JPH0216986A - トランスジェニック植物の作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明はマイクロインジェクション技術を用いて植物の
接合胚内に遺伝物質を挿入する再現性のある新規な方法
に関し、この方法は普遍的な適用の可能性によシ区別さ
れる。 本発明はまたトランスジェニック植物 （ｔｒａｎｓｇｅｎｌｃ　ｐｌａｎｔｓ　）　　を作製
するための本発明に係る方法の使用および本方法によシ
得られるトランスジェニック植物それ自体、並びにそれ
らの後代にも関する。 〔従来の技術〕 多くの研究所で普通の事柄として既に使用されている非
常に多くの方法および技術は、今では組換えＤＮＡ技術
を使用して植物ゲノムの遺伝子操作が利用可能にがっで
きた。 最もよく研究され、そして最も頻繁に使用される方法の
一つは疑う余地なくアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒ　ｉｕｍ　）形質転換系である。 アグロバクテリウム細胞は、それらのＴｉプラスミド上
に大きなりＮＡ断片、いわゆるＴ　−ＤＮＡ領域を有し
、この領域は植物細胞の天然の形質転換に際し植物ゲノ
ム内に組込まれる。 種々の改変を行った彼に、この天然の遺伝子導入系は植
物の明確に制御された形質転換のための遺伝子ベクター
系として使用はれ得る［：Ｃｈｉｌｔｏｎ、　Ｍ、Ｄ、
　１９８５１゜〔発明が解決しようとする課題〕 しかしながら、アグロバクテリウム形質転換系は、アグ
ロバクテリウム属の細菌の宿主範囲が考定の双子葉植物
および農業の経済的観点から重要ではない少数の代表的
な単子葉植物（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ　＠；、　１
９８４　：　ｔ（ｏｏｋａｓ−Ｖａｎ　−５ｌａｇｔｏ
ｅｎ　、１　＋ｌ、１９８４）に限られているという重
大な欠点を肩する。このことは、最も重要な栽培植物が
有効な遺伝子導入に従わないことを意味する。 さらに、使用されたアグロバクテリウム属の細菌は、そ
れらの宿主植物に腫瘍組織増殖の形態で特徴的な病気の
症状を引き起こす病原体であり、そしてそれ故に厳しい
安全警戒がとられる場合にのみ実験室で取り扱うことが
できる。 アグロバクテリウム形質転換系のこれらの欠点を補うた
めに開発された、そして植物プロトプラスト内に外来Ｄ
ＮＡを挿入することを目的とするその他の形質転換系、
例えばプロトプラスト内へのベクターなしでのＤＮＡの
直接遺伝子導入（ｐａＳｚｋｏｗｓｋｉ等、　　１９８
４．　ｐｏｔｒｙｋｕｓ等。 １９８６）　　およびプロトプラスト内へのベクターな
しでのＤＮＡのマイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏ
；ｎｊｅｃｔｉｏｎ　）　（Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ等
、　　１９８６：５ｔｅｉｎｂｉＳＳおよび５ｔａｂｅ
ｌ、　１９８３；ＭｏｒｉｋａｗａおよびＹａｍａｄａ
、　１９８５　）　、または細胞内への上記のマイクロ
インジェクション（ＮｏｍｕｒａおよびＫｏｍａ＋ｎ４
ｎｅ、１９８６　）　　　またはカルスへの上記のマイ
クロインジェク’／＝Ｉン（ＭｅｌｎｉｋＯＷ　ＰＶ等
；ＧＢ　２，２０ＣＪ、５６７）は、非常に多くの植物
種、特にホモノ科（Ｑｒａｍｉｎｅａｅ　）に関する限
りでは疑わしいとみなさなければならず、植物プロトプ
ラストから全体の植物の再生が依然問題として残ってい
る。 Ｙａｍａｄａ等、　　１９８６およびＴｏｒｌｙｍａ等
。 １９８６により行われた研究、とりわけイネグロトプラ
ストの再生に関する研究、並びに［ａｒｒｉＳ等、　　
１９８Ｂ（小麦）およびｐｈｏｄｅｓ等（トウモミコシ
）により行われた研究は、この分野での進歩の最初の足
跡を示した。 これらのその他の形質転換系の別の欠点は、形質転換の
比率であり、この比率は依然として比較的低く、現在の
最高は１係と５優の間である。 形質転換のこれらの低い比率はまた、非常に多くの形質
転換されていない細胞から形質転換体の迅速な選択全可
能にするマーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）が挿入
され得るＤＮＡを供給することを必要としている。 しかしながら、このことは、商業的な観点からでさえも
効果的でそして費用のかからない新規でそして有用な有
性を有するトランスジェニック植物の作製を可能にする
実際ＶＣ／Ｒ足すべき形質転換法がないことを意味し、
このことは特に単子葉類（Ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎ
ｅａｅ　）からの植物に当てはまる。 それ故に、植物の分類学上の区分およびそれと関連する
特徴に関係なく全ての植物の迅速で、効果的で、そして
再現性のある形質転換を可能にし、そしてそれ故に商業
的な観点からできえも効果的でそして経済的であるトラ
ンスジェニック植物の作製を確実にする方法を開発する
ことが優先的な課題としてみなされなければならないう この問題は、特に単子葉類の植物に関し、農業の経済的
観点から最も重要である栽培植物、例えば小麦、大麦、
ライ麦、オート麦、トウモロコシ、イネ、キビ等を包含
し、そしてそれ故に非常に特別な経済的興味があるとり
わけホモノ科の植物に関するが、これはトランスジェニ
ック単子葉植物の作製に利用できる満足すべき方法がこ
れまで無かったことＫ特に起因する。 つい最近開発された２種類の形質転換方法は、この方向
に第一段階を構成する。これらの方法の一方は、ライ麦
植物の幼若な花序内への外来ＤＮＡの注入（ｄｅ　ｌａ
　Ｐｅｎａ等、　　１９８７）　　’ｊｉ包含し、そし
て他方はトウモロコシ植物のトウモロコシ条斑ウィルス
でのアグロバクテリウム介在ウイＡ／、Ｘ感染（（、ｒ
ｉｍｓｌｅｙ等、　　１９８７）を包含する。 しかしながら、これらの新しく開発された方法でさえも
欠点を有し、例えば最初に記載した方法は再現性がない
。 〔課題を解決するための手段〕 不発明の範囲内で、植物の分類学上の区別およびそれと
関連する特徴に関係なく植物に対する非常に有効な形質
転換系を開発することが可能であると驚くべきことに今
明らかにでれ、この形質転換系は公知の方法の上記の限
界を有せず、そしてそれ故に普遍的な適用の可能性によ
り区別され得ろ。 特に、この系は、天然の胚形成の形観、で高い再生可能
性を有する植物の幼若接合肛門にＤＮＮ金含有溶液マイ
クロインジェクションし、そしテマイクロインジェクシ
ョンされた胚を胚形成を促進するために適当な培養培地
中でミクロ培養し、次いで全体の完全でそして生育可能
々植物体に再生させることを特徴とする植物内に遺伝物
質を挿入する方法である。 本発明は１だ、本発明に係る方法を用いて、形質転換さ
れた植物内に新規でそして望ましい特性音導く組換えＤ
ＮＡ分子で形質転換された全体のトランスジェニック植
物の作製にも関し、そしてその方法で作製されるトラン
スジェニック植物それ自体にも関し、そしてそれらの後
代にも関する。 本発明はまた、上記組換えＤＮ人分子を含有する形質転
換でれた一次または二次胚から再生される植物にも関し
、そしてそれらの種子にも関し、そしてまた上記トラン
スジェニック植物材料から再生された植物の後代にも関
し、そしてそれらの突然変異体および変種にも関する。 本究明の範囲内で、トランスジェニック植物の後代は、
有性的または無性的のどちらかで作製でれる形質転換で
れた親植物の後代と理解すべきである。 本発明は捷た、形質転換された植物内に新規でそして望
ましい特性を導く１種もしくはそれ以上の遺伝子−また
けＤＮＡ配列を含有するハイブリッド遺伝構築物、並び
にクローニングビヒクルおよび宿主生物にも関する。 さらに本発明は、新規でそして望ましい特性を有するト
ランスジェニック植物の作製のための本発明に係る形質
転換方法の使用に関する。 以下の記載において、組換えＤＮＡ技術および植物遺伝
学において慣用である多くの用語が用いられている。発
明の詳細な説明および特許請求の範囲、およびこれらの
用語にあてられた範囲の明確な、そして首尾一貫した理
解を確実にするために、以下に定義を記載する。 胚：苗条および根の生長点および子葉からなる植物の生
長の初期段階。 前胚：苗条および根の生長分裂組織および子葉の形成前
の胚的生長の２細胞期ないし多細胞期（第１図参照）。 胚形成：胚発生の可能性を有する細胞から始まる胚の生
長。 接合胚：受精した胚珠から形成された胚。 体細胞胚：胚形成性を有する体細胞から形成された胚。 キメラ：異なる遺伝情報を肩する細胞から構成でれた細
胞、細胞群、組織または植物。 植物材１＋：そのままでまたけ培養液中で生育可能な植
物の部分、例えばプロトプラスト、細胞、カルス、組織
、胚、植物器官、芽、種子等そしてまた全体の植物。 植物細胞：　プロトプラストおよび細胞壁からなる植物
の構造的および生理学的単位。 プロトプラスト：植物細胞または植物組織から分離てれ
、そして細胞クローンまたは全体の植物に再生する能力
を有する細胞壁のない裸の植物細胞。 の細胞から産生される遺伝的に同一な細胞の集合体。 植物組織：構造的および機能的単位の形態に組織化され
た植物細胞の群。 植物器°官：種々の組織、例えば根、茎、葉または胚か
ら構成される構造的および機能的単位。 ないが、しかし組織部分のみのゲノム内に安定に組込ま
れた外来ＤＮＡを含有する植物または組織。 ／ムに安定に組込まれた外来ＤＮＡを含有する植物。 種と同一な糧に由来するＤＮＡ配列。 の特定の生成物をコードするか、または生物学的機能を
遂行し、そして合成手段により合成さルるＤＮＡ配列。 植物プロモーター：植物内であらゆる所望の相同または
非相同ＤＮＡ遺伝子配列の転写を確実に行わせるＤＮＡ
発現の制御配列であるが、前記遺伝子配列はそのような
プロモーターと操作可能に結合されているう 終結配列：転写工程の終了を信号で伝える転写単位の末
端のＤＮＡ配列。 上の特定の生成物をコードするか、または生物学的機能
を遂行し、そして該遺伝子が挿入される種以外の稲に由
来するＤＮＡ配列；該ＤＮＡ配列は外来遺伝子または外
来ＤＮＡとも記載される。 の特定の生成物をコードするか、または生物学的機能を
遂行し、そして該遺伝子が挿入されるで形質転換されな
かった宿主細胞において自然状態で観察されるよりも明
らかに高い程度１で（ＲＮＡまたはポリペプチドの形成
量を測定して）、操作可能に結合された機能遺伝子配列
のトランスジェニック植物細胞内での発現を引き起こし
得る植物プロモーター どもポリペプチドに翻訳されないコード領域の上流また
は下流に位置するＤＮＡの部分。この領域は、制御配列
、例えばリポソーム結合部位（５′）またはポリアデニ
ル化信号（５′）を含む。 されたＤＮＡの発現に必要な全ての信号配列を含有する
クローニングビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテ
リオファージ。 ＤＮ人導入ベクター：遺伝物質の南当な宿主細胞への挿
入をｏＴ能にする導入ビヒクル、例えばＴｉプラスミド
またはウィルス。 第１図（Ｒａｎｄｏｌｐｈ等、　　１９３６に従って）
は、例としてトウモロコシ（ＺｅａｍａＹ５　）　ｆ用
いて穀類の胚の生長の種々の段階を示す。その他の穀類
、例えば小麦（”ｌ’ｒ　ｉ　ｔ　ｉｃｕｍ　ａｅｓｔ
　ｉｖｕｍ　）　　イネ（０ｒｙｚａ　５ａＨｖａ　）
、　大麦（Ｔ（ｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　）およ
びその他のホモノ科の生長は同様の方法で進む： 胚嚢（１）における胚珠の受精により、前胚の種々の段
階（５−２５）へ連続的な有糸分裂により生長する接合
子（２）が形成される。前胚から胚への変化（２５−２
６）は、未熟な苗条分裂組織および未熟な根分裂組織お
よび胚盤（変態子葉）の形成により特徴づけら扛る。 図面は同じ尺度で示していない；前胚（１７）は約０．
０５ｍｍの長さであり、前胚（２５）は約１１７１１Ｉ
＋の長さであり、そして胚（６５）は約８−１０ｍｍの
長さである。 図中の矢印はＤＮＡ含有溶液のマイクロインジェクショ
ンのための好ましい領域を示している。 第２図（Ｒａｎｄｏｌｐｈ等、　　１９５６に従って）
は、例としてナズナ（Ｃａｐｓｅｌｌａ　ｂｕｒｓａ　
ｐａｓｔｏｒ’ｓ　）を用いて双子葉植物の胚の生長の
種々の段階を示す。様々な種の生長の基本的な態様は同
様であるが、しかし細かいところでは非常に異っている
かも知れない。 杢 胚嚢におけ胚珠の受精により、前胚ＣＰ）および胚柄（
Ｓ）へ連続的な有糸分裂により生長する接合子（Ａ）が
形成される。前胚（球形）から胚（Ｅ）への変化は、段
階ＱとＲの間で起こり、そして２枚の子葉の原基の形成
で始まる。 図中の矢印はＤＮＡ含有溶液のマイクロインジェクショ
ンのための好捷しい領域を示している。 植物内への遺伝物質の挿入のための本発明に係る形質転
換方法は、自然の状態で自然な胚形成の形態での高い再
生能力を有する植物の幼若接合肛門へのＤＮＡ含有溶液
のマイクロインジェクションに基づいている。 本発明の範囲内で、単子葉種物の接合前胚または胚内へ
の、特にこれまで形質転換系が利用できなかった穀類お
よびその他のイネ科植物の接合肛門へのＤＮＡ含有溶液
のマイクロインジェクションが好ましい。 まだ生長のどく初期の段階にあり、そして４と１０００
以下の間の細胞数を有する非常に幼若な接合胚を植物中
に見い出すこと、およびそれらを分離してそしてそれら
を試験管内培養の様式で培養することは、本発明のなさ
れた時点までに可能ではなかった。 そのようなタイプの非常に幼若な接合胚（前胚）は培養
で生長しそして増殖できないと今まで思わｎ″ｃきた。 接合胚の分離および培養に関してこれ１で利用できる報
告は、最小の大きさが数十個の細胞を有する胚に限定さ
れており、そしてそれ故に細胞の数が余りにも多いから
可能なマイクロインジェクションには適当でないように
見える。 初期の前胚段階（第１図および第２図参照）で接合胚を
それらをとりまく植物構造体から分離すること、および
その接合胚を試験管内で培養することが、特定のプロセ
ス手段を適用することにより、驚くべきことに本発明の
範囲内で、最初に今可能となった。 受精した胚珠から誘導される前胚および胚内へのＤＮＡ
含有溶液のマイクロインジェクションは、マニュアルで
制御されるかまたは電動機制御ざｎるマイクロマニゲレ
ータ全備えたマイクロインジェクション装置を使用して
本発明に従って行われろ。 上記マイクロインジェクション装置の特定のの構築およ
び設備は、文献に広く記載されている。マイクロインジ
ェクション装置はこれまで様々な会社から販売されてお
り、そして完全な装置としてそれらから直接人手でさる
（例えばＺＥＩＳＳ　：　Ｎａｒａｓｈｌｇｅ　ＮＨｋ
ｏｎ　１ｎｓｔｒ、　：ＬｅＨｔｚ等）。 マイクロインジェクションによりこのように形質転換さ
れた前胚および胚は、次に本発明の方法に従って、ミク
ロ培養により刺激でれて直接胚形成し、そしてこれは次
に全体の植物体に非常に容易に再生さｎ得る。 その目的でマイクロインジェクションさ扛た前胚および
胚全個々にかまたは小群で好捷しくけ適当な培養培地を
含有する市販のミクロ培養プレートのウェル（ｗｅ口）
内に筐ず導き、そして胚特有の構造が形成されるまでミ
クロ培養する。 もちろん、本発明の範囲内で、接合前胚または接合胚の
ミクロ培養に適当なその他の培養法を用いることも可能
である。 胚への分化の後に、これらは最終的に無ビタミンで無ホ
ルモンまたはわずかにホルモンを含む培地に移し、その
培地中でさらに成熟胚への分化および最終的に小植物体
全形成するような成熟胚の発芽が起こる。 このように得られた小植物体金次に土壌に移

【７、そし
てさらに通常の実生と同ａｌＫ、栽培する。 本発明に係る形質転換法が従来の公知方法より優ｎてい
る室壁な利点は、本方法で達成し得、そしてこれまでの
文献に記載された形質転換の達成できる最高の比案上り
１０倍高い２０ｑｂと６０偶の間の値である著しく高い
形質転換の比率に由来する。 でらに、直接胚形成を介して胚から植物の直接再生によ
り、その他の別の方法で、特にその再生段階がカルス段
階全弁している方法で通常起こる「ツマクローナル変異
」の負の効果は、完全［−Ｅたは少なくとも部分的に癖
けられる。 しかしながら、このことは遺伝的に変更した植物（挿入
された遺伝子を除いて）は出発植物と全く同一であるこ
とを意味し、このことは植物育種のためには非常に重要
である。 本発明に係る方法のその他の重大な利点は、これまで適
用可能な形質転換法を用いる場合に、例えばアダロバク
テリウム形質転換系を用いる場合に特定の双子葉植物へ
の制限の形で、または直接遺伝子導入法を用いる場合に
プロトプラストから再生する単子葉植物のこれまでの不
十分な能力の形で起こる特定の標的植物の分類学上の区
分および前記区分と関連する特徴および技術的な困難さ
に関係のない普遍的な適用のり能性である。 分類学上の区分に関係なく、その構造体が通常の、全体
の、そして稔性の植物の引き続く再生を保証するあらゆ
る植物から得られる構造体（幼若有性胚）内に遺伝物質
が物理的方法（マイクロインジェクション）により導入
されるという事実から、本発明に係る方法の上記普遍性
は生ずる。 公知の方法より優れた本発明に係る形質転換法の上記の
利点とは別に、本方法のその他の利点として以下のもの
がある： ａ）再生が直接胚形成により起こり、そして試験管内培
養のその他の慣用のカルス段階および形轢形成誘導段階
が省略さ几るので再生時間が非常に短縮される。 ｂ）−ｒイクロインジエクンヨンされた構造体が二次胚
形成または二次不定苗条形成可能であれば、生成するキ
メラ形質転換体の試験管内分離を行うことが可能であり
、そして Ｃ）生成する形質転換体の試験管内増殖を行うことが可
能である。 ｄ）注意深い注入技術のために形質転換さｆ、マイクロ
インジェクションされた構造体が１００壬まで生き残る
。 高い再生能力を有する植物接合前胚または胚内にＤＮＮ
金含有溶液マイクロインジェクションし、このマイクロ
インジェクションされた接合前胚寸たは胚を胚種構造体
の形成を促進するのに適した培養培地中でミクロ培養し
、そして次に所望により生成する一般にキメラな再生体
からキメラでないトランスジェニック植物を作製するこ
