RU2646108C1 - Способ получения трансгенных растений пшеницы с использованием биобаллистики - Google Patents
Способ получения трансгенных растений пшеницы с использованием биобаллистики Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646108C1 RU2646108C1 RU2016147977A RU2016147977A RU2646108C1 RU 2646108 C1 RU2646108 C1 RU 2646108C1 RU 2016147977 A RU2016147977 A RU 2016147977A RU 2016147977 A RU2016147977 A RU 2016147977A RU 2646108 C1 RU2646108 C1 RU 2646108C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- medium
- transformation
- explants
- shoots
- plants
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 57
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 57
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 49
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 42
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims abstract description 12
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000005595 Picloram Substances 0.000 claims abstract description 6
- NQQVFXUMIDALNH-UHFFFAOYSA-N picloram Chemical compound NC1=C(Cl)C(Cl)=NC(C(O)=O)=C1Cl NQQVFXUMIDALNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims abstract 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims abstract 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 55
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 31
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 11
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 10
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 8
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 8
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 8
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 8
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 7
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 4
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287937 Colinus Species 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 101150071434 BAR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000806 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010001572 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- -1 DREB Proteins 0.000 description 1
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221785 Erysiphales Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001454295 Tetranychidae Species 0.000 description 1
- 241001414989 Thysanoptera Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 235000007264 Triticum durum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209143 Triticum turgidum subsp. durum Species 0.000 description 1
- 102220572519 Tubulin polyglutamylase complex subunit 1_F36W_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101150068318 WRKY71 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M acetylcholine chloride Chemical compound [Cl-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002357 osmotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения трансгенных растений пшеницы методом биобаллистики, включающий в себя холодовой шок (низкотемпературную обработку растений-доноров), культивирование эксплантов перед трансформацией на среде для индукции каллусообразования, при этом среда содержит пиклорам, осмотическую обработку эксплантов перед трансформацией, при этом экспланты помещают на среду с высоким осмотическим давлением, чтобы вызвать плазмолиз, введение в клетки эксплантов чужеродной ДНК с использованием пушки PIG (particle inflow gun), пролиферацию трансформированных клеток без селективного отбора, регенерацию и селективный отбор трансгенных побегов, укоренение побегов на среде с селективным агентом при пониженной температуре, где для индукции каллусообразования у незрелых зародышей используют холодовой шок, где низкотемпературную обработку свежесобранных колосьев растений-доноров осуществляют при +4°C в течение 48 часов, для индукции каллусообразования у незрелых зародышей используют модифицированную питательную среду, содержащую 0,5 мг 2,4-D, 2 мг пиклорама, 40 г мальтозы, 0,5 г глютамина, 0,1 г гидролизата казеина, перед и после трансформации экспланты выдерживают на осмотической среде, содержащей 120 г/л мальтозы, при этом перед трансформацией в течение 4-6 часов, а после трансформации в течение 20-24 часов, после трансформации клетки экспланта проходят этап размножения (пролиферации) на питательной среде без селективного агента, укоренение побегов проводят на селективной среде и при пониженной температуре. Изобретение может быть использовано для создания трансгенных растений пшеницы с эффективностью до 7,8%. 1 ил., 3 табл., 6 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к генетической инженерии высших растений, связанной с созданием трансгенных растений пшеницы. Изобретение может быть использовано в селекции новых сортов и гибридов пшеницы и востребовано семеноводческими компаниями и селекционными станциями, научно-образовательными учреждениями биотехнологического и сельскохозяйственного профиля.
Актуальность изобретения
Пшеница (Triticum aestivum L.) является наиболее важной культурой из всех зерновых культур для большинства населения мира. Она является наиболее важным продуктом питания около двух миллиардов человек (36% населения земного шара). Пшеница обеспечивает 55% углеводов и 20% пищевых калорий, потребляемых во всем мире (Breiman and Graur, 1995)
Потери урожая пшеницы в различных экологических условиях возникают из-за дефицита воды (засухи), засоленности, морозов, жары, грибных и вирусных болезней и насекомых. Каждый из перечисленных факторов среды может снижать урожайность в среднем на 15%. Для увеличения урожайности культуры, в условиях быстро меняющегося климата и сокращения природных ресурсов необходимы сорта нового поколения, широко адаптивные и эффективно использующие ресурсы среды.
За последние тридцать лет были разработаны различные трансгенные методики, позволяющие передавать гены от широкого спектра организмов злаковым культурам. Трансгенные технологии позволяют повысить устойчивость растений к болезням и абиотическим стрессам, улучшить качество зерна, увеличить уровень микроэлементов и витаминов в растении, модифицировать фотосинтез и повысить продуктивность и многое другое. Тем не менее наличие эффективного способа трансформации для введения чужеродной ДНК в геном является существенным барьером для большинства видов однодольных, в том числе кукурузы, риса, овса, ячменя, и в частности пшеницы.
