PT1235921E - Regeneração e transformação de beterraba sacarina - Google Patents

Description

ΡΕ1235921 1 DESCRIÇÃO "REGENERAÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE BETERRABA SACARINA"

CAMPO DO INVENTO O invento refere-se à preparação de plantas de beterraba sacarina geneticamente transformadas. Em particular são descritos métodos e materiais para a transformação de plantas de beterraba sacarina por meio de transferência génica mediada por Agrobacterium tumefaciens.

ANTECEDENTES DO INVENTO A sacarose, vulgarmente conhecida como açúcar, contribui para aproximadamente 11% da ingestão calórica humana em todo o mundo. A beterraba sacarina (Beta vulgaris) é uma das duas principais fontes agrícolas de açúcar comestível. Aproximadamente 40% do fornecimento mundial de açúcar é derivado de beterrabas sacarinas, com a cana do açúcar como principal fonte agrícola adicional de açúcar, a contribuir para quase 60%. Os países da Europa e da Ex-União Soviética produzem quase todo seu açúcar a partir de plantas de beterraba sacarina. Nos Estados Unidos, aproximadamente 30% do açúcar consumido é derivado de beterraba sacarina. 2 ΡΕ1235921

As plantas de beterraba sacarina são susceptíveis a uma variedade de patogénios e pestes. Os danos virais, fúngicos, bacterianos e por insectos podem reduzir grandemente o rendimento e a qualidade do açúcar colhido. 0 aumento da resistência a estes factores através de métodos clássicos de melhoramento por cruzamento tem sido lento. A transformação de plantas de beterraba sacarina através de técnicas modernas de biologia molecular é atractiva, contudo até há pouco tempo as beterrabas sacarinas mostraram ser altamente recalcitrantes à transformação.

Lindsey e Jones (Plant Cell Rep. 8: 71-74, 1989) descrevem a transformação de protoplastos de beterraba sacarina através de electroporação.

Catlin (Plant Cell Rep. 9: 285-288, 1990) relata o efeito de antibióticos na inibição da indução de callus e da regeneração de plantas a partir de cotilédones de beterraba sacarina. Verificou-se que a formação de callus era dependente do genótipo. Verificou-se que os antibióticos inibem a formação de rebentos. Catlin propõe que a regeneração através de explantes de cotilédones combinada com protocolos de selecção de antibióticos deve ser útil na selecção de callus de beterraba sacarina transformados.

Jacq et al. (Plant Cell Rep. 12: 621-624, 1993) relatam os efeitos do genótipo, da acetosseringona, da pré-cultura e da duração da co-cultura na transformação de 3 ΡΕ1235921 beterraba sacarina mediada por Agrobacterium. Explantes de hipocótilos e de cotilédones foram excisados de plântulas e co-cultivados com Agrobacteria. Os transformantes foram quantificados através de ensaios de GUS histoquimicos e fluorométricos. Não foram demonstradas plantas transformadas .

Hall et al. (WO 95/10178) descrevem um método de transformação de protoplastos de beterraba sacarina através de um procedimento de polietilenoglicol, seguido de selecção e regeneração. As frequências de transformação foram entre 2,5xlCT5 e 6,lxlCT4.

Lindsey e Gallois (J. Exp. Botany 41: 529-536, 1990) descrevem a transformação de beterraba sacarina com Agrobacterium tumefaciens contendo um vector binário. Fatias de tecido da base dos rebentos foram inoculadas por imersão numa suspensão bacteriana liquida, induzidas com 6-aminobenzilpurina para produzir rebentos, e seleccionadas por resistência a antibióticos. Os rebentos foram transferidos para meio de indução de raízes contendo ácido 1-naftalenoacético e canamicina. Obteve-se pouco ou nenhum sucesso na regeneração de rebentos a partir de tecidos foliares.

Hall et al. (Nature Biotechnol. 14: 1133-1138, 1996) descrevem um método de criação de plantas de beterraba sacarina transgénicas a partir de protoplastos de células guarda dos estornas. Foi efectuada uma transformação 4 ΡΕ1235921 de ADN por polietilenoglicol em protoplastos derivados de células guarda dos estornas. A selecção dos transformantes foi conseguida através de resistência a bialaphos. As eficiências de transformação estável para os protoplastos foram de entre 1,2 e 5,2χ10“4. Os protoplastos foram regenerados em calli e plantas.

Hayakawa et al. (Proc. Jap. Sugar Beet Technol. 36: 130-135, 1994) descrevem um método para transformação de beterrabas sacarinas mediado por Agrobacterium. As sementes foram germinadas e os cotilédones removidos. Os cotilédones foram criados até aparecerem folhas. Pedaços foliares foram cortados e transferidos para meio para permitir a formação de rebentos. Os rebentos foram utilizados para formar explantes, que foram subsequentemente transformados com Agrobacterium. Os explantes transformados foram deixados a formar rebentos e subsequentemente enraizados em meios apropriados.

Fry et al. (Póster, Gordon Research Conference on Plant Cell and Tissue Culture, 11-16 de Junho de 1989) descreveram a transformação e regeneração de explantes de cotilédones de beterraba sacarina inoculados com Agrobacterium tumefaciens ancorando sequências de ácido nucleico exógenas.

Apesar do número de métodos disponíveis para a transformação de beterraba sacarina, existe a necessidade de um método de transformação que seja mais eficiente, 5 ΡΕ1235921 proporcione uma fonte constante de material vegetal para experiências subsequentes e proporcione uma alternativa aos métodos existentes. 0 presente invento utiliza explantes foliares num método de transformação mediada por Agrobacterium que permite que o material vegetal restante seja propagado in vitro para futuras experiências de transformação. 0 presente invento proporciona métodos melhorados para produção de plantas transgénicas de beterraba sacarina para lhes dar qualidades desejáveis através de engenharia genética.

SUMÁRIO DO INVENTO

Num esforço para desenvolver métodos para a transformação eficiente de plantas de beterraba sacarina, descobriu-se que vários passos eram extremamente benéficos para melhores resultados e simplicidade experimental.

