PT89860B - Processo para a producao de plantas transgenicas - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

-· θ p_resen-(_:e invento diz respeito a um novo processo reprodutível para a inserção de material genético em pro-/embriões ou embriões usando tecnologia de microoinjecção.

SCHWEIZERISCHE ΕIDGENOSSENSCHAFT ΕIDGENOSSI SC ΗE TECHNISCHE HOCHSCHULE (ETH)

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGENICAS

presente invento está também relacionado com a utilização do processo do invento para a produção de plantas transgénicas e com as próprias plain tas transgénicas que são obtidas por meio deste processo e com a sua progénie.

-3Ο presente invento está relaci£ nado com um novo processo reprodutível para a inserção de material genetico em embriões zigoticos de plantas usando tecnologia de microinjecção, processo este que se distingue pela sua aplicação universal.

presente invento também está relacionado com a utilização do processo de acordo com a invento para a produção de plantas trangenicas e com as próprias plantas trangenicas que sao obtidas através deste processo e com a progénie.

Um grande numero de processos e técnicas que já estão a ser usadas de rotina em muitos laboratorios tornaram-se entretanto disponíveis para manipulação genetica do genoma de plantas usando tecnologias dé* DNA ‘recombinante.

Um dos processos mais investigados e mais frequentemente usadois é sem duvida, o sistema de transformação em Agrobacterium.

As células de Agrobacterium têm no seu? plasmideo Ti um fragmento grande de DNA, a chamada região de T-DNA que na transformaçao natural de células vegetais é integrado no genoma vegetal.

-4Após efectuadas varias modifica ções, este sistema natural de transferencia de genes pode ser usado como um sistema vector para genes na transfprmação especialmente controlada de plantas /Chilton, M.D. 19837.

sistema de transformação com Agrobacterium tem no entanto a desvantagem crucial de a gama de hospedeiros de Agrobacterium ser restricta a plantas dicoti ledóneas especifias e a poucos representantes das monocotiledóneas (Herna1steens et a I , 1984; Hokas-Van-Slagtoen et al., 1984) que, no entanto, não são importantes do ponto de vista da economia agrícola. Isto significa que as plantas cultivadas mais importantes não são adequadas a uma transferência de genes eficaz.

-· · --- Em adição, as Agrobacter i um usadas são agentes patogneicos que induzem sintomas de doen ças caracteristicas na forma de crescimento tumoral de tecidos nas suas plantas hospedeiras e portanto pode ser manipuladas no laboratorio apenas se se tomarem precauções estrictas de segurança.

Têm sido desenvolvidos sistemas de transformação alternativos para ultrapassar estas desvantagens do sistema de transformação com Agrobaterium e que consistem na inserção de DNA exogaie em protoplantas vegetais, como seja a transferência directa de genes de DNA vector livre para protoplastos (Paszkowski et aI 1984, Potrykus et a 1, 1986) e a microinjecção de DNA vector livre em protoplastos (Spangenberg et a} 1986); (Steinbiss e Stabel, 1983; Morikawa e Yamade, 1985) ou células

-5(Nomura e Komanione, 1986) ou calos (Melmikon Pv et a 1 . , G.B. 2 200 367), que devem ser encarados como problemáticos para um grande numero de especies vegetais, especialmente do grupo Gramineae, uma vez que a regeneração de plantas completas a partir de protoplastos vegetais ainda é um problema.

As investigações' efectuadas por Yamada et a 1 . , 1986 e Toriyama et a 1, 1986, i nter alia para a regeneração de protoplastos de arroz e por Harris et a 1.1988 (trigo) e por Rhodes et a 1 (milho) mostraram os primeiros sinais de progresso neste campo.

Uma outra desvantagem destes sistemas de transformação alternativos é a taxa de transformação, que ainda é relativamente baixa, sendo presentéíTlé'nté‘~õmáximo entre 1% e 5%.

Estas taxax baixas de transformação também tornam necessário obter o DNA a ser inserido com marcadores (por exemplo genes de resistência a antibióticos) que permitam a selecção rapida dos transformantes a partir de um grande numero de células não transformadas .

Isto significa, no entanto, que presentemente não existe realmente um processo de transformação satisfatório que permita a produção de plantas transgenicas tendo propriedades novas e uteis que seja eficaz e pouco dispendioso mesmo do ponto de vista comercial isto aplicando-se especialmente a plantas do grupo Monocotyledoneae

-6Deve-se portanto encarar como objectivo prioritário o desenvolvimento de processos que permitam a transformação eficaz e reprodutivel de todas as plantas, independentemente da sua categoria taxonómia e das caracteristicas que lhes estão associadas e portanto assegurar uma produção de plantas transgenicas que seja eficaz e económico mesmo do ponto de vista comercial.

ESte assunto diz respeito a plan tas do grupo Monocotyledoneae , especia 1 mente as da familia Grami neae, que inclui as plantas cultivadas de maior importância ao ponto de vista de economia agrícola, tais como trigo, cevada centeio, aveia, milho, arroz, milho miúdo, etc., e que são:' portanto de interesse económico muito especial, especialmentes uma vez que até aqui existam processos satj sfatorios para a produção de plantas monocotile dóneas transgenicas.

Dois processos de transformação que apenas recentemente foram desenvolvidos constituem os primeiros passos nesta direcção. Um destes processos envolve a injecção de DNA exogeno na inf1orescência jovem de plantas de centeio (de la Pena et al., 1987) e o outro envolve uma infecção virai, mediada por Agrobacter i um, de plantas do milho com o Vírus do Raiado de Milho (Grimsberg et a 1, 1987). No entanto, mesmo estes processos recentemente desenvolvidos têm desvantagens; por exemplo, encontrou-se que o primeiro processo mencionado não é reprodutivel .

-7Dentro do âmbito do presente invento foi surpreendentemente provado como sendo possível desenvolver um sistema de transformação de plantas altamente eficaz, independentemente da sua categoria taxonomica e das características que lhes estai associadas, que não têm as limitações previamente mencionadas dos processos até aqui conhecidos sendo portanto distinto pela sua aplicação universal.

Em particular, o sistema é um processo para a inserção de material genetico em plantas que se caracteriza por uma solução contendo DNA ser microinjectada em embriões zigoticos jovens, de plantas que tenham um potencial de regeneração elevado na forma de embriogenese natural e por os embriões microinjectados serem microcu1tivados em meios de cultura adequados para a promoção da embriogenese e por serem então regenerados para plantas completas viáveis.

presente invento também está relacionado com a produção de plantas completas transgenicas que tenham sido transformadas usando o processo de acordo com o invento com uma molécula de DNA recombinante que, na plantas transformadas, conduz a propriedades novas e desej£ veis e as próprias plantas transgenicas que são produzidas daquele modo e com a sua própria progénie.

presente invento também está relacionado com plantas que são regeneradas a partir de embriões primários ou secundários transformados contendo os referida molécula de DNA recombinante e com sementes suas e também com a progenie de plantas que tenham sido

-8regeneradas a partir do referido material transgenico e com mutantes e variantes seus.

Dentro do âmbito deste invento, a progénie de plantas transgenicas deverá ser entendido como sendo a progénie das plantas parentais transformadas que é produzida sexuada ou assexuadamente.

presente invento também inclui construções geneticas híbridas contendo um ou mais genes ou sequências de DNA que conduzam a novas propriedades desejáveis na planta transformada e também veículos de clonagem e organismos hospedeiros.

presente invento ainda está relacionado com a utilização do processo de transformação de acordo com o invento para a produção de plantas transgenicas tendo novas propriedades desejáveis.

Na descrição que se segue são usados com uma serie de termos que são vulgares na tecnologia de DNA recombinante e em genetica de plantas Para assegurar uma compreensão clara e uniforme da descrição e das reivindicações e também do âmbito a ser acordado para os referidos termos, são apresentadas as definições que se seguem.

-9Embrião: Fase precoce do desenvolvimento de uma planta compreendendo pontos vegetativos de rebentos e raizes de cot ilédones .

Proembri ão: Fase de 2 células a múltiplas células do dese£ volvvimento embrionário antes da formação de meristema vegetativo de rebentos e raizes e cotilédones (ver Figura

D.

Embriogénese: Desenvolvimento de um embrião, começando a partir de uma célula que tem o potencial para a formação do embrião.

Embriões zigóticos: Embriões formados a partir de um óvulo fertilizado.

Embr i ões somât i cos : Embriões formados a partir de células somáticas tendo potencial embriogénico.

Quimeras: Célula, grupo de células, tecido ou planta, compostos por células tendo informação genetica diferente.

Material Vegetal : Partes de plantas que sejam viáveis em culturas ou que sejam viáveis como tal, como sejam protoplastos, células, calos, tecidos, embriões, orgãos de plantas, botões, sementes, etc., e também plantas completas.

-10Celula Vegetal : Unidade estrutural e fisiológica da planta compreendendo um protoplasto e uma parede celular.

Protoplasto: Célula vegetal uma que não possui parede vegetal e que foi isolada a partir de células vegetais ou tecidos vegetais e tem o potencial para regenerar um clone celular ou uma planta completa.

Clone celular: Unidade estrutural e fisiológica da planta, compreendendo um protoplasto e uma parede celular.

Protoplasto: Célula vegetal uma que não possui parede vege tal e que foi isolado a partir de células vegetais ou* tecidos vegetais e tem o potencial para regenerar um clone celular ou uma plarta completa.

C1one celular: Populaçãp de células geneticamente idênticas produzidas a partir de uma célula por mitoses contínuas.

Tecido Vegetal : Grupo de células vegetais organizado na forma de uma unidade estrutural e funcional.

Orgão vegeta 1 : Unidade estrutural e funcional compreendendo vários tecidos tais como, por exemplo, raiz, caule, folha ou embrião.

Quimeras transgenicas: Planta ou tecido que não contem DNA estranho estávelmente integrado no genoma em todas as células mas apenas em sectores de tecidos.

Planta Transgenica : Uma planta que contem DNA estranho estávelmente integrado no genoma de todas as células.

Gene(s) ou DNA heterólogos: Uma sequencia de DNA que codifica um produto ou produto específicos ou preenche uma função biológa e que deriva de uma especie diferente daquela em que o referido gene é inserido; a referida sequencia de DNA é também referida como um gene ou DNA estranho.

Gene(s) ou DNA homóloga: Uma sequencia de DNA que codifica um produto ou produtos específicos ou preenche uma função bioJoga-.-e—q-ue deriva da mesma especié em que o referido gene é inserido.

Gene(s) ou DNA sintéticos: Uma sequencia de DNA que codifica um produto ou produtos específicos oud esempenha uma função biologica e que é produzida por meios sintéticos.

Promotor vegetal : Uma sequencia de controle da expressão de DNA que assegura a transcrição de qualquer sequencia genetica pretendida, homologa e/ou heterologa, numa planta desde que a referida sequencia genetica esteja ligada de modo operacional ao tal promotor.

⁴“λ

-12Sequencia de terminação: Sequencia de DNA no extremo de uma unidade de transcrição, que assinala o fim do processo de transcrição.

Promotor vegetal de super-produção (OPP); Promotor vegetal que é capaz, numa célula vegetal transgénica, de induzir a expressão de qualquer sequencia(s) genetica funcional opera_ cionalmente ligada para um grau/medido na forma de quantidade de RNA ou de quantidade de polipeptideo) marcadamente superior ao observado no estado natural nas células hospedeiras que não tenham sido transformadas com o referido OPP .

Região 3 '/5' não traduzida: Secções de DNA situadas a jusante/montante da região codificadora, apesar de transcr/ tas paranRNA , que não são traduzidas em pol i pet ideos .

Esta região contem sequências reguladoras, tais como, por exemplo, o sitio de ligação ao ribossoma (5¹) ou o sinal de poli adeni1 ação (3¹).

Vector de expressão de DNA: Veiculo de clonagem, como seja por exemplo, um plasmideo ou um bacteriofago, contendo todas as sequências sinal necessárias para a expressão de um DNA inserido numa célula hospedeira adequada.

Vector de transferencia de DNA: Veiuclo de transferencia como seja, por exemplo, um plasmideo Ti ou um pirus, que permite a inserção de material genetico numa célula hospedeira adequada.

-13Figura 1 (de acordo com Randolph et a 1 . , 1 936) mostra as varias fases do desenvolvimento de um embrião de cereal usando como exemplo o milho (Zea mays). 0 desenvolvimento de outros cereais, tais como trigo/(Triticum aestivam) arroz, (Oryza sat i va ) , centeio (Hordeum vulgare) e outras Gramineae decorre de modo semelhante:

A fertilização do óvulo no saco embrionário (1) resulta na formação do zigoto (2) que se desenvolve por mitoses continuas para as varias fases do pro embrião (3-25). A transição do proembri ão para embri ão (25-26) é cazraterizado pela formação do meristema imaturo da raiz e do meristema imaturo do rebento e escutelo (cotilédone mod ifiçado ) .

_ As figuras não estão apresentadas na mesma escala; o proembrião (17) tem aproximadamente 0,050 mm de comprimento, o proembrião (25)., tem aproximadamente 1 mm de comprimento e o embrião (35) tem aproximadamente 8-10 mm de comprimento.

As setas indicam as regiões preferidas para a microinjecção da solução contendo DNA.

Figura 2 (de acordo com Randolph et al, 1936) mostra as varias fases do desenvolvimento de um embrião de dicotiledonea usando como por exemplo a bolsa do pastor (Capsella bursa pastoris). As características basicas do desenvolvimento das varias especies são as mesmas mas os detalhes podem ser muito diferentes.

A fertilização do óvulo no saco embrionário resulta na formação de um zigoto (A) que se desenvolve continuas para proembrião(mitoses) (7) e suspensor (7). A transição do proembrião (globular) para o embrião (E) desenrola-se entre as fases Q e R e começa com a formação dos rudimentos dos dois cotilédones.

As setas indicam as regiões pre feridas para a microinjecção da solução de DNA.

processo de transformação de acordo com o invento para a inserção de material genético em plantas baseia-se na microinjecção de uma solução de DNA nos embriões zigoticos jovens de plantas que, no estado natural, tem um elevado potencial de regeneração , na f ojrma de embriogénese natural.

Dentro do âmbito deste invento é preferida a microinjecção de uma solução de DNA nos proembriões zigoticos de plantas monocoti1edoneas , especialmente nos embriões zigoticos de cereais e outras plantas herbaceas para as quais não existe outro sistema de transformação disponível.

Até à altura da divulgação do presente invento não foi possível encontrar em plantas embriões zigoticos muito jovens ainda numa fase muito precoce do desenvolvimento e tendo contagens de células entre 4 e 1000 células e isolá-las e cultivá-las na forma de uma cultura i n vitro.

-15Até agora foi assumido que embriões zigoticos muito jovens (proembriões) daquele tipo não são capazes de crescer e propagar-se em cultura.

As descrições até aqui disponíveis sobre o isolamento e cultura de embriões zigoticos têm sido limitadores a embriões tendo um tamanho minimo de vários milhares de células e portanto parecem ser menos adequadas a possível microinjecção devido ao numero de células ser muito elevado.

Surpreendentemente, dentro do âmbito do presente invento, foi possível pela primeira vez, através da aplicação de processos específicos, isolar embriões zigoticos numa fase proembrionaria preconce (ver Figuras 1 e 2) a partir de estruturas vegetais que os circundam e cultivá-los in vitro.

A microinjecção da solução de

DNA nos proembriões e embriões derivados de ovulos fertilizados e efectuada de acordo com o invento usando um sistema de microinjecção equipado com micromanipu1 adores controlados manualmente e controlados por motor.

A construção eqspecifica e o equipamento dos referidos dispositivos de microinjecção estão largamente descritos na literatura. 0 dispositivo de microinjecção também foi entretanto posto à venda por varias firmas e pode ser adquirido directamente delas como equipamento completo (por exemplo ZEISS; Narashiga Nikon Instr; Leitz, etc.,).

-16Os proembriões e embriões trans formados deste modo por microinjecção podem então, de acordo com o processo do imvento, serem estimulados por microcultura para dirigirem a embriogénese e podem ser então muito facilmente regenerados para plantas completas.

Com aquela finalidade, os proembriões e embriões microinjectados são primeiro introduzidos individua 1 mente ou de preferencia em pequenos grupos nos poços de placas individuais de microcultura contendo meios de cultura adequados e microcu1tivados até se formarem estruturas especificas de embrião.

Também é certamente possível dentro do âmbito deste invento, usar outros processos de cultura,_a4equados à microcultura de pro-/embrião zigoticos.

Após a diferenciação para embri ões, estes são finalmente transferidos para um meio sem vitaminas e sem hormonas ou pobre em hormonas no qual se desenrola posterior diferenciação para embriões maduros e finalmente a germinação dos embriões maduros para formar plântulas .

As plântulas assim obtidas podem então ser transferidas para o solo e ainda cultivadas como sementes normais.

Uma vantagem importante que o processo de transformação de acordo com o presente invento apresenta relativamente aos processos até aqui conhecidos

-17baseia-se nas taxas extraordináriamente altas de transforma ção que podem ser conseguidas com este processo e que, com valores entre 20% e 60% são superiores por um factor de 10 as taxas máximas de transformação conseguidas e descritas na literatura até agora.

Em adição, pela regeneração directa de plantas a partir de embriões v i a embriogénese directa, os efeitos negativos de variação somaclonal que normalmente ocorrem noutros processos alternativos, especia 1 mente naquele cujo passo de regeneração é via numa fase de calo, são completa ou pelo menos parcialmente evita dos. Isto significa no entanto que a planta géneticamente modificada (com a excepção do gene inserido) é idêntica â planta de partida, o que é de importância crucial para as finalidades de cruzamento de plantas.

Ainda uma vantagem crucial do processo de acordo com este invento é a sua aplicação universal, independentemente da categoria taxonómica de planta alvo particular e das características e dificuldades técnicas que lhes estão associados que ocorrem quando se usam os processos de transformação até agora disponíveis, por exemplo na forma de uma restrição para dicoti1edoneas especificas usando o sistema de transformação com

Agrobacterium ou uma insuficiente capacidade de plantas monocoti1edóneas para se regenerarem a partir de protoplastos quando se usa os processos de transferencia directa de genes.

-18Esta universalidade do processo de acordo com o invento resulta do facto do material genetico ser transferido por um método fisico (microinjec ção) para uma estrutura obtida a partir de qualquer planta (embrião sexuada jovens), independentemente da sua categoria taxonómica, estrutura em que garante a regeneração subsequente de plantas completas, normais e ferteis.

Para além das vantagens já mencionadas do processo de transformação de acordo com o invento relativamente aos processos até aqui conhecidos, deve-se mencionar como outras vantagens do processo:

a) um tempo de regeneração grandemente reduzido uma vez que a regeneração se passa atras de embriogénese directa e são omitidas as fases de calo e de indução morfogenetica das culturas i n vitro ,

b) se as estruturas microinjectadas forem adequadas a embriogenese secundaria ou formação secundaria de razies adventícias, é possivel efectuar segregação 1n vitro dos transformantes equiméricos resultantes e,

c) efectuar propagação in vitro dos transformantes resu lmtantes ,

d) até 100% de taxa de sobrevivência das estruturas transformadas microinjectada devido a uma técnica de injecção cuidadosa.