Уровень техники
Первая биобаллистическая трансформация пшеницы осуществлена в 1992 году (Vasil et al, 1992). В настоящее время процесс создания трансгенных растений пшеницы методом биобаллистической трансформации считается достаточно рутинным. Однако это справедливо лишь для некоторых иностранных сортов, отзывчивых к трансформации, таких как Bobwhite, Florida, Fielder, Cadenza и др., но и в этих случаях эффективность трансформации не превышает 1-6% (Weeks I.T. et al, 1993, Chen W.P., et al, 1998, Uze M. et al, 1999, Jordan M.C 2000, Wright M. et al., 2001, Pellegrineschi A. et al. 2002, Greer M.S. et al. 2009, 
C. et al. 2012, Tassy C. et al. 2014).
Известен способ получения трансгенных растений пшеницы, см. Патент US 6153812 A «Rapid and efficient regeneration of transgenic wheat plants», 2000 г. Основным недостатком данного способа, как, впрочем, и большинства других известных методик, является то, что он разработан для модельного сорта Bobwhite зарубежной селекции и неэффективен для продуктивных сортов отечественной селекции, районированных на территории РФ.
Наиболее близким к данному изобретению является способ получения трансгенных растений пшеницы, см. Патент US 5610042 A «Methods for stable transformation of wheat» 1997. Метод заключается в следующем: незрелые зародыши размером 1-2,5 мм помещают на среду Мурашиге и Скуга (Murashige Т. & Skoog F. 1962) с добавлением 5 или 10 мг/л 2,4-D, 13,7% мальтозы, 100 мг/л пролина, 100 мг/л мио-инозитола и 0,7-0,8% фитоагара или 0,1-0,2% герлита. Зародыши культивируют три недели до образования каллуса. Затем каллус отделяют от зародышей и помещают в жидкую осмотическую среду с перемешиванием на магнитной мешалке на несколько часов и далее переносят на твердую осмотическую среду. Затем с помощью генной пушки (DuPont Biolistic Helium device) трансформируют клетки каллуса. Селекцию начинают через 2-6 недель трансформации. В качестве селективного агента используют метотрексат. Основным недостатком способа является то, что для селективного отбора используют малораспространенный селективный агент - метотрексат. К тому же данный способ также разработан для линий пшеницы зарубежной селекции.
Таким образом, задача создания эффективной методики трансформации, пригодной для широкого круга генотипов пшеницы, особенно отечественной селекции, сохраняет свою актуальность.
Дополнительные сложности в работе по разработке такой методики возникают в связи с тем, что большинство разработанных методик осуществлены на модельных сортах с высоким регенерационным и трансформационным потенциалом и требуют дополнительных экспериментальных доработок для внедрения полученных результатов в производство. Это обусловило необходимость перехода от работы с модельными генотипами к использованию продуктивных коммерческих сортов, большинство из которых, как выяснилось, трансформируются значительно хуже, чем лабораторные. Не являются исключением в этом смысле и сорта пшеницы российской селекции.
Недавно было показано положительное влияние пиклорама (ауксин подобного вещества) на индукцию каллусообразования пшеницы (Gorbatyuk I.R. et al. 2015). В нашем методе был впервые использован пиклорам для повышения образования морфогенного каллуса у незрелых зародышей пшеницы отечественных сортов.
С учетом всего вышеописанного при разработке настоящего изобретения ставилась задача создания эффективного способа получения трансгенных растений пшеницы, пригодного для широкого круга перспективных в коммерческом отношении отечественных сортов как яровых, так и озимых. Ожидаемым техническим результатом было повышение эффективности и унификация процедуры трансформации.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение представляет собой разработанный эффективный способ регенерации трансгенных растений пшеницы. Растения, полученные данным способом, являются фенотипически нормальными и полностью фертильными. Трансгенная вставка целевого гена передается потомству в соответствии с законами Менделя.
Эффективную регенерацию трансгенных побегов данный способ обеспечивает, если в качестве мишени для трансформации используются незрелые зародыши с морфогенным каллусом, полученные от растений-доноров после холодового шока. Морфогенный каллус получают на среде, содержащей пиклорам. Для введения чужеродной ДНК применяют биобаллистический способ - прямое введение генов с помощью пушки PIG (particle inflow gun). Также может быть использована любая генная пушка, например фирмы Biorad или DuPont. Перед баллистикой экспланты выдерживают на осмотической среде с мальтозой. Трансформированные клетки размножают на среде для пролиферации. Селективный отбор трансформированных побегов начинают на этапе регенерации побегов. Укоренение побегов проводят при пониженных температурах на средах с селективным агентом. Данная система трансформации может быть использована с различными маркерными системами отбора, в том числе селекция с помощью гербицидов, таких как глифосат и биалафос (фосфинотрицин), а также антибиотиками, такими как канамицин, гигромицин.
В зависимости от поставленной задачи в способе по изобретению могут использоваться различные генетические конструкции. Для создания растений, устойчивых к различным гербицидам, может быть проведена трансформация генами, определяющими устойчивость к глифосату (ген epsps), фосфинотрицину (ген bar), для повышения устойчивости к абиотическим стрессам введения генов транскрипционных факторов, таких как bZIP, DREB, MYB/MYC, NAC и WRKY. Для создания растений пшеницы, устойчивой к насекомым, могут использоваться гены семейства Bt и для устойчивости к грибным заболеваниям - гены дефензинов, такие как MtDef4. Для контроля экспрессии в трансгенных растениях могут быть использованы злакоспецифические (Act-1, Ubi) и индуцибельные промоторы типа rd29A и WRKY71.
Представленная система получения трансгенных растений пшеницы занимает от 2-х до 3-х месяцев. Частоты трансформации новой системы в 2-3 раза выше, чем методы, используемые в настоящее время в других лабораториях.
