inducido por maltosa descrito anteriormente en un
medio Murashige y Skoog con 3 mg/l de BAP y sacarosa al 3%. Dicho
callus friable inducido por maltosa es un cultivo celular tipo II
marcado UC703-0612, se descongela de la
criopreservación y se sitúa en un medio de mantenimiento (medio
Murashige y Skoog + 1 mg/l de 2,4-D + sacarosa al
3%) antes de la regeneración. Para el cultivo de embriones, las
espigas de trigo se recolectan de plantas regeneradas,
esterilizadas con una solución de Clorox al 10% durante 10 minutos,
y se lava varias veces con agua esterilizada. Los embriones
inmaduros de tamaño 1-2 mm, se retiran de las
cariópsides bajo un microscopio de disección y se cultivan en un
medio Murashige y Skoog con bien 5 o 10 mg/l de
2,4-D y 13.7 g/l de maltosa o bien en un medio
Murashige y Skoog con 2 mg/l de 2,4-D y sacarosa al
3%. Este nuevo callus inducido friable, ahora reciclado, se
transfiere a un medio Murashige y Skoog con 1 mg/l de
2,4-D y sacarosa al 3% para el mantenimiento de
experimentos de bombardeo. La anteriormente especificada
regeneración de plantas y proceso de inducción de callus se repiten
entonces para producir futuras generaciones de callus friable. Como
un control, se recogen embriones de plantas salvajes y se cultivan
en el mismo medio de maltosa. La frecuencia de inducción de un
callus friable y embriogenético de los embriones se registro como
se indica a continuación.
Para usar semillas derivadas de plantas
regeneradas como el material de partida, un cultivo celular tipo II
(UC703-0612), el cual se produce de un embrión
crecido en medio que contiene maltosa, se descongela de la
criopreservación y situarlo en un medio de mantenimiento (medio
Murashige y Skoog + 1 mg/l de 2,4-D + sacarosa al
3%). El callus se sitúa entonces en un medio que contiene sales
basales Murashige y Skoog y 3 mg/l de 6-BAP para la
regeneración de plantas. Las semillas se recolectan de las plantas
regeneradas y luego se germinan en el suelo. Para el cultivo de
embriones, los espigones de trigo se recogen de plantas derivadas de
semillas, esterilizadas con una solución de Clorox al 10% durante
10 minutos, y lavado varias veces con agua esterilizada. Los
embriones inmaduros de 1-2 mm de tamaño, se retiran
de las cariópsides bajo un microscopio de disección y se cultivan
en un medio Murashige y Skoog con 2 o 10 mg/l de
2.4-D y 13.7 g/l de maltosa, o sobre un medio MS
con 1 mg/l de 2,4-D y sacarosa al 3% para el
mantenimiento o experimentos de bombardeo.
Como control, se recogen embriones de una
especie salvaje de plantas y se cultiva en el mismo medio de
maltosa. Las frecuencias de inducción de callus friables y
embriogenéticos de embriones se registran y se muestran a
continuación.
Una línea de callus embriogenético reciclado
marcado 0612RC se desarrolla tal y como se describe en el ejemplo
anterior. El callus se prepara para bombardear por agitación y por
plasmolisis durante 2-3 horas en medio líquido
Murashige y Skoog que contiene 1 mg/l de 2,4-D,
sacarosa al 3% y sorbitol 0.6 M en un porcentaje de 1 parte de
células por 16 partes de medio. Cada diana se prepara usando un
aparato de filtro a vacío para adherir 3 ml de la mezcla celular a
filtros de fibra de vidrio que se colocan a continuación en medio
sólido de Murashige y Skoog con 1 mg/l de 2,4-D,
sacarosa al 3% y sorbitol 0.4 M.
El DNA del plásmido pTG48 (ant43/Gus/35Sdhfr) se
precipita sobre partículas de oro de tamaño micrométrico utilizando
CaCl_{2} 0.1 M y NaH_{2}PO_{4} 0.1 M.
Cada diana se dispara dos veces con el
dispositivo de microproyectiles descrito en WO 93/07256 utilizando
una presión de gas de 1900 psi. Después del suministro del gen, los
filtros y células se retiran del medio sorbitol y se sitúan en
medio Murashige y Skoog con 1 mg/l de 2,4-D y
sacarosa al 3% de aproximadamente 24 horas después y se dejan
crecer durante 17 días antes de situar en el mismo medio pero con 1
mg/l de metotrexato incluido. El nivel de selección se incrementa a
2 mg/l de metotrexato 17 días después.