-19Dentro do âmbito deste invento é portanto possível pela primeira vez, independentemente das limitações previamente referidas, produzir com um grau de eficacia elevado plantas transgenicas, especia 1 mente as do grupo Monocotyledoneae, tendo novas propriedades desejáveis através de microinjecção de uma solução de DNA para proembriões ou embriões zigoticos tendo um potencial de regeneração elevado, microcultura dos proembriões ou embriões zigoticos microinjecção em meio de cultura adequado à promoção de formação de estruturas embrioides e depois, facultativamente produção de plantas transgenicas não quiméricas a partir dos regenerantes quiméricos resultantes

Deta1hadamente , o processo de £ cordo com o invento compreende os passos específicos de processo que se seguem:

a) Isolamento de pro-/embriões zigoticos individuais po1ice1u1 ares a mu 11icelu1 ares , adequados a microinjecção a partir de sementes im?aturas de plantas dadoras;

b) Selecção dos pro-/embriões zigoticos isolados para a subsequente microinjecção e introdução dos pro-/embriões seleccionados num meio de cultura adequado;

c) Microinjecção de uma solução de DNA contendo um ou mais fragmentos de DNA nos pro-/embriões zigoticos isolados em a ) ;

dp Microcultura dos pro-/embriões zigoticos microinjectados em meio de cultura adequada à promoção de embriogénese directa;

ί ·*ι:

-20d₂) Como alternativa: cultura dos pro-eembriões injectados em condições que permitam o desenvolvimento de uma cultura de células morgponeicas ou a formação de embriões secundar ias;

f) Regeneração dos referidos pro-/embriões zigoticos transformados para plantas completas geralmente quiméricas e

g) produção de plantas transgenicvas nao- quiméricas tendo novas propriedades desejáveis.

Plantas dadoras que são adequadas como material de partida para o isolamento de proembrrões e^-embriões zigotico podem ser cultivadas ao ar ou numa estufa. Quando se usa como plantas dadoras, plantas que necessitem de vernalisação para induzir a formação de flores, tais como, por exemplo, trigo, centeio, aveia, cevada, milho, etc., deve-se notar que é vantajoso sujeitar estas variedades a um perioro de frio, que pode ser de 1 a 5 semanas, para assegurar um começo de floração óptimo e depois um desenvolvimento um começo de floração e um desenvolvimento de sementes imautras.

A altura em que as plantas dadoras são colhidas depende da especie de planta usada e também das condições climáticas em que as plantas são cultivadas. As plantas dadoras são geralmente colhidas entre 2 e 20 dias após polinização e e£ pecialmente quando os embriões zigoticos atingiram uma fase adequada do desenvolvimento, de preferencia entre a fase de 2 células e a fase de aproximadamente 5000 células. (ver Figura 1 e 2).

-21Os proembriões e embriões zigoticos são isolados de preferencia usando bisturis e agulhas finas ou pinças esticadas muito finas com controle ao microscópio.

isolamento pode ser efectuado por exemplo por remoção do tecido do núcleo contendo o sao embrionário e depois dissecação do saco embrionário e remoção do pro-/embrião a partir do saco embrionário isolado. E também certamente possivel usar qualquer outro método de Isolamento que funcione.

Os proembriões e embriões zigoticos obtidos desta forma são então transferidos para uma gota de meio de cultura liquido. A selecção subsequente das fases embrlonarias adequadas à microinjecção é de preferencia efectuada com controle optico, sendo geralmente usado em estereomicroscópio ou um microscopio invertido e sistemas de selecção adequados á micro-selecção de estrutura celulares é conhecida dos familiarizados com a matéria como seja, por exemplo, os descritos por Koop e Schemeiger (1985), Spangenberg ( 1986) ou por Schwerger et a 1 . , (1987).

Para subsequente microinjecção são preferidos as fases embrionarias que vão das fases precoces globulares proembrionarias as fases precoces do embrião. Deve-se fazer menção especial as fases embriona rias que têm 2 a aproximadamente 5000 células.

-22Uma vez que uma boa microinjec tabilidade por vezes é acompanhada de uma baixa frequência de regeneração das etsruturas microinjectadas devido ao fac to de as fases pro-embrionarias precoces terem apenas um pequeno numero de células, na selecção das fases óptimas devem ser considerados o máximo de critérios possíveis, tais como, por exemplo, bom isolamento das fases de proembrionarias e embrionarias e boa capacidade de regeneração.

No caso das Grami neae além das fases precoces globullares pro-embrionarias tendo um escutelo (ver Figura 1, fases 17 a 25), especialmente as fases precoces embrionarias (ver Figura 1, faese 25 a 30) devem ser consideradas como particularmente adequadas â utilização no processo de acordo com o invento uma vez que além de serem fáceis de isolar distinguem-se pela sua elevada capacidade de regeneração. Ainda é também, assegurada’ um^boa microinjectabi1idade uma vez que a região destinada e preferida para microinjecção (meristema imaturo da raiz) consiste em apenas relativamente poucas células. Dentro do âmbito deste invento são muito especialmente pre feridas as fases precoces embrionarias que tenham já alem do escutelo, rebento imaturo claramente reconhecível e meristema da raiz (ver Figura 1, fases 26-27).

Especialmente as fases precoces globulares proembrionarias (ver Figura 2, fases 0,P, Q) e as fases precoces embrionarias (fases precoce a tardia dos cotilédones) (ver Figura 2, fases R,S,T) são também particularmente adequadas para a inserção do material genetico em plantas do grupo Di cotyIedoneae por microinjec ção.

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-23Α identificação ou selecção da fase óptima do desenvolvimenti para a planta alvo particular, como material de partida para o processo, de acordo com o invento, é possível para um entendido na matéria com base na presente descrição detalhada sem ter de efectuar um número pouco razoável de experiencias.

A microinjecção da solução de

DNA em proembriões ou embriões zigoticos pode ser efectuada usando processos conhecidos per se que são descritos, i nter alia, por Steinbiss e Stabel , 1983; Neuhaus et a 1 , 1984, 1986; Lawrence and Davies, 1985; e por Morikawa e Yamada 1985.

Deta1hadamente, a microinjecção dos pro-/embriões vegetais é efectuada usando um sistema de microinjecção especifico cujo principal equipamento é micropipetas que são controladas por micromanipulação.

Primeiro existe a pipeta de injecção propriadmente dita cujo diâmetro externo é entre 1,00 yjm e 2,00 mm. Prefere-se um diâmetro de 1 ,2 mm e

1,5 mm. 0 diâmetri da ponta do capilar de injecção, por outro lado, é entre 1^im e 10 pm. São especialmente ade quados os capilares de injecção cujo diâmetro das pontas é entre 0,5 pm e 1 pm, para usar no processo de acordo com o invento. Dentro do âmbito do presente invento são úsados capilares de microinjecção de preferencia capilares de micro electricos, tendo filamentos de vidro fechados de vidro de borossi1icato . Também é certamente possível usar quaisquer outros tipos de vidro ou outros materiais adequados para efectuar a microinjecção . Esta pipeta de microinjecção

-24é geralmente ligada via uma unidade reguladora de pressão, o chamado microinjector, a uma fonte de gás, especialmente uma fonte de azoto ou uma fonte de ar comprimido, que asse gura uma transferencia muito precisa da solução de injecção da micropipeta para o tecido vegetal.

Uma segunda pipeta, a chamada pipeta de suporte, serve para fixar os embriões zigoticos em posição durante a operação de microinjecção.

Estas pipetas de suporte têm ge ralmente uma ponta em forma de parte tendo um diâmetro entre 0,02 mm e 1,00 mm de preferencia entre 0,1 mm e 0,5 mm. Através de aplicação de uma fora negativa ou positiva fraca, é possivel submeter os pro-/embriões vegetais a sucção e portanto fixá-los em posição ou libertá-los novamen te após microinjecção da solução de DNA.

Uma terceira micropipeta, a chamada pipeta colectora, é usada para colher os embriões microinjectados e transferi-1 os para placas de microcultura adequadas.

As pipetas colectoras adequadas têm geralmente um diâmetro interno entre 0,1mm e 1 ,0 mm de modo a assegurar uma sucção dos microembriões injectados sem prob1emas .

I

-25A operação de microinjecção propriamente dita começa geralmente com a introdução dos proembriões ou embriões previamente isolados 10ul e 200 ul de meio de cultura adequado em laminas de vidro especialmente preparadas e com a sucção de um pro-embrião adequado com a ajuda da pipeta de suporte, sendo possivel, variar a orientação do pro-embrião selectivo e relativameii te à pipeta de injecção através da sua libertação e depois submetendo-o novamente a sucção até se conseguir uma orientação óptima dos pro-/embriões para a microinjecção.

Quando a ponta de micropipeta pe netra o tecido embrionário dos proembriões o tecido dos embriões a solução contendo DNA para injecção é libertada.

-'· Quando se usa embrião, é pref£ rivel injectar a solução de DNA no tecido do meristema imatu ro do rebento.

volumede injecção geralmente varia entre 1 pl e 100 pl por célula injectada de acordo com o tamanho de célula.

Dentro do âmbito deste invento um volume de injecção de 20 pl a 40 pl por célula injecta' da é preferido.

Para assegurar uma transformação tão uniforme quanto possivel de todas as células que estão envolvidas na construção da estrutura mu 11ice1u1 ara ser injec

Λ

-26tada, estas células são injectadas entre 1 e 1000 vezes, mas de preferencia entre 4 e 60 vezes dependendo do numero de células existentes.

Isto pode ser conseguido de acordo com o invento rodando os proembriões e embriões zigoticos a serem injectados entre as varias operações de injecção de modo que um numero tal grande quanto possível de células diferentes seja microinjectado .

As soluções de DNA adequadas a microinjecção em células vegetais são, por exemplo, solu ções tampao que contêm o DNA transformante numa concentra^ ção adequada.

A concentração de DNA preferida dentro do âmbito deste invento vai de 0,1 ^ug/jjl a 10 pg/pl , mas especia 1 mente de 0,5 jjg/μΐ a 5 pg/jjl. Uma concentração de DNA é de 0,5 |ig/pl a 1,5 ^ig/jul é espec i a 1 mente prefer i d a.

pH da solução tampão pode variar entre 7 e 8, de acordo com o inevnto é preferida uma gama de pH entre 7,5 e 7,8.

Para a integração do gene estra^ nho no DNA genomico da célula vegetal é vantajoso se o DNA transformante estiver delimitado por sequencia de DNA neutras (DNA veiculo). Dentro do âmbito deste invento, por a sequencia de DNA neutras deve-se entender especialmente aquelas sequências que não estão envolvidas na fun-27ção do DNA transformante transferido mas que não são importantes apenas para a integração do DNA inserido no genoma vegetal. As sequências de DNA neutras que delimitam o DNA transformante podem ser de origem sintética ou podem ser obtidas a partir da sequencia de DNA naturais por tratamento destas ultimas com enzimas de restrição adequadas. Por exemplo, plasmideos naturais que tenham sido abertos por uma enzima de restrição, selectiva são adequados com DNA veicu 1 os .

A sequencia de DNA produzida para a transferencia de genes pode, no entanto ter como alternativa uma estrutura anular (estrutura de plasmídeo) Tais plasmideos compreendem uma cadeia de DNA na qual o gene estranho tendo os sinais de expressão e integrado.

Um exemplo, de tais plasmideos é o plasmideo pUC8 (descrito em Messing j.e J. Vieira,

Gene 19, 269-276, 1982). Também podem ser usados como DNA veiculo fragmentos de palsmideos naturais. Por exemplo os mutantes de delecção para o gene VI do Virus do Mosaico da Couve-Flor podem ser usados como DNA veiculo.

De acordo com o invento, o

DNA transformante pode estar na forma de anel aberto ou fechado (estrutura de plasmideo) ou na forma super-enro1ada ou de preferencia linearizada.

Dentro do âmbito deste invento é preferido usar uma mistura de DNA linearizado e super-enrolado.

-28Após microinjecção os proembriões e embriões zigoticos podem ser sugados usando a pipete colectora e transferidos para um meio de cultura adequado.

controle optico de toda a operação de microinjecção é geralmente feito por observação ao microscopio. São preferidos os microscopios invert^ dos ou estereomicroscopios tendo uma combinação de luz in cidente e de luz transmitida.

A ampliação escolhida depende do tamanho do material a ser injectado a varia de 10 a 800 χ a ampliacção.

A cultura i n v i tro dos proembriões e embriões transformados, que se segue à microinjecção efectuada de preferencia em meios de cultura que são adequados a posterior desenvolvimento dos embriões até à planta totalmente desenvolvida.

Relativamente à sua composição estes meios distinguem-se especialmente pelo facto de conterem especialmente as substancias ou elementos minerais que são essenciais ao crescimento e desenvolvimento da célula vegetal (macroelementos), tais como, por exemplo, azoto, fosforo, enxofre, potássio, cálcio, magnesip e ferro além dos chamados elementos evstigiais (microelementos) tais como, por exemplo, zinco, cobre, manganês, boron, vanádio e selénio e molibdénio. Enquanto a macroelementos estão geralmente presentes em quantidades entre 10 mg/ml e algumas centenas de mg/1, a concentração dos microelementos é geralmente no máximo de algumas mg/1.

-29Outros constituintes dos referidos meios incluem uma serie de vitaminas essenciais, tais como acido nicotinico, piridoxina, tianina, inositol, biotina, acido lipóico, riboflavina, Ca-pantotenato ,etc , numa fonte de carbono adequado facilmente assimilável, como seja por exemplo, sucrose ou glucose e vários reguladores do crescimento na forma de fito-hormonas naturais ou sinté ticas da classe das anxinas e citocinimas numa gama de concentrações de 0,01 mg/l a 20 mg/l.

De acordo com o invento deve-se tomar especial cuidado para que a composição do meio e as proproções dos seus componentes individuais possam ser alteradas de acordo com a fase do desenvolvimento dos embriões. Isto aplica-se especialmente aos reguladores de crescimento usados que devem ser aplicados numa proporção. equj_U.br a da uns em relação aos outros para assegurar, caso se pretenda, que a embriogenese directa decorra de modo controlado.

Dentro do âmbito deste invento a gama de concentrações preferida das fito-hormonas da classe das auxinas e das citocinimas é entre 0,01 mg/l e 20 mg/l especialmente entre 0,8mg /1 e 1,2 mg/l.

Os meios de cultura são ainda osmoticamente estabilizados pela adição de álcoois de açucares (por exemplo manitol), açucares(por exemplo glucose) ou iões de sais e são ajustados a valores de pH de 4,5 a 7,5 de preferencia de 5,2 a 6,5.

-30A parte de a utilização de meios sintéticos tendo uma composição precisamente definida dos vários componentes individuais de concentração conhecida, é também possivel de acordo com o invento usar meios nutritivos complexos que são compostos total ou parcialmente por componentes naturais.

Relativamente a isto deve-se salientar por exenplo, o extracto de batata, o leite de coco e endosperma liquido que podem ser obtidos por reacção a partir de sementes imaturas de plantas.

Enquanto os primeiros passos de cultura, que se seguem imediatamente â microinjecção são de preferencia, efectuados em meio de cultura liquido, que pode facultativamente ser colocado sobre meio de cultura soTido,'~õ processo do desenvolvimento embrionário decorrer, conforme se pretenda, em meio de cultura liquido ou solido que pode ser preparado pela adição de um dos agentes solidificantes normalmente usados na tecnologia de microbiologia ou numa combinação de meios líquidos e solidos.

Agentes de solidificação adequa_ dos incluem, por exemplo, agar, agarose, alginato, pectinato

D

Gelrite , gelatina, etc., .São preferidos o agar e a agarose, especialmente agar e agarose do tipo de ponto de fusão baixo (LMT ) .

Quando se usa meios líquidos pode nalguns casos ser vantajoso adicionar ao meio um agente espessante osmóticamente neutro de modo a que a densidade do meio aumento sem que o seu valor osmotico também suba.

-31 Como resultado disto os embriões flutuam no meio assegurando-se uma troca de gases óptima com a atmosfera envolvente.

Dentro do âmbito deste invento são preferidos polímeros sintéticos, tais, como por exemplo copolimeros de sacarose e epicloroidrina tendo um peso molecular entre 70 000 e 400 000.

Os pro-embriões ou embriões microinjectados como atras descrito, são, imediatamente após a microinjecção de preferencia transferidos para placas de microcultura comerciais contendo meios tendo uma composição adequada â cultura in vitro de proembriões ou embriões zigoticos.

A microcultura de proembriões ou embriões zigoticas microinjectados é efectuada de preferencia num emio de cultura liquido ao qual se pode adicionar uma agente espessante osmoticamente neutro de acordo com as necessidades especificas do material vegetal usado e que pode facultativamente cobrir um meio solido

A densidade de cultura é de preferencia entre 1 proembrião ou embrião/yul e 50 proembriões ou embriões/μΐ de meio de cultura; é especialmente preferida uma desnidade de 1 proembrião ou embrião/yjl e 5 proembriões ou embriões/yul de meio de cultura.

A densidade de cultura escolhida depende do tamanho e da fase do desenvolvimento dos proί.

-32/embriões usados.

Dentro do âmbito deste invento mostrou-se vantajoso efectuar a cultura dos proembriões ou embriões microinjectados durante pelo menos algum tempo num sistema de 2 compartimentos que actua como câmara de humidade, o comportamento externo sendo formado, por exemplo,, por água, meio de cultura ou uma solução aquosa de manitol, enquanto que os embriões estão no compartimento interno.

E também vantajoso transferir os proembriõe ou embriões microinjectados todos os dias ou com intervalos até 12 dias de preferencia de 2 em 2 dias ou de 3 em 3 dias, para meio de cultura fresco ou cobrilos, com uma camada de meio de cultura fresco, o volume do meio dependendo do tamanho dos embriões e sendo geraimente de 0,5 pl a 10 pl e existindo uma proporção de embrião: meio de 1:0,2 ρ 1 e 1 :10p1 .

Quando os embriões microcultivados como atrás descrito atingem uma fase especifica do desenvolvimento mas geraimente após 10 a 30 dias, os embriões são transferidos, para diferenciação de rebento e raiz para meios solidos que podem facu 1 taivamente ser cober tos com uma camada de meio liquido. Os meios solidos podem geraimente ser os meios de cultura que se usam normalmente na regeneração de plantas e que daõ origem a uma diferenciação do crescimento de rebentos e)ou raiz devido ao seu teor equilibrado em fito-hormonas, especialmente da classe das auxinas e citoninas.

-33Após um período de cultura de aproximadamente 4 a 8 semanas, dependendo do material vegetal usado, mas no máximo após germinação dos embriões os últimos podem ser transferidos para meios solidos que não tenham hormonas ou com uma concentração de hormonas muito baixa e que são aqui cultivados até se formarem pequenas plantulas (seed1ings ).

Dependendo do material vegetal usado, pode ser vantajoso fazer uma indução da formação de raizes, por exemplo por transferencia dos embriões para meios indutores de raizes conhecidos per se /~ver, por exemplo, meio S4 (Tabela 9); (Tabela 10)7As plantulas transgenicas geralmente quiméricas formadas deste modo pocem então ser plantados no solo e depois tratadas como plantulas normais.