Данное изобретение относится к способу получения растений пшеницы, содержащих чужеродную ДНК, включающему следующие стадии: а) низкотемпературную обработку растений-доноров; б) культивирование эксплантов на среде для индукции каллусообразования; в) осмотическую обработку эксплантов перед трансформацией; г) введение в клетки эксплантов чужеродной ДНК с использованием пушки PIG (particle inflow gun); д) пролиферацию трансформированных клеток без селективного отбора; е) регенерацию и селективный отбор трансгенных побегов; ж) укоренение побегов на среде с селективным агентом при пониженной температуре.
Методика была использована на яровых и озимых сортах мягкой пшеницы отечественной селекции - Злата, Амир, Агата, Дея и Л-1. Эффективность трансформации оказалась высокой для всех исследуемых сортов, независимо от генотипа составила от 1,4 до 7,8%. Данный показатель свидетельствует о высокой эффективности предлагаемого способа.
Краткое описание рисунков
Рисунок - Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов на наличие гена bar в побегах пшеницы сорта Злата, трансформированных ДНК с геном bar.
Дорожки: 1-17 - ПЦР на препаратах ДНК из трансформированных линий; #2bar - положительный контроль, продукт ПЦР на плазмидной ДНК (0,1 нг/реакцию), использованной для трансформации растений; UnP - отрицательный контроль ПЦР на препаратах ДНК из нетрансформированных растений; 100bp - маркер размера (GeneRuler 100bp, ThermoScientific).
Осуществление изобретения
Использование качественных растений-доноров является необходимым условием для получения эффективной регенерации побегов in vitro. Растения могут быть выращены как в открытом грунте, так и в условиях искусственного климата. Помимо обязательного предохранения растений от таких заболеваний, как мучнистая роса, карликовая ржавчина, корневые гнили, и насекомых (паутинный клещ, тля, трипсы и т.д.), должны быть созданы оптимальные условия вегетации (в условиях искусственного климата) - качественное освещение, водоснабжение, почвенные субстраты, удобрения, влажность и качество воздуха.
Для введения генетического материала в клетки была использована пушка для биобаллистики - PIG (particle inflow gun), но может быть приспособлена любая другая генная пушка, при дополнительной отработке баллистических параметров.
Для отбора трансгенных побегов можно воспользоваться различными селективными системами отбора, в том числе системами селекции с помощью гербицидов, таких как глифосат и биалафос (фосфинотрицин), а также антибиотиков, таких как канамицин, гигромицин. В примерах, приведенных ниже, был использован плазмидный вектор pUBar, несущий кассету экспрессии гена bar под контролем промотора Ubi1-гена, кукурузы и Tnos терминатора гена нопалинсинтазы.
Для подтверждения интеграции гетерологичной последовательности в геном пшеницы может быть использован любой способ выделения растительной ДНК с последующим ПЦР-анализом.
Методика
1. Холодовой шок для использованных эксплантатов: низкотемпературная обработка растений-доноров. Собирают незрелые колосья пшеницы на 10-14 день после опыления. Срезанные колосья помещают срезанными концами в воду в холодильную камеру при 4±2°С на 48 ч.
2. Состав сред и условия культивирования
Растительный материал культивировался при температурах в диапазоне от 4 до 25°С, либо в темноте, либо на свету, с 16-часовым фотопериодом (16/8 - день/ночь). Для освещения использовали лампы Osram L36/77 FLUORA и F36W/33 Cool White. В состав всех питательных сред входили макро- и микросоли MS (Murashige Т. & Skoog F. 1962), витамины В5 (Gamborg O.L. et al., 1968), фитогормоны и углеводы (Таблица 1). pH среды доводили до 5,8 перед автоклавированием. Стерилизацию среды осуществляли в автоклаве при давлении 1.2 атмосферы в течение 15 минут.
3. Стерилизация и культивирование эксплантов на среде для индукции каллусообразования
Незрелые зерновки вышелушивают из колосков и стерилизуют 70%-ным этиловым спиртом 6 мин. Промывают стерильной дистиллированной водой 3 раза по 5 мин.
Зародыши размером 0,7-1,5 мм изолируют и помещают на среду А для индукции каллусообразования щитком вверх, по 50 шт. на чашку Петри (9 см), и культивируют 14-18 дней в темноте при 23±2°С до образования каллуса.
В процессе каллусообразования происходит образование двух типов каллусов - морфогенного каллуса (МК) и неморфогенного каллуса (НМК). НМК представляет собой рыхлые, белые, сильно обводненные массы клеток, характеризующиеся высокой скоростью обводнения и увеличения массы и отсутствием морфогенеза, МК - плотный, желтоватый, медленно увеличивающийся в массе каллус, представленный плотно сцепленными между собой меристемными глобулами. На 7 и 14 день после культивирования проводят визуальную оценку образующегося каллуса, МК оставляют вместе с зародышем и используют для трансформации, а НМК отсекают и изымают из культуры in vitro (ВАЖНО не отделять зародыш от морфогенного каллуса, а оставлять их вместе).
4. Осмотическая обработка эксплантов перед трансформацией
Перед трансформацией зародыши с каллусом выкладывают на осмотическую среду (Б), содержащую в качестве осмотического агента мальтозу (120 г/л). Экспланты располагают в центре чашки Петри в виде кольца диаметром 40 мм по 30-40 шт./чашку и выдерживают 4-6 часов до баллистики и 20-24 часа после.