とにより、新規でそして望才しい特性を有するトランス
ジェニック植物、特に単子葉類からの植物を高い効率で
作製することが、本発明の範囲内で上記の制限に関係な
く、それ故にまず最初に可能である。 詳しくは本発明に係る方法は以下の特定の工程段階から
なる： ａ）供与植物の未熟睡子からマイクロインジェクション
に適当な個々のポリ細胞ないしマルチ細胞接合前胚／胚
の分離、 ｂ）　次のマイクロインジェクションのための分離され
た接合前胚／胚の選択および適当な培養培地中への選択
された前胚／胚の導入、 ｃ）　ａ）で分離された接合前胚／肛門への１種または
それ以上のＤＮ人断片を含有するＤＮＡ含有溶液のマイ
クロインジェクション、 ｄｓ）直接胚形成を促進するのに適当な培養培地中での
マイクロインジェクションされた接合前胚／胚のミクロ
培養、 ｄ２）または、形態形成性細胞培養体の生長または二次
胚の形成を可能にする条件下で、注入された前胚／胚の
培養、 ｆ）完全で一般にキメラな植物への前記形質転換でれた
接合前胚／胚の再生、および ｇ）新規でそして望ましい特性を有するキメラでないト
ランスジェニック植物の作製。 接合前胚および胚の分離のための田発材料として適当で
ある供与植物は、戸外条件下または温室中のいずｎかで
生長させ得る。花形成を誘導するために春化処理が必要
である植物例えば小麦、大麦、ｒ−ト麦、ライ麦、トウ
モロコシ等を供与植物として使用する場合、開花の最適
な開始そしてその後の未熟な種子の最適な生長を確実に
するために、１ないし５週間であって良いある期間寒さ
に上記の種の植物を晒すことは有利であることは記載す
べきである。供与植物を収穫する時期は使用される植物
の種そして植物が生長する気候条件にも依存する。受粉
し７２ないし２０日後で、そして特に接合胚が初期の前
胚段階と胚段階の間、とりわけ２細胞期と約５０００細
胞期の間（第１図および第２図参照）の適当な生長期に
達した時に供与植物は収穫される。 接合前胚および胚は、顕微鏡でモニターしながら鋭いメ
スおよび鋭い針または鋭い抜き取り鉗子を用いて好まし
くは分離される。 この分離は例えば胚嚢を含む珠心組織を切除し、そして
次にその胚嚢を分離し、そして分離された胚嚢から前胚
／胚を除去することにより行うことができる。もちろん
あらゆるその他の分離の実行可能な方法音用いることも
できる。 その方法で得られた接合前胚および胚を次に液体培養培
地の液滴に移す。マイクロインジェクションに適当であ
る胚段階の引＠続く選択は好ましくは光学モニターで同
様に行われ、これには一般に立体顕微鏡または倒立顕微
鏡および細胞構造の微小選択（ｍ１ｃｒＯ３ｅ　ｆｅｅ
ｔ　ｉｏｎ　）に適当な選択系そして当業者には公矧の
、例えばにｏｏｐおよび５ＣｈＷｅｉｇｅｒ　（１９８
５）、　Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ（１９８６）または３
ｃｈｗｅｉｇｅｒ等（１９８７）　　により記載された
ものが使用される。 初期の球形前胚段階ないし初期の胚段階に及ぶ胚段階が
、次のマイクロインジェクションには好ましい。２ない
し約５０００個の細胞を有する胚段階をここでは特に言
及すべきであろう初期の前胚段階は少ない細胞しがない
という事実のためにマイクロインジェクションの良好な
可能性はマイクロインジェクションでれた構造体の低い
再生頻度を伴うから、最適段階の選択には可能な限シ多
くのその他の規準、例えば前胚または胚段階の良好な分
離性および良好な再生性も考慮すべきである。 それ故に、ホモノ科の場合、旺盛を有する初期の球形前
胚段階（第１図、段階１７−２５参照）は別として、極
く初期の胚段階（第１図、段階２５−３０参照）は、分
離が容易であることに加えてそれらが高い再生性により
区別されるから、本発明に係る方法での使用に特に適し
ている。 サラに、マイクロインジェクションに意図さｎそして好
ましい領域（未熟な苗条分裂組織）は比較的少ない細胞
だけからなるので、マイクロインジェクションの良好な
可能性はまた確実になる。本発明の範囲内では、それ故
に旺盛は別として明らかに認識できる未熟な苗条および
根分裂組織を既に有する初期の胚段階（第１図、段階２
６−２７参照〕が特に好ましい。 極く初期の球形前胚段階（第２図、段階０．Ｐ。 Ｑ参照）および初期の胚段階（初期ないし後期子葉段階
）（第２図、段階Ｒ，Ｓ、Ｔθ照）もまた、マイクロイ
ンジェクションにより双子葉類の植物内への遺伝物質の
挿入に特に適している。 本発明に係る方法のための出発材料として、特定の標的
植物の生長の最適段階の発見才たけ選択は、途方もない
数の実験全行りことなしに本発明の詳細な記載に基づい
てこの分野の熟練者には可能である。 接合前胚または肛門へのＤＮＡ含有溶液のマイクロイン
ジェクションは、とりわけ３ｔｅｉｎｂＩｓｓおよび５
ｔａｂｅ１．１９８３　；　Ｎｅｕｈａｕｓ等、１９８
４゜１９８６　：　Ｌａｗｒｅｎｃｅおよび（）ａＶｉ
ｅｓ、　１９８５　：並びにＭＯｒ　ｉ　ｋａｗａおよ
びＹａｍａｄａ、　１９８５　　によシ記載さｎている
そｎ自体公知の方法を用いて行うことができる。 詳細には、植物前肢／胚のマイクロインジェクションは
、その主装置がマイクロマニプレータにより制御される
マイクロピペットである特定のマイクロインジェクショ
ン装置を用いて行われる。 まず外径が１．００ｎｗｎと１００ｍｍの間である実際
の注入ピペットがある。１．２ｍｒｎないし１．５ｍの
直径が好ましい。一方、注入キャピラリイの先端の直径
は１μｍ以下と１０μｍの間である。その先端の直径が
［ｌＬ５μｍと１μｒｒｚ７）間である注入ギヤビラリ
イが本発明に係る方法での使用には特に好ましい。 本発明の範囲内で、使用きれるマイクロインジェクショ
ンキャピラリィとして、硼珪酸ガラスのグラスフィラメ
ント’にシールした微小電極ギヤビラリイが好ましい。 もちろん、マイクロインジェクション？行うのに適当な
あらゆるその他のタイプのガラスまたはその他の材料を
使用することも可能である。このマイクロインジェクシ
ョンピペットは一般に圧力制御ユニット、いわゆるマイ
クロインジェクターを介してガス源、特に窒素源または
圧縮空気源、こｎは植物組織内へのマイクロピペットか
らの注入溶液の非常に正確に計量された導入を確実にす
るものテアク、こ−ｎＫ連結さｎる。第二のピペット、
いわゆる保持ピペットは、マイクロインジェクション操
作の間に接合胚を正確な位置に固定するために機能する
。 これらの保持ピペットは一般に［ＬＯ２ｍｍと１．００
ｍ、好ましくは０．１　ｎＴＩＴ＋、！＝　０．５　ｒ
ｒｒｎの間の直径を有する皿形状の先端を有する。弱い
負圧または陽圧全与えることによシ、植物前肢／胚を吸
引に晒し、そしてその様にしてそれらを正確な位置に固
定すること、またはＤＮＡ含有溶液をマイクロインジェ
クションした後にそれら胚を再び遊離することが可能で
ある。第三のマイクロピペット、いわゆる採取ピペット
は、マイクロインジェクションされた胚を採取し、そし
てそれらを適当なミクロ培養プレートに移すために使用
される。 適当な採取ピペットは、マイクロインジェクションされ
た胚のトラブルのない吸引を確実にするように［Ｌｌｍ
ｍと１．Ｏｔｗ＋の間の内径全一般に有する。 実際のマイクロインジェクション操作は、前に分離され
そして選択された前胚または胚を、特別に調製されたカ
バーガラス上の適当な培養培地１０μメないし２００μ
ｌ内に、そして保持ピペットで適当な前胚／胚を吸引し
ながら導入することで一般に始まるが、前胚／胚を遊離
し、そして次にマイクロインジェクションのための前胚
／胚の最適な配位が達成さ扛るまでそれを再び吸引に晒
すことにより注入ピペットに対する前胚／胚の配位音質
えることも可能である。 マイクロピペットの先端が前胚の肝組織を貫通するか、
または胚の組織内に入り込んだ時、ＤＮＮ金含有注入溶
液解放する。 胚を用いた場合、ＤＮＡ含有溶液金未熟苗条分裂組織内
に注入することが好ましい。 注入容量は注入される細胞当たり細胞の大きさによって
１　ｐＡと１ｏｏｐ、ｇの間全一般に変化する。 本発明の範囲内で注入される細胞当たり２゜ｐｊないし
４０　ｐＡの注入容量が好ましい。 注入されるべきマルチ細胞構造体の構成要素に含まれる
細胞全ての可能な限りの均一な形質転換を可能にするた
めに、これらの細胞には１ないし１０００回注入するが
、しかし好ましくけ存在する細胞の数に依存して４ない
し６０回である。 このことは、種々の注入操作の間に注入されるべき接合
前胚および胚を口伝させることにょシ本発明に従って達
成され得、その結果できるだけ非常に多くの異なる細胞
がマイクロインジェクションさｎる。 植物細胞内へのマイクロインジェクションに適当なりＮ
Ａ溶液は、例えば適当な濃度で形質転換性ＤＮＡを含有
する緩衝溶液である。 本発明の範囲内で好ましいＤＮＡ濃度は、０１μｇ／μ
メないし１０μり／μｌ　であるが、しかし特にα５μ
９／μｌないし５μり／μｊ　である。ｒｌ、５μり／
μｊないし１．５μ９／μｊのＤＮＡ濃度が％に好まし
い 緩衝溶液のｐＨは７ないし８を変化し得、ｚ５と１８の
間のｐＨ範囲が本発明には好ましい。 ｍ物細胞のゲノムＤＮＡ内への外来遺伝子の組込みのた
めに、形質転換性ＤＮＡは天然のＤＮＡ配列（キャリヤ
ーＤＮＡ　）が両側に配置さｎている場合に有利である
。本発明の範囲内で、「天然のＤＮＡ配列」とは、転移
さル形質転換するＤＮＡの機能に含まれないが、しかし
植物ゲノム内への挿入ＤＮＡの組込みのためにだけ重要
である配列を特に意味するものと理解されるべきである
。 形質転換性ＤＮＡの両側に配置する天然のＤＮＡ配列は
、合成起源のもの、または適当な制限酵素で天然のＤＮ
Ａ配列を処理することにより天然に生ずるＤＮＡ配列か
ら得られたものかのいずれでも良い。例えば選択的な制
限酵素により開環された天然に生ずるプラスミドは、キ
ャリヤーＤＮＡとして適当である。しかしながら、また
遺伝子転移のためＶＣ，１出されたＤＮＡ配列は環状の
構造（プラスミド構造）を有しても良い。そのようなプ
ラスミドは、その中に発現信号を有する外来遺伝子が組
込まれているＤＮＡの糸からなる。 そのようなプラスミドの例は自由に入手可能なラスミド
ｐＵＣ８（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、およびＪ。 Ｖｉｅｉｒａ、　Ｑｅｎｅ　１９．２６９−２７６、１
９８２に記載）である。また、天然に生ずるプラスミド
の断片全キャリヤーＤＮＡとして使用することもできる
。 例えばカリフラワーモザイクウィルスの遺伝子■に対す
る欠失突然変異体をキャリヤーＤＮＡとして使用するこ
とができる。 本発明によれば、形質転換性ＤＮＡは、開環もしくは閉
環した環（プラスミド構造）または超らせんの形態のど
ちらでも良く、好ましくは線状化された形態である。 本発明の範囲内で線状化されたＤＮＡと超らせんのＤＮ
Ａとの混合物を使用することが好ましい。 マイクロインジェクションの後、接合前胚および胚は、
採取ピペッｌ−ｉ用いて吸い上げ、そして適当な培養培
地に移すことができる。 全体のマイクロインジェクション操作の光学モニターは
、顕微鏡観察により一般に行われる。 入射光と伝導光との組合せを有する倒立顕微鏡または立
体顕微鏡が好ましい。 倍率は注入されるべき材料の大きさに依存して選択され
、セして１０ないし８００倍の倍率を変化する。 形質転換さ扛た前胚および胚の試験管内培養はマイクロ
インジェクションに続く操作であって、これは十分に生
長した植物体１で胚かさらに生長するのに適当である培
養培地中で好１しくけ行われる。 これらの組成を考えると、これらの培地は、それらがそ
れらの化合物中に植物細胞の増殖および生長に必須であ
る鉱物または元素（マクロ元素）、例えば窒素、リン、
硫黄、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよび鉄を
、いわゆる機前元素（ミクロ元素）例えばナトリウム、
亜鉛、銅、マンガン、硼素、バナジウム、セレンおよび
モリブデンの他（で含有する事実により特に区別される
。マクロ元素は１０１Ｒ９／＃と数１００ダ／ｌの間の
量で存在し、ミクロ元素の濃度は最大数η／ｌが一般的
である。 前記培地のその他の溝成成分は、多くの必須ビタミン、
例えばニコチン酸、ピリドキシン、チアミン、イノシト
ール、ビオチン、リボ酸、リボフラビン、Ｃａ−パント
テネート等、適当な容易に同化でさる炭素源、例えばシ
ョ糖またはブドウ糖、およびオーキシン類およびサイト
カイニン類からの天然または合成植物ホルモンの形態に
ある種々の生長調節剤を、０．０１Ｍ９／Ａないし２　
ａｒｍｙ／／、の濃度範囲で包含する。 本発明に従って、培地の組成とそれらの個々の成分の濃
度比金胚の生長段階に従って変え得ることは特別に注意
されるべきである。このことは、所望により直接胚形成
が制御埒れた方法で進行することを確実にするために、
互いにバランスのとれた比で適用されるべき使用でれる
生長調節剤に特に当ては才ろ。 不発明の範囲内で、オーキシン類およびサイトカイニン
類からの植物ホルモンの好捷しい濃度範囲は、０．０１
η／ｂと２０ダ／ｊの間、特に０８ダ／ｂと１．２塾句
の間である。 培養培地をさら１（糖アルコール（例えばマンニトール
〕、糖（例えばブドウ糖）または塩イオンの添加により
浸透圧的に安定きせ、そして４．５ないしｚ５、好１し
くは５．２ないし＆５のｐＨ値に調整する。 既知濃度の種々の個々の成分の正確に規定された組成を
有する合成培地の使用とは別に、本発明に従って全体が
捷たけ少なくとも一部が天然成分からなる複合栄養培地
を使用することも可能である。 これに関連して、植物の未熟な種子から吸弓により得る
ことができる例えばジャガイモ抽出物、ココナツツミル
クおよび液体胚乳にも注意がひかれる。 ところが一方、第一の培養段階はマイクロインジェクシ
ョンの直後に行われるが、こｎは好ましくは液体培養培
地中で行われ、この培地は、所望により固化培養培地上
に積層させても良く、さらに胚生長の途中において、微
生物学的技術において慣用の固化剤の１種を添加するこ
とにより製造され得ろ液体もしくは固体培養培地に、ま
たは固体および液体培地の岨合せのいずれかにたよって
も良い。 適当な固化剤は、例えば寒天、アガロース、アルギネー
ト、ペクチネート、登録商標ゲＪレライ）（Ｇｅ１４ｉ
ｔｅ■〕、ゼラチン等を包よする。寒天およびアガロー
ス、特に低融点タイプ（ＬＭＴ）の寒天およびアガロー
スが好筐しい。 液体培地を使用する場合、ある場合には浸透圧の頃が上
昇しないで培地の濃度が上昇するように浸透圧的に中性
な増粘剤會培池に添加することは有利であり得る。 結果として培地上への胚の浮上および周囲の大気との最
適なガス交換をそれにより確実に行う。 不発明の範囲内で、合成ポリマーが好ましく、例えばそ
れに限定されないが、サブカロースとエビクロロヒドリ
ンとのコポリマーで７０，０００と４００，０００の間
の分子量を肩す５４のである。 １：記の方法でマイクロインジェクションされた前胚棟
たは胚１は、マイクロインジェクションの直後に、好１
しくけ接合前胚および胚の試験管内培養に適当な組成を
有する培地を含有する市販のミクロ培養プレート上に移
す。 マイクロインジェクションされた接合前胚または胚のミ
クロ培養は、浸透圧的に中性の増貼剤を使用きれる植物
材料の特定の要求に従って添加（−得、そして所望によ
り固体溶池上に積層しても良い液体培養培地中で好まし
くは行われる。 培養＃度は１女いし５０個の前胚または胚／培養培地１
μｌが好オしく、特に１なｌＡｌ、　５個の前胚捷たは
胚／培養培地１μｋが好ましい。 選択される培養濃度は、使用でれた前胚／胚の大きさお
よび生長段階に依存する。 マイクロインジェクションされた前胚または胚の培養が
、湿度室として作用する２室系（２−ｃｏｍｐａｒｔｍ
ｅｎｔ　ｓｙｓｔｅｍ）で少なくともある期間性われる
場合、胚が内部の部屋内にある間、外側の部屋が例えば
水、培養培地またはマンニトール水溶液により形成さ扛
、本発明の範囲内で有利であることがわかった。 マイクロインジェクションされた前胚または胚を１ない
し１２日毎に、好ましくは２ないし３日毎に新鮮な培養
培地に移すか、または胚の大きさに応じた培地の容量そ
して一般的にはα５μｊと１０μｊの間で、それ故に胚
：培地の比が１：０．２μ！ないし１：１０μｊどなる
ように新鮮な培養培地の層でそｎらを覆うことも有利で
ある。 上記の方法でミクロ培養された胚が生長の特定の段階に
達した時、しかし通常１０ないし３０日後に胚を苗条お
よび機端の分化のために所望により液体培地の層で覆わ
ｎでも良い固体培地上に移す。固体培地は通常、植物の
再生に使用され、そして特にオーキシン類およびプイト
カイニン類からの植物ホルモンの均衡のとれた含量のた
めに苗条および／またけ根生長の分化を生じる培養培地
であっても通常良い。 使用された植物材料により、約４ないし８週の培養期間
の後であるが、しかし少なくとも胚の発芽の後に、ホル
モン全会く含まないか、またはわずかなホルモン濃度ヲ
有する固体培地上に胚を移すことができ、ここで小さな
小植物体（実生）が形成される１でさらに培養される。 使用された植物材料に応じて、例えばそれ自体公知の根
誘導培地〔例えば培地Ｓ４（表９〕；Ｔ（４（表１０）
参照〕上に胚を移すことにより板形成の誘導を生ずるこ
とは有利であり得る。 この方法で形成された一般的にキメラなトランスジェニ
ック小植物体を次に土壌に移植し、そしてさらに通常の
実生と同様に処理しても良い。 そｎ自体公知の操作手段を用いて、次にキメラでないト
ランスジェニック植物を上記の方法で得られたトランス
ジェニックキメラから非常に簡単に作製し得る。 原理的に２つのどちらかの方法がキメラでないトランス
ジェニック植物の作製に利用できる。 ａ）二次胚形成または二次不定醒条形成に従う植物の場
合には、個々の細胞から誘導される二次構造体を最初に
形成された一般にキメラな再生体から試験管内で分離す
ること、そして互いからそれらを単離すること、および
このようにして純粋なトランスジェニック植物を得るこ
とが可能である。このことは導入された外来遺伝子また
はその１つがトランスジェニック細胞だけが生き残るよ
うな選択培養条件の使用を可能にする場合に特に単純で
ある。 トランスジェニック再生体を次に上記の方法で培養し、
そして全体の植物体に再生することができる。 ｂ）一方、相同に形質転換された（キメラでない）ｉ物