Num aspecto do presente invento, verificou-se que os explantes foliares eram benéficos para a subsequente transformação e tais explantes eram facilmente preparados a partir das folhas de rebentos micropropagados. As culturas micropropagadas permitem que um cientista mantenha uma cultura continua, reduzindo significativamente o tempo envolvido na preparação de plantas transgénicas de beterraba sacarina. Sendo as culturas micropropagadas facilmente mantidas, um cientista não tem que germinar sementes de cada vez que começa um procedimento de transformação. A micropropagação é adicionalmente benéfica 6 ΡΕ1235921 na redução ou eliminação da ocorrência de tecidos quiméricos indesejados.

As caracteristicas e os detalhes do invento serão apreciados mais inteiramente à luz da seguinte descrição detalhada do invento.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As seguintes figuras fazem parte do presente fascículo e são incluídas para demonstrar ainda certos aspectos do presente invento. 0 invento pode ser melhor compreendido por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada das formas de realização especificas aqui apresentadas.

Figura Descrição 1 Mapa do plasmídeo pMONl7303 2 Mapa do plasmideo pMON13819 3 Mapa do plasmídeo pMONl3835 4 Mapa do plasmídeo pMONl3851 5 Vista superior de uma cultura de beterraba sacarina micropropagada 6 Vista lateral de uma cultura de beterraba sacarina micropropagada

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento divulga um método para a transformação eficiente de plantas de beterraba sacarina 7 ΡΕ1235921 utilizando bactérias Agrohacterium tumefaciens como agente de distribuição de uma sequência de ácido nucleico exógena. A sequência de ácido nucleico exógena está de preferência na forma de um vector de transformação de plantas. Qualquer vector adequado para a transformação de plantas pode ser utilizado no presente invento. Um plasmideo ou vector de transformação de plantas adequado contêm tipicamente um marcador seleccionável ou pesquisável e elementos reguladores associados tal como descrito, juntamente com um ou mais ácidos nucleicos capazes de serem expressos numa planta de um modo suficiente para conferir à planta uma determinada característica ou fenótipo desejável. Exemplos de genes de interesse estruturais adequados considerados pelo presente invento incluiriam mas não se limitam a genes para tolerância a insectos ou pestes (bacterianas, fúngicas, nematocidas); tolerância a herbicidas; genes para melhorias de qualidade tais como rendimento, aumentos nutritivos, tolerâncias ambientais ou ao stress; ou quaisquer mudanças desejáveis na fisiologia das plantas, crescimento, desenvolvimento, morfologia ou produto(s) das plantas.

Alternativamente, as sequências de codificação de ADN podem afectar estes fenótipos codificando uma molécula de ARN que não seja traduzivel que cause a inibição alvo da expressão de um gene endógeno, por exemplo através de mecanismos mediados por anti-sentido ou co-supressão (ver, por exemplo, Bird et al., Biotech. Gen. Engin. Rev. 9: 207, 8 ΡΕ1235921 1991). 0 ARN podia também ser uma molécula de ARN catalítica (i.e., uma ribozima) modificada para clivar um produto de ARNm endógeno desejado (ver por exemplo, Gibson e Shillitoe, Mol. Biotech. 7: 125, 1997). Assim, qualquer gene que produza uma proteína ou um ARNm que expresse uma mudança de interesse de fenótipo ou morfologia é útil para a prática do presente invento. Ácidos nucleicos exemplares que podem ser introduzidos através dos métodos englobados pelo presente invento incluem, por exemplo, sequências de ADN ou genes de outras espécies, ou genes ou sequências que têm origem ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporados em células receptoras através de métodos de engenharia genética em vez de técnicas clássicas de reprodução ou melhoramento. No entanto, o termo exógeno pretende também referir-se a genes que não estão normalmente presentes na célula a transformar; ou talvez simplesmente não estão presentes na forma, estrutura, etc., verificada no segmento de ADN ou gene transformante; ou genes que estão normalmente presentes mas que contudo se deseja, por exemplo, ter sobre-expressos. Assim, o termo gene ou ADN "exógeno" pretende referir-se a qualquer gene ou segmento de ADN que seja introduzido numa célula receptora, independentemente de se um gene semelhante possa estar já presente em tal célula. 0 tipo de ADN incluído no ADN exógeno pode incluir ADN que está já presente na célula vegetal, ADN de outra planta, ADN de um organismo 9 ΡΕ1235921 diferente, ou um ADN gerado externamente, tal como uma sequência de ADN contendo uma mensagem anti-sentido de um gene ou uma sequência de ADN codificando uma versão sintética ou modificada de um gene.

Os vectores de transformação de plantas contêm geralmente uma ou mais sequências de ácido nucleico de codificação de interesse sob o controlo de transcrição de sequências reguladoras 5' e 3'. Tais vectores compreendem geralmente, operativamente ligada em sequência no sentido 5' para 3', uma sequência promotora que dirige a transcrição de uma sequência de ácido nucleico estrutural a jusante numa planta; opcionalmente, uma sequência líder a 5' não traduzida; uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse; e uma região não traduzida a 3' que codifica um sinal de poliadenilação que funcione em células vegetais para causar a terminação da transcrição e a adição de nucleótidos poliadenilados à extremidade 3' do ARNm codificando a proteína. 0 promotor pode ser homólogo ou heterólogo à sequência de ácido nucleico estrutural. As sequências reguladoras 5' para 3' típicas incluem um local de início da transcrição, um local de ligação ao ribossoma, um sinal de processamento do ARN, um local de terminação da transcrição e/ou um sinal de poliadenilação. Os vectores de transformação de plantas contêm também geralmente um marcador seleccionável ou pesquisável. A expressão da sequência do marcador seleccionável ou pesquisável resulta num fenótipo que 10 ΡΕ1235921 permite a diferenciação de tecidos de beterraba sacarina transgénicos e não transgénicos.