5. Биобаллистическая трансформация эксплантов
Стерилизация микрочастиц: Для бомбардировки используют вольфрамовые микрочастицы М10 (Sylvania Chemical/Metals), размер частиц в смеси варьирует 0,1-7 мкм, наибольшее количество частиц 80% имеет размер 0,4-2 мкм. Навеску микрочастиц весом 50 мг стерилизуют спиртом (500 мкл 96% спирта) в течение 15 мин. Осаждение частиц проводят на центрифуге при 14000 об/мин в течение 6-8 мин. Промывание частиц проводят три раза стерильной водой. Конечный объем смеси частиц в воде составляет 500 мкл.
Преципитация ДНК:
1. В стерильный эппендорф поместить 25 мкл смеси частиц, предварительно смесь ресуспендировать и отбор брать из нижней части эппендорфа;
2. Добавить 5 мкл ДНК, ресуспендировать;
3. Добавить 25 мкл 2,5 М CaCl2 ресуспендировать;
4. Немедленно добавить 5-10 мкл 0,1 М спермидина, ресуспендировать до стадии выпадения смеси частиц в осадок;
5. Эппендорф поместить на лед на 5 мин;
6. Отобрать пипеткой 50 мкл смеси из надосадка, не затронув частицы;
7. Для выстрела использовать 2,5 мкл смеси (приготовленной смеси 15 мкл должно хватить на 4-5 выстрелов по 2,5 мкл).
Исходные параметры баллистической трансформации:
1. Объем используемого газа при выстреле - 6 см3;
2. Сечение ячейки рассекающего фильтра - 500 мкм;
3. Отрицательное давление вакуума в камере при выстреле - 30 мм ртутного столба;
4. Расстояние от источника частиц до ткани мишени 12-17 см;
5. Давление гелия - 0,6-0,7 МПа = 6-7 атм (1 мегапаскаль [МПа] = 9.869 физическая атмосфера [атм]).
6. Каждая чашка обстреливается дважды.
После первого выстрела каллусы переворачивают и снова выкладывают по кругу диаметром 40 мм.
Генетическая конструкция для баллистической трансформации должна содержать селективную ДНК-последовательность, которая позволяет проводить селективный отбор трансформированных побегов.
6. Пролиферация трансформированных клеток
После трансформации (через 20-24 часа) каллусы переносят на среду (В) для пролиферации каллуса на 3 недели в темноте при 23±2°С. Если в течение этих трех недель наблюдается начало побегообразования, то зародыши с каллусом переносят на среду для регенерации с селективным агентом раньше истечения срока пролиферации.
7. Регенерация и селективный отбор трансгенных побегов
Зародыши с каллусом (не разделяя) помещают на селективную среду Г для регенерации и селекции побегов на 3 недели, при освещении 5000 лк и температуре 23±2°С.
8. Укоренение побегов на среде с селективным агентом при пониженных температурах
Образующиеся в процессе селекции зеленые побеги помещают в пробирки со средой Д для укоренения при освещении 5000-10000 лк температуре 20±2°С. Укоренившиеся побеги пересаживают в перлит во влажную среду для адаптации на 1-2 недели при 15-17°С. Адаптированные растения переносят в почву до полного созревания в условиях теплицы.
Побеги озимых сортов должны проходить этап яровизации, после переноса их в перлит. Для этого растения выдерживают при температуре 3±2°С в течение 6 недель при освещении 5000 лк.
9. Отбор трансгенных растений
Выделение ДНК. Тщательно растереть растительную ткань (количество, равное 2-3 листовым дискам, выдавленным крышкой Eppendorf) в жидком азоте. Суспендировать в 250 мкл буфера [0,2 М Tris-HCl pH 9,0; 0,4 М LiCl; 25 mM EDTA; 1% SDS]. Центрифугировать в течение 10 минут на микроцентрифуге на максимальной скорости. Отобрать 175 мкл супернатанта в новую пробирку и добавить 175 мкл изопропанола. Перемешать содержимое, перевернув пробирку 4-5 раз. Центрифугировать на максимальной скорости в течение 15 минут. Высушить осадок, удалив супернатант и оставив пробирку в перевернутом состоянии на фильтровальной бумаге на 30 минут. Добавить 110 мкл стерильной воды и растворять при комнатной температуре в течение 30 минут на встряхивателе. Осадить остаточный клеточный дебрис центрифугированием в течение 5 минут. 100 мкл раствора геномной ДНК перенести в новую пробирку и добавить 70 мкл фенола, насыщенного трис-буфером pH-8,0, поместить во встряхиватель, а затем оставить на 5 минут на столе. Центрифугировать на максимальной скорости в течение 10 минут. 90 мкл верхней фазы перенести в новую пробирку и добавить 9 мкл ЗМ ацетата натрия (рН-6,0) и 250 мкл этанола, перемешать переворачиванием 10 раз. Поставить в морозилку не менее чем на 20 минут при -20°С. Центрифугировать на максимальной скорости в течение 10 минут, отобрать остатки пипеткой. Добавить 125 мкл этанола 70%, поставить в морозилку не менее чем на 10 минут при -20°С. Центрифугировать на максимальной скорости в течение 10 минут, затем пипеткой отобрать жидкость максимально, осадок подсушить 5-10 минут. Осадок растворить в 50 мкл стерильной воды.
ПЦР-анализ образцов ДНК. Для проведения ПЦР используют ДНК-амплификатор (Bio-Rad Т100 Termocycler). Условия проведения ПЦР: денатурация 95°С - 4 мин, 35 циклов (94°С - 30 сек, 55°С - 30 сек, 72°С - 45 сек) и окончательная достройка - 7 мин. В качестве матрицы используют выделенные образцы геномной ДНК, в качестве прамеров - bar1 (5'-TCAACCACTACATCGAGACAAG-3') и bar2 (5'-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAACC-3').
