PT94177A - Processo para a producao de plantas trans-geneticas - Google Patents

Description

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O presente invento refere-se a um novo processo reprodutível para a produção de plantas transge néticas, que se baseia na inserção de material genético em cé lulas de meristemas apicais e axiais (meristemas adventícios) de plantas, mediante a técnica de micro-injecção, e que se dis tingue pela sua aplicabilidade universal. 0 presente invento refere-se também a utilização do processo de acordo com o invento para a produção de plantas transgenéticas, e se refere às próprias plantas transgenéticas obteníveis por meio do referido proce^ so, e bem assim se refere à progénie das plantas atrás meneio nadas.

Um grande número de processos e de técnicas, que se adoptam já de forma rotineira em muitos labo ratórios, têm sido entretanto desenvolvidos para a manipulação genética do genoma de plantas mediante a técnica de recombina ção de ADN. Não há dúvida de que um dos processos mais bem esclarecidos e mais frequentemente adoptado re presenta o sistema de transformação por Agrobacterium. As células de Agrobacterium apresentam no seu Ti-plasmídeo um fraçf mento de ADN grande, a chamada região de T-ADN que, na transformação natural de células de plantas, é integrada no genoma da planta. -4- -4-

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Após a realização de várias, modificações, este sistema de transferência de genes natural pode ser utilizado como um sistema vectorial genético para a transformação deliberada de plantas /Chilton, MD, 1983/. No entanto o sistema de transformação com Agrobacterium apresenta a desvantagem essencial de a gama de plantas-hospedeiras para as representantes de plantas monocotiledóneas (Hernalsteens ed: al. , 1984; Hookas-Van-Slogteren et ad., 1984) que, porém carecem de importância do ponto de vista da agronomia. Significa isto de que as mais importantes plantas de cultivo não podem ser aproveitadas para uma transferência efectiva de genes.

Além disso, as agrobactérias utilizadas são patogénicas, provocando sintomas mórbidos caracte-rísticos sob a forma de excrescências tumorais nos tecidos das plantas-hospedeiras, pelo que apenas poderão ser manipuladas no laboratório com observâncias de medidas de precaução muito rigorosas.

Os sistemas de transformação alter nativos que têm sido idealizados para contrabalançar as referidas desvantagens inerentes ao sistema de transformação por Agrobacterium, e que destinam à inserção de ADN exógeno em pro toplastos de plantas, como a transferência directa de genes de ADN isento de vectores para protoplastos (Paszkowski et _al. , 1984, Potrykus et ai. 1986) e a micro-injecção de ADN nao-vecto rial em protoplastos (Spangenberg et al.,1986; Steinbiss e Stabel, 1983; Morikawa e Yamada, 1985) ou células (Nomura e Komamine, 1986), devem considerar-se como problemáticos, uma vez que, para grande número de espécies de plantas em especial as pertencentes ao grupo das gramíneas, a regeneração de plantas inteiras a partir de protoplastos de plantas ainda continua a levantar numerosos problemas.

As investigações realizadas por (cf. pag. 2), inter alia para a regeneração de protoplastos de arroz, bem como por Rhodes et. al., 1988 (milho) e por Harris et al., 1988 (trigo), trouxeram os primeiros sinais de progresso neste dominio.

Uma outra desvantagem desses sistemas de transformação alternativos representam as taxas de transformação, gue são ainda relativamente baixas, sendo, pre sentemente, de 1 a 5%. Estas baixas taxas de transformação tam bém implicam de gue o ADN que se pretende inserir nas células seja munido de marcadores (por ex., genes resistentes a antibióticos), que permitam uma rápida selecção das moléculas transformantes de entre o grande número de células não-trans-formadas.

Isto significa, no entanto, de sue actualmente n.ão existe qualquer processo de transformação satisfatório que permita uma produção de plantas transgenétie cas dotadas de novas e úteis propriedades, e que seja eficien te e económico, também sob o ponto de vista comercial, sobretudo no que se refere as plantas pertencentes ao grupo das mo nocotiledóneas.