Usando processos conhecidos per se, pode-se produzir muito facilmente plantas trangenicas não quiméricas a partir de quimeras transgenicas obtidas como descrito atraás.

Em principio existem dois métodos alternativos para a produção de plantas transgenicas não quiméricas.

I

-34a) No caso de plantas que são adequados a embriogenese secundaria ou formação de rebentos adventícios, é possível separar in vitro as estruturas secundarias as quais derivam de células individuais, dos regenerantes inicialmente formados e geralmente quiméricos e isolá-las umas das outras e assim obter plantas transgenicas puras. Isto é especialmente simples se o ou um dos genes estranhos transferidos permitir a utilização de condições de cultura selectivas de modo a que apenas as células transgenicas sobrevivam.

Os regenerantes transgenicos podem então ser cultivados como anteriormente descrito e regenerados para plantas completas.

-b)^- PorOutro lado, plantas (não quiméricas) homogeneamente transformadas podem também ser obtidas por auto-polinização de quimeras transgenicas primarias, que facultativamente pode ser repetida. Uma vez que o progénie sexuada deriva de uma unica célula, nomeadamente o o vo-fèrt i 1 i zado , alguam desta progenie serão plantas transgenicas completas, i.e., quando a região transgenica da quimera participa na formação do polén ou óvulos.

processo previamente descrj_ to para a produção de plantas transgenicas usando tecnologia de microinjecção, incluindo todos os seus passos, constitui parte do presente invento.

processo de acordo com o invento pode ser usado quase universalmente uam vez que \

-35quase todas as plantas formam embriões zigoticos. Inclui a microinjecção de sequências de DNA naturais e de construções de genes híbridos produzidos artificialmente por meio de tecnologia de DNA recombinante.

âmbito alargado do presente invento inclui especialmente moléculas, de DNA recombinante que contem sequências de DNA resultando em transformantes com propriedades uteis e desejáveis.

Aquelas moléculas são preferencialmente moléculas de DNA recombinantes contendo uma ou mais sequências que codificam uma proproedade util e desejável e que estão sob o controle regulador do sinal de expressão activos em plantas de modo a ser assegurado a expressão dos referidos sequências geneticas na célula vegetal transformada.

Genes adequados para usar no processo de acordo com o invento são portanto especialmente aqueles que são expressos na célula vegetal e que conferem à planta uma propriedade util e/ou pretendida, como seja, por exemplo, maior resistência a agentes patogenicos (e.g. a fungos, bactérias, virus etc., fitopatogenicos, resistência a produtos químicos /“e.g. a herbicidas (tais como triazinas, su1foni1 oureias , imidazo1inonas , triazolopirimidinas , bialafos glifosato, et.), insecticidas ou outros biocidas7; resistência a citotoxina (e.g. uma higromicina) canamicina, cloranfenicol , etc)., resistência a influencias ambiente adversos (edáficos ou atmosféricos) e.g. ao calor, frio, vento, condições desfavoráveis do solo, humidade cura, secura)etc., ou com uma maior ou melhor formação de substancias de reserva nas folhas,

sementes , tubérculos, raízes, caules, etc. Substancias desejáveis produzidas por uma planta transgenica incluem, por exemplo, proteínas, amidos, açucares, aminoácidos, alca loides, aromatizantes , corantes, gorduras, etc.,

Também estão incluídos no presente invento genes que codificam substancias activas farmaceut i camente aceita.veis, tais como, por exemplo, alcaloides esteroides, hormonas, imunodu1 adores e outras substancias, fisiologicamente activas.

Por exemplo, a resistência a citotoxinas pode ser conferida por um gene que expresse nas células vegetais uma enzima que desintoxique a citotoxina, por exemplo, fosfatransferase de neomicina tipo II ou fosfotransferase de aminog1icosido tipo IV para desin to?í cáçãÃTcíe canamicina, higromicina e outros antibióticos do tipo aminog1icosido ou uma glutationa-S-Transferase ou citocrónio P-450 ou outra enzima catabólica conhecida como desintoxicante da triazina, su1foni1ureia ou outros herbicidas. A resistência a citotoxina pode também ser conferida por um gene que expresse uma planta uma forma de uma enzima alvo (sitio da acção da citotoxina) que é resistente â citotoxina por exemplo uma forma de aceto-hidro xiacido-sintetase que é insensível à inibíç'ao por sulfonilureias ou imidazolinonas ou outros herbicidas que actuem neste passo metabólico ou numa forma de EPSPsintetase que é insensível à inibição por glifosato.

Pode ser vantajoso expressar estas enzimas alvo alteradas numa forma que permita o seu transporte na célula vegetal para o compartimento celular correcto, i.e., o cloroplastos nos exemplos atrás.

-37Em certos casos é vantajoso direccionar os produtos geneticos para a mitocôndria, vacuolos, vesiculos endoplasmaticas ou outras partes da célula ou mesmo para o espeço intercelular (apop1ástico ) .

A resistência a certas classes de fungos pode ser conferida, por exemplo, pela introdução, de um gene queexpresse quitinase nos tecidos vegetais Muitos fungos patogênicos para plantas contêm quitina como parte integral da estrutura das hifas e esporos, e.g. basidiomicetes (manchas ferrugens) e ascomicetes e fungos imperfeitos (incluindo Alternari va e Bipolari s , Exeroph i1 um turc i cum , Colletotricum , Gleo-cercospora e cercospora ). A quitinase pode inibir o crescimento dos micélios de certos agentes patogênicos in vitro. Uma folha ou raiz de planta que expresse quitinase constitutivamente ou em resposta à _invasão _por um agente patogenico está protegida contra muitos tipos de ataques por fungos. A expressão constitutiva pode ou não ser vantajoso relativamente à expressão induzivel que é a resposta normal ao ataque por um agente patogenico em certas plantas, porque a quitinase esta presente imediatamente em niveis elevados sem ser necessário um periodo de espera para a sintese de novo .

A resistência a insectos pode, por exemplo, ser conferida por um gene codificador de um polipeptídeo, que é toxico para insectos e/ou suas larvas, como seja a proteina cristalina de Baci11us thuringensis /Barton et a 1 . , 1987; Valck et a 1, 1987 7. Uma segunda classe de proteinas que conferirá resistência a insectos são os inibidores de proteases. Os inibidores de proteases são constituintes comuns das estruturas de armazenamento vegetais / Ryan 19737. 0 inibidor de proteases.

Bowman-Birk purificado a partir da soja inibe a protease

-38do intestino das larvas de Tenebr i o /Birk et a I 1 9637 . 0 gene codificador do inibidor de tripsina de Vigna ungu i cu1 ata está descrito por Hilder et a 1 . , ( 1987 ) .

Um gene codificador de um inbidor de proteases pode szr colocado sob o controlo de um pro motor vegetal de preferencia um promotor constitutivo como seja o promotor CaMV 35S /que foi descrito por Odell et a 1. , ( 1985 ) num vector adequado. 0 gene, por exemplo, a sequencia codificadora do inibidor de proteases Bowman-Birk de soja, pode ser obtido usando os métodos de clonagem de cDNA descrito, por Hammond et a 1. , (1984).

Um método alternativo de obtenção de um gene de inibidores de proteases com menos de 100 aminoácidos, como seja o inibidor da tripsina de lima bean, é a sus síntese.

A sequencia codificadora é prevista por retro-tradução e os sitios de restrição adequados ao vector pretendido são incluidos em cada um dos extremos. 0 gene sintético é preparado através da síntese de o 1igonucleotídeos sobreponiveis de 30 a 60 bases. Os fragmentos sao fosforilados , ligados (Maniatis êt a 1 , 1982) e clonados no vector adequado. Um clone cuja inserção está na orientação correcta pode ser identificada por sequenciação. 0 DNA de plasmídeo é isolada e usado para incorporação em protoplastos (Abel et a 1 1986) .

Também estão incluidos no presente invento genes codificadores de ingredientes -fàrmaceuticamente activos, por exemplo, alcaloides, esteróides, hor monas, e outras substancias fisiologicamente activas e fia f

V

39vinas, vitaminas, e corantes. Portanto, os genes que estão contemplados neste invento incluem, mas não estão limitados a genes especificos de plantas, atis como o gene de Zein (Wienand et a 1, 1981)/, genes especificos de mamíferos, tais como o geneda insulina, o gene da somatostatina, o gene da inter1euquina , os genes de t-PA (Pennica et a I , 1983)etc., os genes de origem microbiana tais como o gene de NPTII assim como genes de origem sintética como seja o gene da insulina (Itakura et al, 1975).

A parte os genes naturais que codificam uma propriedade util e desejável, dentro do âmbito deste invento é também possível usar genes que tenham sido previamente modificados de modo especifico usando métodos químicos ou de engenharia genética.

concenito largo do presente invento também inclui genes que são produzidos totalmente por síntese quimica.

Também são adequados para usar no processo de acordo com este invento outras sequências de DNA uteis, especialmente sequências de DNA não codificadas que tenham funções reguladoras. Estas sequências não reguladoras são, por exemplo, capazes de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada em tecido vegetal. Rela_ cionado com isto o promotor do gene hps 70 deverá, por exemplo, ser referido pois pode ser induzido por choque térmico / Spena et a I , 19857; a sequencia delimitando S¹ da sequencia nuclear codificadora até do gene nuclear da subunidade pequena da ribulose-1 ,5-bifosfato-carboxilase (RUBISCO) /“Morelli et al, 19857 ou o gene de proteina de ligação à clorofila a/b, os quais são induzidos pela luz;

ou a região delimitante 5' do gene da álcool-desidrogenase (adhl-s) do milho, o qual é capaz de induzir a expressão de um gene denunciante associado /por exemplo, c 1 oranfenico1

-aceti1-transferase (CAT) (Howard et al, 1987).

-40Um outro grupo de sequências de DNA reguláveis compreende sequências de DNA quimicamente reguláveis, as quais, por exemplo, contidas nos genes das proteínas PR (relacionadas com patogênese) do tabaco e que são induziveis por reguladoras químicos.

As sequências de DNA reguláveis referidas, que são dadas apenas como exemplo, podem ser de origem natural ousinteticas ou podem ser uma mistura de sequenci^-s—de DNA naturais e sintéticas.

Os genes das sequências de DNA que são adequados para usar no âmbito do presente invento sao genes ou DNA homólogos e heterólogos e genes ou DNA sintéticos de acordo com a definição dada no âmbito do presente invento.

A sequencia de DNA pode ser construída exclusivamente a partir de DNA genómico, a partr de cDNA ou a partir de DNA sintético. Uma outra possibilidade é a construção de uma sequencia de DNA híbrida consistindo em cDNA e DNA genómico e/ou DNA sintético.

-41Naquele caso o cDNA pode derivar do mesmo gene do DNA genomico ou o cDNA e o DNA genomico podem derivar de genes diferentes. Em qualquer dos< casos, no entanto, o DNA genómico e/ou o cDNA podem ser preparados individualmente a partir do mesmo gene ou a partir de genes diferentes .

Se a sequencia de DNA possuir porções de mais do que um gene, estes genes podem derivar de apenas um só organismo, de vários organismos pertencentes a varias estirpes ou variedades da mesma especie ou varias espécies do mesmo género ou de organismos pertencentes a mais do que um género da mesma unidade taxonómica (reino) ou de outra diferente.

,₍___ Para assegurar a expressão dos referidos genes estruturais na célula vegetal é vantajoso se as sequências codificadoras dos genes foram primeiro ligadas operacionalmente a sequências de expressão capazes de funcionar nas células vegetais.

As construções de genes híbridos dentro do âmbito do presente invento contêm assim, além dos gene(s) estrutural (ais), sinais de expressão que também incluem sequências do promotor e da terminador e outras sequências reguladoras de regiões 3' e 5' não traduzidas .

^: Qualquer promotor e qualquer ter minador que seja capaz de fazer a indiução da expressão de uma sequencia de DNA codificadora (gene estrutural) podem ser usados como constituintes da sequencia de genes híbridos. São especialmente adequados os sinais de

-42expressão derivados de genes de plantas ou de vírus de plantas. São exemplos de promotores e terminadores adequados por exemplo, os genes da nopalina-sintetase (nos), dos genes de octopina-sintetase (oes) e dos genes do Virus do Mosaico da Couve-flor (CAMV) ou sequências de DNA homóloga que ainda possuam as propriedades características dos sinais de expressão referidos.

Dentro so âmbito deste invento são preferidos os sianais de expressão 35S e 19S do genoma do CaMV ou seus homólogos que possam ser isolados a partir do referido: genoma usando métodos de biologia molecular, como descrito, por exemplo, por Maniatis et a 1 , 1982, e ligados â sequencia de DNA codificadora.

Dentro do âmbito deste invento homologos^- dos sinais de express'ao 35 e 19S deve-se entender como significando espec i a 1 mente os sinais de expres_ são que sejam, apesar de pequenas diferenças da sequencia, substancialmente homologos dás sequências de partida e que ainda desempenham a mesma função.

De acordo com o invento, por exemplo o fragmento Seal do CaMV estirpe S que inclui os nucleotideos 6808-7632 do gene (Frank G. et a 1 , 1980 ) pode ser usado como material de partida para as sequências de controlo de transcrição 35S.

-430 promotor 19S e a região 5' não traduzida está num fragmento de genoma entre o sitio Pst I (posição 5386) e o sitio Hind III (posição 5850) dos genes de CaMV (Hohn, et aI, 1982). 0 correspondente terminador e a região 3' não traduzida ficam num fragmento EcoRV /Bgl II entre as posições 7342 e 7643 de genoma de CaMV.

Também referidos deste invento e dentro do âmbito são os sinais de expressão do CaMV estirpe CM 1841, cuja sequencia de nucleotídeos completa está descrita por Gardner R.C., et al, 1981).

Ainda um representainte eficaz de um promotor vegetal que pode ser usado é num promotor veqpta.l ..xte--super-produção. Este tipo de promotor deverá, ser ligado de modo operacional e um gene que codifique o produto pretendido, ser capaz de induzir a expressão da referida sequencia genetica.

Promotores vegetais super-prodi[ tores que podem ser usados dentro do âmbito;do presente invento incluem o promotor da subunidade pequena (ss) da ribulose-1 ,5-bifosfato-carboxilato de soja /“Berry -Lowe et a I, J. Molecular and Appln. Gen, /, :483-498 (1982) e o promotor da proteina de ligação â clorofila a/b. Estes dois promotores são conhecidos pelo facto de serem induzidos pela luz em célula eucarioticas vegetais /ver, por exemplo Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective A. Cashmore, Plenum, New York, 1983, páginas 29-38; Coruzzi G. et a 1 , The Journal of Biological Chemistry, 258:1399 (1983/ e Dunsmuir, P. et al.,

Journal of Molecular and

Appl ied Genetics 2:285 (1983)7.

As varias secções da sequencia de DNA podem ser ligadas umas às outras para formar uma sequencia de DNA codificadora completa por métodos conhecidos per se. Métodos adequados incluem, por exemplo, a recombinação i η vi vo de sequências de DNA que tenham secções homólogas e a ligação iη vitro de fragmentos de restri ção.

Geralmente são usados como vectores de clonagem vectores palsmideo ou virus (bacteriófagos) tendo sequências de controle de replicação derivadas de especies compatíveis com a célula hospedeira.

vector de clonagem é normalmente portador de uma origem de replicação e também de genes específicos que resultam em características de selecção fenotipica na célula hospedeira transforamada , especialmente resistências a antibióticos ou a herbicidas específicos. Os vectores transformados podem ser seleccionados com base nestas marcas fenotípicas após transformação numa célula hospedeira.

As marcas fenotípicas seleccio narias que podem ser usadas dentro do âmbito deste invento incluem, por exemplo, sem que isto limite o assunto do inven to, resistências a ampicilina, tetracic1ina , higromicina, canamicina, metotrexato, G 418 e neomicina.

-45Dentro do âmbito deste invento são células hospedeiras adequadas procariotas, incluindo hospedeiros bacterianos, tais como, por exemplo, A. tume faciens, E.coli., S.Typhimurium e Serratia marcescens e também cianobacterias.

Hospedeiros eucarioticas tais como leveduras, fungos formadores de micélio e células vegetais também podem ser usados dentro do âmbito deste invento .

splicing da construção de ge nes híbridos de acordo com o invento num vector de clonagem adequado ê efectuado usando métodos convencionais, como seja, os descritos, por exemplo, por Man i at i s et a 1 . , 1982

Como regra, o vector de/e a sequencia de DNA sujeitos e splicing são primeiro clivados com enzimas de restrição adequados. São enzimas de restrição adequados., por exemplo, aqueles que dão fragmentos tendo extremos cegos, tais como, por exemplo, Smal, Hpal, e EcoRV ou enzimas que formam extremos coesivos, tais como, por exemplo, EcoRI , Saci e BamHI.

Os fragmentos com extremos cegos e os possuidores de extremos de coesivos complementares uns dos outros podem novamente ser ligados, usando DNA-ligases adequados para formar uma molécula de DNA uniforme contínua.

-46Os extremos cegos podem também ser produzidos por tratamento dos fragmentos de DNA que têm extremos coesivos projectados com o fragmento Klenon da DNA-po1imerase de E .coli .através do preenchimento dos intervalos com os correspondentes nucleotídeos complementares.

Por outro lado, os extremos coesivos, podem também ser produzidos artificialmente por exemplo pela adição de caudas homopo1iméricas complementares aos extremos de urfia sequencia de DNA pretendida e à molécula de vector clivado usando uma desoxinuc1eotidi1 -transferase terminal ou pela adição de sequências de oligo nucleotídeos (adaptadores) possuidores de um sitio de cliva gem de restrição e depois cortando com a enzima de restrição adequada .

vector de clonagem e a célula hospedeira transformada, por aquele vector são usados de acordo com o invento para aumentar o número de copias do vector. Com um número de copias elevado é possivel iso lar o vector que é portador da construção de genes hibrido de acordo com o invento e usá-lo, por exemplo, para a inser ção da sequencia de genes quiméricos na célula vegetal.

Num outro passo do processo estes plasmideos são usados para inserir os genes estruturais codificadores de um produto genetico pretendido ou uma sequencia de DNA não codificador tendo funções reguladoras na célula vegetal e parea integrá-lo no genoma: de célula vegetal.

λ

-47Assim ο presente invento também está relacionado com a produção de células vegetais recipientes que contem os referidos genes estruturais ou quaisquer outras sequências de DNA incorporadas no seu genoma.

conceito lato deste invento também inclui plantas transgenicas que tenham sido transformadas por meio do processo previamente descrito de acor do com o invento, e também a sua progénie assexuada e/ou sexuada que ainda tenha as novas propriedades pretendidas ou prorpiedades resultantes da transformação da planta progenitora e, em geral, material de propagação vegetal.

A expressão progénie assexuada e/ou sexuada de plantas transgenicas, como definido dentro do âmbito deste invento, cobre também todos os mutantes e variantes que ainda possuam as propriedades caracteristicas da planta transformada de partida e todos os produtos de hibridação e fusão contendo material vegetal transformado.

A expressão material de propagação vegetal como definido dentro do âmbito detse invento deverá ser compreendido como cobrindo por exemplo, protoplastos vegetais, células vegetais, clones celulares, aglomerados celulares, culturas de tecidos de calos e/ou culturas de orgãos e também sementes, polén, ovulos zigotos embriões ou outro material de propagação, derivado de celu las germinais; esta lista que é dada apenas como exemplo não pretende ser limitante do invento.