Qualquer marcador seleccionável adequado para transformação de plantas pode ser utilizado no presente invento. Exemplos de marcadores seleccionáveis relatados como sendo funcionais em plantas incluem EPSPS (Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210(3): 437, 1987), neomicina-fosfotransferase (Loopstra et al., Plant Mol. Biol. 15(1): 1, 1990), higromicina-fosfotransferase (Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16(5): 807, 1991), resistência a metotrexato (Irdani et al., Plant Mol. Biol. 37(6): 1079, 1998), fosfinotricina-acetil-transferase (Shen et al., J. Gen. Virol. 76: 965, 1995) e resistência a clorsulfurona (Lee et al., Plant Cell 2(5): 415, 1990). Marcadores pesquisáveis relatados como sendo funcionais em plantas incluem GFP (Niwa et al., Plant J. 18(4): 455, 1999), GUS (Suzuki et al., Plant Cell Physiol. 40(3): 289, 1999), CAT (Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14(1): 41, 1990) e luciferase (Macknight et al., Plant Mol. Biol. 27(3): 457, 1995). Nalguns casos, a sequência de codificação do ácido nucleico estrutural pode também funcionar como a sequência do marcador seleccionável ou pesquisável. À luz desta divulgação, vários outros genes de marcadores seleccionáveis ou pesquisáveis, elementos reguladores e outras sequências de interesse possíveis serão aparentes aos peritos na técnica. Consequentemente, 11 ΡΕ1235921 pretende-se que a discussão antecedente seja exemplar em vez de exaustiva.

Em particular, o invento dirige-se a um método para a preparação de plantas transgénicas de beterraba sacarina, compreendendo o método: selecção de uma plântula de beterraba sacarina, compreendendo a plântula uma região do cotilédone e uma região do hipocótilo; remoção da região do cotilédone e da metade superior da região do hipocótilo da plântula; colocação da região do cotilédone e da metade superior da região do hipocótilo em contacto com meios de micropropagação para formar um rebento micropropagado, compreendendo o rebento micropropagado pelo menos uma folha ou uma porção desta incluindo uma base da folha em que a referida base da folha compreende a posição inferior da folha onde a folha se une ao rebento micropropagado; remoção de uma folha do rebento micropropagado através da separação da folha na base da folha; e colocação do explante foliar na área da base da folha em contacto com Agrobacteria. A folha pode ser separada na base da folha antes da inoculação com Agrobacterium através de qualquer um de vários métodos, mas de preferência a folha é cortada na base da folha utilizando um instrumento adequado tal como um bisturi e a área de corte da folha é colocada em contacto com a cultura de Agrobacterium. 0 explante é co-cultivado com Agrobacteria, em que a Agrobacteria compreende um vector, compreendendo o vector, operativamente ligado na orientação 5' para 3' : um promotor que dirige a transcrição de uma sequência de ácido nucleico 12 ΡΕ1235921 estrutural; uma sequência de ácido nucleico estrutural; e um terminador da transcrição a 3', e após a incubação com Agrobacterium, o explante foliar infectado compreende uma célula transgénica de beterraba sacarina. 0 explante foliar compreende a base da folha aqui definida como a porção inferior da folha onde a folha contacta com a região de base do explante (ver as Figuras 5 e 6 para ilustrações da cultura de beterraba sacarina micropropagada). Qualquer folha compreendendo uma base de folha pode ser utilizada no presente invento. A folha inteira ou qualquer porção desta compreendendo a base da folha pode ser utilizada. De preferência, a folha é excisada na base da folha e a folha intacta compreendendo a base da folha é utilizada para o processo de transformação. A base da folha compreende a porção inferior das folhas onde as folhas se unem ao rebento micropropagado. 0 explante foliar inclui assim qualquer folha ou porção de uma folha que inclua a base da folha. Concordantemente, o explante foliar pode incluir mas não se limita aos 10% inferiores da folha, aos 25%, 50% inferiores, ou à folha toda ou porções desta, todos compreendendo uma base da folha. A cultura de beterraba sacarina micropropagada compreende múltiplas camadas de folhas que são unidas na base da folha. Concordantemente, pode ser utilizada uma folha de qualquer camada incluindo qualquer folha interior ou exterior compreendendo uma base de folha (ver Figuras 5 e 6). De preferência, são seleccionadas as folhas mais exteriores para que a camada de folhas mais interior seja 13 ΡΕ1235921 deixada intacta. As restantes folhas podem ser micropropagadas ou armazenadas e criadas in vitro. As restantes folhas e as folhas recentemente emersas podem mais tarde ser utilizadas como uma fonte de explantes para experiências futuras.

As Agrobactería podem ser geralmente quaisquer Agrobocteria e são de preferência Agrobacterium tumefaciens. As estirpes preferidas incluiriam mas não se limitam à estirpe de Agrobacterium tumefaciens C58, uma estirpe de tipo nopalina que é utilizada para mediar a transferência de ADN para uma célula vegetal, estirpes de tipo octopina tais como LBA4404 ou estirpes de tipo succinamopina, p. ex., EHA101 ou EHA105. A utilização destas estirpes para transformação de plantas foi relatada e os métodos são familiares aos peritos na técnica. A sequência de ácido nucleico estrutural pode ser qualquer sequência que possa ser transcrita e que confira uma propriedade desejável à planta. De preferência, a sequência de ácido nucleico estrutural codifica uma proteína ou uma sequência de ARN anti-sentido.

Uma forma de realização alternativa é dirigida a métodos para a preparação de plantas transgénicas de beterraba sacarina a partir de uma cultura de micropropagação. Uma cultura de micropropagação é criada até formar um rebento micropropagado, compreendendo o rebento micropropagado pelo menos um explante foliar incluindo uma base de folha; remoção de uma folha na base 14 ΡΕ1235921 da folha do rebento micropropagado; e colocação do explante foliar na área da base da folha em contacto com Agrobacteria em que: as Agrobacteria compreendem um vector, compreendendo o vector, operativamente ligado na orientação 5' para 3': um promotor que dirige a transcrição de uma sequência de ácido nucleico estrutural; uma sequência de ácido nucleico estrutural; e um terminador da transcrição a 3'. Após a incubação com Agrobacterium, o explante foliar infectado compreende uma célula transgénica de beterraba sacarina. As Agrobacteria podem ser geralmente quaisquer Agrobacteria, e de preferência são Agrobacterium tume-fadens. A sequência de ácido nucleico estrutural pode ser qualquer sequência que possa ser transcrita e que confira uma propriedade desejável à planta. De preferência, a sequência de ácido nucleico estrutural codifica uma proteína ou uma sequência de ARN anti-sentido.