Assim, há que considerar-se como tarefa prioritária de idealizar processos que permitam uma transformação rápida, eficaz e reprodútivel de todas as plan^ tas, independentemente da sua categoria taxanómica e das ca-racterísticas dai decorrentes, garantindo a produção de plantas transgenéticas que seja eficaz e económica, também sob o ponto de vista comercial. -6

Este assunto diz respeito sobretu do às plantas pertencentes ao grupo das monocotiledóneas, em especial àquelas da familia das gramíneas, a qual inclui as plantas de cultivo mais importantes sob o ponto de vista da agronomia, tais como trigo, centeio, cevada, aveia, milho, arroz, painço, etc., e que, por isso, se revestem de um interesse económico muito especial, para mais que até agora não têm existindo quaisquer processos satisfatórios para a produção de plantas monocotiledóneas transgenéticas. Vários processos de transformação que foram idealizados apenas há pouco tempo representam as prjL meiras tentativas neste sentido. Um dos processos envolve a in jecção de ADN exógeno na inflorescência jovem de plantas de centeio ( de la Pena et al., 1987 ) e um outro processo diz respeito à infecção vírica, mediada por Agrobacterium, de plãn tas de milho com Maize Streak Virus (Grimsley et al., 1987).

No entanto, mesmo esses processos recentes apresentam desvanta gens; por ex., verificou-se de que o processo mencionado em primeiro lugar não é reprodutível.

Neuhaus et al., 1987, descrevem um processo in vitro para a transformação de plantas de colza através da microinjecção de soluções de ADN em embrióides, que se mantêm numa microcultura (in vitro) e, após a sua transformação efectuada, são regeneradas para plantas inteiras.

Poderá considerar-se o presente invento como um aperfeiçoamento do processo de micro-injecção divulgado por Neuhaus et al., 1987. A principal vantagem do processo de acordo com o presente invento relativamente ao pro cesso descrito por Neuhaus et al., reside na utilização de plantas inteiras como. materiais de partida para a micro-injec- -7-

ção de soluções contendo ADN. Na presente especificação, o ter mo "solução contendo ADN" não deverá ser interpretado no senti, do químico como sendo uma solução verdadeira, mas deverá ser encarado como significando um líquido que contém o ADN, e que pode ser tanto uma solução verdadeira ou uma suspensão, emulsão etc. Dado que se utilizam plantas inteiras, é possível prescin dir da preparação e cultivação de estádios embrionários - processos que, por vezes, demoram tempo, sendo portanto também dispendiosos. A utilização de plantas completas também torna supérflua a etapa de regeneração que, actualmente, e nalguns casos, ainda é complexa e, consoante o material de plantas uti. lizado, levanta diversos problemas.

No âmbito do presente invento des cobriu-se agora de que se torna possível idealizar um sistema altamente eficaz para a transformação de plantas, independente mente da dua classe taxonómica e das correspondentes caracte-rísticas, sistema esse que práticamente não pode ser excedido quanto ã sua simplicidade e aplicabilidade geral, que não apre; senta as limitações , atrás referidas, dos processos já divulgados até agora e que, por isso, se mostra excepcionalmente bem apropriado para uma aplicação rotineira.

Em especial, o referido sistema reveste a forma de um processo para a inserção de material genético em plantas, e que se caracteriza por se introduzir, por micro-injecção, uma solução contendo ADN em células de meriste mas apicais e/ou axiais, préviamente expostos, de plântulas germinativas e se cultivar estas plântulas germinativas micro-in jectadas para se obterem plantas inteiras, completas e, de preferência, plantas férteis. A exposição dos meristemas, que se pode realizar, por ex., removendo os cotilédones, ou puxan-do-os para ficarem separados, não afecta o desenvolvimento ulr terior das plantas, de modo que, após a micro-injecção, elas -8-

podem ser cultivadas da mesma maneira que plântulas germinati^ vas normais.

No âmbito do presente invento pre fere-se especialmente a utilização do chamado ADN isento de vectores", isto é ADN que não possui quaisquer sequências de que saiba estarem associadas funcionalmente com a inserção ou integração de ADN em plantas, tais como, por ex., as correspon dentes sequências dos Ti- ou Ri-plasmídeos de agrobactérias.

Dado que os transformantes primários obteníveis mediante este processo são quimeras, que con têm o material genético micro-injectado apenas nalgumas das suas células, utiliza-se a descendência sexuada ou assexuada dos referidos transformantes primários para a produção de plan' tas transformadas de maneira homogénea.