Este invento também esta relacio nado com partes de plantas, atis como, por exemplo, flores, caules, frutos, folhas e raizes, que derivem de plantas transgenicas ou a sua progénie que tenha sido previamente transformada por uso e meio do processo de acordo com o invento e são pelo menos parcialmente constituídas por células transgénicas.

processo de acordo com o invento é adequado para a transformação de todas as plantas especialmente das pertencentes aos grupos sistemáticos Angiospermae e Gymnospermae.

De entre as Gymnospermae são de particular interesse as da classe Con i ferase .

De particular interesse entre as Angiospermae são, além de arvores e arbustos decíduos plantas de famílias Solanaceae , Cruciferase , Compos i tae ,

Li 1 iaceae , Vitaceae , Chemopodiaceae, Rutaceae , AlIiaceae , Amary11idaceae , Asparagaceae, Orchidaceae, pa1mae ,

Brome 1i aceae , Rubi aceae , Theaceae, Musaceae , Ma 1vacea ou Graminiae e da ordem Leguminosae e destas, especialmente as da familia papi1ionaceae. São preferidos representantes das So1anaceae , Cruciferase , 1eguminosae , Ma 1vacea e

Grami neae.

V

Culturas alvo dentro do âmbito do presente invento também incluem, por exemplo, as seleccionadas daserie: Fragar i a , Lotus , Med i cago, Onobrych i s , Trifolium , Trigone11 a, Vigma , Citrus , Li num , Geran i um , Man i nhot, Daucus , Arab idopsi s, Brass i ca , Paphanus , Sinapis , Atropa , Caps i cum, Datura, Hyoscyamus , Lycopers i con , Nicotiana , So1anum , Petunia , Digital is, Majorana , Cichorium He I i anthus , Lactuca , Bromus , Asparagus, Ant i rrh i num ,

Hemeroca11i s , Nemes i a , Pe1árgon i um, Pas i cum , Penn i setum , Rannuncu 1 us , Senecio , Salpiglossis, Cucumi s , Browa1 lia,

Glycine , ZoIium , Zea , Triticum e Forghum , Grossypium,

Ipomoea , Pasiflora , Cyc1amen , Ma 1us, Prunus , Rosa , Rubus Popu1us , Santa 1 um , Al1ium , Li 1ium, Narc i ssus , Ananas ,

Arachi s , Phaseolus e Pisum.

_ São especialmente preferidos os representantes de familia Grami neae como seja por exemplo plantas que são culturas e cultivadas numa grande area e dão grandes produções. Podem ser referedos os seguintes exemplos: milho, arroz, trigo, centeio, cevada, aveia, milho, miudo ou sorgo e também forragens.

Outras culturas alvo que são especialmente preferidas para usar no processo de acordo com o invento são, por exemplo, palntas dos generos A11i um , Avena , Hordeum , Oryza , Pan i cum , Sacchari um , Seca I e Setar i a , Sorghum , Triticum , Zea , Musa , Cocos , Phoen i χ , e Ε1ae i s .

V

-50As transformações com exito podem ser verificadas de modo conhecido per se, por exemplo, por estudos de biologia molecular que, incluem, especialmente, analise de transferencias Southern.

Naquele método de analise, o DNA extraído é primeiro tratado com enzimas de restrição depois sujeito a electroforese num gel de 0,8% a 1% de agarose, transferido para uma membrana de nitrocelulose /Southern, E.M. J. Mol. Biol., 98 , 503-5 17 ( 1 975 ) 7 e hibridado com o DNA a ser detectado, o qual foi previamente sujeito a nick-trenslation /Rigby W.J., Dieckman,

M. Rhodes, C. e P. Berg, J. Mol. Biol, 113, 237-251) 7 fi P (DNA com actividades especificas de 5 χ 10 a 10 χ 10 cpm/pg ) .

Os filtros são lavados tres vezes durante uma hora de cada vez com uma solução aquosa de 0,03M citrato de sodio e 0,3 M de cloreto de sodio e 65°C. 0 DNA hibridado é visualizado por exposição a um filme de raios X durante 24 a 48 horas.

Para ilustrar a descrição geral feita e para uma melhor compreensão do presente invento será feita referencia a Exemplos específicos que não são limitativos a não ser que haja uma indicação especifica em contrario. 0 mesmo se aplica a todas as listas dadas como exemplos na descrição atrás.

-51 Exemplos não limitantes

Exemplo 1 : Construção do plasmideo pABDI

Os plasmídeos de acesso livre pKm 21 e pkm 244 /'Beck Ε., et al , Gene, 1 9: 327-336 ( 1 982 ) são clivados com a endonuclease de restrição PstI. Os fragmentos de plasmideo, que são usados para recombinação são purificados por electroforese em gel de 0,8% de agarose. 0 plasmideo pKm 21244 obtido por ligação dos fragmentos contem uma combinação das delecções 5' e 3' do gene NPT-II obtidas com Bal 31, como descrito por Beck et al em Gene, 19, 327-326 ( 1982). Para ligar o promotor do Virus do Mosaico da couve-flor ao fragmento Hind III do palsmideo pkm 21244, constroi-se o plasmideo de acoplagem pJPAX. Os _plasmideo de acoplagem pJPAX é obtido a partir dos plasmídeos pUC8 e pUC9 /Messing J. e J. Vieira,

Gene 19, 269-278 (1982)7. 10 pares de bases de sequências adaptadora do plasmideo pUC9 são separados por clivagem nos sitios HindIII e Sall e subsequente preenchimento dos extremos coesivos usando o fragmento Klenow da polimerase I /-Jacobsen, H. et al, Eur. J . Bi ochem. 45 , 623 ( 1974 )_7e ligação da cadeia polinucleotidica resultada na regeneração do sitio HindIII.

Um elemento adaptador sintético de 8 pares de bases (Xhol) é inserido no sitio Smal desta sequencia adaptadora separada. A recombinação dos fragmentos Xor I e Hind III do plasmideo pUC8 e do plasmideo pUC9 modificado produz o plasmideo pJPAX tendo um adaptador parcialmente assimétrico com os seguintes sitios de restrição sucessivos: EcoRI, Smal, BamHI, Sall, PstI, HindIII, BamHI,

-52Xhol e EcoRI. A região promotora do gene VI do CaMV que está ligada ao gene estruturak NPT-II, deriva de genoma de CaMV estirpe CM4-184, numa variante de CaMV estirpe CM 1841, a sesquencia de nucleotídeos completa da qual está descrita por Gardner, r .c .et a 1 , 1981. A região do promotor de CaMV é clonada no cosmídeo pHC79, que contem 6kpb (Kpb: 1000 pares de bases) e que é um derivado do plasmideo pBR322 de £. coli. /Hohn B. e Collins J.,1980)7 o genoma de CaMV e do cosmídeo pHC79 sendo clivados com BstII e os fragmentos resultantes sendo ligados uns aos outros .

sinal de expressão 5' do gene VI do Virus do Mosaico da Couve-Flor e o fragmento HindIII do gene NPT-II são ligados no plasmideo pJPAX por inserção da região promotora do gene VI do Virus do Mosaico da Couve-flor entre o sitio PstI e o sitio HindIII. 0 plasmideo resiflta'frtê'~é clivado no unico sitio HindIII e o fragmento HindIII do plasmideo pKm 21244 é inserido neste sitio de incisão em ambas as direcçõessde orientação resultando nos plasmídeos pJPAX CaKm + e pJPAXCaKm^-1. Para criar uma sequencia EcoRV na vizinhança do sinal de terminação 3' do gene hibrido NPT-II, num fragmento BamHI do plasmideo pJPAXCaKm+ é inserido no sitio BamHI do plasmideo pBR327 /Soberon, X, et a 1, Gene,9, 287-305 ( 1 980)7 . Obtem-se o plasmideo pBR327 Cakm. 0 fragmento EcoRV do plasmideo pBR327 Cakm, que contem a nova construção de DNA é usado para substituir a região EcoRV do gene VI do virus do mosaico de Couve-flor, que foi cionado no sitio Sall no plasmideo pUC8, como resultado do qual a sequencia de DNA codificadora de proteina do gene NPT-II é colocada sob o controle dos sinais de expressão 5' e 3' do gene VI do Virus do Mosaico da Couve-flor. Os plasmídeos resultantes são designados pABDI e pABDII.

ExempIο 2 : Construção do plasmídeo pDH51 plasmídeo pDH51 está decsrito por Pietrzak et a 1 . , 1986 . Este plasmídeo contem a região do promotor 35S e a região terminadora do CaMV que estão separadas por uma região de poli-adaptador inserida contendo numerosos sitios de clonagem.

material de partida usado para a região promotor 35S/terminador é um fragmento Seal de CaMV S que inclui os nucleotídeos 6808-7632 do genoma (Frank G., et a 1 , Ce 11 , 2J : 285-294 (1980) e que é clivado no sitio Sma I de pUC18 (Norrander J. et a 1, Gene 26, : 101-106, para formar o plasmídeo pDB21.

Este é então digerido com a enzima de restrição HpHI. Os extremos coesivos são removidos por tratamento com DNA-polimerase de T4.

Um fragmento contendo a região promotor 35S /pUC18 pos.21 (Hphl)-412 (Smal) mais caMV pos. 6808-7437 (Hphl) é ligado aos adaptadores Kpml, clivado com Ncol (pos.6909 (CaMV), os extremos coesivos são preenchi_ dos usando o fragmento Klanow da DNA-po1imerase , ligado dos adaptadores EcoRI e finalmente digerido com EcoRI e Kpml .

-540 fragmento EcoRI/Kpnl resultante que contem a sequencia promotora CaMV é então inserido no plasmideo pUC18 entre os sitios de restrição Kpnl e EcoRI. Obtem-se deste modo o plasmideo pDG2.

Um segundo fragmento portador dos sinais de terminação (CaMV pos. 7439 (Hphl )-7632 mais pUC18 pos. 413-1550 (Hphl)7 é clivado com EcoRI, os extremos coesivos sendo .preenchido usando Klenow, provido de adaptadores HindIII e digerido com HindIII e SpHI.

fragmento resultante SpHI-HINDIII , que contem a sequencia terminadora de CaMV é então inserido nos sitios de restrição HindIII e SpHI do plasmídeo pDG2.

Exemplo 3 ; Construção do plasmideo pHP23

A construção do plasmideo pHP23 é efectuada por inserção de um fragmento EcoRV do plasmideo pABDI, que contem o gene estrutural APH(3)II e também uma parte da sequencia promotor do RNA 19S de CaMV, no sitio de clivagem, Smal do plasmideo pDH51.

Exemplo 4: Isolamento e injecção de embriões zigoticos de milho.

a) Isolamento e selecção dos embriões de milho.

Proembriões e embriões zigoticos jovens são isolados a partir de Zea mays , cv. Alpine, CV. Issar, G.-4083 ou CV. Tokano, entre 3 e 22 dias após a poli nazação (ver Figura 1, fases 17 a 30).

As superfícies das espigas são esterilizadas durante 30 segundos por um tratamento com et£ nol 70% e os grãos de miljo jovens, que estão separados uns dos outros húmidos com água destilada estéril até serem i so4 ados—tfs-embr i ões zigoticos.

Os embriões zigoticos são i sol a dos usando bisturis e pinças finas com controle ao microscó pio (ampliação 10-52x). 0 tamanho e a fase do desenvolvimento dos embriões isolados varia numa gama entre as fases 17 e 30 da Figura 1.

-56Com vantagem o isolamento é efectuado por

a) removendo uma secção med i ano long i tud i na 1 na região do núcleo

b) seguido da dissecação do saco embrionário e

c) remoção do embrião a partir do saco embrionário isolado

Os dispositivos normalmente usados para a selecção dos embriões s'ão um estereomicrosco pio ( 50 χ-200χ) ou um microscopio invertido (60χ-200χ) e também um microcapilar manipulável com a mão que esta ligado a um tubo de silicone (no caso dos embriões terem mais de 20 células) ou um sistema de micro-se1ecção que está descrito por Koop e Scweiger, 1985; Spangenberg, 1986, e Sçweiggr_£t a 1, 1987.

Imed i atamanete apos o isolameii to, os proembriões e embriões zigoticos assim seIeccionados são transferidos para subsequente microinjecção, para gotas de 50 ul a 100 ul de meio de cultura (M1) sem Ficoll, que foram previamente aplicadas sobre placas de vidro de 24mm a 40 mm. Estas placas de microinjecção estão descritas na secção /~b) ; c)7. As placas de microinjecção são colocadas num sistema de dois compartimentos, como descrito na secção (c) até se efectuar a injecção.

-57b) Microinjecção de DNA do plasmídeo pHP23 em embriões de milho

A) Si stema

A microinjecção de embriões e proembriões de milho é realizada sob observação microscópica usando um microscopio invertido ou um estereomicroscopio com uma combinação de luz incidente e transmitida. A amplija ção depende do tamanho dos embriões e varia de 10χ a 800χ

A manipulação dos proembriões ou embriões é efectuada usando dois micromanipu1 adores que podem ser adaptados ao pé do microscopio (manipuladores aceionados por motor) ou permanecerem lado do microscopio (mánipu(adores mecânicos). Ambos os micromanipu1 adores , são equipados com apoios capilares.

Usam-se como capilares de micro injecção capilares de microe1ectrodos que tenham filamentos fechados de vidros em boro-si1icato e que tenham um diâmetro externo de 1,00 mm a 1,50 mm. Para fixar os embriões em posição durante a operação de injecção são usados os capj_ lares de apoio produzidos especialmente para esta finalidade. Eles consistem em secções de tubo de vidro feito com vidro de soda tendo um diâmetro externo entre 1 ,00mm e 1,50 mm. Ambos ostipos de capilares são feitos usando um sistema comercial para esticar capilares de modo a obterem -se capilares de injecção adequados (diâmetro da ponta apro ximadamente - 1um) e capilares de apoio.

-58Para fazer o acabamento dos ca pilares de apoio usa-se uma microforja na qual o capilar de apoio esticãdo é quebrado verticalmente no diâmetro de abertura necessária entre 0,2 mm e 1,0 mm é polido, (externo boleado tendo uma abertura pequena).

A solução de DNA é injectada usando um microinjector . Este microinjector é um dispositivo de pressão controlada pneumaticamente que permite uma injecção controlada com grande precisão para as células dos embriões. 0 volume de injecção varia de acordo com o tamanho das células entre 1 pl e 100 pl. Podem-se adqui rir microinjectores adequados, por exemplo à Eppendorf, FRG ou Bachhofer, FRG.

B) Solução de DNA

A solução de DNA microinjectada (0,01 ug/ul a 2,0 ug/ml) consiste numa mistura de DNA de pHP23 super-enrolada ou linearizado ou uma mistura de DNA de pHP23 super-enrolada e linearizado num tampão Tris-HCl consistindo em Tris-HCl 50mM, pH-7,78 e 50mMNaCl.

-59C ) Micro injecção

A microinjecção da solução de DNA previamente descrita em células de embriões ou proembriões de modo analogo ao método descrito por Nenhaus , et al, 1984, 1986. As regiões preferidas por microinjecção estão marcadas em setas na Figura 1.

Primeiro fixa-se a uma placa de vidro (24 χ 40 mm), para um dos lados e ao longo da aresta longitudinal, uma outra placa de vidro ( 5 χ 30 mm a 35 mm) ou uma tira de fita adesiva transparente compreein dendo 1 a 4 camadas de mesmo tamanho arrajnadas umas por cima das outras de modo a formar-se uma aresta.

Os embriões são transferidos para gotas de 10 ul a 200 ul de meio de cultura M1 sem Ficoll sobre a placa de vidro assim preparada. Os pequenos embriões são mantidos fixos pelos capilares de apoio, duran te a injecção enquanto que os embriões maiores são mantidos em posição com o capilar de apoio e a aresta da placa de vidro e em seguida procede-se â injecção. Cada embrião é injectado entre 4 χ e 60 χ, dependendo do numero de células e é rodado entre operações de injecção individuais de modo a serem injectadas o maior numero; de células possíveis. Os embriões zigoticos injectados são então cultivados em meio adequado.

\ 1

-60c) Microcultura de proembriões e embriões de milho microin jectados imediatamente após a injecção os embriões são transferidos usando um microcapilar esticado à mão que está ligado a um tubo de silicone, ou usando a ponta de bisel a uma agulha, para poços de uma placa de microcultura em policarbonato (Spangenberg , 1986); Spangenberg et a 1 . ,

1986 ) cada um dos quais contem 0,5ul a 2ul de meio de cult£ ra (M1) com Ficoll. Como alternativa é também possível introduzir aproximadamente 1 ul de um meio M1 solidificado

D com a agarose de baixo ponto de fusão (e.g., Sea Plaque ) em cada poço e cultivar os proembriões ou embriões em aproximadamente 1 ul de um meio liquido M1 que é colocado sobre o meio solidificado.

Como regra, os embriões microinjectados são microcu11ivados individua1 mente . E, no entanto possível colocar até 5 embriões num mesmo poço da placa de-microrrrrtura em policarbonato.

As placas de microcultura contendo os embriões microinjectados são colocados num sistema de dois compartimentos (placa Falcon de cultura de tecj_ dos de orgãos; Falcon USA) que actua como camara húmida e geralmente contem um compartimento externo de 2 ml a 4 ml de uma solução de manitol a 0,2M (Koop e Scweiger, 1985; Spangenberg et a 1 , 1986), água e meio de cultura M1 .

E também certamente possível usar qualquer outro sistema de dois compartimentos adequado à cultura dos embriões.

-61 De 2 em 2 dias ou de 3 em 3 dias os embriões injectados são transferidos para meio de cultu ra fresco (M1 )/ com Ficoll, dependendo da fase do desenvo/ vimento que atingiram se são transferidos para o mesmo volume ou para um volume maior de 4 ul de 10 ul em placas Terasaki (placa de micro-poços; 60 χ 10 ul, Nunc , Roskilde, Denmark ) .

As placas de Petri(sistema de dois compartimentos e placas Terasaki) são então fechadas com Parafilm e incubadas a uma etmperatura entre 25°C e 28°C no escuro ou com um regime de luz (luz fresca, aproximadamente 500 lux) /escuridão de 16/8 horas.

d) Cultura de embriões e regeneração de plantas de milho u;ompl-e-t-a-s .

Após este periodo (de 10 a 30 dias após a injecção) as plântulas de germinadas (comprimento entre 1 cm e 2 cm) que são obtidas a partir de 10% a 60% dos proembriões (ver fases 17 a 24 da Figura 1) e mais de 90% dos embriões injectados (ver fases 26 a 30 da Figura 1) são transferidos para recipientes de cultura maiores (recipientes de cultura de 330 ml, 68 χ 110 mm, Greiner FRG) contendo 30 ml a 50 ul de meio de cultura solido (M2) ou meio MS solidficado com Gelrite e não contendo um aditivo hormonal. As plantas de milho são cultivadas entre 25°C e 28°C e com um regime de luz/escuridão de 16/8 horas (4000 lux, luz branca fria) até se começarem a formar raizes e as plan tuias terem atingido um tamanho de 5 cm a 15 cm. Isto geralmente ocorre após 15 a 20 dias e as plantulas/plantas são então colocadas numa estufa transferidas para o solo e depois cultivadas como plantas de milho normais até à maturação .