は、−次トランスジェニックキメラの自家受粉により得
ることもでき、所望によりこれは繰り返しても良い。有
性の後代は単一細胞、即ち愛情した胚珠から生じるから
、この後代のいくつかは、即ちキメラｔｚ　トランスジ
ェニック領域が花粉または胚珠の形成に関与する時には
、完全なトランスジェニック植物であろう。 マイクロインジェクション技術を用いるトランスジェニ
ック植物の作製のための上記の方法は、全てのその段階
を包含し、本発明の一部を形成する。 本発明に係る方法は、はとんど全ての植物が接合胚を形
成するからほとんど普遍的に使用さｎ得る。それは、天
然のＤＮＡ配列のおよび組換えＤＮＡ技術により人工的
に製造されたノ・イブリッド遺伝子構築物の両方のマイ
クロインジェクションを包含する。 本発明の広い範囲は、形質転換体［有用でそして望まし
い特性を生ずるＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮ人分子
を特に包含する。 これらの分子は、有用でそして望ましい特性をコードし
、そして形質転換された植物細胞内での遺伝子配列の発
現が確実に行われるように植物内で活性な発現信号の調
整制御下にある１種またはそれ以上の遺伝子配列全含有
する組換えＤＮＡ分子が好ましい。 植物細胞内で発現され、そして植物に有用なおよび／捷
たは望ましい特性、例えば病原体（例えば植物病原性菌
類、バクテリア、ウィルスその他）Ｋ対する増加した耐
性；化学物質〔例えば除草剤（例えばトリアジン、スル
ホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、
ビアラホス、グリホセートその他）、殺虫剤もしくはそ
の他の殺生物剤〕に対する耐性；細胞毒素（例えばハイ
グロマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールそ
の他）に対する耐性；不利な環境の（土壌のもしくは大
気の）影響（例えば、熱さ、寒さ、風、不利な土壌条件
、湿気、乾燥その他）に対する耐性：または葉、種子、
塊茎、根、茎その他における保存物（５５〕 質または貯蔵物質の増加した形成または品質の向上した
形成全付与するあらゆる遺伝子が本発明の方法における
使用に適している。トランスジェニック植物により産生
された望ましい物質は、例えばタンパク質、デンプン、
糖、アミノ酸、アルカロイド、フレーバー、色素、脂肪
その他を包含する。 本発明は薬学的に許容性の活性物質、例えばアルカロイ
ド、ステロイド、ホルモン、免疫モジ−レータ−および
その他の生理学的に活性な物質をコードする遺伝子も包
含する。 細胞毒素に対する耐性は、例えば細胞毒素を解毒する酵
素、例えばカナマイシン、ハイグロマイシンおよびその
他のアミノグリコシド抗生物質全解毒するネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ■型もしくはアミ／グリコシ
ドホスホトランスフェラーゼ■型、またはグルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼもしくはチトクロームＰ−４
５０、またはトリアジン、スルホニル尿素もしくはその
他の除草剤を解毒するために公知のその他の異化酵素を
植物細胞内に発現する遺伝子により与えられても良い。 細胞毒素に対する耐性はまた、細胞毒素に対して耐性で
ある「標的酵素」の形態（細胞毒素の作用部位）、例え
ばスルホニル尿素もしくはイミダゾリノン、またはこの
異化段階で作用するその他の除草剤による阻害に対して
感受性でないアセトヒドロキシ酸シンターゼの形態、ま
たはグリホセートによる阻害に対して感受性でないＥＰ
ＳＰシンターゼの形態を植物内に発現する遺伝子により
与えられても良い。植物細胞での正確な細胞内小器官、
即ち上記の例における葉緑体内へそれらを移送させる形
態にあるこれらの改変された標的酵素を発現することは
有利であり得る。 ある場合には、ミトコンドリア、液胞内に、細胞質内部
の小胞もしくはその他の細胞部分に、または細胞間（ア
ポプラスト〕空間内にも遺伝子産物會打ち込むことは有
利である。 ある種の菌類に対する耐性は、例えば植物組織内にキチ
ナーゼを発現する遺伝子の導入により与えられても良い
。多くの植物病原性菌類は、菌糸および胞子構造の欠く
ことのできない部分としてキチンを含有する。そのよう
な菌類は、例えば才且子菌類（黒穂菌およびサビ菌）お
よび子嚢菌類および不完全菌類〔アルテルナリアセルコ
スボラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ　）　］　ｆ包含する。 キチナーゼは試験管内である種の病原体の菌糸体の増殖
を阻害し得る。構造的に、または病原体侵入に応じてキ
チナーゼ會発現する植物の葉または根は、多くのタイプ
の菌類の攻撃に対して保護される。キチナーゼは新たな
合成に必要な誘発期をもたずに高いレベルですぐに存在
するから、構造的な発現は、ある種の植物での病原体攻
撃に対する正常な応答である誘導性発現より有利であり
得るか、またはあり得ない。 昆虫耐性は、例えば昆虫および／またはそれらの幼虫に
対して毒性であるポリペプチド、例ｊｃ−ｉｉ’　ハｆ
　ラス　スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒ
ｉｎｇｅｎｓｉｓ　）の結晶性タンパク質［Ｂａｒｔｏ
ｎ等、　　１９８７　：　Ｖａｅｃｋ等１９８７］　　
をコード化している遺伝子により与えらｆても良い。昆
虫耐性を与えるであろう第二類はプロテアーゼ阻害剤で
ある。プロテアーゼ阻害剤は植物貯蔵構造体の共通構成
要素である［Ｒｙａｎ、１９７５〕。大豆から単離され
た精製ボウマン−パーク（１３ｏｗｙｎａｎ−Ｂｉｒｋ
）プロテアーゼ阻害剤は、テネプリオ（Ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏ　）幼虫の内臓プロテアーゼを阻害することが示され
た［１３１ｒｋ等、　　１９６３］。ササゲトリプシン
阻害剤をコード化している遺伝子は、Ｔ（ｉｌｄｅｒ等
、　　（１９８７）　Ｋより記載サレテイル。 グロテアーゼ阻害剤全コード化している遺伝子は、植物
プロモーター　好′ましくはＣａＭＶ５５Ｓプロモー　
ｐ　−［Ｑｄｅ　１１等、　　（１９８５）により記載
〕のような構造的なプロモーターの制御下で適当なベク
ター内におかれていても良い。遺伝子、例えば大豆ボウ
マン−パークプロテア−ゼ阻害剤のコード配列は、Ｈａ
　ｍｍ　ｏｎｄ等、（１９８４）によりｉ己−祝された
ｃＤＮＡクローニングを用いて得られつる６１００個よ
り少ないアミノ酸を有するプロテアーゼ阻害剤例えばり
ママメトリブジン阻害剤のための遺伝子全得ろ別の方法
は、それを合成することである。コード配列全バーｌク
トランスレーションにより予測し、そして所望のベクタ
ーに対して適当な制限部位は各端部に包含される。合成
遺伝子は、６０ないし６０塩基の重複オリゴヌクレオチ
ドを合成することにより製造される。断片をリン酸転移
し、連結しくＭａｎｉａｔｉ５等、　　１９８２）、−
ｔ　Ｌ　Ｔ：　ｉＭ　当’ｌｘ　ヘクＩ−内にクローン
化する。その挿入が正確な配向にあるクローンは、配列
決定により同定され得る。プラスミドＤＮＡ−１分離し
、そしてプロトプラスト内への編入のために使用する（
ＡＪｙｅｌ等。 １９８６）、ｌ 薬学的に活性な成分、例えばアルカロイド、ステロイド
、ホルモンおよびその他の生理学的に活性な物質、およ
びフラビン、ビタミンおよび１色土ヲコードする遺伝子
も本発明に包含される。それ故に、本発明内で意グされ
る遺伝子は、植物特有の遺伝子、例えばゼイン遺伝子（
Ｗｉｅｎａｎｄ等、　　１９８））、ホ乳類特有の遺伝
子、例えばインシュリン遺伝子、ソマトスタチン遺伝子
、インターロイシン遺伝子、ｔ−ＰＡ−遺伝子（ｐｅｎ
ｎｉｃａ等、　　１９８３）その他、または微生物起源
の遺伝子、例えばＮＰＴ　［１遺伝子並びに合成起源の
遺伝子例えばインシュリン遺伝子（Ｉｔａｋｕｒａ等、
１９７５）’ｉ包含するが、しかしこれに限定でれない
。 有用でそして望ましい特性全コードする天然に生じる遺
伝子を別にして、本発明の範囲内で、化学的方法または
遺伝子操作方法を用いる特定の方法で予め変形した遺伝
子を使用することも可能である。 本発明の広い概念はまた化学合成により全体が製造ざｎ
た遺伝子も包含する。 その他の有用なりＮＡ配列、特に制御機能を有する非コ
ードＤＮＡ配列も、本発明に係る方法における使用に適
当である。これらの非コード配列は、例えば植物組織内
の関連ＤＮＡ配列の転写を制御できる。この点では、ｈ
ｐｓ７０遺伝子のプロモーターが例えば熱シヨツク処理
により誘導さ扛得る［　５ｐｅｎａ等、　　１９８５］
　コト；リフロース１，５−ビスホスフヱート力ルポキ
シラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）　遺伝子の小すプエニット
の核コード化配列［Ｍｏｒｅｌｌｉ等、　　１９８５］
またはクロａフィルムａ／ｂ結合タンパク質遺伝子の５
′−配置配列が光により誘導され得ること；またトウモ
ロコシのアルコールデヒドロｙ　す−セ（ａｄｈｌ−ｓ
　）遺伝子の５′−配置配列が関連リポータ−遺伝子［
例ｔｔｆクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＣＡＴ　）　］　（Ｈｏｗａｒｄ等、　　１９８
７）の発現を誘導することがでさることを言及すべきで
ある。 制御可能なりＮＡ配列のその他の群は化学的に制御可能
なりＮＡ配列からなり、そ扛は例えばタバコのＰＲ（病
原体関連）タンパク質遺伝子内に含まれ、そして化学的
な制御剤により誘導性である。 上記の調節性ＤＮＡ配列は、実施例に与えられているの
みであるが、天然起源または合成起源であって艮（、ま
た天然および合成りＮ人配列の混合物であっても良い。 本発明の範囲内での使用に適当である遺伝子またはＤＮ
Ａ配列は、本発明の範囲内で与えられた定義による相同
および非相同遺伝子またはＤＮＡおよび合成遺伝子また
はＤＮＡの両方である。 ＤＮＡ配列は排他的にゲノムＤＮＡから、ＣＤＮＡから
、または合成り８人から構築さ扛ることができる。ｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方および／または合成り８
人からなる）・イブリッドＤＮＡ配列の構築がもう１つ
の可能性である。 その場合、ＣＤＮＡはゲノムＤＮＡと同一な遺伝子から
生じても良く、またはｃＤＮＡとゲノムＤＮ人の両方が
異なる遺伝子から生じても良い。 しかしながら、あやゆる場合において、ゲノムＤＮＡお
よび／またばｃＤＮＡは同一またけ異なる遺伝子から個
々に各々製造されても良い。 ＤＮＡ配列が１以上の遺伝子の部分を含む場合には、こ
れらの遺伝子は１種そして同一個体から生じても、また
は同−属の四一種もしくは様々な種の様々な株もしくは
変種に属する１々の個体から生じても、また同一もしく
は異なる分類学上の単位（門）の１以上の属に属する個
体から生じても良い。 植物細胞中の構造遺伝子の発現全確実にするために、コ
ード遺伝子配列は植物細胞内で機能し得る発現配列に操
作可能に最初に結合されるならば有利である。 従って本発明の範囲内のハイブリッド遺伝子構築物は、
概して、構造遺伝子に加えて、プロモーターおよびター
ミネータ−配列の両方並びに３′および５′非翻訳領域
のその他の調節配列をも包含する発現信号を含有する。 コードＤＮＡ配列（構造遺伝子）の発現の誘導を引き起
こし得るあらゆるプロモーターおよびあらゆるターミネ
ータ−をハイブリッド遺伝子配列の成分として使用し得
る。、植物または植物ウィルスの遺伝子から生ずる発現
信号は特に適当である。適当なプロモーターおよびター
ミネータ−の例は、ツバリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ
）、オクトピンシンターゼ遺伝子（ＯＣＳ）およびカリ
フラワーモザイクウィルス遺伝子（ＣａＭＶ）のもの、
または記載した発現信号の特徴的な特性を依然有する相
同ＤＮＡ配列である。 ＣａＭＶグ／ムゲノムＳおよび１９Ｓ発現信号またはそ
ｎらの相同物が本発明の範囲内で好ましく、こｎらは例
えばマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等。 １９８２年に記載されるような分子生物学の方法を用い
る前記ゲノムから分離され、そしてコードＤＮＡ配列に
結合−ｇＡ得る。 ３５５および１９５発現信号は、不発明の範囲内で、わ
ずかな配列の相違があっても実質的に出発配列と相同で
あり、そして同一の機能を依然有する発現信号を意味す
るものとして理解されるであろう。 本発明に従って、５５Ｓ転写制御配列に使用される出発
材料は、例えば遺伝子地図〔フランクジー、　（ｐｒａ
ｎｋ　Ｇ、　）等、　１９８０年〕　のヌクレ、１−　
ｆ　）”　６８０Ｂ−７６５２ｆ包含するＣａＭＶ　”
　Ｓ　’株の５ｃａｌ断片であって良い。 １９５プロモーターおよび５′非翻訳領域は、ＣａＭＶ
遺伝子地図［ホーン（Ｈｏｈｎ）等、　１９８２年］の
Ｐｓｔ　１部位（５３８６位）とＨｉｎｄｌ１１部位（
５８５０Ｑ）　　との間のゲノム断片上にある。 相当するターミネータ−および５′非翻訳領域は、Ｃａ
ＭＶゲノムの７３４２位と７５４３位トノ間のＥｃｏＲ
Ｖ／ＢｇＡ　ＩＩ断片上に存在する。 完全なヌクレオチド配列がガードナー　アール、　、７
−、　（Ｑａｒｄｎｅｒ　Ｒ，Ｃ，）等、　　１９８）
年に記載されるＣａＭＶ　ＣＭ　１　Ｂ４１　株の発現
信号が不発明の範囲内で好捷しい。 使用し得る効果的な植物プロモーターのもう１つの例は
、過産生植物プロモーターである。 この種のプロモーターは、所望の遺伝子産物全コードす
る遺伝子配列に操作可能に結合さｎているならば、前記
遺伝子配列ｌ・発現可能ｔＬｉ＊るべきである。 本発明の範囲内で使用し得る過産生植物プロモーターは
、大豆からのりブロース−１，５−ビスホスフェートカ
ルボキシラーゼの小すフユニットのプロモーター〔ベリ
ー−ローライ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ　）、　　Ｊ、Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ａｎｄ　　Ａｐｐ、Ｇｅｎ、、　
　１　　：４８３−４９８（１９８２）　］　　および
クロロフィルａ／ｂ−結合タンパク質のプロモーターを
包含する。これら２種のプロモーターは、それらが真核
植物細胞中に光により誘導されるという事実で刊られで
いろ〔例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ　
−ｎｇ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ、　ａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ　ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ。 ニー、キャッシュモア（Ａ、　Ｃａ５ｔｌｌｌｌｏｒｅ
　）、プレナＡ　（ｐ　Ｉｅｎｕｍ　）、　　＝　ユ＋
ヨーク　１９８３年、第２９−３８頁：コルツチ　ジー
、　（Ｃｏｒｕｚｚｌ　Ｇ、　）等。 Ｔｔｌｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５８：１３９９（１９８
３）およびダンスムイル　ビー（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ　ｐ
、　）等、　　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　（、ｃｎｅｔｉｃｓ、　
２　：２８５（１９８３）参照］。 そｎ自体公知の方法で完全がコードＤＮＡ配列全形成す
るためにＤＮＡ配列の様々な部分を互いに連結すること
ができる。適当な方法は、例えば相同部分を有するＤＮ
Ａ配列の生体内ｉ：■換えおよび制限断片の試験管内連
結全包含する。 使用さｔしるクローニングベクターは一般的Ｋ、宿：Ｅ
　＆’ｌｌ胞に適合する種起源の、複製および制御配列
を有するプラスミドまたはウィルス（バクテリオファー
ジ〕ベクターである。 クローニングベクターは通常複数の開始およびまた形質
転換ざｎた宿主Ｈ１胞巾に選択可能な表現型マーカー、
将に抗生物質才たはある種の除草剤に対する耐性を結果
として生ずる特定の遺伝子もイ丁する。形質転換さ′ｉ
″ｌ−たベクターは宿主細胞円での形質転病後これらの
表現型マーカーにより選択されうる。 本発明の範囲内で使用さｎ（４る選択可能力表現型マー
カーは、例えばこｎが本発明の主題を限定することなく
アンピシリン、テトラサイクリン、ハイグロマイクン、
カナマイシン、メトトレキサート、Ｇ４１Ｂ、ｓｙよび
ネオマイクンに対する耐性を包含する。 本発明の範囲内の適当な宿主細胞は、原核生物てあり、
細菌宿主、例えばアグロバクテリウムチュメ７７　’／
　エフ　Ｘ　（Ａ、　ｔｔｌｍｃｆａｃｉｅｌｌｓ　）
、大腸菌、ニス、チフィムリウＡ　（Ｓ、ｔＹｐｌｌｉ
ｍｕｒｉＬＩｍ）およびセルラチアマルセッセンス（５
ｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）　　およびシ
アノバクテリアを含む。 真核生物宿主、例えば酵母、菌糸体形成菌および植物細
胞も不発明の範囲内で使用でき乙。 本発明に係るハイブリッド遺伝子（ｎ築物のスプライジ
グは、例えばマニアチス等、１９８２年に記載された標
準法を用いて適当なりローニングベクター内で行われる
。 一役的にスプライシングされるべきベクターおよびＤＮ
Ａ配列をまず潰初に適当々１ｔｊｌ限酵素で切断する。 遣ちな制限酵素ｊｉ、例えばプラント末＠を有する断片
を生じろもの、列えば５ｍａ、　ｌ、Ｈｐａ　Ｉおよび
ＥｃｏＲＶ　、または粘着端を形成する酵素、例えばＴ
ｉ：ｃｏ　Ｒ１、Ｓａｃ　（およびｌｏａｍ　ＩＩであ
る。 プラント末端を有する断片と互いに相補的で（６９〕 ある粘着端を有する断片の両方を、適当なりＮＡ　リガ
ーゼにより再び連結し、連続的で均一なりＮＡ分子を形