Tal como exposto acima, o invento proporciona um método para a preparação de plantas transgénicas de beterraba sacarina. 0 método compreende de preferência: selecção de uma plântula de beterraba sacarina, compreendendo a plântula uma região do cotilédone e uma região do hipocótilo; remoção da região do cotilédone e da metade superior da região do hipocótilo da plântula; colocação da região do cotilédone e da metade superior da região do hipocótilo em contacto com meios de micropro-pagação para formar um rebento micropropagado, compreendendo o rebento micropropagado pelo menos uma folha compreendendo uma base da folha; remoção de uma folha do rebento 15 ΡΕ1235921 micropropagado pela base da folha; colocação da folha em contacto com Agrobacteria na área da base da folha para formar uma folha infectada em que: as Agrobacteria compreendem um vector, compreendendo o vector, operativamente ligado na orientação 5' para 3': um promotor que dirige a transcrição de uma sequência de ácido nucleico estrutural, uma sequência de ácido nucleico estrutural e um terminador da transcrição a 3'; cultura do explante foliar infectado para formar um rebento transgénico; cultura do rebento transgénico para formar um rebento transgénico enraizado; e criação do rebento transgénico enraizado para formar a uma planta transgénica de beterraba sacarina. As Agrobacteria podem geralmente ser quaisquer Agrobacteria e são de preferência Agrobacterium tumefaciens. A sequência de ácido nucleico estrutural pode ser qualquer sequência que possa ser transcrita e que confira uma propriedade desejável à planta. De preferência, a sequência de ácido nucleico estrutural codifica uma proteína ou uma sequência de ARN anti-sentido. A semente de beterraba sacarina pode ser esterilizada através de qualquer método aceitável e de preferência através da colocação da semente de beterraba sacarina em contacto com hidróxido de sódio, hipoclorito de sódio, etanol ou captano. A semente da beterraba sacarina é de preferência germinada no escuro ou sob condições de luz pouco intensa. Os meios de micropropagação podem ser geralmente quaisquer meios de micropropagação aceites na técnica. Exemplos de meios adequados incluiriam mas não se limitam a meios baseados em MS (Murashige e Skoog, Physiol. Plant. 15: 473, 1962) ou meios baseados em N6 (Chu et al., 16 ΡΕ1235921

Scientia Sinica 18: 659, 1975) suplementados com aditivos de meios que podem incluir mas não se limitam a amino-ácidos, macro-elementos, ferro, micro-elementos, vitaminas e compostos orgânicos, hidratos de carbono, componentes indefinidos de meios tais como hidrolisados de caseína, um agente gelificante apropriado tal como uma forma de agar, tal como uma agarose de baixo ponto de fusão ou Gelrite, se desejado. Os peritos na técnica estão familiarizados com a variedade de meios de cultura de tecidos, que quando suplementados apropriadamente, suportam o crescimento e o desenvolvimento de tecidos vegetais e são adequados para a transformação e regeneração de plantas. Estes meios de cultura de tecidos podem ser comprados como preparação comercial ou preparados à medida e modificados. Os meios seleccionados podem ser suplementados com os aditivos apropriados dependendo do estádio no processo de transformação. Por exemplo, para micropropagação pode ser utilizado um meio aqui referido como meio de micropropagação que suporte o crescimento e a manutenção de tecido vegetal in vitro. Concordantemente, noutros estádios do processo de transformação incluindo mas não se limitando à germinação, indução de rebentos e indução de raiz, são utilizados meios suplementados com os aditivos apropriados e podem incluir mas não se limitam a meios tais como Linsmaier e Skoog (Linsmaier e Skoog, Physiol. Plant. 18: 100, 1965), Uchimiya e Murashige (Uchimiya e Murashige, Plant Physiol. 54: 936, 1974), meios de Gamborg (Gamborg et al.r Exp. Cell Res. 50: 151, 1968), Meios de Plantas Lenhosas de McCown (McCown e Loyd, Hort. Science 16: 453, 17 ΡΕ1235921 1981), Nitsch e Nitsch (Nitsch e Nitsch, Science 163: 85-87, 1969) e Schenk e Hildebrandt (Schenk e Hildebrandt, Can J. Bot . 50: 199, 1972) ou derivações destes meios suplementados concordantemente. Os peritos na técnica estão cientes que os meios e os suplementos de meios tais como nutrientes e reguladores do crescimento para utilização em vários estádios da manutenção de plantas, e estádios de transformação e regeneração para além de outras condições de cultura tais como a intensidade luminosa durante a incubação, o pH, e as temperaturas de incubação podem ser optimizados para uma determinada variedade de planta. O seguinte protocolo experimental é ilustrativo do invento. Um perito na técnica apreciará que podem ser feitas várias modificações nos materiais, meios, na duração dos processos, na temperatura e nas condições de luminosidade .

Esterilização das sementes

As sementes podem ser esterilizadas utilizando qualquer método aceitável. Verificou-se que o seguinte método era eficaz.

As sementes de beterraba sacarina são adicionadas a uma solução contendo aproximadamente 1 N de hidróxido de sódio e agitadas durante cerca de uma hora à temperatura ambiente. O liquido é decantado e as sementes são enxaguadas com água destilada para remover o hidróxido de 18 ΡΕ1235921 sódio residual. É adicionada água fria e as sementes são agitadas durante cerca de uma hora. As sementes são removidas do liquido e uma pequena porção do revestimento da semente de cada embrião é removida para expor uma parte do embrião da semente. As sementes são enxaguadas momentaneamente com etanol a 95%. A solução de etanol é decantada e as sementes são agitadas numa solução diluída de hipoclorito de sódio a 2,5% p/v durante cerca de vinte minutos. 0 líquido é removido e as sementes são enxaguadas em água destilada estéril três vezes. É adicionado Captano (um pó que se pode humedecer utilizado como solução aquosa para o controlo de certas doenças fúngicas, Micro Fio Co., Lakeland, FL) e um pouco de água estéril suficiente para cobrir as sementes. As sementes são embebidas durante pelo menos uma hora. 0 embebimento pode ser continuado de um dia para o outro se desejado.