-62TABELA 1: Meio de cultura (Ml) para a cultura de embrião zigóticos de milho

Constituintes dc Meio de Cultura Ml	Concentração (mg/ml)
NH<.N0j	1650
KNOj	1900
CaCl2-2 H20	440
MgSOu-2 H20	370
NH2POu	170
FeNa2-EDTA	40
HjBOj	6.2
MnSO.,’4 H20	22.3
ZnSOu-4 H20	8.6
Kl	0.83
Na2MoOu-2 H20	0.25
CuSOi, · 5 H20 BAP1	0.025
1
glutamina	750
meio-inosi toi	100
tiamina-HCl	0.4
sucrose	60000
Ficoll 400®2	200000
agarose	6000

pH 5.6

BAP benzilaminopurina

Ficoll 400® (Pharmacia:polímero sintítico produzido por copolimerizaç ão de sacarosa e epicloroidrina e tendo um peso molecular de 400.000.)

-63TABELA 2: Meio de cultura (M2) para a cultura de embriões z igoticos de mi lho

Constituintes do Meio de cultura M2	Concentração (mg/1)
KHzPOu	300
KNOj	1000
NHuNOj	1000
Ca(NOj)u*4 H2O	500
MgSOu· 7 H2O	72
KC1	65
MnSOu-H2O	5.0
Na2MoOu· 2 H2O	0.25
ZnSOu-H2O	0.17
H3BO3	0.16
Kl	0.08
Na2-EDTA	37.25
XeS0u-7 H2O	27.85
ácido nicotinico	5.0
piridoxina-HCl	5.0
tiamina-HCl	1.0
inositol	100
glicina	2.0
IAA3	0.5
sucrose	20000
agar	8000 500

pH 5.9

IAA ácido indolacético

-64Exemplo 5

Isolamento e injecção de embriões zigoticos de nabo

a) Isolamento e selecção de embriões de nabo

Embriões zigoticos imaturos são isoaldos a partir de Brassica napus L. (genotipo GGC 5cicla gem rapida) e cv. Bronowski, Ag, 903 que são cultivados numa estufa a uma temperatura de 16°C e com um regime de luz/es curidão de 16/8 horas.

Colhem-se vagens de 3 a 6 cm de comprimento entre 5 e 20 dias, de preferencia entre 8 e 15 dias, após a polinização das plantas e de nabo, a sua sufterfiçJ_e_e esterilizada durante 30 minutos com uma solução a 1% de hipoclorito de cálcio e levados tres vezes em água destilada esteril. Entre 5 e 8 vagens são então trans_ feridos em conjunto para uma placa de Petri(10 cm de diâme tro) contendo 4 ml de agua destilada. As placas de Petri são fechadas com Parafilme e guardadas a 4°C à temperatura ambiente (de 25° a 28°C) até serem isoladas embriões zigoticos imaturos. Usando pinças finas e bisturis as vagens são abertas controlando opticamente com uma ampliação de 10 χ a 20 χ ao estereomicroscopio. Das vagens retiram-se 8 a 15 sementes imaturas, transferem-se para 1 ml a 3ml de meio de cultura sem hormonas (R3) em placas de Petri de 6 cm de diâmetro e guardam-se a 4°C ou a 25°C até serem isolados embriões zigoticos. Em seguida, usando duas agulhas de dissecação, as sementes imaturas são abertas e os embriões zigoticos em faese de desenvolvimento e tamanhos variando de fases precoces globulares proembrionarias (ver Figura 2, fase O,P,Q) a fases de cotilédones, precoces

-65ou tardias, de aproximadamente 2000 células (ver Figura 2, fases R,S,T) são isolados controlando com um microscopio. Imediatamente após o isolamento, os embriões são seleccionados de modo analogo ao método descrito na ponto 4a) mas neste caso o meio sem hormonas (R3) é usado em lugar do meio (M1) sem Ficoll referido no ponto 1a).

b) Microninjecção do DNA de pHP23 em embriões de nabo

A inserção de DNA de pHP23 em embriões de nabo por microinjecção é efectuado exactamente do mesmo modo de método descrito no ponto 4b).

As regiões preferidas para a microinjecção estão marcadas com setas na Figura 2.

c ) Microcultura de embriões de nabo microinjectados

A microcultura de embriões de microinjectados é efectuada de modo analogo ao método descrito no ponto 4c) para a cultura de embriões de milho.

Neste caso, no entanto, os poços de plascas de microcultura em policarbonato são cheios de/com vários meios de cultura de acordo com o tamanho e fase de desenvolvimento dos embriões de nabo microninjectados. Embriões globulares jovens e a embriões na fase em forma de coração são transferidos para 0,5 ρ 1 a 1,0 jjI de endosperma liquido, que é isolado por sucção dos conteúdos de sementes de nabo imaturas que estejam numa fase de desenvolvimento semelhante.

-66Os embriões de nabo na fase em forma de coração tardia â fase em forma de torpedo precoce a são microcultivados em 0,5 ρ 1 a 1,0 jj 1 de uma mis tura de endosperma liquido de nabo (conforme obtido atrás) e meio de cultura sintético (R3) (normalmente numa mistura a 1:1).

Os embriões de nabo microinjec tados na fase de torpedo tardia a fase de cotilédone preco ce são microcu1tivados directamente em 0,5 jul a 1,0 ^1 de meio de cultura sintético (R3) .

Os embriões microinjectados são cultivados numa desnidade de 1 a 5 embriões/poço nas placa de microcultura e incubados num sistema de dois compartimen_ tos servindo como câmara húmida (como descrito no ponto 4c4 a 2-5-2^—no escuro ou com Cim regime de luz (luz aproximadamente 500 lux )/escuridão de 16/8 horas.

d) Cultura de embriões de nabo microinjectados e regeneração de plantas completas.

Todos os segundo e quarto dias começando 1 a 4 dias após microinjecção dependendo do tam£ nho e da fase de desenvolvimento dos embriões de nabo micro injectados, os embriões são transferidos por poços de placas de microcultura em policarbonato 0,5^ul e a 2,0 jjl de meio de cultura liquido (R3) ou para 4^1 a 10 jul de meio de cultura (R4) em poços de placas Terasaki.

-ηΑ gama de pequenos volumes (0,5 pl a 2,0 pl) é usada para embriões jovens de nabo que atingiram fases de desenvolvimento entre a fase de/em forma de coração precoce e a fase de torpedo precoce. A gama de volumes grandes ( de 4 pl a 10 pl), por outro lado, é usada para embriões microinjectados numa fase de desenvolvimento entre a fase de torpedo e a fase de cotilédone tardia.

Esta fase de cultura desenrola -se a uma temperatura entre 25° e 28°C e com um regime de luz/escuridão de 16/8 horas (4000 lux, luz branca fria).

A regeneração de plantas completas a partir de embriões de nabo microinjectados e a indução de embriões secundários a partir dos regenerantes primários são efectuadas por transferencia dos embriões de nabo micfoirijêcfãdos para um meio de cultura solido (R5). Norma/ mente transferem-se 5 embriões para 7 ml de meio de cultura (R5) em placas de Petri de 6 cm de diâmetro. As placas de Petri são então fechadas com Parafilm e incubados entre 25° e 28°C com um regime de luz/escuridão de 16/8 horas (4000 lux, luz branca fria) durante 1 a 3 semenas até as plantas serem regeneradas ou até ocorrer indução de uma embriogénese secundaria.

Após regeneração de plantulas verdes (por germinação directa dos embriões primários micro injectados por diferenciação dos embriões secundários induzidos/estes são tranbsferidos para posterior desenvolvimento para recipientes de plástico de 50 ml de contendo 25 ml de meio de cultura (R6) e são cultivados a uma temperatua entre 23°C e 28°C e com um periodo de iluminação de 10 a 16 horas (4000 lux, luz branca fria) até terem atingido um tamanho entre 1 cm e 3 cm.

-68Após a formação de rebentos e raízes, as plântulas de rape são. transferidos para recipientes de cultura de 330 ml contendo entre 30 ml e 50 ml de meio de cultura solido (R6) até terem atingido um tamanho de 5 a 10 cm. Isto ocorre de um modo geral após mais 1 a 3 semanas. As plantas são então colocada numa estufa e ainda cultivadas como plântulas de nabo normais até à natureza da maturação.

-69TABELA : Me i o de cultura (R3;R4) para a cultura de embriões zigoticos do nabo

Constituinte	Concentração	(mg/1) Ru
Ca(NO3)2-4 H20	500	500
kno3	125	125
MgSOu-7 H20	125	125
KH2POu	125	125
HnS0u-4 H20	25	25
h3bo3	10	10
ZnSOk-4 H20	10	10
Na2MoOu-2 H20	0.25	0.2.
CuS0u-5 H20	0.025	o.o;
CoC12-6 H20	0.025	o.o;
Na2-EDTA	37.3	37.3
FeSOu-7 H20	27.8	27.8
glicina	2	2
ácido nicotínico	5	5
pírídoxina-HCl	0.5	0.5
tiamina-HCl	0.5	0.5
ácido fólico	0.5	0.5
biotina	0.05	0.0
inositol	100	100
glutamina	1000	1000
asparagina	1000	-
serina	-	100
sucrose	20000	120000
4 BAP	0.1	0.2
IAA5	0.5	0.3
NAA6	-	0.5

pH 5.8 pH 6.0

BAP: benzilaminopurina

IAA: ácido indol-acético NAA : ácido naftil-l-acético

-70TABELA 4 : Meio de cultura (R5:R6) para a cultura de embri ões zigoticos de nabo

Constituinte	Concentração Rs	(mg/g) r6
kno3	2 500	2 500
CaCl2-2 H2O	150	150
MgSOq«7 H20	250	2 50
(;;h. )so«.	134	1 34
NaH2POu-H2O	150	1 50
Kl	0.75	0.7
H3BO3	3.0	3.0
MnSOt, -H2O	10.0	25
ZnSOu-4 H2O	2.0	2.0
Na2MoOu-2 H2O	0.25	0.2
CuSOu«5 H2O	0.025	0.0
CoC12«6 H2O	0.025	0.0
Na2-EDTA	37.3	37 . 3
FeSOu-7 H2O	27.8	27.8
inositol	100	100
	1.0	-
	1.0	-
	10.0	-
su c rose	30000	100
BAP7	0.05	-
	8000	7000
	-	1000

pH 5.8 pH 5.8

BAP: benzilaminopurina

ί

-71Exemplo 6a:

Isolamento e injecção de prorembriões e embriões zigoticos de trigo com subsequente germinação directa

a) Isolamento e selecção de proembriões e embriões zigoticos de trigo o isolamento de embriões zigotj_ cos é efectuado entre 4 e 12 dias após polinização a partir de sementes imaturas de trigo.

A preparação e selecção dos embrj ões zigoticos são efectuadas exactamente como no método descrito no ponto 4a) para o milho e no ponto 5a) para nabo.___

Após esterilização da superfieie da semente imatura e introdução em ãgua destilada, os embriões zigoticos são isolados com a ajuda de um estereomicroscopio, bisturi finos e pinças finas e depois selec-⁹ cionados para subsequente microinjecção. Os embriões mais adequados para microinjecção são os da fase entre 16 e 500 células.

Os embriões zigoticos isolados e seleccionados são primeiro transferidos para 0,5 mlde meio de cultura W1 (Tabela 5) em pequenas placas de plástico quadradas cada uma tendo 4 poços (multidish 4, Nuncton Delta. SI, Nunc , Denmark). Geralmente são até deixadas um dia a uma temperatura de 4°C no escuro. A densidade de cultura preferida é de 8 a 10 embriões por poço.

λ

V

-72b) Microinjecção de DNA de pHP23 para proembriões e embriões de trigo

A inserção de DNA de pHP23 em embriões de trigo por microinjecção é efectuada exactamente do mesmo modo que o método descrito no ponto 4b). A inje£ ção da solução de DNA é efectuada de preferencia na regiêo do eixo embrionário, uma região de células meristemáticas a partir da qual emergem mais tarde a plumula e a radícula.

c) Microcultura de proembriões e embriões de trigo microinjectados

Após microinjecção, os embriões injectados são ainda cultivados durante mais um dia nas mesmas condições e nas mesmas placas de cultura. Um dia após a injecção, os embriões são cultivados a 25°C sob luz difusa durante mais 3 a 5 dias. Após um periodo de cultura total entre 5 e 7 dias e num meio de cultura liquido os embriões são transferidos para placas Terasaki contendo duas camadas de meios diferentes.

A primeira camada compreende

R yl de meio W2 solidificado com agarose Sear Plaque e a segunda camada é formada por 10 ^il de meio liquido W1 que é colocado sobre o meio solido. E também certamente possível usar para a asolidificaç¹ ao do meio W2 outros meios solidificadores adequados à cultura de embriões vegetais, de preferencia agarose de baixo ponto de agarose LMP. Também neste acso a cultura é efectuada nas mesmas condições ou seja a uma temperatura de 25°C e sob luz difusa .

ι

-73Após um periodo de cultura de a 15 dias, dependendo do seu tamanho os embriões começam a germinar. Após 10 a 14 dias,, os embriões microinjectados são portanto transferidos para 1ml a 5 ml de meio de cultura p

W2 solidificado por agárose Sea Plaque em placas de cultura Multiwell e são ainda cultivados a uma temperatura de 25°C com um regime de luz/escuridão de 16h/8h para diferenciação .

d) Cultura dos embriões e regeneração de plantas do trigo completas

Aproximadamente 4 semanas após microinjecção as plantulas germinadas são transferidas para recipientes de cultura maiores. Estes são recipientes de-cu ltu-w-tendo um volume de 60 ml de que contem 15 ml de meio de cultura W3 e foram mais tarde trocados para frascos de cultura maiores tendo um volume de 330 ml que contem 30 ml a 50 ml de meio W4.

Quando as plantulas atingem um certo tamanho são transferidas para o solo e colocados numa estufa onde são ainda tratadas do mesmo modo que plantulas de trigo norma i s .

TABELA 5a:

Meios de cultura (W1;W2;W3;W4) embriões zigoticos de trigo para a cultura de

	WI [mg/1]	W2 [mg/1]	W3 [mg/1]	W4 [mg/1]
KNO3	1900	1900	1900	1900
NHuNO3	165	165	165	165
CaCl2-2 H20	440	440	440	440
MgSO.,-7 H20	370	370	370	370
KH2POu	170	170	170	170
FeNa2-EDTA	40	40	40	40
MnSO^-4 H20	22.3	22.3	22.3	22.3
H3BO3	6.2	6.2	6.2	6.2
ZnSOu-4 H20	8.6	8.6	8.6	8.6
Kl	0.83	0.83	0.83	0.83
Na2Mo0i,*2 H2O	0.25	0.25	0.25	0.25
CuS0u-5 H20	0.025	0.025	0.025	0.025
cinetina	-	-	1.0	2.0
BAP8	0.5	0. 5	-	-
9 NAA	-	-	0.5	1.0
IAA10	0.1	0.2	-	-
tiamina, HCl	1.0	1.0	0.4	0.4
sucrose	20000	20000	30000	20000
glucose	5000	5000	-	-
mio-inositol	100	100	100	100
glutamina	500	500	7 50	7 50
aqarose Sea Plaque'®		6000	7000	7000

BAP: benzilaminopurina

NAA: ácido naftil-1—acético

IAA: ácido indolacético

Agarose Sea Plaque®: FMC Corporation ,Marine Colloids Div.Rockl .nd

Exemplo 6b: Isolamento e injecção de pro-embrião de trigo com subsequente indução de embrlóides adventício^

a) Isolamento e seleccção de pro-/embriões zigoticos de trigo isolamento de embriões zigoticos imaturos é efectuado entre 4 e 12 dias após polinização a partir de sementes imatura de trigo.

A preparação e selecção dos embri ões zigoticos é efectuada exactamente do mesmo modo que o método descrito no ponto 4a) para o milho ou no ponto 5a) p_à ra o nabo.

Após esterilização da superfície da semente imatura (15 minutos em solução a 1,8% (v/v) de h^ poclorito de sodio seguido de lavagem tres vezes com água destiladas estéril) e introdução em agua destilada os pro-embriões zigoticos são isolados com a ajuda de um bisturi e agulhas de dissecação com controle com um microscopio (ampliacção 10 χ -50 χ). 0 tamanho é a fase de desenvolvimento dos pro-/embriões isolados varia numa gama entre proembriões globulares de aproximadamente 20 células tendo um suspensor e embriões tendo um escutelo e um coleopt ilo.

Imediatamente após serem isolados so pro-/embriões zigoticos seleccionados são transferidos para subsequente microinjecção, para gotas de 50 jjl a 100^1 de meio de cultura WZ1 que foi previamente aplicado sobre placas de vidro medindo 24 χ 40 mm. Estas placas de micro-76injecção estão descritas na secção /4b]C)_7. As placas de microinjecção são mantidas num sistema de dois compartimentos como descrito na secção 4(c) até se fazer a micro injecção.

b) Microinjecção do DNA de pHP23 em pro-embriões zigoticos de trigo

A inserção de DNA de pHP23 em pro-embriões de trigo por microinjecção é efectuada exac tamente como no método descrito no ponto 4b).

c) Microcultura de pro-/embriões de trigo microinjectados

Imediatamente após a injecção os embriões são transferidos usando um microcapilar esticado à mão que esteja ligado a um tubo de silicone ou usnado ponta em bisel de uma agulha, nos poços de uma placa de microcultura em policarbonato (Spangenberg , et a 1 . ,

1986), cada um contendo entre OJ5JJ1 e 1 pl de meio de cultura WZ2. Em adição este meio de cultura solido, WZ é coberta com uma camada de 0,5 jj 1 a 1 1 de endosperma líquido (por sucção do contendo de sementes de trigo imaturas que estão numa fase do desenvolvimento smelhante.).

Como regra, pro-embriões micro injectados são microcultivados individualmente. E também possível, no entanto, transferir até 10 pro-/embriões para um poço de placa de microcultura em policarbonato. As placas de microcultura contendo embriões microinjectadas são colo-

-77cadas num sistema de dois compartimentos (placa de Falcon de cultura de tecidos de orgãos No.3037 Falcon USA) que actua como câmara húmida e geralmente contendo entre 2 ml e 3 ml de uma solução 0,2 M manitol no compartimento externo (Koop e Scweizer, 1985, Spangenberg et a 1 , 1985) e o sistema é fechado com Parafilm e incubado no escuro a uma temper^ tura de 25-28°C.

d) Cultura dos embriões de trigo microinjectados indução de embrioides secundários e regeneração de plantas completas

De 2 em 2 dias ou de 3 em 3 dias começando 2 dias após a injecção dos pro-/embriões de trigo, entre 0,5 ^1 e 2 ^il de meio de cultura WZ 3 são introduzidos nos poços individuais; semeados com pro-embriões injectados das~p 1 aca-&—de microcultura ate os pro-embriões terem atingido um tamanho de aproximadamente 2-5 mm.