No âmbito do presente invento pre fere-se, portanto, especialmente um processo para a inserção de material genético em plantas, caracterizado por se introduzir, por micro-injecção, úma solução contendo ADN em células de meristemas apicais e/ou axiais, préviamente expostos, de plântulas germinatitoas, e se cultivarem plantas inteiras, e em especial plantas inteiras e férteis, partindo das referidas plântulas germinativas micro-injecção ou de partes delas e, após a intercalação de um ou vários passos de multiplicàçãdsse xuada ou assexuada, se selectar, mediante processos conhecidos a descendência assexuada ou sexuada, assim obtenível, transfo_r mada de maneira homogénea das referidas plantas de partida transformadas de forma heterogénea.

De acordo com um processo alternativo, é também possível, em especial no caso de plantas sus ceptíveis de regeneração partindo de meristemas isolados, pro ceder ao isolamento dos meristemas apicais e/ou axiais micro--injectados, quer imediatamente após a micro-injecção, quer em qualquer altura posterior, com um ou sem pressão selectiva, e criá-los para se formarem culturas morfogenéticas , a partir das quais, por sua vez, se podem regenerar plantas inteiras mediante processos usuais. 0 presente invento refere-se tam bém à produção de plantas inteiras transgenéticas, que são tr transformadas, através do processo do presente invento, com uma molécula de ADN recombinante que, na planta transformada, induz propriedades inéditas e desejáveis, e se refere também às próprias plantas transgenéticas produzidas desta maneira, e se refere ainda à. sua descendência, e também às mutantes e va riantes das referidas plantas transgenéticas. 0 presente invento refere-se também a plantas que foram regeneradas a partir de células ou de outras partes de plantas contendo a referida molécula de ADN recombinabte, e se refere às suas sementes, e ainda se re fere à descendência de plantas regeneradas a partir do referjL do material de plantas transgenéticas, e bem assim se refere às suas mutantes e variantes.

No âmbito do presente invento entende-se por descendência de plantas transgenéticas a progénie da planta progenitora transformada, produzida quer por via sexuada, quer por via assexuada, e também a progénie dos meristemas apicais e/ou axiais microinjectados e isolados, que foi produzida mediante técnicas de culturas celulares e/ou -10-

culturas tissulares. O presente invento refere-se também à aplicação do processo de transformação de acordo com o invento para a produção rápida e reprodútivel de plantas transgenéticas com novas e desejáveis propriedades.

Na especificação seguinte utili za-se uma série de termos que se adoptam normalmente no domínic da tecnologia de ADN de recombinação e em genética de plantas. A fim de garantir uma compreensão inequívoca e uniforme da e£3 pecificação e das reivindicações, bem como do alcance que se pretende atribuir aos referidos termos, estabelecera-se as seguintes definições:

Meristema apical: zona no vértice vegetativo do eixo vegetati-vo, onde se formam e se dividem as células.

Meristema axial (=adventício): meristemas que não estão relacionados com um meristema apical, mas que são formados espontâneamente a partir de tecidos do vértice vegetativo /por ex., botões foliares axilares (meristemas)/.

Quimera: célula, grupo de células, tecidos ou planta, constituí dos por células que possuem informações genéticas diferentes ("plantas transformadas de modo heterogéneo").

Material de plantas: partes de plantas viáveis em culturas ou viáveis autonomamente, tais como protoplastos, células, calos tecidos, embriões, órgãos de plantas, botões, sementes, etc., -11-

e também plantas inteiras. Célula vegetal; unidade estrutural e fisiológica da planta, compreendendo um protoplasto e uma membrana celular.

Protoplasto: célula vegetal "ntía", que não possui qualquer mem brana celular e que foi isolada a partir de células de plantas ou de tecido vegetal, e que tem a capacidade de regenerar para um clone celular ou se transformar numa planta inteira.

Clone celular: população de células genéticamente idênticas, produzidas a partir de uma única célula por mitoses contínuas.

Pro-embrião: estádio precursor do embrião antes da diferenciação polar nas estruturas atrás referidas, características do embrião.

Tecido vegetal:grupo de células vegetais organizadas sob a for ma de uma unidade estrutural· e funcional.

Orgão vegetal: unidade estrutural e funcional constituída por vários tecidos, tais como, por ex., raízes, caule, folha ou embrião.

Gene(s) ou ADN heterólogos; uma sequência de ADN que codifica um produto ou produtos específicos ou que cumpre uma função biológica, e que deriva de uma espécie diferente daquela na qual se introduz o referido gene; sendo que a referida sequên cia de ADN também se designa por gene estranho ou ADN estranho -12-

Gene(s) ou ADN homólogo(s); uma sequência de ADN que codifica um produto especifico ou produtos específicos, ou que desempe nha uma função biológica, e que se origina da mesma espécie que aquela na qual o referido gene está a ser inserido.