Germinação das sementes

As sementes podem ser germinadas utilizando qualquer método aceitável. Verificou-se que o seguinte método era eficaz. Outras formulações de meios incluindo mas não se limitando às descritas anteriormente podem ser adequadas para promover a germinação em vez das formulações descritas abaixo.

As sementes são transferidas da suspensão de captano para placas contendo meio MSMO (Tabela 1) . São colocadas aproximadamente 15 sementes em cada placa de 19 ΡΕ1235921 germinação de 100x25 mm. As placas são colocadas em sacos, de preferência sacos de plástico sem furos. De preferência as sementes são germinadas no escuro e os sacos são colocados no escuro a aproximadamente 20°C-25°C, de preferência a aproximadamente 23°C-24°C. A incubação no escuro pode ser feita de qualquer modo incluindo mas não se limitando à colocação dos sacos numa caixa de cartão selada. A duração óptima do armazenamento no escuro varia por genótipo de beterraba sacarina, mas tipicamente variará entre duas e quatro semanas. O revestimento da semente é cuidadosamente removido das plântulas germinadas e as plântulas são subsequentemente transferidas para recipientes com meio MSMO. As plântulas são incubadas a aproximadamente 23°C-24°C durante cerca de 1-5 dias, de preferência cerca de 2 dias. O fotoperiodo durante a incubação é mantido a um ciclo de luz:escuro de aproximadamente 16:8.

Tabela 1: Meio MSMO

Componente Concentração Sais de MSMO (Sigma M-6899) 4,4 g/1 Sacarose 30 g/1 Phytagar 7 g/1

Iniciação e manutenção de culturas de rebentos micropro-pagados

As culturas de rebentos micropropagados podem ser 20 ΡΕ1235921 iniciadas utilizando qualquer método aceitável. Verificou-se que o seguinte método era eficaz no laboratório. Outras formulações de meios tal como descritas anteriormente podem ser adequadas para iniciar culturas de rebentos micropro-pagados em vez das formulações de meios descritas abaixo. A metade inferior da região do hipocótilo é cuidadosamente removida das plântulas germinadas. A porção das plântulas contendo os cotilédones e a porção superior do hipocótilo são transferidas para meio MSMO contendo 0,1 mg/1 de β-benzilaminopurina. Após uma incubação de três semanas com luminosidade tal como acima, os rebentos são transferidos para meio fresco. Após mais três semanas, as folhas podem ser utilizadas para transformação. De preferência, são utilizadas as folhas mais exteriores e as folhas mais interiores são utilizadas para manter o tecido in vítro. Para a manutenção das culturas micropropagadas, após as folhas serem removidas para subsequente transformação, a região apical e mais interior da folha (geralmente cerca de 0,5-3,0 cm) é transferida para meio fresco para manter as culturas de rebentos micropropagados (ver Figuras 5 e 6). A Figura 5 ilustra uma vista superior da cultura de micropropagação de beterraba sacarina. A Figura 6 ilustra uma vista lateral que representa as folhas exteriores, as folhas interiores, a área da base das folhas e o corte ou a área de ferimento onde as folhas são removidas na base das folhas. As culturas de micropropagação de beterraba sacarina são de preferência transfe- 21 ΡΕ1235921 ridas para meio fresco pelo menos uma vez por mês para manter as culturas saudáveis e uma fonte pronta de tecido para transformação. Mantendo deste modo o tecido de beterraba sacarina, está constantemente disponível material de explante adequado para transformação sem necessidade de iniciar culturas a partir de sementes, poupando pelo menos um mês no processo.

Preparação de culturas bacterianas

As culturas bacterianas podem ser preparadas utilizando qualquer método aceitável. Verificou-se que o seguinte método era eficaz no laboratório. Outras formulações de meios podem ser adequadas para preparar culturas bacterianas em vez das formulações de meios descritas abaixo. Qualquer estirpe de Agrobacterium adequada para participação nos métodos do invento pode ser utilizada e é preferida Agrobacterium tumefaciens. Os métodos para o crescimento e a manutenção de culturas de Agrobacterium são conhecidos dos peritos na técnica.

Agrobacterium tumefaciens contendo a sequência de ADN exógena a ser transferida para beterraba sacarina é tipicamente plaqueada em meio LB contendo antibióticos selectivos (ver, por exemplo, meio LBsck suplementado com espectinomicina, cloranfenicol e canamicina, Tabela 2). As bactérias são criadas à temperatura ambiente durante cerca de dois a três dias. As bactérias são utilizadas para 22 ΡΕ1235921 iniciar culturas liquidas em LBsck dois dias antes da transformação a fim de se alcançar a densidade celular correcta. As bactérias são diluídas aproximadamente 100 vezes em meio ABsck (Tabela 3) ou YEP (Tabela 4) . São utilizados aproximadamente 2 ml de meio por cultura, embora um perito na técnica reconheça que a variação da escala da cultura não terá um impacto significativo no crescimento das bactérias. As culturas são deixadas a incubar de um dia para o outro num agitador orbital. As culturas bacterianas são diluídas aproximadamente 12,5x em meio ABsck ou meio ABsck suplementado com acetosseringona 200 μΜ, de preferência com um volume total de cerca de 50 ml. As culturas são colocadas num agitador orbital e incubadas a cerca de 26°C de um dia para o outro. A cultura é monitorizada até alcançar uma densidade celular de cerca de 3,0xl09 células/ml, que corresponde a uma ϋΟεοο de cerca de 1. O volume é ajustado com meio txd (Tabela 5) para dar uma densidade celular de cerca de lxlO9 células/ml.