成することができる。 突出する粘着端を肩するＤＮＡ断片を大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼのクレノー断片と処理して、相当する相補的ヌ
クレオチドで空隙を充填することによりプラント末端ヲ
裂造することもできる。 他方、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼを用いて所望のＤＮ人配列オよび切断されたベ
クター分子の端部に相補的ホモポリマー尾部を添加する
か、または制限切断部位を有する合成オリゴヌクレオチ
ド配列（リンカ−〕を添加し、そして次に適当な酵素で
切断することにより、粘着端を人工的に製造することも
できる。 クローニングベクターおよび該ベクターで形質転換され
た宿生細胞は、本発明によりベクターのコピー数を増や
すために使用される。増加したコピー数によって、本発
明のハイブリッド遺伝子構築物を有するベクターを分離
すること、そしてそれを使用すること、例えばキメラ遺
伝子配列を植物細胞内に挿入することが可能となる。 その他のプロセス段階において、所望の遺伝子産物をコ
ードする構造遺伝子または制＃機能を有する非コードＤ
ＮＡ配列を植物細胞内に挿入し、そしてそｎｉ植物ゲゲ
ノ内に組込むために上記プラスミドを使用することがで
きる。 そｎ故に、本発明は、植物細胞のゲノム内に取込まれ、
上記構造遺伝子またはあらゆるその他の適当なりＮＡ配
列を含有する受容植物細胞にも関する。 本発明の広い概念は、本発明の上記の方法を用いて形質
転換されたトランジェニック植物並びに親植物の形質転
換で生ずる新規でそして望ましい特性を依然有するそれ
らの無性および／または有性の後代（ｐｒｏｇｅｎｙ）
　　ｋも包含する。 −ｔｔｔ故に、［トランスジェニック植物の無性および
／または有性の後代］という本発明の範凹円で定義され
たような表現は、形質転換された出発植物体の特徴的な
特性金依然有するあらゆる突然変異体および変種並びに
形質転換された植物材料を含むあらゆるノ・イブリッド
形成および融合産生物音も包含する。 「植物増殖材料」という本発明の範囲内で定義されたよ
うな表現は、例えば植物プロトプラスト、細胞、細胞ク
ローン、細胞塊、カルス組織培養体および／まｆｃ、は
器官培養体および種子、花粉、胚珠、胚、接合子または
遺伝系列から生じるその他の増殖材料を含むと理解さｎ
るべきである。そして上記のものは例示のためのもので
あり、本発明の主題を制限するものではない。 本発明はまた植物体の部分、例えば本発明の方法を用い
て、前に形質転換されたトランスジェニック植物または
それらの後代から発生し、そしてそれ故に少なくとも部
分的にはトランスジェニック細胞である花、茎、果実、
葉および根にも関する。 本発明の方法は、全ての植物、特に被子植物亜目および
裸子植物亜目の体系的な群に属するものの形質転換に適
当であろう 裸子植物亜目の中では球果植物綱の植物が特に興味深い
。 被子植物亜目の中では落葉樹および潅木に加えて、ナス
科、ジュウジバナ科、キク科、ユリ科、ブドウ科、アカ
ザ科、マツカゼンウ科、アリアセアエ科、ヒガンバナ科
、アスパラガセアエ科、ラン科、ヤシ科、アナナス科、
アカネ科、ツバキ科、ハシヨウ科、アオイ科またはホモ
ノ科、およびマメ目、および特にパピリオナセア工科の
植物が特に興味深い。ナス科、ジュウジバナ科、マメ科
、アオイ科およびホモノ科の代表種が好ましい。 本発明の範囲内の標的作物は、例えばフラガリ７　（Ｆ
ｒａｇａｒ＋ａ　）、ロータス（Ｌｏｔｕｓ　）、　メ
ディケーゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　）、オノブリイキスウ
ム（Ｑｅｒａｎｌｕｍ　）、−ｒ＝ホット（Ｍａｎ　１
ｈｏｔ　）、トーカＸ　（１）ａｕｃｕｓ）、アラビド
プシス（Ａｒａｂｔｄｏｐｓｉｓ）、プラッシカ（Ｂｒ
ａｓｓ；Ｃａ）、う７７５Ｃス（Ｒａｐｈａｎｕｓ　）
、シナビニｘ　（ＳｉｎａｐｉＳ）、アトロバ（人ｔ　
ｒ０＋）ａ　）、カブシカＡ　（Ｃａｐｓｌｃｕｍ）、
ダチュラ（Ｄａｔｕｒａ）、／〜イオシアムス（Ｈｙｏ
ｓｃｙａｍｕｓ　）、リコベルシコン（ＬＹＣｏｐｅｒ
ｓ　１ｃｏｎ　）、ニコチアナ（ＮｉｃｏｔＨａｎａ　
）、ソラヌム（５ｏ１ａｎｕｍ）、ペチュニア（Ｐｅｔ
ｕｒＢａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｉｓ　）、
マジョラナ（ＭａＪＯｒａｎａ　）、シコリウム（Ｃｉ
ｃｈｏｒｉｕｍ）、へりアンタス（Ｉ（ｅｌｌａｎｔｈ
ｕｓ）、ラクチュカ（Ｌａｃｔｕｃａ　）、ブロムＸ　
（Ｂｒｏｍｕｓ　）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕ
ｓ　）、アンチリヌＡ　（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、
ヘメロ力リス（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、ネメシア
（１’Ｊｅｍｅｓｉａ）、ベラルゴニウＡ　（ｐｅｌａ
ｒｇｏｎｉｕｍ）、パニカＡ　（ｐａｎｉｃｕｍ）。 ペンニセタＡ　（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ラヌンカ／
Ｉ／ス（ＴｒｉｔＨｃｕｍ）およびツルガム（Ｓ　ｒｏ
ｇｈｕｍ　）、ゴッシピウＡ　（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）
、イボモニア（ｌｐｏｍｏｅａ　）、パフシフローラ（
ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ　）、シクラメン（Ｃｙｌａｍｅ
ｎ）、マルス（Ｍａｌｕｓ　）、プルナス（ｐｒｕｎｕ
ｓ）、ローザ（Ｒｏｓａ）、ルプス（Ｒｕｂｕｓ）、ポ
プラ／Ｃ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、サンタラム（５ａｎｔａ
ｌｕｍ）、アリウム（人ｌｌｉｕｍ）、リリウＡ　（［
、ｉｌｉｕｍ）、ナルシサ、Ｘ　（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ
　）、アナナ、（（Ａｎａｎａ５）、アラキス（人ｒａ
ｃｌｓ）、７了セオ／ｌ／　７．　（ｐｈａｒｅｏ−１
ｕｓ）およびビサム（Ｐｉｓｕｍ）からなる群から選択
されるものも含む。 ホモノ科の代表種が特に好ましく、例えば広い領域に栽
培さ扛、そして高収量で生産きれる植物である。記載さ
れ得る例は、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、ライ麦
、オート麦、キビまたはモロコシであり、そ（−で牧草
でもある。 本発明の使用に特に好ましいその他の標的作物は、例え
ばアリウム、アペナ（Ａｖｅｎａ　）　、　　ホルデウ
Ａ　（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、オリザ（Ｏｒｙｚａ）、パニ
カム（ｐａｎ　ｒ　ｃｕｍ　）、サブカラム（５ａｃｃ
ｈａｒｕｍ　）、セカーＶ　（！；ｅｃａｌｅ　）、セ
タリ７　（Ｓｅｔａｒ；ａ　）、ツルガム、トリチウム
、ゼア、ムｖ　（Ｍｕｓａ　）、ココス（（：ｏｃｏｓ
）、７　ｘ　二７り、（（ｐｈｏｅｎｌｘ　）およびエ
ラエイス（Ｅｌａｅｉｓ）属の植物である。 成功した形質転換はそ九自体公知の方法、例えば爵にサ
ザンプロット分析を包含する分子生物学的研究により確
認することができる。 その分析の方法において、抽出されたＤＮＡを最初に制
限酵素で処理し、次に０．８壬ないし１婆アガロースゲ
ル中での“電気泳動に供し、ニトロセルロース膜上に移
し［５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、Ｍ。 Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｔ、　９８．５０３−５１７（１
９７５）］、そして検出すべｆｉ　ＤＮＡとハイブリッ
ド形成する、ここでのＤＮＡは二、ソクトランスレーシ
ョ／を予め行ったものであるＣ　Ｒｉｇｂｙ、　ｗ、　
Ｊ、、　Ｉ］ｅｃｋｍａｎｎ、　Ｍ、、　Ｒｈｏｄｅｓ
、　Ｃ，およびＰ、　Ｂｅｒｇ、Ｊ、　Ｍａｌ。 ＢＨｏｌ、　１１５．２３７−２５１　〕（５Ｘ　１０
’ないし１０ｘ　１０’　ｃ、　ｐ、ｍ、／ｐりのＤＮ
Ａ　！異的活性）。 フィルターｉ０．０３Ｍクエン酸ナトリウムと０．６Ｍ
［化ナトリウムの水溶液で各回１時間で３回、６５℃に
て洗浄する。ハイブリッド形成されたＤＮＡはＸｌ１Ｉ
Ｊ！フイルムを２４ないし４８時間、黒化することによ
り可視化石れる。 〔実施例および発明の効果〕 本発明のかなシ一般的々記載を説明するために、そして
より良い理解のために、説明の目的で特定の実施例を記
載するが、これらはそのように明記しないが本発明の性
質を限定するものではない。実施例により示された全て
の表にも上記のことが当てＦｉする。 （７７〕 自由に利用可能なグラスミドｐｋｍ２１およびｐｋｍ２
４４（ペック　イー、　　（Ｂｅｃｋ、　Ｅ、　）等、
　Ｇｅｎｅ１９、３２７−５３６（１９８２））を制限
エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで切断する。組換えに使用
されるグラスミド断片全０．８％アカロースゲル内で電
気泳動により精製する。ペック等のＧｅｎｅ。 １９．５２７−３３６（１９８２）に記載されるように
、その断片を結合することに上シ得られるグラスミドｐ
ｋｍ　２１２４４は、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子の５′−およ
び３’　−Ｂａｌ　３１欠失の組合せ全含有する。カリ
フラワーモザイクウィルスのプロモーター信号とグラス
ミドｐｋｍ２１２４４のＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片とを結合
するために、力ヴグリンググラスミドｐＪＰＡＸを構築
する。カップリングプラスミドｐＪＰＡＸ＃：ｔグラス
ミドｐｕｅａとｐＬｌｃ９から得られる〔メッシング、
ジエイ、およびジェイ、ビエイラ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　
Ｊ、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｖｉｅｉｒａ　）、　　Ｇｅｎｅ
　１９゜２６９−２７６（１９８２））。プラスミドｐ
ＵＣ９のリンカ−配列１０塩基対を、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ
とＳａＩ１部位での切断し、そして引き続きポリメラー
ゼ＝Ｉ−クレノー断片〔ジャコブンン、エイチ。 （Ｊａｃｏｂｓｅｎ、　Ｈ，）　、等、Ｅｕｒ、　Ｊ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４５　。 ６２５、（１９７４））を用いて粘着端金製造し、そし
てポリヌクレオチド鎖全結合することによｐ分離し、そ
れによってＨｉｎｄｌ１１部位を再び製造する。８塩基
対の合成リンカ−要素（ＸｈｏＩ）ｔ、分離したリンカ
−配列のＳｍａ　１部位に挿入する。 グラスミドｐｕｃ　８と改変プラスミドｐｕｃ　９の適
当なＸｏｒｌとＨｉｎｄ（［断片の組換えは１次々と続
く以下の制限部位：　ＥｃｏＲｌ、　Ｓｍａ　ｌ　、　
ＢａｒｒＨＩ　。 ＳａＩ　ｌ、　Ｐｓｉ　ｌ、　Ｈｉｎｄｌｌ、　Ｂａｍ
Ｈｌ、　Ｘｈｏ　ＩおよびＥｃｏＲＩ　ｋ有する部分的
に非対称のりンカ配列を有するグラスミドｐＪＰＡＸ＝
ｚ製造する。 ＮＰＴ−［構造遺伝子に結合しているＣａＭＶ遺伝子遺
伝子上プロモーター領域ａＭＶ　０Ｍ４−１８４株、Ｃ
ａＭＶ　ＣＭ　１８４１株の変種のゲノムに由来し、そ
の完全なヌクレオチド配列は、ガードナー　アール、シ
ー、　　（Ｇａｒｄｎｅｒ　Ｒ，Ｃ，）等、１９８）に
記載されている。ＣａＭＶプロモーター領域ヲ、６　ｋ
Ｂｐ（ｋＪＪｐ：　ｊ　Ｑ　００塩基対）からなジ、そ
して大腸菌グラスミドｐＢＲ５２２の誘導体〔ホーン　
ビーおよびコリンズ　ジェイ、　　（Ｈｏｈｎ　Ｂ　ａ
ｎｄ　Ｃｏ１１ｉｎｓＪ、）、１９８０　）であるコス
ミドｐ）ＩＣ７９内にクローン化し、そしてＣａＭＶゲ
ノムとコスミドｐＨＣ７９ｆ　ＢｓＬ　１１で切断し、
そして生成する断片を互いに連結させる。カリフラワー
モザイクウィルス遺伝子■およびＮＰＴ−１遺伝子のＨ
ｉｎｄ■断片の５′発現信号をグラスミドｐＪＰＡＸ内
で１’ｓＬＪ部位と１−Ｊｉｎｄ　Ｉ１１部位との間の
カリフラワーモザイクウィルス遺伝子■のプロモーター
領域を挿入することにより結合させる。生成するグラス
ミドを単一の山ｎｄ　［１部位で切断し、そしてプラス
ミドｐｋｍ２１２４４のＨｉｎｄ　ｉｌｌ断片を。 この切断部位内に、両方向に挿入し、グラスミドｐＪＰ
ＡＸ　Ｃａｋｍ＋およびｐＪＰＡＸ　Ｃａｋｍ　　ｆ生
成する。Ｎ）’Ｔ　−ＩＩＩ・イブリヴド遺伝子の６′
終結倍号近傍にＥｃｏＲＶ配列を製造するために、グラ
スミドｐＪＰＡＸ　Ｃａｋｍ＋のＨａｍＨ１断片をグラ
スミドｐＪ３Ｒ３２７のＢａｍ　Ｈｊ部位内に挿入する
〔ンヘロン、ニック、ｘ、　（８ｏｂｅｒｏｎ、　Ｘ）
等、Ｇｅｎｅ。 ９．２８７−３０５（１９８０））。プラスミドｐＢ）
Ｌ５２７　Ｃａｋｍ　ｆ得る。新規なりＮＡ構築物を含
むプラスミドルＢ几５２７　ＣａｋｍのＥｃｏＲＶ断片
は、プラスミドｐＵｃａ内のＳａＩ１部位でクローン化
されたカリフラワーモザイクウィルス遺伝子■のＥｃｏ
ＲＶ領域を置換するために使用され、その結果としてＮ
ＰＴ−ｆｔ遺伝子のタンノくり質コード化ＤＮ人配列は
カリフラワーモザイクウィルス遺伝子■の５′−および
６′−発現信号の制御下に置かれる。そのようにして製
造されたプラスミドはｐＡＢＤ　ｌおよびｐＡＢＤ　ｎ
と記載される。 実施例２ニブラスミドｐＤＨ５１の構築グラスミドｐＤ
Ｈ５１はピエトルツアク（ｆ’ｉ　ｅ−ｔｒｚａｋ）等
、１９８６に記載されている。このグラスミドは、多く
のクローニング部位を含む挿入されたポリリンカー領域
によシ分離される、６５８プロモーター領域およびＣａ
ＭＶのターミネータ−領域を含む。 ３５　Ｆ３プロモーター／ターミネータ−領域に用いら
れる出発材料に、ＣａＭＶ　”　８　”のＳｃａ　ｌ断
片であり、これは遺伝子地図のヌクレオチド６ＢＯＢ−
７６５２を包含し〔フランク　ジー（Ｆｒａｎｋ　Ｇ、
）、　Ｃｅ１ｌ、　２１　：２８５−２９４．１９８０
）。 そしてｐＵｃ　１．８のＳｍａ　１部位内にスゲライジ
ングさｎて〔ナランダー　ジェイ、　　（Ｎｏｒｒａｎ
ｄｅｒ　Ｊ、）等、（Ｊｅｎｅ、２６：、１０１−１０
６．１９８３）、プラスミドｐＤＢ２１を形成する。こ
れを次に制限酵素１−ｉｐｈ　ｌで消化する。粘着端＜
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとの処理により除去する。 ５５Ｂグロモーター領域〔ｐＵＣ１８，２１位（Ｈｐｈ
　ｌ　）　−４１２位（Ｓｍａ　ｌ　）　＋　ＣａＭＶ
　６８０８位−７４３７位（Ｈｐｈ　Ｉ）　）　ｋ含む
断片ｔＫｐｎｌリンカ−と結合させ、ＮｃｏＩで切断し
くＣａＭＶ　６９０９位）、粘着端ｙ２　ＤＮＡポリメ
ラーゼのクレノー断片で付は足し、ＥｃｏＲｌ　リンカ
−と結合させ、そして最後にＥｃｏＲｌおよびＫｐｎ　
ｌで消化する。 ＣａＭＶプロモーター配列を含む生成するＥｃｏＲ１／
Ｋｐｎｌ断片を次にグラスミドｐＵｃ１Ｂ内のＫｐｎｌ
とＥｃｏＲｌとの制限切断部位の間にスゲライジングさ
せる。この方法でプラスミドｐＤＧ２ｉ得る。 終結信号（ＣａＭＶ　７４５９位（Ｈｐｈｌ）−７６３
２位＋　ｐｌｙｃ　１８．４１’３位−１５５０位（）
ｌｐｈ　Ｉ　）　）を有する第二断片ｆ　ＥｃｏＲＩで
切断し、粘着端をクレノーで付は足し、Ｈｉｎｄｌ［ｌ
リンカ−を与え、そしてＨｉｎｄｌｌおよびｓｐｈ　ｌ
で消化する。 ＣａＭＶターミネータ−配列を含む生成するｓｐｈ　■
−Ｈ１ｎｄ　Ｉｌｌ断片を次にプラスミドｐｌ）Ｇ２内
のＨ４ｎｄ　［１とＳｐｈ　Ｉ制限切断部位にスゲライ
ジングさせる。 実施例３ニゲラスミドｐＨＰ　２５の構築ＡＰｉ（（３
’）ＩＩ構造遺伝子とＣａＭＶの１９　Ｓ　ＲＮＡプロ
モーター配列の一部も含むグラスミドｐＡＪ３Ｄ　１の
ＥｃｏＲＶ断片をグラスミドｐＤＨ５１のＳｍａ　ｌ切
断部位内に挿入することによＱグラスミドｐＨＰ２３を
構築する。 幼若接合前胚および胚を、トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａ
■）のアルパイン（Ａｌｐｉｎｅ）種、アイザル（ｌｓ
ｓａｒ）　＊、Ｇ−４０８３またはタカノ（Ｔａｋａｎ
ｏ）種から、受粉して３ないし２２日後に分離する（第
１図、段階１７ないし６０参照）。 穂軸を７０％エタノール処理により６０秒間表面殺菌し
、そして互いに分離した幼若トウモロコシ穀粒をベトリ
皿内に貯え、接合胚を分離する１で殺菌蒸留水で湿気を
保つ。 顕微鏡でモニターしながら（倍率１０−５０倍）鋭いメ
スと鋭い鉗子を用いて接合胚を分離する。 分離された胚の大きさおよび生長段階は第１図の段階１
７と３０の間の範囲に及ぶ。 この分離は、 ａ）珠心の領域で縦方向の中位の部分を切除し、 ｂ）次いで胚嚢を分離し、そして Ｃ）分離された胚嚢から胚を除去することにより行うの
が有利である。 胚を選択するために一般に使用される装置は、立体顕微
鏡（５０−２００倍）または倒立顕微鏡（６０−２００
倍）そして１だシリコンチューブにつながれている手で
引伸ばしたマイクロキャピラリィ（２０個以上の細胞を
有する胚の場合）であるか、またｉｊ；Ｋｏｏｐおよび
８ｃｈｗｅｉｇｅｒ、　１９８５　；Ｓｐａｎｇｅｎｂ
ｅｒｇ、　１９８６．およびＳｃｈｗｅｉｇｅｒ等。 １９８７により記載された特別な微小選択系である。 分離後すぐに、そのように選択さ扛た接合前胚および胚
を次のマイクロインジェクションのために、２４雪ない
し４０１０１のカッ（−ガラスを予め適用したフィコー
ル（Ｆｉｃｏｌｌ）　ｆ含まない培養培地（Ｍｌ）の小
滴５０ないし１００μｌ中に移す。 これらのマイクロインジエクショングレートハセクショ
ン〔ｂ）；Ｃ）〕に記載している。注入を行う１で、マ
イクロインジェクションプレート全セクション（Ｃ）に