Состав реакционной смеси для ПЦР (на одну микропробирку):
- Праймеры - по 1 мкл каждого (10 мкМ);
- 10Х Taq-буфер - 2,5 мкл;
- 10 мМ dNTP - 0,5 мкл;
- 25 мМ MgCl2 - 2 мкл;
- Taq полимераза - 0,2 мкл (1 ед.);
- ДНК-матрица - 2 мкл;
- Н2О - до 25 мкл.
Для центрифугирования используют настольную микроцентрифугу (Eppendorf 5415С) с максимальной скоростью вращения ротора 14000 об/мин. Термостатирование образцов осуществляют в сухом термостате (Eppendorf Termomixer).
Анализ продуктов ПЦР осуществляют методом электрофореза в агарозном геле с последующим окрашиванием гелей бромистым этидием (концентрация красящего раствора 1 мкг/мл в воде, время окрашивания - 20 мин при комнатной температуре) и фотографированием полученной картины в ультрафиолетовом свете (длина волны - 260-280 нм) цифровым фотоаппаратом. Обработку оцифрованной информации проводят при помощи пакета Adobe Photoshop 7.0.
Заключение о встраивании в геном растения чужеродного гена делают на основании появления продукта ПЦР с ожидаемым (в зависимости от используемых специфических праймеров) размером.
Далее приведены конкретные примеры осуществления изобретения, которые не могут рассматриваться как ограничивающие его объем.
Пример 1. Получение трансгенных растений яровой пшеницы сорта Злата, содержащих ген bar
Растения пшеницы сорта Злата срезали на 10 день после опыления. Срезанные колосья в количестве 40 шт. помещали в сосуды с водой и в течение 2 суток выдерживали в холодильной камере при температуре 4°С. После холодового шока из колосьев вышелушивали незрелые зерновки в количестве 600 шт. Зерновки стерилизовали согласно Методике. Выделение незрелых зародышей проводили с помощью скальпеля под стереомикроскопом при увеличении 10Х. Зародыши размером 0,7-1,5 мм изолировали и помещали на среду А щитком вверх, по 50 шт. на чашку Петри (9 см), и культивировали в темноте при 23°С до образования каллуса. На 7 и 15 день НМК удаляли, а МК оставляли вместе с зародышем. На 16-й день культивирования экспланты (зародыши с МК) переносили на осмотическую среду Б по 30 шт на чашку Петри за 6 часов до трансформации. Для трансформации было отобрано 486 эксплантов. Перед обстрелом экспланты выкладывали в виде круга с диаметром - 4 см и производили обстрел каллусов при помощи баллистической пушки PIG. Условия баллистики приведены в Методике. После трансформации через 24 часа каллусы переносили на среду В и культивировали в темноте в течение 18 дней при температуре 23°С. Размноженный каллус переносили на среду Г для регенерации с селективным агентом - фосфинотрицином в концентрации 5 мг/л и культивировали 25 дней, с пересадкой на свежую селективную среду через 12 дней после начала селекции. Образующиеся в процессе селекции зеленые побеги помещали в пробирки со средой Д для укоренения с селективным агентом (3 мг/л фосфинотрицина) и культивировали при освещении 5000 лк и температуре 22°С. Укоренившиеся побеги пересаживали в перлит для адаптации на 2 недели при 15°С. Адаптированные растения переносили в сосуды (V=4 л) с почвой до полного созревания в условиях теплицы. В процессе селекции было получено 112 зеленых побегов, из которых 38 укоренилось. Все побеги были проверены на наличие гена bar методом ПЦР.
Пример 2. Получение трансгенных растений яровой пшеницы сорта Амир, содержащих ген bar
Растения пшеницы срезали на 12 день после полного опыления колоса. Срезанные колосья в количестве 35 шт ставили в сосуды с водой и выдерживали в холодильной камере при температуре 4-5°С в течение 2 суток. После холодового шока из колосьев вышелушивали незрелые зерновки в количестве 390 шт. Зерновки стерилизовали по вышеприведенной Методике. Выделение незрелых зародышей проводили так же, как в Примере 1. Выделенные зародыши размером от 0,7 до 1,5 мм переносили на среду А, щитком вверх, в количестве 60 шт./чашку Петри и культивировали в течение 16 дней в темноте при температуре 23±2°С до образования каллуса. МК оставляли вместе с зародышем и использовали для трансформации, НМК удаляли на 8 и 15 сутки культивирования. Трансформацию проводили на 17 день после начала культивирования и проводили как описано в Методике и Примере 1. Для трансформации было отобрано 256 эксплант. После трансформации через 21 час каллусы с осмотической среды переносили на среду для пролиферации каллуса. Образованные побеги через 20 дней переносили на среду для регенерации с селективным агентом. Образующиеся в процессе селекции зеленые побеги в количестве 67 шт. помещали в пробирки со средой для укоренения при освещении 5000 лк, температуре 23°С. Укоренившиеся 5 побегов пересаживали в перлит во влажную среду для адаптации на 16 дней при 15°С. Адаптированные растения переносили в сосуды (V=2 л) с почвой до полного созревания в условиях теплицы.