Tabela 2: Meio LBsck

Componente Concentração Peptona 10 g/1 Extracto de levedura 5 g/1 Cloreto de sódio 5 g/1 Bacto-agar de Difco 15 g/1 Espectinomicina 100 mg/1 Cloranfenicol 25 mg/1 Canamicina 50 mg/1 ΡΕ1235921 23

Tabela 3: Meio ABsck

Componente Concentração Glicose 5 g/1 Phytagar 7,5 g/1 Sais AB 25 mg/1 Tampão AB 25 mg/1 Espectinomicina 0,1 mg/1 Cloranfenicol 0,025 mg/1 Canamicina 0,05 mg/1

Sais AB (500 ml): 10 g de NH4CL, 12,5 g de MgS04.7H20, 1,5 g de KC1, 0,1 g de CaCl2 ou 0,132 g de CaCl2.2H20, 25 mg de FeS04 ou 45,55 mg de FeS04.7H20.

Tampão AB (500 ml): 39,33 g de K2HP04.3H20 ou 30,0 g de K2HP04, 11,5 g de NaH2P04.2H20.

Tabela 4: Meio yep

Componente Concentração Extracto de levedura 10 g/1 Peptona 10 g/1 Cloreto de sódio 5 g/1 pH = 7 ΡΕ1235921 24

Tabela 5: Meio TXD

Componente Concentração Sais MS com vitaminas B5 (Sigma M0404) 4,4 g/1 PCPA 4 mg/1 Cinetina 5 pg/l Sacarose 30 g/1 pH ajustado a 5,8

Preparação das placas de co-cultura

As placas de co-cultura podem ser preparadas utilizando qualquer formulação de meios aceitável. Formulações de meios diferentes das descritas abaixo podem ser adequadas. São feitas placas contendo meio 1/10 de MS (Tabela 6) suplementado de preferência com acetosseringona 200 μΜ e ácido galacturónico 1 mM. A acetosseringona e o ácido galacturónico são adicionados ao meio MS após autoclavagem. Um papel de filtro estéril é colocado sobre o meio sólido e humedecido com meio TXD antes da utilização com explantes. ΡΕ1235921 25

Tabela 6: Meio MS

Componente Concentração Sais MS (Sigma) 4,4 g/1 Sacarose 30 g/1 Vitamina SB #1 2 ml/1 Vitamina SB #2 1 ml/1 pH = 5,95

Explantação da Base da folha A explantação pode ser executada utilizando qualquer método aceitável. Verificou-se que o seguinte método era eficaz. Outras formulações de meios tais como descritas anteriormente podem ser adequadas para a explantação em vez das formulações de meios descritas abaixo.

As folhas dos rebentos micropropagados são excisadas e transferidas para uma caixa de petri contendo papel de filtro estéril humedecido com meio TXD. Podem ser utilizadas no presente invento folhas de qualquer parte do rebento micropropagado. Concordantemente, qualquer folha interior ou exterior pode ser utilizada para subsequente transformação. De preferência são utilizadas as folhas mais exteriores. A folha inclui a lâmina da folha e a base da folha e pode ser excisada de qualquer modo. De preferência as folhas são removidas cortando a folha na base da folha 26 ΡΕ1235921 (ver Figura 6) para que a folha seja primeiramente intacta e o local da ferida esteja na base da folha. Após excisão de cerca de 25 folhas dos rebentos micropropagados, os explantes são transferidos para a cultura bacteriana diluida e incubados. A duração da incubação dos explantes foliares com Agrobacterium pode ocorrer durante qualquer período de tempo. De preferência o período de incubação com Agrobacterium é de até sessenta minutos, de maior preferência cerca de quinze a vinte minutos e a incubação é executada de uma maneira que exponha o local da ferida à cultura de Agrobacterium. De preferência o local ferido inferior do explante foliar na base da folha está em contacto com a cultura de Agrobacterium. Os explantes são removidos da cultura bacteriana, secos em papel de filtro estéril tal como papel de filtro Whatman e transferidos para placas de co-cultura. 0 período de co-cultura pode ocorrer durante qualquer período de tempo. De preferência a duração da co-cultura é de até cinco dias. De maior preferência, o período de co-cultura é de cerca de dois a cinco dias. Ainda de maior preferência, o período de co-cultura é de quatro dias. As placas de co-cultura são colocadas em sacos de plástico selados e incubadas durante cerca de quatro dias a aproximadamente 22°C-24°C. É utilizado um fotoperíodo de luz:escuro de cerca de 16:8 para o período de incubação.

Opcionalmente, as folhas dos rebentos micropropa- 27 ΡΕ1235921 gados podem ser excisadas tal como descrito acima e transferidas directamente para placas de co-cultura para um período de pré-cultura de um dia para o outro a cerca de 22°C-24°C antes da adição da cultura bacteriana. Embora seja preferida a pré-cultura de um dia para o outro, a pré-cultura durante pelo menos cerca de seis horas também é eficaz. Após o período de pré-cultura, os explantes são infectados com Agrobacterium através da adição da suspensão bacteriana directamente aos explantes nas placas de co-cultura. Após uma incubação de cerca de vinte minutos, as bactérias podem ser removidas através de qualquer modo incluindo aspiração e os explantes podem permanecer nas mesmas placas durante a duração do período de co-cultura.

Condições de cultura e selecção

Os explantes podem ser cultivados e seleccionados utilizando qualquer método aceitável. Verificou-se que o seguinte método era eficaz. Outras formulações de meios tal como descritas anteriormente podem ser adequadas para cultura e selecção em vez das formulações de meios descritas abaixo.