記載するように２室系内に置く。 Ａ）装置 トウモロコシ前胚および胚のマイクロインジェクション
を、入射光と透過光とを組合せた倒立顕微鏡または立体
顕微鏡を用いる顕微鏡観察下で行う。倍率は胚の大きさ
に依存し、そして１０倍ないし８００倍に及ぶ。 顕微鏡立てに固定し得る（電動機駆動マニプレータ）か
、または顕微鏡の傍に立てることのできる（機械的マニ
プレータ）２種のマイクロマニブレークを用いて接合前
胚筐たは胚の取扱いを行う。両方のマイクロマニプレー
タはキャピラリイホルダーを備えている。 硼珪酸のグラスフィラメントをシールし、そして外径１
．００１１１ｍないし１．５０ｍ＋に有する微小電極キ
ャピラリイがマイクロインジェクションキャピラリィと
して使用される。注入操作の間、胚を正確な位置に固定
するために、その目的のために特別に製造した保持キャ
ピラリイ全使用する。それらは外径１．００ｍないしｔ
ｓｏｔｍｎのソーダガラスからなるガラス管の一部であ
る。両方のタイプのキャピラリィは、適当な注入キャピ
ラリイ（先端直径約≦１μｍ）および保持キャピラリイ
が製造されるような市販のキャピラリイ引伸し装置を用
いて引伸される。 保持キャピラリィを仕上げするために、引伸ばされた保
持キャピラリイが［１０２ＷｒＩｎないし１．００瓢の
所望の口径で垂直に折られ、そしてみがかれる（小さい
口径奮有する丸められた先端）微小炉を使用する。 マイクロインジェクターを用いて１）ＮＡ浴溶液注入す
る。このマイクロインジェクターは、胚細胞内へ非常に
正確に計量された注入全可能にする圧縮空気で作動され
る圧力装置である。注入容量は細胞の大きさに応じて１
　ｐｌと１００　ｐｌの間を変わる。適当なマイクロイ
ンジェクターは、例えば西ドイツ国のＥｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ、　　’Ｅたは西ドイツ国のＢａｃｈｈｏｆｅｒ、　
　・Ｉから入手できる。 Ｂ）　　Ｉ）ＮＡ浴溶 液イクロインジェクションされたＩ）ＮＡ浴溶液　ｏ、
０１　ｔｔｇ／ｌｔｔなイＬ　２．Ｏｐｇ／　ｐｌ、　
）は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、　ｐ　Ｈ７−７，８と
５０　ｍＭ　ＮａＣＬとからなるトリス−ＨＣ１緩衝液
中の超らせんもしくは線状化ｐＨＰ　２３　ＤＮＡ’Ｅ
たは超らせんおよび線状化ｐｋ−ＩＰ２５ＤＮＡの混合
物である。 トウモロコシ胚または前胚の細胞内への上記ＤＮＡ含有
浴液のマイクロインジェクションは、Ｎｅｕｈａｕｓ等
、１９８４；ｊ９８６にょシ記載された方法と同様に行
われる。マイクロインジェクションの好ましい領域は、
第１図中の矢印で示している。 １ず始めに、−側面に向けてカバーガラス（２４Ｘ４０
．）に付着させ、そして縦方向の角に沿ってもう一つの
カバーガラス（５Ｘ　３０　ｔｌＩＩｆｆｆＺ　Ｖｋし
３５ｍ）または積層された同じ大きさの１ないし４層か
らなる透明接着テープの小片に付着させ、その結果角が
形成される。そのようにつくられたカバーガラス上のフ
ィコールを含有しない培養培地Ｍ１の１０μｌないし２
００μｌの液滴内に胚を移す。小さい胚は注入の間、保
持キャピラリイにニジしつかり保持され、一方よシ大き
い胚は保持キャピラリイおよびカバーガラスの角で正し
い位置に保持され、そして次に注入を行う。各胚＃′１
４０ないし６０回、細胞の数に応じて注入され、そして
できるだけ多くの細胞が注入されるように個々の注入操
作の間に回転させる。注入された接合胚を次にさらに適
白な培地中で培養する。 注入後すぐに、シリコンチューブにつながれている手で
引伸ばしたマイクロキャピラリィを用いるか、ｌたは針
の屈曲チップを用いて、各々がフィコール含有の培養培
地（Ｍｌ）α５μｌないし２μｌを含有するポリカーボ
ネートミクロ培養グｖ　−）　（Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒ
ｇ、　１９８６　；　８ｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ等、１９
８６）のウェル内に胚を移す。また、各ウェル内に低融
点アガロース〔例えば登録商標シー　グラーク（Ｓｅａ
　Ｐｌａｑｕｅ■）〕で固化させたＭ１培地約１μｌ２
導入すること、および固化培地上に積層される液体Ｍ１
培地約１μｌ中で前胚または胚全培養することも可能で
ある。 一般にマイクロインジェクションされた胚は個々に培養
される。しかしながら、ポリカーボネートミクロ培養グ
レートの１個のウェル内で５個筐での胚全−緒に置くこ
とも可能である。 マイクロインジェクションされた胚を載せたミクロ培養
プレートは、湿気室として作用しそして一般に０．２　
Ｍマンニトール溶液（ＫｏｏｐおよびＳｃｈｗｅｉｇｅ
ｒ、　１９８５　；　Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ等、１９
８６）２ｄないし４　ｔｔｔｌ　、水またはＭ１培養培
地を外部の室に含有する２室系〔米国、ファルコン（Ｆ
ａｌｃｏｎ）の１フアルコン　器官組織培養皿（Ｆａｌ
ｃｏｎ　ｏｒｇａｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　
ｄｉｓｈ）”〕内に置かれる。 もちろん、胚培養のために適当なあらゆるその他の２室
系を使用することも可能である。 ２ないし３日毎に、注入された胚をフィコール含有の新
鮮培養培地（Ｍｌ）に移すが、それらを同容量またはテ
ラサキプレート（デンマーク、ロスキルテ、ヌンクのマ
イクロウェルグレート；６０ｘ１０μｌ）上で４μｌな
いし１０μｌのよシ犬容量に移すかはそれらが達した生
長段階に依存する。 ベトリ皿（２室系およびテラサキグレート）’を次にパ
ラフィルムでシールし、そして暗室中または１６／８時
間の明（薄暗い光、約５００ルクス）／暗すイクルで２
５ないし２８℃の温度で培養する。 再生 この期間の後（注入して１０ないし３０日後）、前圧＜
ｇｇ１図の段階１７ないし２４径照）の１０％ないし６
０チおよび注入された胚（第１（？す 図の段階２６ないし３０参照）の９０−以上から得られ
る発芽した小植物体（長さ１ｃｒｎないし３α）をより
大きい培養容器（３３０ｄ培養容器、６８Ｘ１１０ｍｍ
、Ｇｒｅｉｎｅｒ、西ドイツ国）に移すが。 該容器には固体培養培地（Ｍ２）４たはゲルライトで固
化したＭＳ培地３０ゴないし５０ｍＩ！が入っており、
ホルモン添加剤は入っていない。根が形成し出し、そし
て小植物体が５αないし１５副の大きさに達する１で、
トウモロコシ８９１）ｋ２５ないし２８℃および１６７
８時間の明／暗サイクル（４０００ルクス、来日色光）
で培養する。 これは一般に１５ないし２０日後に起こり、そして次に
植物体全温室に置き、土−に移植し、そしてさらにそル
らが成熟する１で通常のトウモロコシ実生と同様の方法
で栽培する。 表１　：　トウモロコシ接合胚の培養のための培地（Ｍ
ｌ）氏不二トウモロコシ接合胚の培養のための培地（Ｍ
２）１：ｌＡＰ　：ペンジルアミノプリン Ｆｉｃｏｌｌ　４００■’　（７７／’　マ’／　７　
：サー／　力。 ３　　１ＡＡ：インドール酢酸 実施例５：セイヨウアブラナ接合胚の分離および注入 １６℃の温度で温室中、そして１６／８時間の明／暗サ
イクルで成長したブラヴシ力　ナパスエル、　　（Ｂｒ
ａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　：Ｌ、　）　（遺伝子型Ｇ
ｒＧＣ５１ラピッドサイクリング＃）およびプロノウス
キ（Ｂｒｏｎｏｗｓｋｉ）　Ａｇ　９０３から未熟接合
胚全分離する。 長さ５６にないし６（Ｍのさやをセイヨウアブラナ植物
の受粉５日ないし２０日後、好１しくけ８日ないし１５
日後集め、次亜塩素酸カルシウム１％溶液中で３０分間
表面殺菌し、そして殺菌蒸留水で５回洗浄する。５ない
し８個のさやを一緒に次に蒸留水４ｍｌ！’ｊｚ含有す
るベトリ皿（直径１０　ｅｙｐｒ　）内に移す。ベトリ
皿をパラフイレムでシールし、そして未熟接合胚が分離
されるまで４℃でまたけ室温で（２５ないし２８℃〕貯
える。鋭いメスと鋭い鉗子を用いて、顕微鏡丁１０倍な
いし２０倍の倍率で光学的にモニターしながら、さやを
開く。８ないし１５個の未熟種子全さやから取ｐ出し、
直径６αのベトリ皿中のホルモンを含まない培養培地（
ｆ（，３）　１　すいし３ｄ内に移し、そして接合胚が
分離される筐で４℃または２５℃で貯える。次いで、２
本の解剖針を用いて、未熟種子全開き、そして初期の球
形前圧段階（第２図、段階０．　Ｐ、　Ｑ参照）から初
期ないし後期子葉のおよそ２０００細胞期（第２図、段
階Ｒ，Ｓ、　Ｔ　）に及ぶ生長段階および大きさの接合
胚全顕微鏡でモニターしながら分離する。分離後すぐに
、胚を実施例４ａ）の記載と同様の方法で選択するが、
しかしこの場合実施例１ａ）で記載したフィコール全含
有しない培地（Ｍｌ）の代わりに、ホルモンを含有しな
い培地（托３）′（１１−使用する。 ｂ）セイヨウアブラナの胚内へのｐＨＰ　２３　ＤＮＡ
のマイクロインジェクション マイクロインジェクションによるセイヨウアブラナの胚
内へのｐｉ（Ｐ　２５　ＤＮＡの挿入は、実施例４ｂ）
に記載したものと全く同じ方法で行う。 マイクロインジェクションのための好ましい領域は第２
図中の矢印で示している。 マイクロインジェクションされたセイヨウアブラナの胚
のミクロ培養ヲ、トウモロコシの胚の培養のために実施
例４ｃ）で記載した方法と同様に行う。しかしながら、
この場合ポリカーボネートミクロ培養グレートの９エル
をマイクロインジェクションされたセイヨウアブラナの
胚の大きさおよび生長段階によって種々の培養培地で満
たす。幼若球形胚ないし初期の心臓型段階にある胚全液
状胚乳（１５μｌないし１．０μｌ内に移す。この胚乳
は成長段階が同じである未熟なセイヨウアブラナの種子
の内容物を吸引することによシ分離する。 後期心臓型ないし初期魚雷型段階にあるセイヨウアブラ
ナの胚を、セイヨウアブラナの液状胚乳（上記のように
して得られた）および合成培養培地（Ｒ３）の混合物（
通常１：１混合物）０．５μｌないし１．０μｌ中でミ
クロ培養する。 後期魚雷型段階ないし初期子葉段階にあるマイクロイン
ジェクションされたセイヨウアブラナの胚を、合成培養
培地（Ｈ，３）α５μｌないし１．０μｌ上で直接ミク
ロ培養する。 マイクロインジェクションされた胚全ミクロ培養グレー
ト上で胚１ないし５個／ウェルの濃度で培養し、そして
湿度室として作用する２室系（実施例４りで記載）中、
暗がりで２５℃で、筐たは１６／８時間の明（薄暗い光
、約５００ルクス）／暗すイクルで培養する。 再生 マイクロインジェクションして１ないし４日後から始め
、そしてマイクロインジェクションされたセイヨウアブ
ラナの胚の大きさと成長段階に応じて、２および４日毎
に、液体培養培地（几３）ｉｎ５μｌないしｚＯμｌ含
有するポリカーボネートミクロ培養グレート内のウェル
または培養培地（Ｒ４）＝ｉ４μｌないし１０μｌ含有
するテラサキグレートのウェル内に胚を移す。 歩容ｔ（（１，５μｌないし２．０μｌ）は、初期心臓
型と初期魚雷型段階の間の成長段階に達したセイヨクア
ブラナの幼若胚に使用さ九る。一方、大容量（４μｌな
いし１０μｌ）は、後期魚雷型と後期子葉段階の間の成
長段階に達したマイクロインジェクションされた胚に使
用される。 この培養段階を２５ないし２８℃の温度および１６７８
時間の明／暗サイクル（４０００ルクス、寒白色光）で
行う。 セイヨウアブラナのマイクロインジェクションされた胚
から全体の植物体の再生および一次再生体の茎から二次
胚の誘導は、マイクロインジェクションされたセイヨウ
アブラナの胚全固体培養培地（Ｒ５）に移すことにより
行われる。 通常５個の胚を一緒に直径６ｃｔｎのベトリ皿中の培養
培地（Ｈ，５）７ｄ上に移す。ベトリ皿を次にバラフィ
ルムでシールし、ソして２５ないし２８℃および１６／
８時間の明／暗サイクル（４０００ルクス、寒白色光）
で１ないし６週間、植物体が再生される１で、または二
次胚形成の誘導が起こる葦で培養する。 緑色の小植物体の再生後（マイクロインジェクションさ
れた一次胚の直接発芽によるか、筐たは誘導二次胚様体
の分化により）、それらが１１！ｍないし３（７）の大
きさに達するまで、培養培地（１％６）ｆ２５ｍｌ含有
する５０罰グラスチツク容器内での生長のために移し、
セして２３ないし２８℃および１０ないし１６時間の照
明時間（４０００ルクス、寒白色光）で培養する。 苗条および枳の形成＠、セイヨウアブラナの小植物体が
５ないし１０αの大きさに達する１で、固体培養培地（
Ｒ６）ｉ３０ないし５０ａｕ含有する３３０ＩＩＩＩ！
培養容器内に移す。これはさらに１ないし３週間後に通
常起こる。植物体を次に温室内に置き、さらにそれらが
成熟する１で通常のセイヨウアブラナの小植物体と同様
の方法で生長させる。 表３：セイヨウアブラナの接合胚の培養のための培地（
Ｒｓ　；　Ｒ４） ＢＡ）’：ベンジルアミノグリン ＩＡＡ：インドール酢酸 ＮＡＡ：ナフチル−１−酢酸 表４：セイヨウアブラナの接合胚の培養のための培地（
Ｒ５：島） 構成成分　　　□　　濃　　度　（巧／１）ＢＡＰ：ベ
ンジルアミノプリン 実施例６ａ：引き続いて直接発芽する小麦の接合未熟接
合胚の分離全小麦の未熟種子から、受粉して４ないし１
２日後に行う。 接合胚の調製および選択をトウモロコシに対して実施例
４ａ）で、またはセイヨウアブラナに対して実施例５ａ
）で記載した方法と全く同様に行う。 未熟種子の表面殺菌および蒸留水中への導入の後、立体
顕微鏡、鋭いメスおよび鋭い鉗子を用いて接合胚全分離
し、そして次いで次のマイクロインジェクションのため
に選択する。マイクロインジェクションに最も適したも
のは、１６と５００細胞期の間のものである。 分離し、そして選択した接合胚全１ず、各々４個のウェ
ル全有する小さい四角のグラスチック皿〔デンマーク、
ヌンクのヌンクトン　デルタ　ニスアイ（Ｎｕｎｃｔｏ
ｎ　Ｌ）ｅｌ　Ｌａ　Ｓｌ　）の？／ｌ／チディツシ：
ｓ−４（ＭｕＨｉｄｉｓｈす〕上の培養培地Ｗ１（表５
）［Ｌ５ａｕ中に移す。それらを暗室中、４℃で１日間
静置する。好ましい培養濃度はウェル当たり胚８ないし
１０個である。 マイクロインジェクションによる小麦前圧内へのｐＨＰ
　２３１）ＮＡの挿入は、実施例４　ｂ）で記載した方
法と全く同様に行われる。ＤＮＡ＠有溶液の注入は、好
１しくに胚軸の領域、幼芽および幼根が後に現われる分
裂細胞の領域に行われる。 マイクロインジェクション後、注入された細胞を同一条
件および同一培養グレート上でもう１日さらに培養する
。 注入１日後、胚全２５℃で散乱光の下さらに３ないし５
日培養する。液体培養培地中での５ないし７日間の全培
養の後、２層の異なる培地を含有するテラサヤプレート
上に胚を移す。 第一の層はシーグラークアガロースで固化しく１０５） た培地Ｗ２１０μｌからなり、そして第二の層は固体培
地上に積層した液体培地Ｗ１１０μｌによシ形成される
。もちろん、植物胚の培養に適当なその他の固化ｔｌ　
（Ｓ−が培地Ｗ２の固化に用いることができ、好ましく
は低融点タイプのアガロス（ＬＭＰアガロース）である
。この場合にも、培養を同一条件、即ち２５℃の温度そ
して散乱光の下で行う。 それらの大きさに応じて７ないし１５日の培養期間の後
、胚が発芽し始める。１０ないし１４日後、それ故にマ
イクロインジェクションされた胚をマルチフェル培養皿
中のジ−プラークアガロースにより固化した培養培地Ｗ
２１１Ｌｌ！ないし５！ＩＬｌ上に移し、さらに２５℃
の温度および分化のための１６／８時間の明／暗サイク
ルで培養する。 マイクロインジェクションして約４ｉＭ間後、発芽した
小植物体をより大きい培養容器に移す。 これらは、培養培地Ｗ５　１５ｄｉ含有する６０ｄ容量
の培養容器であり、そしてそれらはＷ４培地３０ｘｌな
いし５０ａｌｉ含有する３３０１容量のよジ大きい培養
容器に彼に交換される。 小植物体がある大きさに達した時、それらを土に移し、
そして温室に置き、そしてそこでそれらを通常の小麦の
実生と同様にさらに処理する。 表５８：小麦接合胚の培養のたの培地（Ｗｌ、　Ｗ２゜
Ｗ３．　Ｗ４　） ＢＡ、Ｐ　：ベンジルアミノプリン ＮＡＡ：ナフチル−１−酢酸 ＩＡＡ：インドール酢酸 Ｓｅａ　　Ｐｌａｑｕｅ■アガロク：米国、ロ　ツクラ
ンド、マリンコロイズディブ、のＦＭＣ社 未熟接合胚の分離全小麦の未熟（１に子から、受粉して
４ないし１２日後に行う。 接合胚の１ｌｌｌＩｉ製および選択をトウモロコシに対
して実施例４ａ）で、Ｉたはセイヨウアブラナに対して
実施例５ａ）で記載した方法と全く同様に行う。 未熟種子の表面殺菌（次亜塩素酸す）　ＩＪウムの１．
８％（ｖ／ｖ　）溶液中１５分、続いて殺菌蒸留水で３
回洗浄する）および蒸留水中への導入の後、顕微鏡（１
０ないし１０倍）でモニターしながらメスと解剖針を用
いて接合前胚／胚を分離する。分離した前圧／胚の大き
さおよび段階は、胚柄を有する約２０細胞期の球形前圧
と杯盤〉よび子＃ｌ＃全有する胚の間の範囲に及ぶ。 分離後すぐに、選択された接合前胚／胚を、次のマイク
ロインジェクションのために１寸法２４Ｘ４０ｖｍのカ
バーガラスを予め適用した培養培地ＷＺ１の液滴５０μ
ｌないし１００μｌ内に移す。 これらのマイクロインジェクションプレートは実施例４
　ｂ）　Ｃ）に記載されている。マイクロインジェクシ
ョンが行われる１で、マイクロインジェクショングレー
ト全２室系内に置く。 マイクロインジェクションによる前圧／肛門へのｐＨＰ
　２３１ＪＮＡの挿入は、実施例４ｂ）で記載した方法
と全く同様に行われる。 マイクロインジェクション後すぐに、シリコンチューブ
につながれている手で引伸されたマイクロキャピラリィ
を用いるか、または針の曲屈端を用いて、各々培養培地
ＷＺ２−１７Ｑ、５μｌないし１μｌ含有するポリカー
？ネートミクロ培養グレート（８ｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ
、　ｅｌ　ａｌ　１９８６　）のウェル内に胚を移す。 さらに、この固体培養培地ＷＺＺを液状胚乳（同じ成長
段階にある未熟小麦種子の内容物の吸引による）０，５
μｌないし１μｌの層で覆う。 一般に、マイクロインジェクションされた前胚／胚全個
々に培養する。しかしながら、ポリカーボネートミクロ
培養グレートの１個のウェル内に１０個１での前圧／胚