Пример 3. Получение трансгенных растений яровой пшеницы сорта Эстер, содержащих ген bar
После цветения и опыления на 11 день пшеничные побеги длиной 40 см срезали и колосья в количестве 50 шт, в течение 2 суток выдерживали в холодильной камере при температуре 4°С. После холодового шока из колосьев вышелушивали незрелые зерновки в количестве 600 шт. Стерилизацию и выделение проводили, после этого зерновки стерилизовали 70% этанолом, непрерывно помешивая в течение 6 минут и промывая стерильной водой трижды по 5 минут. Выделение незрелых зародышей проводили с помощью скальпеля под стереомикроскопом при увеличении 10Х. Выделенные зародыши размером от 0,8 до 1,7 мм переносим в чашки Петри на среду А, щитком вверх, в количестве 50 шт. Чашки с зародышами размещают в климакамере и культивируют в течение 18 дней в темноте при температуре 24±2°С до образования каллуса. НМК отсекали на 6 и 15 сутки, МК оставляли вместе с зародышем и использовали для трансформации. На 17 день эксплантаты, используемые в эксперименте, в количестве 510 шт., переносили на осмотическую среду по 40 шт на чашку Петри и производили обстрел каллусов при помощи баллистической пушки. Экспланты выкладывали на среду по кругу диаметром 40 мм. Обстреливали дважды. После трансформации через 20 часов каллусы переносили на среду для пролиферации каллуса в темноте. Образованные побеги через 17 дней переносили на среду для регенерации с селективным агентом - фосфинотрицином в концентрации 5 мг/л и культивировали 40 дней с пересадкой на свежую селективную среду. Образующиеся в процессе селекции зеленые побеги, в количестве 70 шт., помещали в пробирки со средой для укоренения при освещении 5000 люкс и температуре 20°С. Укоренившиеся побеги, в количестве 5 шт., пересаживали в перлит во влажную среду для адаптации на 12 дней при 16°С. Адаптированные растения переносили в сосуды (V=4 л) с почвой до полного созревания в условиях теплицы.
Пример 4. Получение трансгенных растений пшеницы сорта Агата, содержащих ген bar
Пшеничные побеги длиной около 30 см срезали после цветения и опыления на 12 день. Срезанные колосья в количестве 40 шт ставили в сосуды с водой и в течение 2 суток выдерживали в холодильной камере при температуре 4°С и после холодового шока из колосьев вышелушивали незрелые зерновки, в количестве 430 шт. После этого зерновки стерилизовали 70% этанолом, выделение незрелых зародышей проводили с помощью скальпеля под стереомикроскопом при увеличении 10Х. Выделенные зародыши размером от 0,8 до 1,4 мм переносим в чашки Петри на среду А, щитком вверх, в количестве 60 шт. Чашки с зародышами размещают в климакамере и культивируют в течение 18 дней в темноте при температуре 24±2°С до образования каллуса. Образовавшийся морфогенный каллус оставляли вместе с зародышем и использовали для трансформации, неморфогенную часть отсекали и убирали из эксперимента. Далее в эксперименте было задействовано 367 эксплантов. На 18 день эксплантаты, используемые в эксперименте, переносили на осмотическую среду по 30 шт на чашку Петри в форме круга диаметром 40 мм, и производили обстрел каллусов при помощи баллистической пушки. После трансформации через 20 часов каллусы переносили на среду для пролиферации каллуса в темноте, каждые 3 недели. Образованные побеги через 20 дней переносили на среду для регенерации с селективным агентом (5 мг/л фосфинотрицина). Образующиеся в процессе селекции зеленые побеги помещали в пробирки со средой для укоренения при освещении 5000 лк температуре 20°С, всего было получено 83 побега данного сорта. Из них укоренилось 22 побега. Укоренившиеся побеги пересаживали в перлит во влажную среду для адаптации на 15 дней при 15°С. Адаптированные растения переносили в сосуды (V=2 л) с почвой до полного созревания в условиях теплицы.
Пример 5. Получение трансгенных растений пшеницы сорта Дея, содержащих ген bar
После цветения и опыления на 12 день пшеничные побеги длиной 40 см срезали и помещали в сосуды с водой и в течение 2 суток выдерживали в холодильной камере при температуре 4°С. После холодового шока из 50 срезанных колосьев вышелушивали незрелые зерновки, в количестве 600 шт. После этого зерновки стерилизовали 70% этанолом и выделяли незрелые зародыши с помощью скальпеля под микроскопом при увеличении 10Х. Выделенные зародыши размером от 0,7 до 1,4 мм переносили в чашки Петри на среду А, щитком вверх, в количестве 60 шт. Чашки с зародышами размещали в климакамере и культивировали в течение 16 дней в темноте при температуре 24±2°С до образования каллуса. Морфогенный каллус оставляли вместе с зародышем и использовали для трансформации, НМК удалялся на 10 сутки. На 16 день эксплантаты, используемые в эксперименте (428 шт.), переносили на осмотическую среду по 30 шт на чашку Петри в кольцо диаметром 40 мм и производили обстрел каллусов при помощи баллистической пушки дважды. После трансформации через 23 часа каллусы переносили на среду для пролиферации каллуса в темноте. Образованные побеги через 17 дней переносили на среду для регенерации с селективным агентом - фосфинотрицином, 5 мг/л. Образующиеся в процессе селекции 55 зеленых побегов помещали в пробирки со средой для укоренения при освещении 7000 лк температуре 17°С. Укоренившиеся побеги пересаживали в перлит во влажную среду для адаптации на 2 недели при 15°С (12 шт.). Затем побеги проходили этап яровизации после переноса их в почву. Для этого растения выдерживали при температуре 2-5°С в течение 42 дней при освещении 7000 лк. Адаптированные растения переносили в сосуды (V=10 л) до полного созревания в условиях теплицы.