Gene(s) ou ADN sintético(s): uma sequência de ADN que codifica um produto ou que desempenha uma função biológica e que é obtida por métodos de síntese.

Cone de crescimento: região no vértice de um eixo germinativo, onde está centrado o meristema.

Promotor da planta: uma sequência de controlo para a expressão de ADN, que garante a transcrição de qualquer sequência de genes de ADN homólogos ou heterólogos numa planta, na medida em que a referida sequência de genes esteja ligada funcionalmente âo referido promotor.

Sequência de terminação: Sequência de ADN na extremidade de uma unidade de transcrição, que assinala o termo do processo de transcrição.

Promotor de planta de sobre-expressão genética(OPP): promotor de planta que é capaz - dentro de uma célula de uma planta transgenética - de realizar a expressão de qualquer(quaisquer sequenciais) de gene funcional(ais), ligada(s) de maneira operativa, num grau (medido sob a forma da quantidade de ARN ou do número de polipéptidos) que é nitidamente mais elevado do que aquele que se observa no estado natural em células-hospedeiras que não tenham sido transformadas pelo referido OPP. -13-

Reglão não-traduzida nos locais 3'/5': Fragmentos de ADN situados a jusante/ a montante/ da região de codificação, que, em bora tenham sido transcritos em m-ARN, inão estão traduzidos na forma de um polipéptido. Esta região apresenta sequências reguladoras, como, por ex., o local para a ligação aos ribos-somas (5') ou o sinal para a poliadenilação (3').

Vector de expressão de ADN: veículo de clonação, tal como, por ex., um plasmídeo ou um bacteriéfago, contendo todas as sequên cias de sinais necessárias para a expressão de um ADN inserido numa célula-hospedeira apropriada.

Vector de transferência de ADN: veículo de transferência, tal como, por ex., um Ti-plasmídeo ou um vírus, que permita a inser ção de material genético numa célula-hospedeira apropriada.

Mutantes, variantes de plantas transgenéticas: derivado de uma planta transgenética que é produzido de forma espontânea, ou por via artificial, mediante processos conhecidos, tais como, por ex., tratamento com raios UV, tratamento com agentes mu-tagénicos, etc., e que continua a apresentar as característi-cas e propriedades da planta de partida que são essenciais ao presente invento. 0 processo de transformação de acordo com o presente invento para a inserção directa de mate rial genético em plantas bàseia-se na micro-injecção de uma solução contendo ADN em células de meristemas apicais e/ou axiais de plantas. Prefere-se sobretudo a micro-injecção nos meristemas apicais (pontos vegetativos ou de crescimento). -14-

Os cones vegetativos das gemas e raízes alojam um grupo de células que se designam por células do meristema primordial e que são o material de partida para o desenvolvimento do inteiro corpo da planta. Estas célu las do meristem primordial ou primário distinguem-se de maneira característica das células circundantes. Tal como as cé lulas embrionárias dad quais derivam directamente, estas célu las são relativamente pequenas e mais ou menos isodiamétricas. As suas membranas celulares, que geralmente se alinham perpendicularmente umas relativamente às outras, são muito delgadas e ainda pobres em celulose. As células do meristemas primário estão condensadas em espaços muito estreitos. A cavidade celu lar é preenchida de protoplasma denso contendo um núcleo celu lar relativamente grande. Esta região dos vértices de raízes e de gomos, que se designa por meristema apical ou vértice vegetativo, comprenede apenas algumas poucas centenas de célu las e encontra-se concentrada numa área de cerca de 100 um por 100 um.

Descobriu-se agora, de forma surpreendente, no âmbito do presente invento de que estas células que estão concentradas na região do vértice vegetativo da raiz ou ga gema podem ser submetidas a uma micro-injecção desde que se adoptem processos adequados que, seguidamente, irão ser descritos em pormenor. A micro-injecção de uma solução contendo ADN, uma ou várias vezes; nas células do meristema apical (vértice vegetativo) de plantas conduz à formação de células meristemas primárias, transformadas, que , seguidamen te, se diferenciam mais em células e tecidos transformados e, que, por isso, dão origem à formação de plantas transformadas de maneira heterogénea (quimeras). Quando se , injecta, por micro-injecção, a solução contendo ADN numa área do interior

do vértice ou ponto vegetativo, directa ou indirectamente en volvida na formação de meristemas florais, então o material genético incorporado pode transmitir-se à linha germinativa da planta e, por isso, pode ser transferido para a descendência sexuada das plantas-progenitoras transformadas de maneira heterogénea.