を一緒に移すことも可能である。マイクロインジェクシ
ョンされた胚を載せたミクロ培養プレートを２室系（米
国、ファルコンのパフアルコン器官ｍ織培養皿”Ａ３０
３７）内に置く。この２室系は湿度室として作用し、そ
して外部室には０．２Ｍマンニトール溶液２ゴないし５
　ａｔを一般に含有しく　ＫｏｏｐおよびＳｃｈｗｅｉ
ｇｅｒ、　１９８５．　Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ等！１
９８６）、そしてパラフィルムでシールでさｎｌそして
暗室中２５−２８℃で培養される。 次に、そしてそれらの生長段階に応じて、注入源れた胚
を個々にまたは５１固１での胚の群として、小さい四角
のグラスチック皿（デンマーク、ヌンクの４ウエルマル
チデイツシユ）内ノウエル中の培養培地ＷＺ４　１ｍ／
上に移す。 培養培地ＷＺＪ上で４ないし６週の培養段階の後に、二
次胚形成性を有するカルスの誘導を行なう。これらの胚
形成性カルスを分割し、そしてステライリン（ＳＬｅｒ
ｉｌｉｎ）　１２５ＡＰプラスチツク容器（英国、フェ
ルサムのステライリン社）中の培養培地ＷＺ５１０ｍ上
に苗条分化のために移す。 さらに、これらの苗条の生長および板形成は、体の再生 小麦前胚／胚を注入して２日後から、２ないし５日毎に
、前圧／胚が約２−５１ＤＩの大きさに達する１で、培
養培地ＷＺ３０．５μｌないし２μｌ全←≠≠子≠寸徒
χされた前圧／胚を載せた個々のウェル内に誘導する。 ｔｔｔｌないし８０ｄ上への繰シ返される移植の後に起
こる。分化した小植物体がある犬き芒（５ｔｙＲないし
１０ｍ）に達した時、そしてそれらが適当な根糸全発生
した時、それらを土に移し、そして温室に置き、そこで
通常の小麦の笑生と同様の方法でさらに処理する。 ２．４−Ｄ：２．４−ジクロロフェノキシ酢酸ＡＢＡ：
アブシジン散 ＧＡ２ニジベレリン酸 （１１４ン 未熟接合前胚または胚の分離全小麦の未熟稚子から、受
粉して６ないし１２日後に行う。 接合胚の調製および選択をトウモロコシに対して実施例
４　ａ）で、またはセイヨウアブラナに対して実施例５
　ａ）で記載した方法と全く同様に行う。 未熟種子の表面殺菌および蒸留水中への導入の後、立体
顕微鏡ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）　、鋭いメスと鋭い鉗子
を用いて接合前胚または胚全分離し、そして次に次のマ
イクロインジェクションのために選択する。マイクロイ
ンジェクションに最も適したものは、段階２０と２５の
間（第１図参照）の前胚または胚である。 ＩＡＡ：インドール酢酸 マイクロインジェクションによるイネ前胚または胚内へ
のｐＨＰ　２５　ＤＮＡの挿入は、実施例４ｂ）で記載
した方法と全く同様に行われる。ＤＮＡ含有溶液の注入
は、好ましくは矢印（第１図参照）で示した胚細胞内に
行なわれる。 Ｃ）マイクロインジェクションされたイネの胚マイクロ
インジェクション後、注入された前胚または胚を同一条
件および同一培養プレート上でもう１日さらに培養する
。 注入２日後、前圧／胚を２５℃で散乱光の下さらに５な
いし７日培養する。液体培養培地中での７ないし１０日
間の全培養の後、２層の異なる培地を含有するテラサキ
グレート上に胚を移す。 第一の層は低融点アガロース、例えばシーグラークアガ
ロースで固化した培地凡Ｓ２５μｌからなシ、そして第
二の層は固体培地上に積層した液体培地ル８）　５μｌ
により形成される。もちろん、１−Ｌ８２培地は、植物
胚の培養に適当なその他の固化媒体により固化きれても
良く、好１しくは低融点タイプのアガロース（ＬＭＰ　
７　カロース）である。この場合にも、培養全同一条件
、即ち２５℃の温度そして散乱光の下で行う。 使用される前圧／胚の大きさに応じて７ないし１５日の
培養期間の後、前胚または胚が発芽し始める。それ故に
１５日後、マイクロインジェクションされた前圧萱たは
胚をマルチウェル培養皿中の例えばシーズラークアガロ
ースにより固化した培養培地Ｒ８２１１ＬＩ！ないし２
ＩＬｔ上に移し、さらに２５℃の温度および分化のため
の１６／８時間の明／暗サイクルで培養する。 マイクロインジェクションして約４−５週間後、発芽し
た小植物体をより大きい培養容器に移す。これらは、培
養培地凡Ｓ３１５ｍＡ＋ｉ含有する６０ｄ容量の市販の
培養容器であり、そしてそれらはａＳ４培地３０ｍない
し４０ＩＩＩ！を含有する３３０ｄ容量のより大きい培
養容器に後に交換される。 小便物体がある大きさに達した時、それら全土に移し、
そして温室に置き、そしてそこでそれらケ通常のイネの
実生と同様にさらに処理する。 （ｉｉａ） 表６ イネ接合前胚／胚の培養のための培地 実施例８：大麦の接合前胚および胚の分離および注入 択 未熟接合前胚および胚の分離をホルデウム（Ｉｇｒｉ　
）から、受粉して６ないし１４日後に行う。 大麦の穂から得た未熟種子を次亜塩素酸ナトリウム１．
８チ（ｖ／ｖ）溶液中で１５分間表面殺菌し、そして次
に殺菌蒸留水で３回洗浄する。 接合前胚／胚の調製および選択をトウモロコシに対して
実施例４ａ）で、オたはセイヨウアブラナに対して実施
例５ａ）で記載した方法と全く同様に行う。 未熟種子の表面殺菌および蒸留水中への導入の後、顕微
鏡（１０倍ないし５０倍）でモニターしながらメスと鋭
い鉗子を用いて接合前胚／胚を分離する。 分離した前胚／胚の大きさおよび生長段階は、胚柄を有
する初期の球形前肢と旺盛および子葉鞘を有する未熟胚
との間の範囲に及ぶ。 分離され、そして選択された接合胚を、各々４ウエルを
有する小さい四角のプラスチック皿〔デンマーク、ヌン
クにあるヌンクトンデルタ　ニスアイ（Ｎｕｎｃｔｏｎ
　Ｄｅｌｔａ　ＳＩ　）のマルチデイツシュ４〕上の培
養培地Ｑ１　［Ｌ５ｔＺ中に１ウエル轟たシ８ないし１
０個の前胚／胚の好ましい濃度で移し、そしてそれらが
マイクロインジェクションされるまで２５℃で貯える。 マイクロインジェクションによる大麦の前胚／肛門への
ｐＨＰ２５ＤＮＡの挿入は、実施例４１））で記載した
方法と全く同様に行われる。 ＤＮＡ含有溶液の注入は、好ましくは胚軸の領域、幼芽
および幼根が稜に現われる分裂細胞の領域で行われる。 好ましい注入部位は第１図の矢印によシ正確に示されて
いる。 マイクロインジェクションされた大麦の前胚／胚のミク
ロ培養を、トウモロコシの胚の培養のために実施例４ｃ
）で記載した方法と同様に行う。 しかしながら、この場合ポリカーボネートミクロ培養プ
レートのウェルを培養培地Ｇ１α５μ！ないし１．０μ
！で満たす。マイクロインジェクションされた前胚／胚
を次に、ミクロ培養プレート上にウェル当たり１ないし
２０個の前胚／胚の濃度で移し、そしてそのウェルを液
体培養培地Ｇ１α５μノないし１μｌで満たす。 体の再生 マイクロインジェクションされた前胚／胚を新鮮培養培
地Ｇ１上に３ないし１２日毎に移し、そしてそのウェル
がミクロ培養される前胚／胚の大きさと数に応じて培養
培地を１μｌないし１０μｌ含有する新しいミクロ培養
室に置く。前胚／胚が２ｍｘないし５１ｒｍの大きさに
達した時、それらを培地Ｇ２内に培養培地１０ｍ／およ
びベトリ皿当たり胚１６個の濃度で移す。ベトリ皿をバ
ラフィルムでシールし、そして次に暗室中、２５℃で５
日間培養する。それらが緑色に変わるまで１０時間／日
（４０００ルクス、寒白色光）の照射で培養を行う。 緑色の小植物体が再生した時、それらを培地Ｇ　３．２
５−含有の市販の６０ｄプラスチツク容器内に移し生長
させ、そしてそれらが１ｃｒｎ々いし３αの大きさに達
するまで、２３℃匁いし２６℃で１０ないし１６時間（
４０００ルクス、寒白色光）の照射で培養する。再生し
た小植物体を培養培地Ｇ３に再び移すことによシ根形成
が達成される。種々の苗条および根の形成後、植物の鉢
を２４０＊／容器内に移し、セして６ないし８週間、２
０００ルクス（フィリップス、暖白色光）で１０ないし
１６時間の照明時間、４℃で培養することにより冬大麦
の開花結実を促進する。 表７ 大麦の接合前胚／胚の培養のための培地実施例９：ワタ
接合前層および胚の分離および注入 １９ＢＡＰ　：ベンジルアミノプリン 幼若接合前胚および胚を、ゴッシピウムヒルスタム（Ｇ
ｏｓｇｙｅｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ　）　　の寸法１
ｃｌｎないし２ｃｒｎの未熟果実から、受粉しておよそ
４ないし２０日後に分離する。 果実外をまず水道水の流水下で、所望によシ市販の台所
用洗剤〔ラックス（Ｌｕｘ　）　、プリル（Ｐｒ１ｌ）
等〕を添加して、予備洗浄する。 十分に洗浄した後、果実外に７０チエタノールを噴霧し
、そして次いで蒸留水で洗浄する。 未熟な果実を次に添加剤としてツイーン２００．１チ含
有の３．６チ次亜塩素酸ナトリウムで４５分間殺菌する
。次に果実を殺菌水で適当に洗浄し、そして湿気を保っ
ている（室温）ペトリ皿に貯える。鋭いメスと鉗子を用
い、１０倍な、いし２０倍の倍率の顕微鏡下で果実を開
く。胚嚢を果実から除去し、そして各々４ウヱルを有す
る小さい四角のプラスチック皿（デンマーク、ヌンクに
あるヌンクトンデルタ　ニスアイのマルチデイシュ４）
上のホルモンを含まない培地（Ｃ１）約０．５ｄ内に移
す。次いで顕微鏡下で観察しながら、２：杢の解剖針を
用いて、球形の２０細胞期（第２図、段階０．Ｐ、Ｑ参
照）から初期ないし後期子葉のおよそ２０００細胞期（
第２図、段階Ｒ，Ｓ、Ｔ）に及ぶ種々の大きさにある胚
嚢から前胚および胚を分離する。分離後すぐＫ。 胚を実施例４　ａ）の記載と同様の方法で選択するが、
しかしこの場合ホルモンを含まない培地（Ｃ１）が使用
される。 前胚／胚のミクロ培養 マイクロインジェクションされたワタ前胚／胚の培養は
、トウモロコシの胚培養のための実施例４ｃ）の方法と
同様に行う。Ｃ１培地での第一ミクロ培養段階は約７日
続ける。前胚／胚を次に適当な培養容器（実施例４ｃお
よび４ｄ参照）内の０２培地中４ないし６週間培養する
。これらの小植物体が約６ないし１０ｍの大きさに達し
た時、それらを温室中に移し得、そこでそれらが成熟す
るまで通常のワタ植物と同様にさらに栽培され得る。 マイクロインジェクションによるこれらの前胚／肛門へ
のＰＨＰ２３ＤＮＡの挿入は、実施例４ｂ）に記載した
ものと全く同じ方法で行う。 マイクロインジェクションのだめの好ましい領域は第２
図中の矢印で示している。 表８ ワタ接合胚の培養のための培地 実施例１０：大豆接合前胚および胚の分離および注入 幼若接合前胚および胚を、グリシン　マツ”ＡＢＡ：ア
プシジン酸 ２１　ＧＡ　、ジベレリン酸 （Ｍａｒｐｌｅ　Ａｒｒｏｗ　）種の長さ１０餌ないし
５０鱈のさやから（受粉しておよそ３ないし２０日後）
分離する。この植物は温室中、１９℃々いし２１℃およ
び１６／８時間の明／暗サイクルで生長した。 分離前に、添加剤としてツイーン２０、［ｌＬ１チ含有
の１．５チ次亜塩素酸カルシウムで１０分間殺菌し、次
に殺菌蒸留水で適当に洗浄する。そのように処理したさ
やを、次の処理に供するまで湿気を与えたベトリ皿内に
約４℃で暗室中貯える。鋭いメスと鉗子を用い、１０倍
ないし２０倍の倍率の顕微鏡下でさやを開く。未熟な種
子をさやから取出し、そして直径３αのベトリ皿内のホ
ルモンヲ含まない培地（Ｓ３）約１　ｍｌ中に移す。胚
嚢を未熟な種子から取出し、そして直径３ｃｒｎのペト
リ皿内のホルモンを含オない培地（Ｓ３）約１ｄ中に移
す。次いで顕微鏡下で観察しながら、２本の解剖針を用
いて、初期の球形前胚段階（第２図、段階０．Ｐ、Ｑ参
照）から初期ないし後期子葉のおよそ２０００細胞期（
第２図、段階Ｒ，Ｓ、Ｔ　）に及ぶ種々の大きさにある
胚嚢から前層および胚を分離する。分離稜、胚を実施例
４ａ）の記載と同様の方法で選択するが、しかしこの場
合フィコールなしのホルモンを含オない培地（Ｓ３）が
使用される。 マイクロインジェクションによるこれらの前層／肛門へ
のｐＨＰ２３ＤＮＡの挿入は、実施例４１））　　に記
載したものと全く同じ方法で行う。 マイクロインジェクションされた大豆前胚／胚の培養は
、トウモロコシの胚培養のための実施例４ｃ）の方法と
同様に行うが、しかしこの場合には、ポリカーボネート
ミクロ培養プレート内のウェルをマイクロインジェクシ
ョンされた前胚／胚の大きさおよび生長段階に応じて変
わる培地の量で満たす。幼若球形前胚を培地Ｓ１のａ１
μ！ないし０５μ１層上に置き、そしてＳ３培地１１μ
！ないし０．５μｌの層で覆う。この様に、罰杯１−１
０個をミクロ培養プレートの１個のウェル中で培養する
。 心臓型と後期子葉段階の胚を培地Ｓ１のＩＩＬ２μノな
いし［１５μ）層上に置き、そしてｓ３培地ａ、２μノ
ないし［１５μ）の層で覆う（実施例７Ｃ参照）。 これらのよシ大きい生長段階のものけ好ましくけ常に個
々に培養する。ミクロ培養プレート２１℃で暗室中、ま
ｆｃ−ｉｊ１６／Ｂ時間の明（薄暗い光、約５００ルク
ス）／暗すイクルで、湿度室として作用する２室系（実
施例４ｃに記載）中で培養する。 マイクロインジェクションして１ないし４日後から始め
て、そしてそれらの大きさと生長段階に応じて、２およ
び４日毎に、マイクロインジェクションされた胚に８５
培地α２μ！ないしａ５μノを添加することによシ新鮮
な培地を供給する。約６ないし１０日後、培養された胚
の大きさに応じて、これらの胚をテラサキプレートのウ
ェル内の培養培地８２４μノないし１０μ！上に移す。 この場合傾も、培養された前胚／胚は、ウェル内に移し
た後に８３培養培地［１２μ！ないし１μｌの層で覆う
（実施例７Ｃ参照）。湿度を十分に保つために、殺菌水
約１−ないし２　ｄをテラサキプレートのウェルの角に
貯えておく。この胚を再び、２５℃および１６７８時間
の明／暗すイク、（４０００ルクス、来由色光）で培養
する。 ３ないし４日毎に、生長する胚にＳ３培地α２μｌない
し１．０μｌを添加して水分を与える。 小さい実生が再生した時、それらをコースタ−プレート
〔１コースタ−ウェルズ（Ｃｏａ−ｓｔｅｒ　ｗｅｌｌ
ｇ　）　’　；　２４ウェル；直径１６ｍ；カタログ番
号５５２４：マサチューセッツ州、ケンブリッジにある
ティッシュ　カルチャークラスター（Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ１ｕｓｔｅｒ　）　、１内のＳ３培地
（α８％アガロース含有）上に移し、そしてさらに上記
の培養条件下で培養する。培地にホルモンを添加するこ
とにょ力板誘導を再び生ずることが必要であることが証
明され得る。これは例えば根誘導培地（ｓ４）上に小植
物体を３ないし６日間保つことにょシ達成され得る。種
々の／Ｆ葉および根の形成後、これらの小植物体を、（
Ｌ８％アガロース含有の８３培地２ｎｄカいし５０＠７
を保持する３５ｒＪｗｇｔ＠養容器内に移す。小植物体
が約６ｅｆｎないし１０αの大きさに達した時、それら
を温室中に移し、そこでそれらが成熟するまで通常の大
豆植物と同様にさらに栽培される。 ２３ＩＢＡ：インドール酪酸 実施例１１：　ヒマワリ接合前胚および胚の分離および
注入 ａ）ヒマワリの前胚／胚の分離および選択幼若接合前胚
および胚を、ヘリアントゥスアンヌム（Ｈｅ１ｉａｎｔ
ｈｕｓ　ａｎｎｕｍ　）　　長さ６ＣＩｎないし８ｍの
未熟果実（淡灰色ないし白色果実壁）から、受粉してお
よそ４ないし２０日後に分離する。 果実序をまず水道水の流水下で、所望によシ市販の台所
用洗剤〔ラックス（Ｌｕｘ　）　、プリル（Ｐｒｉｌ）
等〕を添加して、予備洗浄する。 十分に洗浄した後、果実序に７Ｄ（４エタノールを噴霧
し、そして次いで蒸留水で洗浄する。 灰色ないし白色の果実壁を有する未熟な果実を、次にメ
スを用いて果実序から取シ出し、そして５５０ｍ１プラ
スチツク容器に集める。これらの容器の各々に約１／４
満たす。未熟な果実を次に添加剤としてツイーン２ｏ　
α１％含有の１．５−次亜塩素酸カルシウムで１５分間
殺菌する。次に果実を殺菌水で適崩に洗浄し、そして湿
気を保っている（４℃）ベトリ皿に貯える。鋭いメスと
鉗子を用い、１０倍ないし２０倍の倍率の顕微鏡下で果
実を開く。 胚嚢を果実から除去し、そして直径３備のベトリ皿中の
ホルモンを含まない培地（Ｈ３）約１ｄ中に移す。次い
で顕微鏡下で観察しながら、２本の解剖針を用いて、初
期の球形前圧段階（第２図、段階０．Ｐ、Ｑ参Ｎ４）か
ら初期ないし後期子葉のおよそ２０００細胞期（第２図
、段階Ｒ，Ｓ、Ｔ）Ｋ及ぶ種々の大きさに弗る胚嚢から
前胚および胚を分離する。分離後、胚を実施例４！Ｌ）
の記載と同様の方法で選択するが、しかしこの場合フィ
コールなしのホルモンを含まない培地（Ｈ３）が使用さ
れる。 マイクロインジェクションによるこれらの前胚／肛門へ
のｐＨＰ２３ＤＮＡの挿入は、実施例４１））に記載し
たものと全く同じ方法で行う。 Ｃ）　　マイクロインジェクションされたヒマヮすの／
胚のミクロ培養 マイクロインジェクションされたヒマ７すの胚の培養は
、トウモロコシの胚培養のための実施例４　ｃ）の方法
と同様に行うが、しかしこの場合にはポリカーボネート
ミクロ培養プレート内のウェルをマイクロインジェクシ
ョンされた胚の大きさおよび生長段階に応じて変わる培
地の量で満たす。幼若球形前胚を培地Ｈ１のα１μノな
いしα５μノ層上に置き、セしてＨ３培地α１μｌない
しα５μノの層で覆う（実施例７ｃ参照）。この様に、
前圧１−１０個をミクロ培養プレートの１個のウェル中
で培養し得る。心臓型と後期子葉段階の胚を培地Ｈ１の
［１２μ！ないしく１５μ）層上に置き、そしてＨ６培
地α２μｌないし［ＬＳＩ）の層で覆う。 これらのよル大きい生長段階のものは好オしくけ常に個
々に培養する。ミクロ培養プレートを２５℃で暗室中、
またＦｉ１６７８時間の明（薄暗い光、約５００ルクス
）／暗すイクルで、湿度室として作用する２室系（実施
例４ｃに（１！１８） 記載）中で培養する。 マイクロインジェクションして１ないし４日後から始め
て、そしてそれらの大きさと生長段階に応じて、２およ
び４日毎に、マイクロインジェクションされた胚にＨ３
培地［１２μ！ないしくＬ５μ）を添加することによシ
新鮮な培地を供給する。約６ないし１０日後、各々の場
合に培養された胚の大きさに応じて、これらの胚をテラ
サキプレートのウェル内の培養培地Ｈ２４μｌないし１
０μｌ上に移す。 この場合にも、培養された胚は、ウェル内に杉した後に
Ｈ６培養培地α２μノないし１μノの層で覆う。湿度を
十分に保つために、殺菌水的１−ないし２Ｍｌをテラサ