Пример 6. Получение трансгенных растений пшеницы линии Л1, содержащих ген bar
После цветения и опыления на 11 день пшеничные побеги длиной 30 см срезали. Срезанные колосья в количестве 50 шт ставили в сосуды с водой и в течение 2 суток выдерживали в холодильной камере при температуре 4°С. После холодового шока из колосьев вышелушивали незрелые зерновки, в количестве 500 шт. Затем зерновки стерилизовали 70% этанолом, непрерывно помешивали в течение 6 минут по приведенной выше методике и трижды промывали стерильной водой по 5 минут. Выделяли незрелые зародыши с помощью скальпеля под микроскопом при увеличении 10Х. Выделенные зародыши размером от 0,8 до 1,5 мм переносили в чашки Петри на среду А щитком вверх в количестве 50 шт. Чашки с зародышами размещали в климакамере и культивировали в течение 17 дней в темноте при температуре 24±2°С до образования каллуса. Морфогенный каллус оставляли вместе с зародышем и использовали для трансформации, в количестве 363 шт. На 17 день эксплантаты, используемые в эксперименте, переносили на осмотическую среду по 30 шт на чашку Петри, диаметр кольца 40 мм, и производили обстрел каллусов при помощи баллистической пушки. Обстрел проводили дважды, после первого раза каллусы переворачивали и укладывали на прежнее место. После трансформации через 20 часов каллусы переносили на среду для пролиферации каллуса в темноте. Образованные побеги через 15 дней переносили на среду для регенерации с селективным агентом в концентрации 5 мг/л фосфинотрицина. Образующиеся в процессе селекции зеленые побеги (35 шт.) помещали в пробирки со средой для укоренения при освещении 7000 лк температуре 17°С. Было укоренено 5 побегов. Укоренившиеся побеги пересаживали в перлит во влажную среду для адаптации на 2 недели при 16°С. Затем побеги проходили этап яровизации после переноса их в почву. Для этого растения выдерживали при температуре 2-5°С в течение 40 дней при освещении 7000 лк. Адаптированные растения переносили в сосуды (V=10 л) до полного созревания в условиях теплицы при повышенной влажности.
Литература
1. Breiman A.G.D. 1995. Wheat evaluation // Israel J Plant Sci. - T. 43. - C. 58-95.
2. Vasil V. et al. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus // Nature Biotechnology. - 1992. - T. 10. - №.6. - C. 667-674.
3. Weeks J.Т., Anderson O.D., Blechl A.E. Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum) // Plant Physiology. - 1993. - T. 102. - №.4. - C. 1077-1084.
4. Chen W.P. et al. Introduction and constitutive expression of a rice chitinase gene in bread wheat using biolistic bombardment and the bar gene as a selectable marker // Theoretical and Applied Genetics. - 1998. - T. 97. - №.8. - C. 1296-1306.
5. Uze M., Potrykus I., Sautter C. Single-stranded DNA in the genetic transformation of wheat (Triticum aestivum L.): transformation frequency and integration pattern // Theoretical and Applied Genetics. - 1999. - T. 99. - №.3-4. - C. 487-495.
6. Jordan M.C. Green fluorescent protein as a visual marker for wheat transformation // Plant Cell Reports. - 2000. - Т. 19. - №.11. - C. 1069-1075.
7. Wright M. et al. Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) and wheat (Triticum aestivum L.) using the phosphomannose isomerase gene, pmi, as the selectable marker // Plant cell reports. - 2001. - T. 20. - №.5. - C. 429-436.
8. Pellegrineschi A. et al. The effect of pretreatment with mild heat and drought stresses on the explant and biolistic transformation frequency of three durum wheat cultivars // Plant Cell Reports. - 2002. - T. 20. - №.10. - C. 955-960.
9. Greer M.S., Kovalchuk I., Eudes F. Ammonium nitrate improves direct somatic embryogenesis and biolistic transformation of Triticum aestivum // New biotechnology. - 2009. - T. 26. - №. 1. - C. 44-52.
10. Tassy C. et al. Biolistic transformation of wheat: increased production of plants with simple insertions and heritable transgene expression // Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). - 2014. - T. 119. - №.1. - C. 171-181.
11. С., Jones H.D., 
L. Biolistic-and Agrobacterium-mediated transformation protocols for wheat // Plant Cell Culture Protocols. - 2012. - C. 357-384.
12. US 6153812 A (2000-11-28). Rapid and efficient regeneration of transgenic wheat plants.
13. US 5610042 A (1997-03-11). Methods for stable transformation of wheat.
14. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia plantarum. - 1962. - T. 15. - №.3. - C. 473-497.
15. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells // Experimental cell research. - 1968. - T. 50. - №.1. - C. 151-158.
16. Gorbatyuk I.R. et al. Effect of synthetic auxin like growth regulators on callus regenerative ability of common wheat Vc. Zymoyarka // Biotechnologia Acta. - 2015. - T. 8. - №.1.