Aproximadamente 7 semanas después las colonias
se retiran de las placas de selección original a un medio fresco
que contiene 1 mg/l de metotrexato. Las colonias se identifican como
positivas para la presencia del gen dhfr por PCR. El tejido se
hincha y se mantiene en un nivel reducido de 2,4-D
(0.5 mg/l) para estimular la maduración somática del embrión. Las
plantulas se regeneran por medio de usar un medio Murashige y Skoog
con 5 mg/l de GA y 1 mg/l de NAA. Algunos tejidos se regeneran por
situar sobre Osmorafts en medio líquido de Murashige y Skoog con
sacarosa al 3% y 10 mg/l de zeatina. Las plantulas se transfieren a
contenedores estériles llamados "GA7s" que contienen sales de
fuerza media de Murashige y Skoog, sacarosa al 2% y 0.5 mg/l de NAA,
aproximadamente 20 semanas después del bombardeo. Las plantas se
transfieren a un invernadero para su propagación. Se analizan 5
plantas por Southern y se confirma la presencia del gen dhfr.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel
de conocimientos de aquellos expertos en la materia a los cuales
pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de
patentes se incorporan aquí como si cada solicitud o publicación
individual fuese específica e individualmente indicada en su
incorporación como referencia.
Aunque la invención precedente ha sido descrita
en algunos detalles por medio de un ejemplo ilustrativo por motivos
de claridad y entendimiento, es obvio que algunos cambios y
modificaciones pueden practicarse dentro del limite de las
reivindicaciones anexadas.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel
de conocimientos de aquellos expertos en la materia a los cuales
pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de
patentes se incorporan aquí como si cada solicitud o publicación
individual fuese específica e individualmente indicada en su
incorporación como referencia.
Aunque la invención precedente ha sido descrita
en algunos detalles por medio de un ejemplo ilustrativo por motivos
de claridad y entendimiento, es obvio que algunos cambios y
modificaciones pueden practicarse dentro del limite de las
reivindicaciones anexadas.
Claims (13)
1. Método para producir plantas de trigo
fértiles transformadas de manera estable, comprendiendo dicho
método:
(a) escindir un embrión inmaduro de una planta
de trigo;
(b) preparar una placa Petri de dicho embrión
inmaduro escindido en un medio de crecimiento;
(c) bombardear dicho embrión inmaduro escindido
y en la placa Petri con una secuencia de DNA de interés de 0 a 10
días después de la escisión;
(d) mantener el embión o callus en desarrollo
durante 1 a 10 semanas en la oscuridad en medio de crecimiento con
o sin presión de selección;
(e) regenerar a partir del mismo plantas
transformadas fértiles en presencia de selección.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho bombardeo comprende someter al embrión inmaduro a múltiples
disparos de partículas revestidas de DNA.
3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que dicho método comprende además un tratamiento de plasmolisis
antes del bombardeo.
4. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que dicho método comprende además un tratamiento de plasmolisis
después del bombardeo.
5. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que dicho método comprende además un tratamiento de plasmolisis
tanto antes como después del bombardeo.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha secuencia de DNA de interés
comprende un gen de resistencia.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha secuencia de DNA de interés
comprende un gen que confiere valor nutricional, esterilidad
masculina y/o femenina, o un gen antifúngico, antibacteriano o
antivírico.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha secuencia de DNA de interés
comprende un gen que codifica RNA antisentido.
9. El método de la reivindicación 6, en el que
dicha secuencia de DNA de interés comprende un gen de resistencia a
una enfermedad o a insectos.
10. El método de la reivindicación 6, en el que
dicho gen de resistencia es el gen neomicina fosfotransferasa II
(npt-II) o el gen de resistencia a higromicina
B.
11. El método de la reivindicación 6, en el que
dicha secuencia de DNA de interés comprende una secuencia que
codifica para dihidrofolato reductasa (dhfr).
12. El método de la reivindicación 11, en el
dicho gen dhfr es un gen bacteriano.
13. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que la planta transformada fértil
obtenida en la etapa (e) expresa dicho gen de interés
específicamente en las anteras.
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| US992391 | 1992-12-16 | ||
| US147261 | 1993-11-01 | ||
| US08/147,261 US5610042A (en) | 1991-10-07 | 1993-11-01 | Methods for stable transformation of wheat |
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| ES2134925T3 ES2134925T3 (es) | 1999-10-16 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94903608T Expired - Lifetime ES2134925T5 (es) | 1992-12-16 | 1993-12-13 | Metodos para la transformacion estable de trigo. |
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