Em seguida, e de acordo com a sua fase de desenvolvimento, os embriões injectados são transferidos individualemnte ou em grupos de até 5 embriões para 1 ml de meio de cultura WZ4 em poços de pequenas placas de plástico quadradas (multiplacas de 4 poços, Nunc, Denmark) .

Após uma fase de cultura de 4 a 6 semanas no meio de cultura WZ4, faz-se a indução do calo tendo potencial pãra embriogenese secundaria. Estes calos embrionários são divididos e transferidos para 10 ml de meio

-78\

de cultura em WZ5 em frascos de plástico Sterilin 125 AP (Sterilin Ltd. Feltham, England) para a diferenciação de rebentos .

Posterior desenvolvimento destes rebentos e a formação de raizes decorre após transferencia para repetida e para 30 ml a 80 ml de meio de cultura WZ5 em frascos de cultura maiores (frascos de cultura de 330 ml, 68 χ 110 mm, Greiner FRG). Quando as plântulas diferenciadas atingem um determinado tamanho de (5 cm a 10 cm) e têm de senvolvido um sistema de raizes adequado, elas são transferidas para o solo e colocadas numa estufa onde são ainda tra^ tadas como plantulas de trigo normais.

-79TABELA 5b : Meios de cultura (WZ1;WZ2;WZ3;WZ4) para a cultura de embriões zigoticos de trigo

	WZI [mg/1]	WZ2 [mg/1]	WZ3 [mg/1]	WZ4 [mg/1]
NH^NOj	1650	1650	1650	3300
KNO3	1900	1900	1900	3800
CaCl2-2 H2O	440	440	440	880
MgSOu-7 H2O	370	370	370	740
KH2POi,	170	170	1 70	340
KI	0.83	0.83	0.83	1.66
H3BO3	6.2	6.2	6.2	12.40
MnS0u«4 H2O	22.3	22.3	22.3	44.60
ZnSOt, · 4 H2O	8.6	8.6	8.6	17.20
Na2MoOq-2 H2O	0.25	0.25	0.25	0. 5
CuSOi, · 5 H2O	0.025	0.025	0.025	0. 5
CoCl2*6 H 20	0.025	0.025	0.025	0.5
Na2-EDTA	37.3	37.3	37.3	74.6
-*· · · · ·»·—'
FeS0u-7 H2O	27.8	27.8	27.8	55.6
ácido nicotinico	0.5	0.5	0.5	0.5
piridoxina-HCl	0.5	0.5	0.5	0.5
tiamina-HCl	0.1	0.1	0.1	0.1
glicina	2.0	2.0	2.0	2.0
cefotaxima	-	-	-	0.1
agarose LMP	-	6000	-	6000
sucrose	30000	30000	30000	20000
inositol	200	200	200	200
hidrolisado de	200	200	200	200
caseína
glutamina			—	500
_ , Í 2
2,4-D	1.0	1.0	-	2.0
cinetina	1.0	1.0
ABA	0.5	0.5	—
14
GA 3	0.1	0.1	-	-

ácido 2,4-diclorofenoxiacético ácido abscisico ácido giberélico GA_g

-80TABELA 5c : Meios de cultura WZ5

	wz 5 [mg/1)
KH2POu	300
KNOj	1000
NHuNO3	1000
Ca(NO3)u-4 H2O	500
MgSOu-7 H2O	72
KCl	65
MnSOi. <H2O	5.0
ZnSO ι, · H 2 0	0.17
H3BO3	0.16
Kl	0.08
Na2-EDTA	37.25
FeSO^-7 H2O	27.85
ácido nicotinico	5.0
piridoxina-HCl	5.0
tiamina-HCl	1.0
inos1tol	100
glicina	2.0
IAA15	0.5
suc rose	20000
agar	8000
carvão activado	500
pH 5.9	-

IAA: ácido indolacético

Exemplo 7 :

Isolamento e injecção de embriões zigoticos de arroz

a) Isolamento e selecção de proembriões e embriões zigoticos de arroz.

Os promebriões e embriões zigoticos imaturos são isolados entre 6 e 12diasapós polinização a partir de semente imatura do arroz.

A preparação e selecção dos proembriões e embriões zigoticos é efectuada exactamente do mesmo modo que ao método descrito no exemplo a4a) para o milho ou no Exemplo 5a) para o nabo

Após a esterilização da superfície da semente imatura e introdução em agua destilada, os proembriões ou embriões zigoticos são isolados com a ajudade estereomicroscopio (Zeiss) bisturis finos e pinças finas e depois seleccionadas para subsequente microinjecção. Para a microinjecção são mais adequadas os proembriões ou embriões que estejam entre a fase 20 e a fase 25 (ver Figura 1).

Os proembriões ou embriões zigoticos isolados e seleccionados são primeiro transferidos para 0,5 ml de meio de cultura RS1 (Tabela 6) em pequenas placas de plástico quadrados cada um tendo 4 poços (Mu 1 didish 4, Nuncton Delta SI, Nunc, Denmark). A densidade de cultura adequada é de 4 a 6 proembriões ou embriões por poço.

-82b) Microinjecção de DNA do pHP23 em proembriões ou embriões de arroz

A inserção de DNA de pHP23 em proembriões ou embriões de arroz por microinjecção é efectua da exactamente como descrito no método do Exemplo 4b).

A solução contendo DNA é injectada de prefeerncia nas células embrionárias marcadas com uma seta (ver Figura 1).

c) Microcultura de embriões de arroz microinjectados

Após microinjecção os proembr£ ões ou embriões de injectados são ainda cultivados durante mais um dia_nas mesmas condições e nas mesmas placas de cultura.

Dois dias após a injecção os pro-embriões são cultivados a 25°C e sob luz difusa duranet mais 5 a 7 dias. Após um período de cultura total de 7 a 10 dias em meio de cultura liquido, os embriões são transferidos para placas Terasaki contendo duas camadas de meios diferentes. A primeira camada compreende 5 ul do meio RS2 que está solidificado por uma agarose de baixo ponto de fusão como seja, por exemplo, com agarose SEa Plaque (0,6% v/p) ; a segunda camada é formada por 5 ul de meio liquido RS1 que cobre o meio solido. 0 meio RS2 pode também certamente ser solidificado com outros meios de solidificação que sejam adequados à cultura de embriões vegetais, de preferencia agarose do tipo baixo ponto de fusão (agarose LMP). Neste caso também a cultura é efec-83tuada nas mesmas condições ou seja a uma temperatura de

25°C e sob luz difusa.

Após um periodo de cultura de a 15 dias, dependendo do tamanho dos pro-embriões usados, este pro-embrlão começam a germinar. Após 15 dias, os pro-embriões microinjectados são portanto transferidos para 1 ml a 2 ml de meio de cultura RS2, que é solidificado, por

D exemplo com agarose Sea Plaque em placas de cultura de vários poços e são ainda cultivadas a uma temperatura de 25°C com um regime de luz/escuridão de 16/8 horas para a d i ferenc i ação .

d) Cultura dos embriões e regeneração de plantas completas de arroz

Aproximadamente 4-6 semanas apó microinjecção , as plantulas germinadas são transferidas para frascos de cultura maiores. Estes são frascos de cultura comerciais tendo um volume de 60 ml e contendo 15 ml de meio de cultura RS3 e são mais tarde trocados por frascos de cultura maiores tendo um volume de 330 ml e contendo 30 a 40 ml de meio RS4.

Quando as plantulas atingem um certo tamanho, elas são transferidas para o solo e colocadas numa estufa onde são posteriormente tratadas como plantulas de arroz normais.

-84TABELA 6 : Meios para a cultura de pro-/embriões zigoticos de arroz

	RS1 [mg/1]	RS2 [mg/1]	RS3 [mg/1]	RS4 [mg/1]
kno3	1900	1900	1900	1900
NHuNO3	165	1650	1650	1650
CaCl2’2 H20	440	440	440	440
MgSOq-7 H20	370	370	370	370
KH2PO<.	170	170	170	170
FeNa2-EDTA	40	40	40	40
MnSO^-4 H20	22.3	22.3	2 2.3	22.3
H jBO3	6.2	6.2	6.2	6.2
ZnSOu-4 H20	8.6	8.6	8.6	8.6
Kl	0.83	0.83	0.83	0.83
Na2MoOu-2 H2O	0.25	0.25	0.25	0.25
CuSO.,’5 H2O	0.025	0.025	0.025	0.025
cinetina	—	—	1.0	1.0
Ló . · ·, -
BAP	0.5	0.5		-
17
IAA	0.2	0.2	0.5	0.5
.18
NAA	—	-	0.5	0.5
tiamina, HC1	1.0	0.4	0.4	0.4
sucrose	20000	20000	2 5000	20000
glucose	5000	5000	-	-
mio-inos i tol	100	100	100	100
hidrolisa to de	300	-	—
caseína	500
glutamina	160	160	160
agarose/agar	-	Sea plaque® 0.6 %	agar 0.75 %	agar 0.75

BAP: benzi1aminopurina IAA: ácido indolacético NAA: ácido naftil-l-acético

-85Exemplo 8: Isolamento e injecção de pro-embriões e embriões zigoticos de cevada

a) Isolamento e selecção de proembriões e embriões zigoticos de cevada

Proembriões de/e embriões zigoiticos imaturos são isolados a partir de Hordeum vulgare cv. Igri entre 6 e 14 dias após polinização.

A semente imatura obtida a partir das espigas de cevada é esterilizada superficia 1 mente durante 15 minutos numa solução de 1 ,8%(v/v) de hipoclorito de sodio e depois lavada tres vezes em água destilada estéril^. .. ______

A preparação de selecção de pro -/embriões zigoticos são efectuados exactamente como descri to no método de no ponto 4a) para o milho ou no ponto 5a) para

Após esterilização da superfície da semente imatura e introdução em água destilada os pro-embriões zigoticos são isolados usando em bisturi e pinças finas com controle ao microscopio (ampliacção 10 χ -50χ ) .

tamanho em fase de desenvolvi mento dos proembriões isolados varia numa gama de entre proembriões globulares precoces tendo um supressor e embriões imaturos tendo um escutelo e um coleóptilo.

-86Os embriões zigoticos e isolados e seleccionados são primeiro transferidos para 0,5 ml de meio de cultura G1 em pequenas placas quadradas de plástico cada uma tendo 4 poços (Multidish 4, Nuncton, Delta SI, Nunc, Denmark) numa desnidade preferida de 8 a 10 pro-embriões por poço e aí guardados a 25oC até serem microinjectados .

b) Microinjecçao de DNA de pHP23 em pro-embriões zigoticos de cevada

A inserção de DNA do pHP23 em pro-embrião de cevada por microinjecção é efectuada exactamente como descrito no processo do ponto 4b). A solução de DNA é injectada de preferencia na região de eixo embrionário, uma região de células meristemáticas a partir das. quai,-s—emergem mais tarde a plumula e a radícula. 0 sitio de injecção preferido está indicado mais precisamente por uma seta na Figura 1.

c) Microcultura dos pro-embriões de cevada microinjectada

A microcultura dos pro-embriões de cevada m i croin j ectados é efectuada de modo analogo ao método descrito ao ponto 4c) para a cultura de embriões de milho.

Neste caso, no entanto, os poços de placas de microcultura em policarbonato são cheios com 0,5 pl a 1,0 yul de meio de cultura liquido G1. Os pro-embriões microinjectadps são então transferidos a uma densidade

-87de 1 a 20 pro-embriões por poço para placas de microcultura e os poços são cheios com 0,5 a 1 |jl de meio de cultura G1 .

d ) Cultura pl antas de pro-embriões de cevada e regeneração de comp1etas

Os pro-embriões microinjectados spao transferidos regularmente com intervalos de 3 a 12 dias para meio de cultura fresco G1 e colocados em novas câmaras de microcultura os poços contendo entre 1 yj 1 e 10 fil de meio de cultura G1 dependendo do tamanho e numero de pro/embriões microcultivados. Quando os pro-embriões atingem um tamanho de 2 mm a 5 mm são transferidos para meio G2 numa desnidade de 16 embriões por 10 ml de meio de cultura e pJacade—f^etri . As placas de Petri são fechadas com Parafilm e depois incubadas no escuro durante um periodo de 5 dias a uma temperatura de 25°C. As culturas são mantidas então a uma temperatura de 23oC com um periodo de iluminação de 10 horas/dia (4000 lux, luz dia branca) até ficarem verdes .

Após regeneração de plântulas verdes, elas são transferidas para posterior desenvolvimento para recipientes comerciais de plástico de 60 ml contendo 25 ml de meio G3 e são cultivadas a uma temperatura de 23°C a 26°C com um periodo de iluminação de 10 a 16 horas (4000 lux, luz fria branca) até terem atingido um tamanho entre 1 cm e 3 cm. A formação de raízes é conse guida por transferencia das plântulas regeneradas novamente para meio de cultura G3. Após a formação de vários rebentos e raizes, a cevada de inverno pode ser vernalizada por trans

-88ferencia dos vasos de plantas para recipientes de 240 ml e cultura a 4°C com um periodo de iluminação de 10 a 16 horas a 2000 lux (Phillips, luz branca quente) durante um periodo de 6 a 8 semanas.

-89TABELA 7 : Meios para a cultura de pro-embriões zigoticos de cevada__

Constitu inte	Gl [mg/l]	G2 [mg/1]	G3 [mg/1]
NHuNOj	165	165	165
KNOj	1900	1900	1900
CaCl2*2 H20	440	440	440
HgSOu·7 H20	370	370	370
NH2POu	170	170	170
FeNa 2-EDTA	40	40	40
H3BOj	6.2	6.2	6.2
MnSOu·4 H2O	22.3	22.3	22.3
ZnSOu-4 H2O	8.6	8.6	8.6
Kl	0.83	0.83	0.83
Na2MoOu-2 H2O	0.25	0.25	0.25
CuS0u-5 H2O	0.025	0.025	0.025
BAP19	-	0.4	-
glutamina	750	7 50	750
mioinosi tol	100	100	100
tiamina-HCl	0.4	0.4	0.4
sucrose	20000	20000	20000
agarose Sea Plaque	-	6000	6000
pH	5.6	5.6	5.6

BAP benzilaminopurina

-90Exemplo 9 rlsolamento e injecção de proembriões e embriões zigoticos do algodoeiro

a) Isolamento e selecção de pro-/embrião de algodoeiro

Proembriões e embriões zigoticos jovens são isolados aproximadamente entre 4 e 20 dias após polinização a partir de frutos imaturos de Gossypium h v i sutum medindo entre 1 cm e 2 cm.

A infrutescencia é primeira pré-limpa com agua corrente , facultativamente com a adição de um detergente para limpeza de cozinhas (Lux, Pril , etc.) Após limpeza profunda, a infrutescencia é pulverizada com etanol a 70% e depois lavada com agua destilada. 0 fruto imíturo'é então esterilizado durante 45 minutos com uma solução de 3,6% de hipoclorito de sodio contendo 0,1% de Tween 20 como aditivo. 0 fruto é então adequadamente lavado com água esteril e guardado uma placa de Petri que é mantida húmida (temperatura ambiente). Usando pinças finas e bisturis o fruto é aberto com um estereomicroscopio numa ampliação de 10 χ -20χ. Os sacos embrionários são removidos do fruto e transferidos para aproximadamente 0,5 ml de meio de hormonas (C1) em pequenas caixas de plástico quadrados cada uma tendo 4 poços (Multidish 4, Nuncton Delta SI, Nunc, Denmark). Em seguida, ao mesmo tempo que se observa com um microscopio e usando duas agulhas de dissecação, os proembriões e embriões são isolados a partir dos sacos embrionários em vários tamanhos variando entre fases globulares de 20 células (ver Figura 2, fase O,P.Q) a cotilédone precoce a tardio, faese de aproximadamente 2000 células (ver Figura 2, fases R,S,T). Após isolados os

-91 embriões são seleccionados de modo analogo ao método descrito no Exemplo 4a), neste caso sendo usado melo sem hormo nas (C 1 ) .

b) Microinjecção de DNA de pHP23 em pro-embriões de algodoeiro

A inserção de pHP23 nestes pro-embriões por microinjecção é efectuado exactamente do mesmo modo que descrito no método do Exemplo 4b). 0 sitio de injecção preferido está marcado com uma seta na Figura 2.

c) Microcultura do pro-embrião de algodoeiro microinjectados

A cultura dos pro-embriões de algodoeiro microinjectados é efectuada de modo analogo ao método descrito no Exemplo 4c) para a cultura de embriões de milho. A primeira a fase de microcultura em meio C1 dura aproximadamente 7 dias. Os pro-embriões são entpao cultivados durante 4 a 6 semanas em meio C2 em recipientes de cultura adequados (ver Exemplo 4c) e 4d) . A regeneração subsequente para pequenas plantulas é efectuada em meio C3. Quando estas plantulas atingem um tamanho de aproximadamente 6 a 10 cm, podem ser transferidas para uma estufa onde podem ser ainda cultivadas como plantas de algodoeiro normais até estarem maduras.

-92TABELA 8: Meios para a cultura de embriões zigoticos do algodoeiro

Consti tuinte	Cl [mg/1]	C2 [mg/1]	C3 [mg/1]
NHuNOj	240.12	1650	1650
KNOj	505.56	1900	1900
CaCl2-2 H2O	176.42	440	440
MgSOu'7 H2O	492.96	370	370
kh2po^	27.20	170	170
H3BO3	1.85	6.3	6.3
MnS0„*4 H20	5.07	22.3	22 . 3
ZnSOu-7 H20	2.59	8.6	8.6
Kl	0.25	0.83	0.83
Na2MoOu-2 H2O	0.22	0.25	0.25
CuSOu·5 H2O	0.0075	0.025	0.025
CoC12-6 H20	0.0071	0.025	0.025
Na2FeEDTA	20	40	40
inósirrl-	100	100	100
ácido nicotinico	0.5	1.0	1.0
piridoxina-HCl	0.5	1.0	1.0
tiamina-HCl	10	10	10
glicina	2.0	-	-
HgCl2	750
a .20
ABA	-	0.1
21
GA	—	0.1	0.1
glucose	30000	30000	-
sucrose	-	-	20000
gelrite®	-	-	1600

2j ABA ácido abscisico GA ácido giberélico

Exemplo 10 : Isolamento de/e injecção de proembriões e embriões zigoticos de soja

-93a) Isolamento e selecção dos pro-embriões de soja

Proembriões e embriões zigoticos jovens são isolados a partir de vagens de 10 mm e 50 mm de comprimento (aproximadamente 3 a 20 dias após polinização) de Glycine max cv. Marple Arrow. As plantas são culti_ vadas numa estufa a uma temperatura de 19°C a 21°C com um regime de 1uz/escuridão de 16/8 horas.