Claims (1)
- Способ получения трансгенных растений пшеницы методом биобаллистики, включающий в себя холодовой шок (низкотемпературную обработку растений-доноров), культивирование эксплантов перед трансформацией на среде для индукции каллусообразования, при этом среда содержит пиклорам, осмотическую обработку эксплантов перед трансформацией, при этом экспланты помещают на среду с высоким осмотическим давлением, чтобы вызвать плазмолиз, введение в клетки эксплантов чужеродной ДНК с использованием пушки PIG (particle inflow gun), пролиферацию трансформированных клеток без селективного отбора, регенерацию и селективный отбор трансгенных побегов, укоренение побегов на среде с селективным агентом при пониженной температуре, отличающийся тем, что для индукции каллусообразования у незрелых зародышей используют холодовой шок, где низкотемпературную обработку свежесобранных колосьев растений-доноров осуществляют при +4°C в течение 48 часов, для индукции каллусообразования у незрелых зародышей используют модифицированную питательную среду, содержащую 0,5 мг 2,4-D, 2 мг пиклорама, 40 г мальтозы, 0,5 г глютамина, 0,1 г гидролизата казеина, перед трансформацией в течение 4-6 часов и после трансформации в течение 20-24 часов экспланты выдерживают на осмотической среде, содержащей 120 г/л мальтозы, после этого клетки экспланта проходят этап размножения (пролиферации) на питательной среде без селективного агента, укоренение побегов проводят на селективной среде и при пониженной температуре.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147977A RU2646108C1 (ru) | 2016-12-07 | 2016-12-07 | Способ получения трансгенных растений пшеницы с использованием биобаллистики |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147977A RU2646108C1 (ru) | 2016-12-07 | 2016-12-07 | Способ получения трансгенных растений пшеницы с использованием биобаллистики |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2646108C1 true RU2646108C1 (ru) | 2018-03-01 |
Family
ID=61568368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016147977A RU2646108C1 (ru) | 2016-12-07 | 2016-12-07 | Способ получения трансгенных растений пшеницы с использованием биобаллистики |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2646108C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2783891C2 (ru) * | 2021-03-09 | 2022-11-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии"(ФГБНУ ВНИИСБ) | Простой способ изоляции протопластов пшеницы для редактирования генома |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5610042A (en) * | 1991-10-07 | 1997-03-11 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for stable transformation of wheat |
-
2016
- 2016-12-07 RU RU2016147977A patent/RU2646108C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5610042A (en) * | 1991-10-07 | 1997-03-11 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for stable transformation of wheat |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ФАДЕЕВ В.С. Оптимизация параметров генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) и изучение трансгенных растений, несущих гены bar и gst, авто диссертации, Москва, 2006. * |
| ФАДЕЕВ В.С. Оптимизация параметров генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) и изучение трансгенных растений, несущих гены bar и gst, автореферат диссертации, Москва, 2006. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2783891C2 (ru) * | 2021-03-09 | 2022-11-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии"(ФГБНУ ВНИИСБ) | Простой способ изоляции протопластов пшеницы для редактирования генома |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Oosumi et al. | High-efficiency transformation of the diploid strawberry (Fragaria vesca) for functional genomics | |
| Dan et al. | MicroTom—a high-throughput model transformation system for functional genomics | |
| US7935529B2 (en) | Method for excision of plant embryos for transformation | |
| US8404930B2 (en) | Methods for improving monocot transformation | |
| JPH0216986A (ja) | トランスジェニック植物の作製方法 | |
| WO2008112267A2 (en) | Transformation of immature soybean seeds through organogenesis | |
| US20080092255A1 (en) | Methods of producing and using cold temperature tolerant plants, seeds, and crops | |
| Liu et al. | Sorghum genetic transformation by particle bombardment | |
| Tiwari et al. | Improvement of soybean through plant tissue culture and genetic transformation: A review | |
| US5066594A (en) | Method for the manipulation of pollen in plants | |
| Loyola-Vargas et al. | Plant tissue culture | |
| Ismagul et al. | Biolistic transformation of wheat with centrophenoxine as a synthetic auxin | |
| Sandal et al. | Development of transgenic tea plants from leaf explants by the biolistic gun method and their evaluation | |
| CN116240219B (zh) | 一种小麦rth-1基因及其应用 | |
| RU2646108C1 (ru) | Способ получения трансгенных растений пшеницы с использованием биобаллистики | |
| MX2007002083A (es) | Metodos para regeneracion, transformacion y produccion de plantas de abelmoschus esculentus transgenica resistente a insectos. | |
| El-Siddig et al. | Agrobacterium-mediated transformation of tomato plants expressing defensin gene | |
| WO1996022015A1 (en) | Transgenic grasses | |
| Verbitskaya et al. | Transformation of immature wheat germ (Triticum aestivum L.) by particle bombardment | |
| Joung et al. | Plant transformation methods and applications | |
| Valkov et al. | Plastid transformation in potato: an important source of nutrition and industrial materials | |
| WO2024212216A1 (en) | Methods for rapid agrobacterium-mediated sunflower stable transformation | |
| Muvingi et al. | COMPARISON OF THE EFFECTIVENESS OF METHODS FOR CREATING TRANSGENIC PLANTS OF SOFT WHEAT (TRITICUM AESTIVUM L.), RESISTANT TO ABIOTIC FACTORS | |
| Rashid et al. | Genetic Transformation of Tomato (Solanum Lycopersicum. L) Using Cry1Ac Gene to Impart Resistance Against Fruit Borer | |
| Badr-Elden et al. | Transgenic date palm containing endotoxin Cry3Aa gene |