キプレートのウェルの角に貯えておく。この胚を再び、
２５℃および１６／８時間の明／暗サイクル（４０００
ルクス、来日色光）で培養する。 ３ないし４日毎に、生長する胚ＫＨ５培地［１２μ！な
いし１，０μｌを添加して水分を与える。 小さい実生が再生した時、それらをコースタ−プレート
内のＨ５培地（（Ｌ８％アガロース含有）上に移し、そ
してさらに上記の培養条件下で培養する。培地にホルモ
ンを添加することによシ根誘導を再び生ずることが必要
であることが証明され得る。これは例えば根誘導培地（
Ｈ４）上に小植物体を５ないし６日間保つことＫよシ達
成され得る。種々の小葉・および根の形成後、これらの
小植物体を、ｆ１８％アガロース含有のＨ３培地５０ｗ
１ないし５０ｄを保持する３３０ｄ培養容器内に移す。 小植物体が約６６ｎないしｆ（ｌｆｆｌの大きさに達し
た時、それらを温室中に移し、そこでそれらが成熟する
寸で通常のヒマワリ植物と同様にさらに栽培される。 表１０ ヒマワリの接合胚の培養のための培地 ０．１ コ０ 選択 幼若接合前胚および胚を、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　）　　のコロンビア
種の長さ５Ｂないし１５ｍのさや（受粉して約３−２０
日後）から分離する。この植物は温室中、１６ないし１
８℃、および１６／８時間の明／暗サイクルで生長した
。分離前に、１，５チ次亜塩素酸カルシウムで１０分間
殺菌し、次に殺菌蒸留水で適当に洗浄する。そのように
処理したさやを、次の処理に供するまで湿気を与えたベ
トリ皿内に約４℃で暗室中貯える。鋭いメスと鉗子を用
い、１０倍ないし２０倍の倍率の顕微鏡下でさやを開く
。未熟な種子をさやから取出し、そして直径３鍔のベト
リ朋内のホルモンを含まない培地（Ａ３）約１ｄ中に移
す。次いで顕微鏡下で観察しながら、２本の解剖針を用
いて、初期の球形前胚段階（第２図、段階０．Ｐ、Ｑ参
照）から初期ないし後期子葉のおよそ２０００細胞期（
第２図、段階Ｒ，Ｓ、Ｔ）　に及ぶ種々の大きさにある
未熟な種子から前胚および胚を分離する。 分離後、胚を実施例４　ａ）の記載と同様の方法で選択
するが、しかしこの場合フィコールなしのホルモンを含
まない培地（Ａ３）が使用される。 マイクロインジェクションによるこれらの前胚／肛門へ
のｐＨＰ２５ＤＮＡの挿入は、実施例４１））に記載し
たものと全く同じ方法で行う。 クションされた胚の大きさおよび生長段階に応じて変わ
る培地の量で満たす。幼若球形前胚を培地Ａ１のＱ、１
μｌないし［１５μｌＮ上に置き、セしてＡ３培地Ｑ、
１μ）ないし［Ｌ５μ）の層で覆う（実施例７ｃ参照）
。この様に、前胚１−１０個をミクロ培養プレートの１
個のウェル中で培養する。・ｔＣ″−鳴・型と後期子葉
段階の胚を培地Ａ１のα２μｌないしα５μｌ層上に置
き、セしてＡ３培地α２μノないし［１５μ）の層で覆
う。これらのよ）大きい生長段階のものは好プしくけ常
に個々に培養する。ミクロ培養プレートを２１℃で暗室
中、または天然光下で（約５００ルクス）湿度室として
作用する２室系（実施例４ｃに記載）中で培養する。 マイクロインジェクションされたアシビドプシス胚の培
養は、トウモロコシの胚培養のための実施例４　ｃ）の
方法と同様に行うが、しかしこの場合には、ポリカーボ
ネートミクロ培養プレート内のウェルをマイクロインジ
エマイクロインジェクションして１ないし４日後から始
めて、そしてそれらの大きさと生長段階に応じて、２お
よび４日毎に、マイクロインジェクションされた胚にＡ
３培地０２μ！ないしα５μノを添加することＫより新
鮮な培地を供給する。約６ないし１０日後、培養された
胚の大きさに応じて、これらの胚をテ２サキプレートの
ウェル内の培養培地Ａ２４μ！　ないし１０μｌ上に移
す。この場合にも、培養された胚は、ウェル内に移した
後にＡ３培養培地［１２μ）ないし１μノの層で覆う。 湿度を十分に保つためＫ、殺菌水約１ｔｔｌないし２−
をテラサキプレートのウェルの角に貯えておく。この胚
を再び、２１℃および天然光下（５００ルクス）で培養
する。 ３女いし４日毎に、生長する胚にＡ３培地α２μノない
し１．０μノを添加して水分を与える。 この培養段階の初期に、小植物体（１０−１５日）が生
長し、次にこれを［Ｌ８％アガロース含有のＡ３培地を
１ゼないし１．３ｄ保持するコースタ−カルチャープレ
ート上に移す。種々の小葉および根の形成後、これらの
小植物体を、！１８チアガロース含有のＡ３培地５０ｗ
１ないし５０ｔ／を保持する３３〇−培養容器内に移す
。小植物体が約５画ないし６σの大きさに達した時、そ
れらを温室中に移し、そこでそれらが成熟する捷で通常
のアラビドプシス植物と同様にさらに栽培される。 ｐＨ５，８ ＰＨ５，８ ｐ　ｌ（５，８ ”ＢＡＰ：ペンジルアミノプリン 実施例１３：　植物ゲノム内のＮＰＴ　−Ｉｆ遺伝子の
検出 ｓｏｍｍｏｌ、＃エチレンジアミンーＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ
’−四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｃｌ、２５ｍｏｌ／７塩化ナ
トリウムおよび５０ｍｍｏｌ／ｌα、α、α−トリス（
ヒドロキシメチル）−メチルアミン塩酸ＣＴＲｌ５−Ｈ
Ｃｌ）を含有する１５％ショ糖溶液（ｐＨ＆Ｑ）中、０
℃で再生および形質転換された植物の葉組織のホモジネ
ートを調製する。１０００ｙで５分間ホモジネートを遠
心分離し、細胞核をおおまかに分別する。５０ｍｍｏｌ
　　ＥＤＴＡおよび５０ｍｍｏｌ／ノＴＲｌ５−ＨＣｌ
を含有する１５チシヨ糖溶液（ｐ）（ａｏ）中に細胞核
を再懸濁し、ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）
を最終濃度が［１２チに達するまで添加し、そして全体
を７０℃で１０分間加熱する。混合物を２０−２５℃ま
で冷やした後、酢酸カリウムを濃度が０−５ｍｏｌ／Ｉ
Ｋ達する寸で添加する。この混合物を０℃で１時間培養
する。生成した沈殿を遠心分離する（微量遠心分離機内
４℃で１５分）。２０−２５℃で２．５倍容量のエタノ
ールを添加することによシ上清液からＤＮＡを沈殿させ
る。１０μｙ／ｘｔリボヌクレアーゼＡを含有する１０
ｍＭＴＲｌ５−ＨＣＡ！溶液中に、分離したＤＮＡを溶
かし、３７℃で１０分間培養し、プロテナーゼＫｔ−ａ
度が２５０μに匂に達するまで添加し、そして全体を５
７℃でさらに１時間培養する。プロテナーゼＫをフェノ
ールおヨヒクロロホルム／イソアミルアルコール抽出工
程によシ除去する。インプロパツール中の［Ｌ６Ｍ酢酸
ナトリウム溶液０．６容量部を添加することによシ水相
からＤＮＡを沈殿させ、そして１０ｍｍａｌ／ｌＴＲｌ
５−ＨＣＩおよび５ｍｍｏｌμＥＤＴＡを含有する溶液
（ｐＨ７５）５０μＺ中に溶かす。この調製によシ、主
として５０．０００塩基対以上含むＤＮＡ配列が得られ
る。このＤＮＡのＥｃｏＲＶエンドヌクレアーゼでの制
限、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子の放射標ＲＨｉｎｄｌｌ断片と
の前記断片のハイブリッド形成、そしてプラスミドｐＡ
ＢＤＩとの比較は、サザンプロット分析において、形質
転換された植物細胞の細胞核ＤＮＡ内ＫＮＰＴ−■遺伝
子の存在を示す。 実施例１４：　ドツトプロット分析 ゲノムＤＮＡ１０μりをＥｃｏＲＩで１晩消化し、そし
て次に予め電気泳動で分離することなく直接ニトロセル
ロース膜上にドツトの形態で適用する〔西ドイツ国、ダ
ッセルにあるシュライへル　ラント　ジュール　ゲーエ
ムペーハー（５ｃｈｌｅｉｅｈｅｒ　ｕｎｄ　５ｃｈｉ
ｉｌｌ　ＧｍｂＫ　）の操作指示書参照〕。 ハイブリッド形成反応および続くオートラジオグラフィ
ーはサザンプロット法と同様に行う。 実施例１５：　サザンプロット分析 バツコウスキーおよびソーｋ　（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ
ａｎｄ　５ａｕｌ　）、１９８３に記載された方法に従
って植物ＤＮＡのサザンプロット分析を行う。 ゲノムＤＮＡ約５μりをＥｃｏＲＶまたはＨｉｎｄ　Ｄ
ｒのいずれかの制限酵素で切断し、そして生成する断片
を１チ標準アガロースゲル中で電気泳動によシ分離する
〔マニアテス、ティー、（Ｍａｎｉ−ａｔｉｓ、Ｔ−）
　　等、１９８２〕。 ニックトランスレーション（ｎ１ｃｋ−ｔｒａｎｓｌａ
ｔｉｏｎ）をこの場合ファインベルクおよびホーゲルス
タイン（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌｓｔｅ
ｉｎ　）、１９８３に記載の「ランダムプライ７−　（
ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｒ）Ｊ法に置き換える。 究 葉片（１０口ないし２００１１！／）ホモジネートをエ
ッペンドルフ遠心管内の抽出緩衝液２０μノ中で調製す
る。この緩衝液は、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ
。 Ｌ、　、　ＤｅＢｌｏｃｋ　、Ｍ、　、　Ｍｅｓｓｅｎ
　ｓ　、　Ｅ、　、　Ｈｅｒｎａ　１５ｔｅｅｎｓ　、
Ｊ、　−Ｐ、。 Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、Ｍ、およびＪ、　５ｃｈｅｌ
ｌ、ＥＭＢＯＪ、　２゜９８７−９９５（１９８３）Ｋ
よシ使用された緩衝液のウシ血清アルブミンを［ＬＩＭ
サク力ロースで置きかえた変形である。抽出物を１２，
０００ｙで５分間遠心分離し、そしてブロモフェノール
ブルーを１００４％の最終濃度まで上溝に添加する。 １０チ非変性ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動に
よシ上清３５μ）からタンパク質を分離する。カナマイ
シンおよびγ”Ｐ標ＲＡＴＰを含有するアガロースゲル
の層をゲル上に載せ、培養を行い、そしてホスホリル化
反応物をホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）ｐ”ホスホ
セルロース紙上に移す。その紙を９０℃の脱イオン水で
６度洗浄し、そして次にオートラジオグラフィーに供す
る。 結果： セイヨウアブラナの場合、そしてトウモロコシ、大麦お
よびイネの場合にも８週間以内に、直接胚形成を介して
マイクロインジェクションされた接合胚から全体のトラ
ンスジェニック植物を再生させることが可能で、達成さ
れた再生率は非常に高かった。二次胚形成を有する植物
の場合、二次再生体は形質転換頻度を決定するために用
いられた。以下の方法がその他の全ての植物に用いられ
た：受粉後、これらの植物の種子を発芽させ、そして植
物のこの発芽体を遺伝子の形質転換および発現を示すた
めに用いる。 形質転換頻度は５％ないし３５％の範囲にある。 −成否生体から生じるＦ１世代の高分子量ＤＮＡ内への
完全なマイクロインジェクションされた遺伝子の安定な
組込みを、前記Ｆ１再生植物のゲノムＤＮＡのサザンプ
ロット分析によシ証明することができた。組込まれた遺
伝子の発現を実施例１６（アミノグリコシドホスホトラ
ンスフェラーゼ酵素活性の研究）に記載した酵素分析に
よシ証明した。 寄託： 本発明の範囲内で使用されるプラスミドｐＨＰ２５ば、
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペ
スト条約の要請に従って、西ドイツ国、ブルンスクイッ
クの国際寄託機関として認められた「トイチエ　ザンム
ルンク　７オンミクロオルガニスメンＣＤｅｕｔｓｃｈ
ｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉ
　ｓｍｅｎ　（Ｄ　ＳＭ　）　：ｌ　Ｊ　に寄託された
。寄託された試料の生存認定は該国際寄託機関によシ行
われた。 Ｈ （ｐｌ ミド 換さ） 堅号之社。 ＢａｒＣＱｒ、１に、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａ
ｎｔ　Ｐｈｖｇｉｏｌ、　　８５：　１１０３−１１０
９．１９８７ｆｌｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　ユ
麩３２７−３３６．１９８２Ｂｅｒｒｙ−Ｌａｕｅ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　　１．　Ｇａｎｅｔ、
　　］：　４Ｂ３−４９８．１９８２Ｂｉｒｋ、　Ｙ、
、　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｎ　ｈｖ
ｓ、　Ａｃｔａ、　６１：　３２６−３２８．１９６３
Ｃａｓｈｍｏｒｅ　Ａ、　”Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ、　ａｎ　Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｅｒ−ｓｐａｃｔｉｖｅ−Ｐｌ
ｅｎｕｍ、ＮｅＩＪＹｏｒｋ、１９８３，５ｅｉｅｅ２
９−３８Ｃｈｉｌｔｏｎ　Ｈ−Ｄ、　５ｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　２ム［１：　　５０−５９
．　１９８３Ｃｏｒｕｚｚｉ　　Ｇ　　ｅｔ　　ａｌ、
　丁ｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏ　
　１ｃａｌ　　Ｃｈａｍｉｓｔｒｖ　　　２５８°　１
３９９ＤａＬａＰｅｎａｅｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３２
５：２７７１−２７６．１９８７Ｄｕｎｓｍｕｉｒ　Ｐ
　ｅｔ　、す、　Ｊ、　Ｎｏ１．　　１．　Ｇｅｎｅｔ
、　　２：　２８５．１９８３Ｆｅｉｎｂｅｒｇａｎｄ
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、ＡｎａｌｖｅｉｃａｌＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｖ、１３２°６−１３，１９８３Ｆｒａ
ｎｋ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ、Ｃｅ１１．２１：　２８５−２
９４．１９８０Ｇａｒｄｎ＠ｒ　ＲＣａｔ　ａｌ、　Ｎ
ｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９：　２８７］−
２８８８，１９８］ＧｒｉｍｓｌｅｙＮＨｅｔａλ＋Ｎ
ａｔｕｒａ３２５三１７フー１７９．１９８７）１ｓｍ
ｍｏｎｄ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、、２５９：　９Ｂ８３−９８９０，１９８ム）１ａ
ｒｒｉｇＲａｔａｌ、ＰｌａｎｔＣｅ３≦７．７：３３
フー３’＋０．１９８８Ｈａｒｎａｌｓｔｅａｎｓ　Ｊ
Ｐ　ａｔ　、す、　ＥＭＢＯＪ、、　３：　３０３９−
３０４］、　１９８４Ｈｅｒｒｅｒａ−Σ５ｔｒａｌｌ
ａＬａｔａｌ、ＥＨＢＯＪ、２：９８フー９９５．１９
８３Ｈｉｌｄｅｒ、　Ｖ、Ａ、、ａｔ　ａｌ、、　Ｎａ
ｔｕｒｅ、　３３０：　１６０−１６３．１９８７Ｈｏ
ｈｎ　Ｂ　ａｎｄ　Ｃｏ１１ｉｎｓ　Ｊ、　Ｇｅｎｅエ
ユＩ：　２９］−２９８，１９８０ＨａｈｎＴｅｔａｌ
、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎセ
Ｔｕｍｏｒｓ”、ＡｃａｃｌｅｍｉｃＰｒｅｓｓ。 ５ｅｉｔｅ　５４９−５６０．　１９８２Ｈｏｏｙｋａ
ａｓ−Ｖａｎ−５ｌｏｇｅｅｒｅｎ　ａｔ　ａｌ、　Ｎ
ａｅｕｒｅ二ｌｌｂ　７６３−７５４．１９８４Ｈｏｖ
ａｒｄａｔａ１．、Ｐｌａｎｔａ１１７０：５Ｂ５．１
９８フＩｔａｋｕｒａ、　　Ｋ　　、　ｅｔ　　ａｌ、
、　　Ｊ、　　Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、　
９７・　フ３２７．　１９７５ＪａｃｏｂｓｏｎＨａｔ
ａｌ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４５：６２３，
１９フ４Ｋｏｏｐ　Ｈ−Ｖ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｅｉｇｅ
ｒ　ＨＧ、　Ｊ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｖｓｉｏｌ、　１
２］：　２４５−２５７，１９８５Ｍａｎｉａｔｉｓｅ
ｔａｌ１ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。 Ｍａｌｎｉｋｏｕ　Ｐ、Ｖ、　ｅｔ　ｒ状、、　ＯＲ２
，２００，３６７Ｍａｓｓｉｎｇ　ａｎｄ　Ｖｉ＠ｉｒ
ａ、　Ｇｅｎｅ　１９°２６９−２７６、１９８２Ｍａ
ｒ＠ｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、　３］５：
　２００．１９８５Ｈｏｒｉｋａｕａ　Ｈａｎｄ　Ｙａ
ｍａｄａ　Ｙ、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｖｓｉｏ
ｌ、　　２６：　２２９−２３６．１９８５（＋５５） Ｎａｕｈａｕｓ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ、　ＥＭＢＯＪ　　３
：　２］６９−２１７２．１９８４Ｎｅｕｈａｕｓ　Ｇ
　ｅｔ　ａｌ、　ＥＭＢＯＪ　　５：　１４３７−］ム
４４．１９８６Ｎｏｍｕｒａ　ｌ：　ａｎｄ　Ｋｏｍａ
ｍｉｎｅ　Ａ　　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉ４１：　　５３−
５８．　１９８６Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　Ｊ　ｅｔ　ａ旦
Ｇｅｎｅ　　２虹＋０１−１０６．１９８３０ｄｅｌｌ
、Ｊ、Ｔ、、ｅｔ　ａ】、　Ｎａｔｕｒｅ、３１３，８
）０．１９８５Ｐａｓｚｋｏｕｓｋｉ　　Ｊ　　ｅｔ　
　ａｌ、　ＥＭＢＯＪ　　　３：　　２フ１７−２７２
２．１９８４Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　Ｊ　ａｎｄ　５ａ