Antes de serem isoaldas das vagens são esterilizadas através de um tratamento de 10 minutos com uma solução de 1,5% de hipoclorito de cálcio c onien.d q-D-J % de Tween 20 como aditivo e são então adequada^ mente enxaguadas com ãgua destilada esteril. As vagens assim tratadas são guardadas no escuro a aproximadamente 4°C em placas de Petri? humidificadas até serem sujeitas a outro tratamento. Usando pinças e bisturis finos as vagens são abertas com um estereomicroscopio numa ampliação de 10χ - 20χ., A semente imatura é removida das vagens e transferidas para aproximadamente 1 ml de meio sem hormonas (S3) em placas de Petri de 3 cm de diâmetro. Os sacos embrio narios são removidos da semente imatura e transferido para aproximadamente 1 ml de meio sem hormonas (S3) em placas de Petri de 3 cm de ditòetro. Em seguida, com observação ao microscopio e usando duas agulhas de dissecação, os proembriões e embriões são isolados a partir dos sacos embrionários em vários tamanhos variando entre fases embrionarias globulares precoces (ver Figura 2, fases O,P,Q) a cotilédones precoces a tardios, fases de aproximadamente 2000 células (ver Figura 2, fases R,S,T), Após isolados, os embriões são seleccionados de modo analogo ao método des-

-94crito no Exemplo 4a) neste caso sendo usado o meio sem hormonas (S3) e sem Ficoll.

b) Microinjecção; de DNA do pHP23 em pro-embriões de soja

A inserção de pHP23 nestes proembriões por microinjecção é efectuado exactamente como de/ crito no método do Exemplo 4b).

c) Microcultura de pro-embriões de soja microinjectados

A cultura dos pro-embriões de soja microinjectados é efectuada de modo analogo ao método des'crí'tõ^,'Tro^_ Exemp 1 o 4c) para a cultura dos embriões de milho mas neste caso os poços nas placas de microcultura em policarbonato são cheios com quantidades variaveis de meio de cultura dependendo do tamanho e das fases de desenvolvimento dos pro-embriões microinjectados. Os proemnriões globula res jovens são colocados numa camada de 0,1 ρ 1 a 0,5 pl de meio S1 e cobertos com uma camada de 0,1 pl a 0,5 pl de meio S3. Deste modo, 1-10 embriões são cultivados no poço de uma placa de microcultura. As fases em forma de coração e de cotiledonea tardia são colocadas numa camada de 0,2 |jl a 0,5 pl de meio S1 e cobertas com uma camada de 0,2 μ 1 a 0,5 ^il de meio S3 (ver Exemplo 7c). Estas fases maiores do desnvo1vimento são de preferencia sempre cultivadas indj_ vidualmente. As placas de microcultura são incubadas a 21°C no escuroi ou com uma regime de luz(luz fresca de aproximad/ mente 500 1ux)/escuridão de 16/8 horas num sistema de dois compartimentos actuando como uma camara húmida /“como descrito no Exemplo 4c) / <Μ»'

-95d) Cultura dos pro-embriões microinjectados e regeneração de plantas completas

De 2 em 2 dias ou de 4 em 4 dias começando a partir de 1 a 4 dias após microinjecção e depen_ dendo do tamanho e da fase do desenvolvimento aos embriões microinjectados é dado meio de cultura fresco pela adição de 0,2 pl a 0,5 pl de meio S3. Após aproximadamente 6 a 10 dias, em cada um dos casos dependendo do tamanho dos embriões em cultura, estes embriões são transferidos para 4 yjl a 10 pl de meio de cultura S2 em poços de placas Terasaki. Neste caso também, os pro-embriões cultivados são cobertos com uma camada de 0,2 pl a 1pl de meio de cultura S3 após serem transferidos para os poços (ver Exemplo 7c). Para assegurar humidade suficiente, deposita-se aproximadamente 1a 2 ml de agua esteril na borda dos poços das placas de JerasaJcL 0s embriões são novamente incubados a 25°C com um regime de 1uz/escuridão de 16/8 horas (4000 lux, luz branca fria).

De 3 em 3 dias ou de 4 em 4 dias os embriões em desenvolvimento são humidificados pela adição de 0,2 pl a 1,0 pl de meio S3. Após regeneração de plantulas pequenas, estas são transferidas para meio S3 (com 0,8% de agarose) em placas Costar (poços Costar ;24 poços; 16mm de diâmetro; =/= 3524; Tissue Culture C1 u£ ter, cambridge, Mass). e ainda cultivados nas condições de cultura descritas atrás. Pode ser necessário fazer novamente a indução de raizes através da adição de hormonas ao meio. Isto pode ser conseguido, por exemplo, mantendo as plantulas em meio indutor de raizes (S4) durante 3 a 6 dias. Após a formação de varias plantulas (foliculos e raizes, estas plantulas qão transferidas para frascos de cultura de

330 ml contendo 20 ml a 50 ml de meio S3 que contem 0,8% de agarose. Quando as plantulas atingem um tamanho de apro ximadamente 6 cm a 10 cm podem ser colocadas numa estufa onde podem ainda ser cultivadas do mesmo modo que as plantas de soja normais até ficarem maduras.

TABELA 9: Meios para a cultura de embriões zigoticos de soja

constituinte	SI [mg/l]	S2 (mg/l]	S3 [mg/l]	S4 [mg/l]
NHuNOj	1650	1650	1650	—
KNO3	1900	1900	1900	1900
CaCl2*2 H20	440	440	440	440
MgSOu-2 H2O	370	370	370	370
NH2POu	170	170	170	1 70
PeNa2-EDTA	40	40	40	40
H3BO3	6.2	6.2	6.2	6.2
MnSOu· 4 H2O	22.3	22.3	22. 3	2 2.3
Zn S0 u·H2 0	8.6	8.6	8.6	8.6
KI	0.83	0.83	0.83	0.83
Na2MoOu ·2 H20	0.25	0.25	0.25	0.25
CuSOu · 5 H2O	0.025	0.025	0.025	0.025
inositol	10000	10000	10000	10000
tiamina-HCl	40	40	40	40
sucrose	3000Q	20000	10000	10000
„ 22
BAP	0.6	0.4	-	-
zeatina	0.1	0.05
23
IBA	-	-	-	1
agarose (A Sea Plaque® agar Difco-Bactír	6000	6000
	-	-	7000
pH	5.8	5.8	5.8	5.8

BPA: benzi 1aminopurina IBA: ácido indolebutirico

-98Exemplo 11: Isolamento e Injecção de proembriões e embriões zigoticos de girassol

a) Isolamento e selecção dos pro-embriões de girassóis

Proembriões e embriões zigoticos jovens são isolados a partir de frutos imaturos com 6 mm a 8 mm de comprimento (parede de fruto cinzenta clara e branca) de He 1i anthus annum aproximadamente entre 4 e 20 dias após a polinização. A infrutescencia é primeiro limpa com água da torneira, facultativamente com a adição de um detergente comercial para limpeza de cozinhas (Lux, Pril, etc.). Após lavagem profunda, a infrutescencia é vaporizada com etanol a 70% e depois lavada com agua destilada. 0 fruto imaturo que tem uma parede entre cinzenta e branco é então removido do infrutescencia usando pinças e colhidos em recipientes de plástico de 330 ml. Cada um deles recipientes deverá estar cheio de até aproximadamente 1/4.

fruto imaturo é então esterilizado durante 15 minutos com uma solução a 1,5% de hipoclorito de cálcio contendo 0,1% de Tween 20 como aditivo. 0 fruto é então adequadamente lavado com água esteril e guardado numa placa de Petri que é mantida húmida (4°C).

Usando pinças finas e bisturis o fruto é aberto ao estereomicroscopio com uma ampliacção de 10 χ-20χ. Os sacos embrionários são removidos de fruto e transferidos para aproximadamente 1 ml de meio sem hormonas (H3) em placas de Petri de 3 cm de diâmetro. Em seguida, com observação ao microscopio e usando duas agulhas de dissecação os proembriões e embriões são isolados a partir de sacos embrionários de vários tamanhos variando entre fases proenTbrionários globulares precoces(ver Figura 2, fases

-99O,P,Q) fases de cotilédones, precoces a tardios de aproximadamente 2000 células (ver Figura 2, fases R,S,T). Após isolados os embriões são seleccionados de modo analogo ao método descrito no Exemplo 4a), neste caso é usado o meio sem hormonas (H3) e sem Ficoll.

b) Microίnjecção de DNA de pHP23 em pro-embriões de girassol

A inserção de pHP23 nestes pro-embriões por micronização é efectuada exactamente como descrito no método do Exemplo 4b).

c) Microcultura de embriões de girassol microinjectada

A cultura de embriões de girassol microinjectada é efectuada de modo analogo ao método descrito no Exemplo 4c) para a cultura de embriões de milho mas neste caso os poços da placa de microcultura em policarbonato de cheios com quantidades variaveis de meio de cultura dependendo do tamanho e das fases de desenvolvimento dos embriões microinjectados. Os proembriões globulares jovens são colocados numa camada de 0,1 u1 a 0,5 ^1 de meio H1 e cobertos com uma camada de 0,lpl a 0,5 pl de H3 (ver Exemplo 7c)). Deste modo, 1-10 proembriões podem ser cultivados num ροςο^Λ da placa de microcultura. As fases em forma de coração e de cotilédone tardio são colocadas numa camada de 0,2 μΐ a 0,5 ^Jl de H1 e cobertas com uma camada de 0,2 jul a 0,5 ρ 1 de meio H3. estas fases tardias do desenvolvimento são de preferencia cultivadas individualmente. As placas de microcultura são incubadas a 25°C na escuridão ou com um regime de luz (luz fusca; aproximadamen^ te 500 lux) escuridão de 16/8 horas num sistema de dois com

-100partimentos actuando como camara húmida (conforme descrito no Exemplo 4c ) . ).

d) Cultura de pro-embrião microinjectados e regenerados de plantas completas

Nos segundo e quarto dias começando entre 1 a 4 dias após microinjecção e dependendo de uma fase do desenvolvimento, os embriões microninjectados são alimentadps com meio de cultura fresco pela adição de 0,2 pl a 0,5 pl de meio H3. Após aproximadamente 6-10 dias em cada um dos acsos dependendo do tamanho dos embriões cultivados, estes são transferidos para a 4pl a 10pl de meio de cultura H2 em poços de placas Terasaki. Neste caso também, os embriões cultivados são cobertos com uma camada de 0,2- pl· a—T-pil de emio de cultura H3 após serem transferidos para os poços. Para assegurar humidade suficiente, aproximadamente 1 ml a 2 ml de água estéril são depositados na borda dos poços das placas de Terasaki. Os embriões são novamente incubados a 25°C com um regime de luz/escuridão de 16/8 horas (4000 lux,luz branca fria).

Cada 3-4 dias os embriões em desenvolvimento são humidificados pela adição de 0,2 ju1 a 1 ,0 ml ul de meio H3. Após terem sido regeneradas pequenas plantulas, eles são transferidos para meio H3 (com 0,8% de agarose) em placas Costar e ainda cultivadas nas condições de cultura descritas atrás. Pode ser necessário fazer novamente a indução de raizes através da adição de hormonas ao meio. Isto pode ser conseguido, por exemplo, mantendo as plantulas durante 3-6 dias num meio indutor de raizes (H4). Após desta formação de vários foliculas e raizes, estas plantulas são transferidas para recipientes de cultura de 330 ml contendo 30 ml a 50 ml de meio H3 que contem 0,8% de agarose. Quando as plantulas atingem um tamanho de aproximadamente 6 a 10 cm, elas podem ser colocadas numa estufa onde podem ainda ser cultivadas tal como plantas de girassol normais e atéamadurecerem.

TABELA 10: Meios para a cultura de embriões zigoticos de girassol

consti tilinte	Hl [mg/1]	H2 [mg/1]	H3 [mg/1]	H4 [mg/1]
NHuNOj	1650	1650	16 50	-
KNOj	1900	1900	1900	1900
CaCl2-2 H2O	440	440	440	440
MgSOu'2 H2O	370	370	370	370
nh2po„	170	170	1 70	170
EeNa2-EDTA	40	40	40	40
Η 3BO3	6,2	6,2	6,2	6.2
HnSOu· 4 H2O	22.3	22.3	22. 3	22.3
ZnSOu-4 H2O	8.6	8.6	8.6	8.6
Kl	0.83	0.83	0.83	0.83
Na2MoOu *2 H2O	0.25	0.25	0.25	0.25
CuSOu-5 H2O	0.025	0.025	0.025	0.025
inositol	100	100	100	100
.ácido nicotinico	0.5	0.5	0.5	0.5
piridoxina-HCl	0.5	0.5	0.5	0.5
tiamina-HCl	0.1	0.1	0.1	0.1
bidrolisatode caseii	»a 500	500	500	500
sucrose	30000	20000	10000	10000
„ 24
BAP	0.6	0.4	-	-
25
NAA	-	-	-	0.1
agarose Sea plaque-* ®	6000	6000	-	-
agar Difco-Bactci	—	—	-	7000

BAP: benzilaminopurina NAA: ácido naftil-1-acético

-103Exemplo 12 Isolamento e injecção de proembriões e embriões zigoticos de Arabidopsis

a) Isolamento e selecção dos pro-embriões de Arabidopsis ³

Proembriões e embriões zigoticos jovens são isolados a partir de vagens de 5 mm a 15 mm de comprimento (aproximadamente 3-20 dias afios polinização de Arabidopsis thaliana cv. Columbia. As plantas são cultivadas numa estufa a uma temperatura de 16°C a 18°C com um regime de 1uz/escuridão de 16/8horas. Antes de serem iso ladas, as vagens são esterilizadas atarves de um tratamento de 10 minutos com hipoclorito de cálcio a 1,5% e depois adequadamente lavadas com agua destilada esteril. As vagens são tratadas e guardadas no escuro em placas de Petri hume decidas a aproximadamente 4°C até serem sujeitas a posterios tratamento/ Usando pinças e bisturis finso, as vagens são abertas com o auxilio de um estereomicroscopio numa ampliac; ção de 10χ-20χ. A sementes imatura é removida das vagens e transferida para aproximadamente 1 ml de meio sem hormonas (A3) em placas de Petri de 3 cm de diâmetro. Em seguida, com observação do microscopio e descendo duas agulhas de dissecação, os proembriões e embriões são isolados a partir de sementes imaturas em vários tamanhos variando das fases proembrionarias globulares precoces(ver Figura 2, fases O,P,Q) a fases de cotilédone precoce a tardio, de aproximadamete 2000 células (ver Figura 2, fases R,S,T). Após serem isolados os embriões são seleccionados de modo analogo ao método descrito no Exemplo 4a), neste caso sendo usa_ do meio sem hormona (A3) e sem Ficoll.

b) Microinjecção de DNA do pHP23 em pro-embriões de Arabidops i s

A inserção de pHP23 nestes proembriões por microinjecção é efectuada exactamente do mesmo modo que o método descrito no Exemplo 4b).

c) Microcultura de pro-embrião deArabidopsis microinjectados

A cultura de pro-embriões de Arabidopsis microinjectados é efectuadode modo analogo ao método descrito no Exemplo 4c) para a cultura de embriões de milho mas neste caso os poços das placas de microcultura -«mpo44-e-arbon ato de são cheios com quantidades variáveis de meio de cultura dependendo do tamanho e das fases de desenvolvimento dos embriões microinjectados. Os proembriões globulares jovens são colocados numa camada de 0,1 μ 1 a 0,5 1 de A1 e cobertos com uma camada de 0,1 ^il a 0,5 ^ul de meio A3 (ver Figura 7c). Deste modo, 1-10 proembriões podem ser cultivados niirn poço da placa de microcultura As fases em forma de coração e de cotiledonea tardio são colocadas numa camada de 0,2 yul a 0,5 ^j1 de meio A1 e cobejr tas de meio A1 com uma camada de 0,2 yul a 0,5 pl de meio A3. Estas fases tardias do desenvolvimento são de preferencia cultivadas individualmente . As placas de microcultura são incubadas a 21°C no escuro ou em luz permanente (aproximadamente 500 luxj num sistema de dois compartimentos actuando como uma câmara húmida (conforme descrito no Exemplo 4c ) .

\

-105d) Cultura dos pro-embriões microinjectadps e regeneração de plantas completas

Nos segundos e quarto dias começando entre 1 e 4 dias após microinjecção e dependendo do tamanho e fase do desenvolvimento, os embriões microinjectados são alimentados com meio de cultura fresco pela adição de 0,2 pl a 0,5 pl de meio A3. Após aproximadamente

6-10 dias, em cada um dos casos dependendo do tamanho dos embriões cultivados, estes são transferidos para 4 ul a 10 ul de meio de cultura A2 em poços de placas Terasaki. Neste caso também os embriões cultivados são cobertos com uma camada de 0,2 pl a 1 pl de meio de cultura A3 após serem transferidos para os poços. Para assegurar humidade suficiente, aproximadamente 1 a 2 ml de agua esteril são depositadas nos bordos dos poços das placas de Terasaki. Os embriões são novamente incubados a 21°C com 1 uz_ pe.rn)iD£iite (aproximadamente 500 lux).

Todos os 3-4 dias os embriões em desenvolvimento são humidificados pela adição de 0,2 pl a 10p 1 de meio A3. Nesta fase de cultura desenvolvem-se pequenas plantulas (10-15 dias) que são então transferidas para placas de cultura Costar tendo entre 1 ml e 1,3 ml de meio A3 que contem 0,8% de agarose. Após a formação de vários foliculos e raizes estas plantulas spão transferidas para recipientes de cultura comerciais de 330 ml contendo 30 ml a 50 ml de meio A3 que tem 0,8% de agarose.

Quando as plantulas atingirem úm tamanho de aproximadamente 5 cm a 6 cm podem ser colocados uma estufa onde são ainda cultivadas como plantas de Arabidopsis normais até â maturação.

TABELA 11 : Meios para cultura de embriões de Arabidopsis

constituinte	Al [mg/1]	A2 [mg/1]	A3 [mg/1]
kno3	2500	2500	2 500
CaCl2«2 H20	150	150	150
MgSO<.-7 H2O	250	2 50	2 50
(NH<,)SO<.	134	134	134
NaH2POu-H20	150	150	150
Kl	0.75	0.75	0.75
H3BO3	3.0	3.0	3.0
MnSOu-4 H2O	10.0	10.0	10.0
ZnSOu-4 H2O	2.0	2.0	2.0
Na2MoOu-2 H2O	0.25	0.25	0.25
CuSOu-5 H2O	0.025	0.025	0.025
CoC12>6 H2O	0.025	0.025	0.025
Na2-EDTA	37.3	37.3	37.3
FeSOi. · 7 H2O	27.8	27.8	27.8
inosltól'	100	100	100
ácido nicotinico	1.0	1.0	1.0
piridoxina-HCl	1.0	1.0	1.0
tiamina-HCl	10.0	10.0	10.0
sucrose	30000	20000	4000
„ 2 6
BAP	0.6	0.1	-
agarose	6000	6000
Se a plaque f-7
cinetina	0.05 pH 5.8	0.05 pH 5.8	pH 5.8

BAP: benzilamino purina

-107Exemplo 13: Detecção do gene NPT-II no genoma de plantas tecido em folhas de plantas transformadas e regeneradas é homogeneizadas a 0°C numa solução a 15% de sacarose contendo 50 mmol/1 do acido etilenodiamina Ν,Ν,N¹,N*-tetracetico (EDTA) 0,25 mmol/1 de cloreto de sodio e 50 ml/1 de hidrocloreto de -ν' ,<>/,·<,Tris-(hidroximeti1 )--meti1amina (Tris-HCl) a pH 8,0.