Os explantes são transferidos das placas de co-cultura para um meio de cultura. De preferência, os meios de cultura são um meio baseado em MS suplementado com 0,5 mg/1 de benzilaminopurina (BAP) ou benziladenina (BA), 0,05 mg/1 de ácido 1-naftalenoacético, 500 mg/1 de carbenicilina e 100 mg/1 de cefotaxime. As condições de co-cultura podem 28 ΡΕ1235921 variar dependendo do marcador seleccionável. Para selecção de glifosato(N-fosfonometilglicina), os explantes infectados são colocados num meio de atraso sem a adição do agente selectivo glifosato. A duração do período de atraso dependerá do genótipo utilizado. São executadas experiências com cada genótipo para determinar a duração óptima do período de atraso. Tipicamente, o período de atraso pode ocorrer durante até dez dias. De preferência o período de atraso sem selecção é de cerca de dois a sete dias. Ainda de maior preferência, o período de atraso sem selecção é de cerca de seis dias a aproximadamente 24°C de preferência em sacos de plástico com furos. São efectuadas experiências com cada genótipo para determinar o nível óptimo do agente selectivo. Para a selecção de glifosato, depois do período de atraso, os explantes infectados são transferidos do meio de atraso (sem glif osato) para um meio baseado em MS suplementado com 0,50 mg/1 de benziladenina, 0,05 mg/1 de ácido 1-naftalenoacético, 500 mg/1 de carbenicilina, 100 mg/1 de cefotaxime e glifosato 0,05-0,10 mM (de preferência glifosato cerca de 0, 075 mM) . Os explantes podem ser cultivados durante cerca de duas a quatro semanas no meio de selecção. De preferência, os explantes são cultivados durante cerca de três a quatro semanas a cerca de 24°C, de preferência em sacos de plástico com furos. É utilizado um fotoperíodo de luz:escuro de cerca de 16:8 para o período de cultura. Os explantes são transferidos para o mesmo meio contendo o agente de selecção apropriado cada três semanas. Geralmente, duas a três transferências são suficientes para identificar uma planta transgénica. 29 ΡΕ1235921

Procedimentos de micropropagação e enraizamento A micropropagação e o enraizamento podem ser efectuados utilizando qualquer método aceitável. Verificou-se que o seguinte método era eficaz. Outras formulações de meios tal como descritas anteriormente podem ser adequadas para a micropropagação e o enraizamento em vez das formulações de meios descritas abaixo. A micropropagação é benéfica para reduzir ou eliminar tecidos quiméricos indesejados. A utilização de micropropagação é especialmente útil para obtenção das plantas transgénicas desejadas e poupa tempo através da eliminação da necessidade de obter material vegetal a partir de sementes. 0 tecido pode ser mantido em vários vasos de cultura de tecidos incluindo mas não se limitando a placas de petri ou copos de gelado.

Os rebentos transformados são transferidos para meio de micropropagação contendo meio baseado em MS suplementado com 0,5 mg/1 de 6-benziladenina, 500 mg/1 de carbenicilina e 100 mg/1 de cefotaxime. Os rebentos são criados e divididos neste meio até que seja obtido o número de rebentos desejado. De preferência, para selecção de glifosato, o glifosato pode ser adicionado ao meio de micropropagação para auxiliar na selecção de material clonal. Por material clonal tal como aqui se utiliza 30 ΡΕ1235921 entenda-se que o rebento inteiro é transformado e não contém qualquer material vegetal quimérico que consiste em tecido transformado e não transformado. Os rebentos individuais são enraizados em meio 1/2 de MS suplementado com 5 mg/1 de ácido indolebutirico, 100 mg/1 de cefotaxime e 500 mg/1 de carbenicilina. As raízes devem aparecer em aproximadamente 4-12 semanas. Os rebentos enraizados podem ser transplantados para o solo, de preferência Metro Mix 350 (Metro Mix é uma marca registada de Scotts Company, Marysville, OH).

Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar formas de realização preferidas do invento. Deve ser apreciado pelos peritos na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionarem bem na prática do invento, e podem assim ser consideradas como constituindo modalidades preferidas para a sua prática. No entanto, os peritos na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas formas de realização específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado igual ou semelhante sem sair do espirito nem do âmbito do invento.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construções plasmídicas

Todas as construções descritas nos Exemplos são vectores de transformação de plantas de bordo duplo 31 ΡΕ1235921 contendo uma origem de replicação de E. coli (ori322), uma origem de replicação de uma ampla variedade de hospedeiros (ori-V), e uma região de codificação (Spc/Str) para a adeniltransferase Tn7, que confere resistência a espectinomicina e estreptomicina. Para transformação de plantas, a estirpe bacteriana hospedeira utilizada foi a estirpe de Agrobacterium tumefaciens ABI. 0 promotor, a região de codificação e os terminadores a 3' estão indicados dentro de parênteses. P-e35S é o promotor para o ARN 35S de CaMV contendo uma duplicação da região -90 a -300 tal como descrito na Patente U.S. N° 5424200; P-FMV é o promotor 35S do Virus do Mosaico de Scrophulariaceae tal como descrito na Patente U.S. N° 5378619; P-aa-chit é o promotor para a quitinase ácida de Arabidopsis tal como descrito em Samac e Shah (Plant Cell 3: 1063, 1991); AEPSPS/CTP2 é a região do péptido de trânsito da EPSPS (ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquimico-sintetase) de Arabidopsis tal como descrito na Patente U.S. N° 5633435; CP4syn é a região de codificação para CP4 EPSPS (sequência sintética) tal como descrito na Patente U.S. N° 5633435; fbp é a sequência de codificação para a frutose-1,6-bisfosfatase de E. coli tal como descrito em Hamilton et al. {Nucleic Acids Res. 16: 8707, 1988); glgC16 é um gene da ADP-glicose-fosforilase de E. coli tal como descrito na Patente U.S. N° 5648249; mz SPS é a região de codificação para a sacarose-fosfato-sintetase do milho tal como descrito na Patente U.S. N° 5750869; E9 3' é a extremidade 3' do gene rbc de ervilha E9, que funciona como sinal de poliadenilação; 7S é o sinal 32 ΡΕ1235921 de terminação 3' do gene da proteína de armazenamento da semente de soja 7S; GUS:1 é a sequência de codificação do gene da beta-glucuronidase de E. coli (Jefferson, R.A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 8447-8451, 1987) modificado para conter um local de restrição Ncol (CCATGG) no codão de início.