ｕｌ　）ｌｌＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ
　　、υ１１６２７−６１１６．１９８６Ｐａｎｎｉｅ
ａ、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０１
・２］４．　＋９８３ＰｉａｔｒｚａｋＨａｔａｌ、Ｎ
ｕｃｌ、ＡｃｊｄｓＲｅｓ、１４：５８６８．１９８６
ＰｏｔｒｙｋｕｓＴａｔａ１．１Ｄｉｒａｃ［Ｇｅｎｅ
ＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｒｏｔｏｐ］ａｓｔｓ：ＡｎＥ
ｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄＧｅｎｅｒａｌｌｙ　Ａｐｐｌ
ｉｃａｂｌｅ　Ｈａｔｈｏｄ　ｆｏｒ　５ｔａｂｌｅ　
Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｏ
ｍｓ”　ｉｎＦｒｅｅｌｉｎｇＭ（ｅｄ、）＋Ｐｌａｎ
ｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、／ｗＲ，Ｌｉ５ｓＩｎｃ、、１１
１］％１Ｙｏｒｋ、ｐｐ、１８）−１９９Ｒａｎｄｏｌ
ｐｈ　ＬＦ、　Ｊ、　　　’ｃｕｌｅｕｒａｌ　Ｒｅｓ
、　　５３：　８８］−９１６，１９３６Ｒｈｏｄｅｓ
ＣＡ、Ｂｉｏｅｅｃｈｎｎ］ｏＹ６：５６−６０，１９
８ＢＲｉｇｂｙＷＪｅｔａｌ、Ｊ、）Ｉｏｌ、Ｂｉｏｌ
、１１３：２３フ−２５１，１９７７Ｒｙａｎ、　Ｃ，
、ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　
Ｐｈｖｓｉｏｌ、、　２４：　１７３−１９６．１９７
３ＳｃｈｕｅｉｇｅｒＨＧｅｔａｌ、Ｔｈｅｏｒ、］、
］Ｇｅｎｅｔ、７３°７６９−７８３１９８７Ｓｏｂｅ
ｒｏｎ　Ｘ　ｅｅ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　　９：　２８７
−３０５．１９８０ＳｏｕセｈｅｒｎＥ）４．Ｊ、Ｍｏ
１．Ｄｉａｌ、９８・５０３−５］フ、１９フ５Ｓｐａ
ｎｇｅｎｂｅｒｇ　Ｇ、”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　
１ｎｄｉｖｉｄｕａｌｌｅｒ　Ｚｅｌｌｅｎ　ｄｅｒ　
ＮｕｔｚｐｆｌａｎｚｅＢｒシＱ−≦」Ｅ２工Ｓ辷９−
−１１！孔■トｖ−ヨエー１．−ｍｉ仁　１１ｉＨｓ　
　ｖｏｎ　　ｒ、１ａｋｔｒｏｆｕｓｉｏｎ、　　Ｚｅ
ｌｌｒｅｋｏｎｓｔｒｕｋｔｉｏｎ　　ｕｎｄＭｉｋｒ
ｏｉｎｊａｋｅｉｏｎ−ｐｈｎｔｈｅｓｉｓ、ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔａｔ）Ｉｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、１９８６Ｓｐ
ａｎｇａｎｂｅｒｇ　Ｇ　ａｔ　ａｌ、　Ｆ、ｕｒ　　
、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｉｏｌ、　　４２：　２３６−
２３８．１９８６Ｓｐｅｎａ　ａｔ　ａｌ、、　ＥＨＢ
ＯＪ、、ｑ：　２７３６．１９８５Ｓｔａｉｎｂｉｓｓ
　　Ｈ）ｌ　　ａｎｄ　　５ｔａｂｌｅ　　Ｐ、　　Ｐ
ｒｏｔｏ　　ｌａｓｍａ　　　１１６二　２２３−２２
７．１９８３Ｔｏｒｉｙａｍａ　　Ｋ　　ｅｔ　　ａｌ
、　　Ｔｈｅｏｒ、　　　　　１．　　Ｇｅｎｅｔ、　
　　７３：　　１６−１９．　１９８６（＋５６） ４図面の簡単な説明 第１図１ないし５５けトウモロコシの胚の生長の種々の
段階を示す説明図であシ、 第２図ＡないしＷけナズナの胚の生長の種々の段階を示
す説明図である。 特許出願人　　　　逢う”？ｊ、ｚ′／ｘ＋１．．−−
フイ１１゛°ノ・ｖｔ＞す↑フＶフイ１ケ゛木・γス゛
イー／”／ＬＴ−ルニ’／Ｌ　　オー”ｔ、Ｉ”−−シ
（エートｌ−） 代理人　弁理士　萼　　　優　美（ほか２名）手続補正
書（方式） 平成元年６月２Ｇ日 １、事件の表示 平成元年　特許願　第５０９７９号 ２、発明の名称 トランスジェニック植物の作製方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　シュヴアイツ風すツシエ　アイトゲノツ６、補正
の対象 明細占の図面の簡単な説明の欄、図面およびＵ：人証Ｉ
ＪＩ古 ７、補正の内容 （１）ＩＪＩ細書の第１５７頁第２行の「第１図１ない
し３５」を「第１図」と補正する。 （２）願書に最初に添付した図面第１図および第２図の
浄書・別紙のとおり（内容に変更なし）。 （３）法人証明書およびその訳文を提出する。 （ほか２名） ５、補正命令の日付

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）天然の胚形成の形態で高い再生能力を有する植物
   の幼若接合前胚または胚内にＤＮＡ含有溶液をマイクロ
   インジェクションし、 このマイクロインジェクションされた前胚 または胚を胚形成促進に適当な培養培地中でミクロ培養
   し、そして次に所望により、 生成する一般にキメラな再生体からキメラでないトラン
   スジェニック植物を作製することを特徴とする植物内に
   遺伝物質を挿入する方法。 （２）以下の特定の工程段階： ａ）供与植物の未熟種子から、マイクロインジェクショ
   ンに適当な個々のポリ細胞ないしマルチ細胞接合前胚ま
   たは胚の分離、 ｂ）次のマイクロインジェクションのための分離された
   接合前胚または胚の選択および適当な培養培地中への選
   択された前胚または胚の導入、 ｃ）ａ）で分離された接合前胚または胚内への１種また
   はそれ以上のＤＮＡ断片を含有するＤＮＡ含有溶液のマ
   イクロインジェクション、 ｄ）直接胚形成を促進するのに適当な培養培地中でのマ
   イクロインジェクションされた接合前胚または胚のミク
   ロ培養、 ｆ）完全で一般にキメラな植物への前記形質転換された
   接合前胚または胚の再生、およびｇ）新規でそして望ま
   しい特性を有するキメラでないトランスジェニック植物
   の作製、からなることを特徴とする請求項１記載の方法
   。 （３）形態形成性細胞培養体の生長または二次胚の形成
   を可能にする条件下で、マイクロインジェクションされ
   た前胚または胚の培養を行う請求項２記載の方法。 （４）以下の部品： ａ）注入操作を光学モニターするための顕微鏡、 ｂ）キャピラリィホルダーを有する電動機駆動または機
   械駆動のマイクロマニプレータ、ｃ）１．０ｍｍないし
   ２．０ｍｍの外径および１μｍ以下ないし１０μｍの先
   端直径を有するマイクロインジェクションキャピラリィ
   、 ｄ）０．０２ｍｍないし１．０ｍｍの先端直径を有する
   保持キャピラリィ、 ｅ）ＤＮＡ含有溶液を注入するための空気制御された圧
   力装置、 から実質的に構成されるマイクロインジェクション装置
   を用いてマイクロインジェクションが行われる請求項１
   記載の方法。 （５）マイクロインジェクションキャピラリィが硼珪酸
   ガラスのグラスフィラメントをシールした微小電極であ
   る請求項４記載の方法。 （６）マイクロインジェクション操作が以下の段階： ａ）カバーガラス上の培地の液滴１０μｌないし２００
   μｌ中に前胚または胚を導入し、ｂ）保持キャピラリィ
   を用いて正確な位置に胚を固定し、 ｃ）マイクロインジェクションキャピラリィを用いて前
   胚または胚の個々の細胞内にＤＮＡ含有溶液を注入し、 ｄ）各々の注入操作後に前胚または胚を回転させ、そし
   て個々の細胞内に新たに注入し、ｅ）注入された前胚ま
   たは胚を適当な培養培地中で培養する、 ことからなる請求項１記載の方法。 （７）生長の最適段階、即ち良好なマイクロインジェク
   ション可能性、良好な分離性および良好な再生性により
   区別される植物前胚または胚内にＤＮＡ含有溶液をマイ
   クロインジェクションする請求項６記載の方法。 （８）初期の球形前胚段階ないし初期の胚段階にある胚
   が使用される請求項６記載の方法。 （９）胚盤とは別に明らかに認めることができる未熟苗
   条および根分裂組織を既に有する初期の胚段階のものが
   使用される請求項６記載の方法。 （１０）２ないし約５０００細胞期にある植物前胚また
   は胚内にＤＮＡ含有溶液をマイクロインジェクションす
   る請求項６記載の方法。 （１１）植物胚が４ないし１００細胞期にある請求項１
   ０記載の方法。 （１２）マイクロインジェクション操作が胚または前胚
   当たり１ないし１０００回行われる請求項６記載の方法
   。 （１３）マイクロインジェクションが胚または前胚当た
   り４ないし６０回行われる請求項１２記載の方法。 （１４）未熟な苗条分裂組織内にＤＮＡ含有溶液をマイ
   クロインジェクションする請求項１２記載の方法。 （１５）注入容量が注入される細胞当たり１ｐｌないし
   １００ｐｌである請求項６記載の方法。 （１６）注入されるＤＮＡ含有溶液のＤＮＡ濃度が０．
   １μｇ／μｌと１０μｇ／μｌの間である請求項６記載
   の方法。 （１７）前記ＤＮＡ含有溶液が緩衝溶液である請求項６
   記載の方法。 （１８）緩衝溶液のｐＨがｐＨ７．０とＰＨ８．０の間
   の範囲内にある請求項１７記載の方法。 （１９）前記ＤＮＡ含有注入溶液が、 ａ）線状化された形態、 ｂ）超らせんの形態、 ｃ）線状化されたＤＮＡと超らせんＤＮＡの混合物の形
   態、 にある形質転換性ＤＮＡを含有する請求項１６記載の方
   法。 （２０）前記形質転換性ＤＮＡの両側に天然ＤＮＡ配列
   が配置されている請求項１９記載の方法。 （２１）マイクロインジェクションに意図されたＤＮＡ
   含有溶液が、形質転換された植物に有用でそして望まし
   い特性を導く組換えＤＮＡ分子を含有する請求項６記載
   の方法。 （２２）有用でそして望ましい特性をコードし、そして
   植物細胞内での発現を保証する植物細胞内で活性な発現
   信号に操作可能に結合されている１種またはそれ以上の
   構造遺伝子から前記組換えＤＮＡ分子が実質的に構成さ
   れる請求項２１記載の方法。 （２３）前記組換えＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ
   Ａもしくは合成ＤＮＡ、またはこれらＤＮＡの組合せか
   らなる請求項２１記載の方法。 （２４）前記構造遺伝子が、 ａ）病原体、除草剤、殺虫剤またはその他の殺生物剤に
   対する高められた耐性または許容性を形質転換された植
   物に付与し、 ｂ）熱さ、風、寒さ、乾燥、湿気、特に極端な土壌条件
   および浸透圧の群から選択される不利な環境の影響に対
   して高められた耐性または許容性を形質転換された植物
   に付与し、ｃ）葉、種子、塊茎、根および茎における保
   存物質および貯蔵物質の形成および品質を改善し、そし
   て ｄ）薬学的に許容性である活性物質または その他の生理学的に活性な物質をコードする、請求項２
   ２記載の方法。 （２５）ＤＮＡ含有溶液が制御機能を有する非コードＤ
   ＮＡからなる請求項２記載の方法。 （２６）前記発現信号が植物または植物ウィルスの遺伝
   子に由来する請求項２記載の方法。 （２７）前記発現信号がカリフラワーモザイクウイルス
   の遺伝子に由来するか、またはそれらに相同である請求
   項６記載の方法。 （２８）発現信号が、 ａ）カリフラワーモザイクウイルスゲノムの３５Ｓ発現
   信号もしくはそれらの相同体、または ｂ）カリフラワーモザイクウイルスゲノムの１９Ｓ発現
   信号もしくはそれらの相同体、である請求項２７記載の
   方法。 （２９）マイクロインジェクションされた前胚および胚
   のミクロ培養が、直接胚形成を刺激する液体培養培地中
   で行われる請求項３記載の方法。 （３０）浸透圧に中性な増粘剤を前記培養培地に添加す
   る請求項９記載の方法。 （３１）前記液体培養培地を固体培地上に積層する請求
   項９記載の方法。 （３２）前記増粘剤がサッカロースとエピクロロヒドリ
   ンとのコポリマーであり、７００００と４０００００の
   間の分子量を有する請求項３０記載の方法。 （３３）前記固体培地が寒天、アガロース、アルギネー
   ト、ペクチネート、ゼラチンおよびゲルライトからなる
   群から選択される固化剤を含有する請求項３１記載の方
   法。 （３４）前記培養培地が以下の組成： ａ）それらの化合物の中に、窒素、リン、硫黄、カリウ
   ム、カルシウム、マグネシウムおよび鉄その他（マクロ
   元素）並びにナトリウム、亜鉛、銅、マンガン、硼素、
   バナジウム、セレンおよびモリブデンその他（ミクロ元
   素）からなる群から選択される植物細胞の増殖および生
   長に必須である鉱物または元素、ｂ）ニコチン酸、ピリ
   ドキシン、チアミン、イノシトール、ビオチン、リボ酸
   、リボフラビン、Ｃａ−パントテネートその他からなる
   群から選択される必須ビタミン、 ｃ）ショ糖、ブドウ糖その他からなる群から選択される
   容易に同化可能な炭素源、 ｄ）オーキシン類およびサイトカイニン類から選択され
   る天然または合成植物ホルモンの形態にある種々の生長
   調節剤、 ｅ）糖アルコール、糖イオンおよび塩イオンその他から
   なる群から選択される浸透圧安定剤、 を有する請求項２９記載の方法。 （３５）直接胚形成が制御された方法で進行することを
   確実にするために、互いにバランスのとれた比でオーキ
   シン類およびサイトカイニン類の群からの種々の生長調
   節剤を前記培養培地が含有する請求項５４記載の方法。 （３６）オーキシン類およびサイトカイニン類からの植
   物ホルモンが、胚の成長段階に応じて ０．０１ｍｇ／ｌと２０ｍｇ／ｌの間の濃度範囲である
   請求項３５記載の方法。 （３７）培養培地のｐＨが４．５と７．５の間である請
   求項３４記載の方法。 （３８）胚の培養のために、全体がまたは少なくとも一
   部が天然成分からなる複合栄養培地を使用する請求項３
   ４記載の方法。 （３９）前記天然成分がジャガイモ抽出物、ココナッツ
   ミルクおよび液体胚乳その他からなる群から選択される
   請求項３８記載の方法。 （４０）前胚または胚の培養濃度が、それらの大きさお
   よび生長段階に応じて、培養培地１μｌ当たり前胚また
   は胚１個と５０個の間である請求項２９記載の方法。 （４１）前胚または胚のミクロ培養を２室系中で少なく
   ともある時間行う請求項２９記載の方法。 （４２）１ないし１２日毎に、マイクロインジェクショ
   ンされた前胚または胚を新鮮な培養培地に移すか、また
   は新鮮な培養培地の層で覆う請求項２９記載の方法。 （４３）前胚または胚が特定の生長段階に達した時、し
   かし通常１０ないし３０日後に、これら前胚または胚を
   、植物再生には慣用で、所望により液体培地の層で覆わ
   れても良い固体培養培地上に苗条および根の先端の分化
   ために移す請求項２記載の方法。 （４４）４ないし８週の培養期間の後に、しかし少なく
   とも胚の発芽の後に、ホルモンを全く含まないか、また
   はわずかなホルモン濃度を有する固体培地上に前胚また
   は胚を移す請求項３記載の方法。 （４５）再生した小植物体を上に移植し、そして通常の
   実生と同様にさらに処理する請求項４４記載の方法。 （４６）ａ）二次胚形成または二次不定苗条形成に従う
   植物の場合には、個々の細胞から誘導された二次構造体
   は、試験管内で、最初に形成された一般にキメラな再生
   体から分離され、互いに単離され、そして全体の植物に
   再生されるか、または ｂ）キメラなトランスジェニック植物を、 所望によりそれら同志で繰り返し交配させる請求項１記
   載のキメラでないトランスジェニック植物の作製方法。 （４７）ナス科、ジュウジバナ科、キク科、ユリ科、ブ
   ドウ科、アカザ科、マツカゼソウ科、アリアセアエ科、
   ヒガンバナ科、アスパラガセアエ科、ラン科、ヤシ科、
   アナナス科、アカネ科、ツバキ科、バショウ科、ホモノ
   科、およびマメ目からなる群から選択される植物の前胚
   または胚が使用される請求項１記載の方法。 （４８）アオイ科の植物の前胚または胚が使用される請
   求項１記載の方法。 （４９）アリウム、アベナ、ホルデウム、オリザ、ハニ
   カム、サッカラム、セカーレ、セタリア、ソルガム、ト
   リチカム、ゼア、ムサ、ココス、フェニックスおよびエ
   ラエイスからなる群から選択される植物の前胚または胚
   が使用される請求項４６記載の方法。 （５０）請求項、記載のトランスジェニック植物の作製
   方法。 （５１）請求項１記載の方法に従って作製されたトラン
   スジェニック植物並びにそれらの有性および無性の後代
   。 （５２）請求項５１記載の植物およびそれらの後代のト
   ランスジェニック種子。 （５３）プロトプラスト、細胞、細胞クローン、細胞塊
   、カルス培養体および／または組織培養体、種子、花粉
   、胚珠、接合子、胚または生殖系列細胞に由来するその
   他の増殖材料およびそれらから誘導された後代からなる
   群から選択される請求項５１記載のトランスジェニック
   植物の増殖材料。 （５４）形質転換に起因する新規な特性を依然有する請
   求項５１記載のトランスジェニック植物の全てのハイブ
   リッド形成および融合産生物。 （５５）形質転換に起因し、請求項５１記載のトランス
   ジェニック植物の突然変異体および変種の作製のために
   使用された植物出発材料の特徴的な特性を依然有する請
   求項５１記載のトランスジェニック植物およびそれらの
   有性および無性の後代の変種および突然変異体。 （５６）請求項５１記載のトランスジェニック植物に由
   来するか、またはそれらの後代に由来し、そして少なく
   とも一部はトランスジェニック細胞からなる例えば花、
   茎、果実、葉および根のような植物の部分。 （５７）請求項１記載の方法に使用するための請求項２
   １記載の組換えＤＮＡ分子。 （５８）形質転換された接合前胚から、または形質転換
   された胚から再生され得るトランスジェニック植物。