Os núcleos celulares são removidos por centrifugação de homo geneizado durante 5 minutos a 1000g. Os núcleos celulares são ressuspensos numa solução de 15% de sacarose pH8,0 contendo 50 mmol/h de EDTA e 50 mmol/1 de Tris-HCl, adiciona-se dodeci1su1fato de sodio (SDS) até se atingir uma concentração final de 0,2% e a mistura é aquecida durante 10 minutos a 70°C. Após a mistura ter sido arrefecida até 20 a 25°C, adiciona-se o acetato de potássio até.,se 4iin.gir concentração de 0,5 ml /1. Esta mistura é incubada durante 1 hora a 0°C. 0 precipitado resultante é separado por centrifugação (15 minutos a 4°C numa microcentr i fuga ) .

DNA é precipitado a aprtir de sobrenadante entre 20 e 25°C. pela adição de 2,5 vezes o volume de etanol. 0 DNA é dissolvido numa solução de 10 mM Tris HC1 contendo 1,0 pg/ml de ribonuclease A e incubado durante 20 minutos a 37°C; a proteinase K é adicionada até se atingir uma concentração de 250 pg/ml e to tal é incubada durante mais uma hora a 37°C. A proteina K é removida por processos de extracção com fenol e cloroformio/alcool isoamílico. 0 DNA é precipitado a partir da fase aquosa por adição de 0,6 partes por volume de uma solução 0,6M de acetato de sodio em isopropanol e dissolvido em 50 pl de uma solução a pH 7,5 contendo 10 mmol/1 de

-108Tris-HCl e 5 mmol/1 de EDTA. Através desta preparação obtem -se sequências de DNA o maior parte das quais contendo mais de 50 000 pares de bases. A restrição deste DNA com a endonuclease ECORV, hibridação dos fragmentos com fragmentos HindIII , marcados radioactivamente, do gene NPT-II e comparação com o plasmideo PABDI demonstra, numa analise de transferencias Southern, a presença de gene NPT__II no DNA do núcleo celular das células de plantas trasnformadas .

Exemplo 14 : Analise de dot-blot yug de DNA genomici são digerj_ dos durarte a noite com ECORI e depois aplicados na forma de pontos, sem separação electroforética previa, directamente numa membrana de nitrocelulose (ver as instruções de Schleicher and Schill GmbH, Dassel , FRG).

A reacção de hibridação e a subsequente autorradiografia são efectuadas de modo analogo ao método de trnsferencia Southern.

-109Exemplo 15: Analise de transferencia Southern

A análise de transferencia

Southern de DNA vegetal é efectuada de acordo com um método descrito por Paszkowski e Saul, 1983.

Aproximadamente 5 ug de DNA genomico são clivados com as enzimas de restrição ECORV ou HindIII conforma pretendido e os fragmentos resultantes são separados por electroforese num gel convencional de 0,08% a 1% de agarose (Maniatis, T.et al, 1982)

A nick-trans1ation é substitu^ da pelo método de random prirner'¹ descrito por Feinberg e Voge lsterrr,- 1983.

-110Exemplo 16: Pesquisa de actividade da enzima aminoglicosido -fosfotransferase em plantas transformadas_

Pedaços de folha (100 a 200 mg) são homogeneizados em 20 ^il de tampão de extracção num tubo de centrífuga Eppendorf. 0 tampão é uma modificação do tampão usado por Herrera-Estre11 a, L. DeBlock, M.,Messens E. Herna1steeens , J.P. Van Montagu, M. e J. Schell,

EMBOJ 2, 987-995(1983 ) em que albumina do soro bovina é sub_s titulda por sacarose 0,1M. Os extractos são centrigugados durante 5 minutos a 12 000 g e adiciona-se azul de bromofenol à fase de sobrenadante até se obter uma concentração final de 0,004%. As proteínas são separadas a partir de 35 pl de fase do sobrenadante por electroforese num gel de 10% de poliacrilamida não desnaturante. Sobre o gel coloca-se uma camada de gel de agarose contendo como canamicina e ATP marcado com s P, incuba-se e os produtos de reacção fosforilados são transferidos para papel de fosfoce1u1ose Whatman p81. 0 papel é lavado mais vezes com água desioniz£ da de 90°C e depois sujeito a autorradiografia.

Resultados

Foi possível efectuar a regeneração de plantas transgenicas completas a partir de embriões zigoticos microinjectados via embriogenese directa no caso do nabo e também no caso do milho, cevada e arroz dentro de um período de 8 semanas, as taxas de regeneração conseguidas sendo muito altas. No caso das plantas com embriogénese secundaria, os regenerantes secundários foram • Λ

-111usados para determinar a frequência de transformação. 0 método que se segue foi usado para todas as outras plantas: após fertilização, as sementes destas plantas são induzidas a germinar e esta geração de plantas é usada para demonstrar a transformação e expressão do gene. As frequências de transformação são da gama de 5% a 35%.

Foi possível demonstrar a integração estável dos genes microinjectados completos em DNA de alto pseo molecular da geração F1, a qual deriva dos regenerantes primários, usando analise de transferências Southern do DNA genomico das referidas plantas da geração Fl. A expressão dos genes integrados foi demonstrada por meio do ensaio enzimãtico descrito no Exemplo 16 (investigação da actividade da enzima aminog1icosido-fosfotransferase).

Deposição plasmídeo PHP23 usado no âmbito do presente invento foi depositado no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(DSM) em Brunswick, Republica Federal da Alemanha, que é reconhecido como um depositário oficial de acordo com as exigências do Trtado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Deposito de Microorganismos para Fins de Processo de Patente. A declaração relativa à viabilidade das amostras depositadas foi publicada pelo referido Depositário Internacional.

microorganismc	data do depósito	número do depósi to	data do certificado de viabilidade
(Escherichia coli DH1 transformada com o ENA do plasmideo DNA pHP23)	21.12.1987	DSM 4323	21 .12.1987

* Número de depósito, publicado pelo Depósito Internacional atrás indicado

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Claims (49)

1-.- Processo para a inserção de material genético em plantas, caracterizado por numa solução contendo DNA ser microinjectada em pro-embriões ou embriões zigoticos jovens de plantas que têm um elevado potencial de regeneração na forma de embriogénese natural, os pró/embriões microinjectados são microcu1tivados em meio de cultura adequado á promoção dá embriogénese, e, facultativamente as plantas transgénicas não quiméricas serem produzidas a partir dos regenerados resulatntes geralmente qu iméri cos .

2^?.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos seguintes passos es p.ec i fi-e-o-s-:

a) Isolamento de pro-/embriões individuais zigoticos po1ice1u1 ares ou multicelulares, adequados a microinjecção, a partir de sementes imaturas de plantas dadoras;

b) selecção das pro-/embriões zigóticos isolados para a subsequente microinjecção e introdução dos pro-/embriões seleccionados num meio de cultura adequado;

c) Microinjecção de uma solução contendo DNA tendo um ou mais fragmentos de DNA para os pro-/embriões zigóticos isolados em a):

d) Microcultura dos pro-/embr i ões zigoticos m i cro i n j ecta_ dos em meio de cultura adequado â promoção de embriogénese directa;

f) Regeneração dos referidos pro-/embriões zigoticos transformados para completar plantas de um modo geral quimé ricas; e

g) Produção de plantas transgénicas não quiméricas tendo propriedades novas e desejáveis.

3^?.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a cultura dos pró-embriões microinjectados ser efectuada em condições que permitam o desenvolvimento de uma cultura de células morfogénicas ou a formação de embriões secundários.

4*.- Processo de acordo com a refvindícTção 1, caracterizado por a microinjecção ser efe£ tuada usando um sistema de microinjecção compreendendo essencialmente os seguintes componentes:

a) um microscópio para o controlo óptico da operação de injecção ,

b) micromanipuladores comandados por motores ou mecânicamente tendo suportes capilares,

c) capilares de microinjecção tendo um diâmetro externo de 1 ,0 mm a 2,0 mm e um diâmetro de ponta aguçada de menor ou igual a 1 yjm a 10 ^im.

d) capilares de suporte tendo um diâmetro da ponta aguç£ da de 0,02 mm a 1,0 mm.

\

-117-

e) um dispositivo de pressão controlado pneumáticamente para injecção da solução contendo DNA.

5^?.- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por os capilares de microinjecção serem microeléctrodos tendo colocados filamentos de vidro de boro-si1icato.

6³.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a operação de microinjec ção consistir nos passos seguintes:

a) introdução dos pro-embriões ou embriões em gotas de 10 -jj 1 a «2-ΘΌ—jj 1 de meio em lamelas

b) fixação dos embriões em posição usando os capilares de suporte ,

c) injecção da solução contendo DNA nas células individ£ ais de pro-/embrião usando os capilares de microinjecção ,

d) rotação dos pro-/embriões após cada operação de inje£ ção e nova injecção de células individuais

e) cultura dos pro-/embriões injectados em meio de cultu ra adequado.

-118-

7^?.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a solução contendo DNA microinjectada em pró-/embriões de plantas que estão numa fase óptima de desenvolvimento, i.e, que se distinguem porboa microinjectabi1 idade , bom isolamento e boa regeneração.

8-.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pore se usarem embriões que estão entre uma fase pró-embrionária globular inicial e uma fase embrionária inicial.

9^?.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por serem usadas as fases embrionarias iniciais que já posuem, além do escutelo um rebento ‘imaturo e meristema radicular claramente reconhecíveis.

10-.— Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a solução contendo DNA ser microinjectada nos pro-embriões ou embriões vegetais que estão na fase de 2 a aproximadamente 5000 células.

11^â.- Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os embriões vegetais estarem na fase de 4 a 100 células.

-119

12⁵.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a operação de microinjec ção ser efectuada entre 1 e 1000 vezes por embrião ou pro-embr i ão.

13⁵.- Processo de acordo coma reivindicação 12, caracterizado por a microinjecção ser efectuada de 4 a 60 vezes por embrião ou pro-embrião.

14⁵.- Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a solução contendo DNA ser microinjectada no tecido do meristema de raiz imaturo.

15⁵.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o volume de injecção ser a 1 pl a 100 pl por célula injectada.

16³.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a concentração de DNA de solução contendo DNA injectada ser de entre 0,1 ug/ul.

-12017-.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida solução contendo DNA ser uma solução tampão.

18-.- Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o pH da solução tampão estar na gama entre pH 7,0 e pH 8,0.

19-.- Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida solução de injecção contendo DNA ter DNA transformante na

a) forma 1inearizada ,

-b ) f orwa-super-enrolada ,

c) forma de uma mistura de DNA linearizado e super-enro lado.

20³.- Processo de acordo com a reivindicação 1Θ, caracterizado por o referido DNA transformante ser flanqueado por sequências de DNA neutras.

21^?.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a solução contendo DNA destinada a microinjecção conter uma molécula de DNA recombinante que conduz a propriedades uteis e desejáveis na planta transformada.

-12122⁵.- Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a referida molécula de DNA recombinante consistir substancialmente em um ou mais genes estruturais que codificam uma propriedade util e desejável e que são operacionalmente ligados a sinais de expressão activos na célula vegetal garantindo uma expressão na célula vegeta 1 .

23 ⁵ .- Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a referida molécula de DNA recombinante compreender DNA genómico, um cDNA ou DNA sintético ou uma combinação do referido DNA.

·.,_—

24⁵ .- Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o referido gene estrutura 1

a) conferir â planta transformada uma maior resistência ou tolerância contra agentes patogénicos, herbicidas, insecticidas, ou outros biocidas;

b) conferir â planta transformada uma maior resistência ou tolerância contra influências ambientais adversas, seleccionadas do grupo: calor, vento, frio, secura, humidade, condições extremas do solo particulares e stress osmótico;

c) melhorar a formação e qualidade das substancias de reserva e armazenamento nas folhas, sementes, tubérculos, raízes e caules; e

-122d) codificar substâncias farmacêuticamente aceitáveis ou outras substancias fisiológicamente activas

25^a.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a solução contendo DNA compreender um DNA não codificador tendo funções reguladoras .

26^a.- Processo de acordo com as reivindicação 2, caracterizado por os referidos sinais de expressão derivarem de genes de plantas ou de vírus de plantas.

27^a.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os referidos sinais de expressão derivarem de genes do Virus do Mosaico da Couve-Flor (CaMV) ou são homólogos deles.

reivindicação 27, serem 28^a caracter izado .- Processo de acordo com a por os sinais de expressão a) os sinais de seus homólogos; expressão de 35S do genoma de CaMV ou b) os sinais de expressão de 19S do genoma de CaMV ou

seus homólogos;

29³.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a microcultura dos pro-embriões e embriões microinjectados ser efectuada num meio de cultura liquido que estimula a embriogénese directa

30³.- Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por um agente espessante osmóticamente neutro ser adicionado ao referido meio de cultura.

31³.- Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido meio de cultura ser aplicado (liquido) sobre um meio sólido.

32³.- Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o referido agente espe£ sante ser um copolímero de sacarose e de epic1oro-hidrina tendo um peso molecular entre 70 000 e 400 000.

33⁵.- Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o referido meio solido conter um agente solidificante seleccionado do grupo constituído por agar, agarose, alginato, pectinato, gelatina e Gelrite.

-12434^a.- Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por o referido meio de cultura ter a seguinte composição:

a) nos seus compostos, substancias minerais ou elementos essenciais ao crescimento e desenvolvimento da célula vegetal, seleccionados do grupo constituído por azoto, fósforo enxofre, potássio, cálcio, magnésio, e ferro, etc., (macro elementos) e sódio, zinco, cobre, manganês, vanádio, selénio e molibdénio, etc., (microelementos).

b) vitaminas essenciais seleccionadas do grupo constitui do por acido nicotinico, piridoxina, tiamina, inositol, biotina, acido lipóico, riboflavina, Ca-pantotenato, etc.,

c) uma fonte de carbono fácilmente assimilável, seleccio nad-β -dO ••grupo constituído por sacarose, glucose, etc.,

d) vários reguladores de crescimento na forma de fito-hormonas naturais ou sintéticas, seleccionadas da classe das auxinas e citocininas,

e) estabilizadores osmóticos seleccionados do grupo constituído por álcoois de açúcar, iões de açúcar ou iões de sais, etc . ,

35^a.- Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por o referido meio de cultura conter os vários reguladores de crescimento do grupo das auxinas e citocininas numa proporção equilibrada relativamente uns aos outros de modo a assegurar que a embriogénese directa decorra de um modo controlado.

36⁹.- Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por as fito-hormanas do grupo das auxinas e citocininas estarem numa gama de concentrações entre 0,01 mg/1 e 20,0 mg/1, dependendo da fase de desenvolvimento dos embriões.

37^â.- Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por o pH do meio de cultura estar entre 4,5 e 7,5.

38-.- Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por, para a cultura nos embriões se usarem meios nutritivos complexos compostos inteiramente ou pelo menos parcialmente por componentes naturais.

39³.- Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por os referidos componentes serem seleccionados do grupo constituído por extracto de batata, leite de coco ou endosperma líquido, etc.

-12640³.- Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por a densidade de cultura dos pro-/embriões ser entre 1-pro-/embrimo por yjl de meio de cultura e 50 pro-/embriões por ^j1 de meiode cultura dependendo do tamanho da fase de desenvolvimento dos pro-/ embriões.

41^a.- Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por a microcultura dos pro-/embriões ser efectuada pelo menos durante algum tempo num sistema de dois compartimentos.

42^a.- Processo de acordo com a re/vipd i ça^â° 29, caracterizado por os pró-/embriões microinjectados serem transferidos para um meio de cultura fresco ou são cortados e cobertos com uma camada de meio de cultura fresco diãriamente ou com intervalos até 12 dias.

43^a.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por os pro-/embriões , quando estiverem atingido uma fase especifica do desenvolvimento, mas geralmente após 10 a 30 dias, serem transferidos, para diferenciação dos ápices de rebentos e raízes, para meios de cultura solidos que são normaimente usados durante a regeneração de plantas e que podem facultativamente ser cobertos com uma camada de meio líquido.

-12744⁹.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado põr após um período de cultura de 4 a 8 semanas, mas o mais tardar após a germinação dos embriões, os pro-/embriões serem transferidos para meios solidos que não têm ou têm apenas concentrações baixas de hormonas.

45⁹.- Processo de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por as plântulas regeneradas serem colocadas no solo e ainda tratadas do mesmo modo que culturas normais.

46⁹.- Processo para a produção de plantas transgénicas não quiméricas de acordo com a rei_vindi£a.çao 1, caracterizado por:

a) na caso das plantas que são susceptíveis de embriogénese secundária ou formação de raízes adventícias secundárias, as estruturas secundarias, derivadas de células individuais, serem in vitro, separadas das inicialmente formadas, geralmente regeneradas quiméricos, isolados, umas das outras e regeneradas para dar plantas completas ou

b) plantas quiifiericas transgénicas ou facultativamente repetidamente cruzadas com elas próprias.

-12847⁵.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por serem usadas pro-/embriões ou embriões de plantas seleccionadas do grupo constituí_ do pelas famílias So1anaceae , Cruc i ferase , Compositae ,

Li 1i aceae , Vi taceae , Chenopod i aceae , Rutaceae , Al1i aceae Amary11i daceae , Asparagaceae , Orch i daceae, Pa 1mae ,

Brome 1i aceae , Rubi aceae , Theaceae, Musaceae , Grami neae , e da ordem Leguminosae

48⁵.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por serem usados pro-/embriões ou embriões de plantas de família Ma 1vaceae.

—

49⁵ .- Processo de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por serem usados pro-/embrj_ ões ou embriões de plantas seleccionadas do grupo constitu£ do pelos géneros Al1ium , Avena , Hordeum , Oryza , Pani cum Saccharum , Seca 1e , SEtari a, Sorghum , Trit i cum , Zea Musa, Cocos , Phoenix e EIaei s

50⁵.- Processo para a produção de plantas transgénicas , caracterizado por se utilizar o processo de acordo com a reivindicação 1.

-12951^a.- Progénies sexuadas e assexuadas de plantas transgénicas , caracteerizadas por serem produzidas de acordo com um processo de acordo com a reivindicação 1 .

52^a.- Material de propagação de plantas transgénicas de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por compreender sementes transgénicas de plantas e sua progénie.

53^a.- Material de propagação de plantas transgenicas de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por ser seleccionado do grupo constituído por protop1astos , células, clones de células, aglomerados de células, culturas de calos e/ou culturas de tecidos, sementes, pólen, óvulos, zigotos, embriões ou outro material de propagação derivado de células germinais e a sua progénie.

54^a.- Produtos de hibridação e fusão de plantas transgenicas de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por ainda possuírem as novas propriedades resultantes de transformação.

55^a.- Variantes e mutantes de progénies sexuadas e assexuadas de plantas transgénicas de acordo com a reivindicação 51, caracterizada por ainda po£ suirem as propriedades características, resultantes da

-130transformação, do material de partida vegetal que foi usado para a produção dos referidos mutantes e variantes.

56³.- Partes de plantas, tais como, por exemplo, flores, caules, frutos, folhas e raízes, caracterizadas por derivarem de plantas transgénicas de acordo com a reivindicação 51 ou da sua progénie e que são constituídas pelo menos parcialmente por células transgénicas.

57^?.- Processo para a produção de uma planta transgénica, caracterizado por a referida planta poder ser regenerada a partir de pro-/embriões zigoticos transformados ou a partir de embriões transformados .