Dado gue a descendência sexuada se origina a partir de uma única célula (o zigoto), a referida progénie representa plantas transformadas de forma homogénea gue contém o material genético, inserido mediante micro--injecção, estávelmente incorporado no seu genoma.

Tal como foi descrita acima, a formação de quimeras transgenéticas que, nalguns casos, é indesejável, poderá assim ser evitada.

Dentro do âmbito do presente in vento prefere-se a micro-injecção de uma solução contendo ADN nos cones vegetativos de plantas monocotiledóneas, mas, em es_ pecial, nos cones vegetativos de cereais e outras gramíneas, para os quais até agora não existia qualquer sistema de tran^ formação satisfatório.

No âmbito do presente invento descobriu-se agora de maneira surpreendente de que se pode, pela primeira vez, mediante processos específicos, introduzir por meio de micro-injecção, material genético, in vivo, espe-cíficamente de maneira controlada, nas células de meristemas apicais (cones vegetativos) de plântulas germinativas e criar plantas transformadas de maneira homogénea a partir das plan-: tas assim tratadas. -16-

0 processo de acordo com o presente invento não se limita apenas aos meristemas apicais, mas pode também adoptar-se, de maneira exactamente idêntica, no ca so de meristemas axiais de plantas. A micro-injecção da solução con tendo ADN nos meristemas apicais e/ou axiais realiza-se, segundo o invento, mediante uma aparelhagem de micro-injecção equipada de micro-manipuladores accionados manualmente ou por motor. A estrutura de base e o equipamento básico dos referidos dispositivos para a micro-injecção estão descritos de ma neira pormenorizada na literatura do ramo. Actualmente, aparelhos de micro-injecção estão também a ser vendidos sob a forma de uma aparelhagem completa e fazem já parte integral do equipamento habitual de muitos laboratórios.

Os meristemas apicais e/ou axiais de plântulas germinativas constituem o material vegetal de partida preferido para a micro-injecção. Depois da efectivação da micro-injecção atrás referida, e consoante a espécie de plantas a ser utilizada, esses meristemas são colocados direc-tamente no solo e cultivados muito rápidamente, transformando--se em plantas inteiras, mediante as usuais medidas de cultivo ou os meristemas apicais e/ou axiais micro-injecção ou partes deles são isolados a partir das plântulas, desde que se trate de plantas que possam ser regeneradas a partir de meristemas isolados, podendo depois ser cultivados muito prontaménte, in vitro, até se obterem culturas morfogenéticas, e ser regenerados para plantas inteiras mediante processos conhecidos.

As plantas que se podem obter inicialmente mediante o processo de acordo com o presente invento são quimeras, isto é, plantas transformadas de maneira heterogénea, das quais apenas uma parte dos seus tecidos contém o material genético micro-injectado, incorporado de forma estável no seu genoma. Para se prepararem plantas transformadas de maneira homogénea seleccionar-se»ão ’.de preferência qui meras que possuam células de linhas germinativas transformadas e cuja descendência sexuada apresenta, assim, as caracte-rísticas de transformação desejada. Esta selecção segundo ca racterísticas conspícuas pode ser realizada fácilmente pelos técnicos do ramo.

Segundo um processo alternativo as quimeras podem ser preparadas, por meio de uma etapa de cultivo i_n vitro, sob pressão selectiva, contando que se utilizem plantas que possam ser regeneradas para plantas inteiras partindo de meristemas apicais e/ou axiais isolados. Em primeiro lugar, os meristemas apicais isolados e micro-injectados são isolados a partir das plântúlas germinativas, são criados sob a forma de culturas in vitro e, em seguida, são regenerados tornando-se plantas completas. De preferência, as culturas vão ser submetidas a uma pressão de selecção deliberada-mente específica, de modo que apenas sejam regeneradas as plantas capazes de exprimir o material genético injectado.