Exemplo 2: Transformação com ABI pMONl73Q3

As folhas mais exteriores foram excisadas directamente a partir de rebentos micropropagados de beterraba sacarina e utilizadas como explantes para transformação. As folhas foram cortadas na base da folha e incubadas com Agrobacterium para que a área da base da folha ficasse em contacto com a cultura de Agrobacterium. A estirpe de Agrobacterium tumefaciens ABI continha a construção pMONl7303 (P-e35S/mz SPS/E9 3', P-FMV/CP4syn/E9 3'; Figura 1) e o método de transformação foi tal como descrito na Descrição Detalhada do Invento. Não foi utilizada pré-cultura nas transformações que utilizaram esta construção. A selecção de células transformadas foi executada utilizando glifosato 0,075 mM. De 573 explantes, obtiveram-se 3 plantas transformadas para uma eficiência de transformação de 0,5%.

Exemplo 3: Transformação com a construção ABI PMON13819

As folhas mais exteriores foram excisadas 33 ΡΕ1235921 directamente a partir de rebentos micropropagados de beterraba sacarina e utilizadas como explantes para transformação. As folhas foram cortadas na base da folha e incubadas com Agrobacterium para que a área da base da folha ficasse em contacto com a cultura de Agrobacterium. A estirpe de Agrobacterium tumefaciens ABI continha a construção pMONl3819 (P-e35S/fbp/E9 3', P-FMV/CP4syn/E9 3'; Figura 2). A transformação e selecção foram efectuadas tal como descrito no Exemplo 2 e na Descrição Detalhada do

Invento. De 1875 explantes, obtiveram-se 52 plantas transformadas para uma eficiência de transformação de 3%.

Exemplo 4: Transformação com a construção ABI PMON13835

As folhas mais exteriores foram excisadas directamente a partir de rebentos micropropagados de beterraba sacarina e utilizadas como explantes para transformação. As folhas foram cortadas na base da folha e incubadas com Agrobacterium para que a área da base da folha ficasse em contacto com a cultura de Agrobacterium. A estirpe de Agrobacterium tumefaciens ABI continha a construção pMONl3835 (P-e35S/mz SPS/E9 3', P-FMV/CP4syn/E9 3'; Figura 3). A transformação e selecção foram efectuadas tal como descrito no Exemplo 2 e na Descrição Detalhada do Invento. De 2580 explantes, obtiveram-se 12 plantas transformadas para uma eficiência de transformação de 0,5%. 34 ΡΕ1235921

Exemplo 5: Transformação com a construção ABI PMON13851

As folhas mais exteriores foram excisadas directamente a partir de rebentos micropropagados de beterraba sacarina e utilizadas como explantes para transformação. As folhas foram cortadas na base da folha e incubadas com Agrobacterium para que a área da base da folha ficasse em contacto com a cultura de Agrobacterium. A estirpe de Agrobacterium tumefaciens ABI continha a construção pMONl3851 (P-e35S/mzSPS/E93'/P-FMV/CP4syn/E93'; Figura 4). A transformação e selecção foram efectuadas tal como descrito no Exemplo 2 e na Descrição Detalhada do Invento, com a adição de um passo de pré-cultura de um dia para o outro antes de colocar o tecido vegetal em contacto com as Agrobacteria. De 2890 explantes, obtiveram-se 14 plantas transformadas para uma eficiência de transformação de 0,5%.

Lisboa, 6 de Junho de 2007

Claims (9)

1. ΡΕ1235921 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a preparação de uma planta transgénica de beterraba sacarina, compreendendo o método: selecção de uma plântula de beterraba sacarina, compreendendo a plântula uma região do cotilédone e uma região do hipocótilo; remoção da região do cotilédone e da metade superior da região do hipocótilo da plântula; colocação da região do cotilédone e da metade superior do hipocótilo em contacto com meios de micropropagação para formar um rebento micropropagado, compreendendo o rebento micropropagado pelo menos uma folha ou uma porção desta compreendendo uma base da folha, em que a referida base da folha compreende a parte de baixo da folha onde a folha se une ao rebento micropropagado; remoção de uma folha do rebento micropropagado na base da folha; colocação da base da folha em contacto com Agrobacteria de modo a formar um tecido compreendendo uma célula transgénica de beterraba sacarina; cultura do referido tecido para formar um rebento transgénico; cultura do rebento transgénico para formar um rebento transgénico enraizado; e criação do rebento transgénico enraizado para formar uma planta transgénica de beterraba sacarina capaz de expressar uma sequência de ácido nucleico estrutural exógena, em que: 2 ΡΕ1235921 as Agrobacteria compreendem um vector; e o vector compreende, operativamente ligado na orientação 5' para 3': um promotor que dirige a transcrição de uma sequência de ácido nucleico estrutural exógena; uma sequência de ácido nucleico estrutural exógena; e um terminador da transcrição a 3'.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que a folha ou porção desta compreende uma folha exterior ou uma porção desta.
3. 3. Método da reivindicação 1, em que a folha ou porção desta compreende uma folha interior ou uma porção desta.
4. 4. Método da reivindicação 1, em que a semente de beterraba sacarina é germinada no escuro.
5. 5. Método da reivindicação 1, em que os meios de micropropagação compreendem meios MSMO e cerca de 0,1 mg/1 de 6-aminobenzilpurina.
6. 6. Método da reivindicação 1, em que o agente de selecção compreende glifosato.
7. 7. Método da reivindicação 1, em que as Agrobacteria são Agrobacterium tumefaciens. 3 ΡΕ1235921
8. 8. Método da reivindicação 1, em que a sequência de ácido nucleico estrutural codifica uma proteína ou uma sequência de ARN anti-sentido.
9. 9. Método da reivindicação 1, em que a folha ou porção desta compreendendo uma base da folha é pré-cultivada antes do passo de contacto com as Agrobacteria. Lisboa, 6 de Junho de 2007