Assim, este processo alternativo para a produção de plantas transformadas de maneira homogénea que se pode aplicar sobretudo em plantas que possam ser regeneradas para plantas inteiras, partindo de meristemas api cais e/ou axiais isolados, baseia-se, sobretudo, na identifi. cação e selecção de células transformadas ou de tecidos de plantas transformados de maneira heterogénea e na sua regeneração in vitro, de preferência em meios de cultura que promovam a formação de botões germinativos adventícios ou de embri. ões adventícios, para plantas inteiras, transformadas de maneira homogénea, mediante processos conhecidos. -18-

Processos para a regeneração in vi-tro, do material vegetativo transformado vêm descritos, por ex nas seguintes publicações: Paszkowky and Saul, "Director Gene Transfer to Plants" in: Methods for Plant Molecular Biology, eds. A & H Weisbach, Academic Press, 1988,pages 447-463; Ro-gers SG et ail., "Gene Transfer in Plants: Production of Trans-formed Plants Using Ti-Plasmid Vectors", in Methods for Plant Molecular Biology eds. A & H Weisbach, Academic Press,1988,pa-ges 423-436.

Uma vantagem importante do processo de acordo com o invento é que este processo pode ser utilizado universalmente, independentemente da classe taxonómica da plan ta-alvo específico e das inerentes características e dificulda des técnicas que ocorrem na utilização dos processos de transformação até agora adoptados, e que se traduzem para limitações e determinadas plantas dicotiledóneas quando da adopção do sijs tema de transformação com Agrobacterium ou para uma deficiente regenerabilidade de plantas monocotiledóneas, que se tem feito sentir até agora , a partir de protoplastos aquando do emprego dos processos de transferência genética directos.

Esta universalidade do processo de acordo com o presente invento se deve ao facto de que o material genético é transferido através de um método físico (micro -injecção) para uma estrutura (cone meristemático) obtenível de qualquer planta, independentemente da sua classe taxanómica, ALém disso, pelo facto de se criarem plantas directamente de plântulas germinativas, podem ser evitados por inteiro ou, pelo menos, parcialmente, os efeitos negativos da "variação somaclonal" que se verificam geralmente com outros processos de transformação, em especial naqueles cu ja etapa de regenaração se processa por via de uma fase de calo, e esta ausência ou quase inexistência de efeitos negativos da variação somaclonal reveste-se de especial importância para a criação de plantas. -19-

Assim, no âmbito do presente invento, torna-se agora possível, pela primeira vez, e inde-pendentemente das limitações atrás referidas, produzir - com um elevado grau de eficácia - plantas transgenéticas, em espe ciai também aquelas do grupo das monocotiledoneas, com novas e desejáveis propriedades, introduzindo, por micro-injecção, de uma solução contendo ADN nas células de meristemas apicais (vértices vegetativos) e/ou de meristemas axiais de plântulas germinativas e, em seguida, mediante processos de cultivo conhecidos, criando as plântulas germinativas ou partes delas, micro-injectadas, até' se transformarem em plantas inteiras, completas.

Em pormenor, o processo de acor do com o presente invento compreende as seguintes fases específicas : a) Germinação de sementes da respectiva planta-alvo e selecção de apropriados estádios germinativos; b) Exposição do(s) meristema(s) apical(ais) e/óu axial(ais) para a micro-injecção subsequente; c) Micro-injecção de uma solução de ADN contendo um ou mais fragmentos de ADN nas células do(s) meristema(s) esposto(s) referido(s) em b); d^ Cultivação das plântulas germinativas micro-injectadas até se obterem plantas transformadas de maneira heterogénea; d2> Isolamento e regeneração in vitro de meristemas apicais e/ou axiais micro-injectados, sem pressão selectiva, até se formarem plantas completas, tarnsfornadas de maneira heterogénea; -20-

dg) Isolamento e regeneração in vitre de meristemas apicais e/ou axiais micro-injectados, sob pressão selectiva, até se obterem plantas transformadas de maneira homogénea; e) Produção da ascendência sexuada ou~ assexuada das plantas transformadas de maneira heterogénea, obtidas segundo o ponto d^) ou ^2^· e selecção da descendência transformada de maneira homogénea.

Para a preparação de plântulas germinativas apropriadas, a germinação das sementes das plan-tas-alvo correspondentes processar-se-á, de preferência, em condições de esterilidade (condições assépticas). O período de germinação depende da actividade germinativa do material de sementes e, gerelmente, demora 2 a 10 dias.

No âmbito do presente invento preferem-se as plântulas germinativas gue se encontrem numa fase evolutiva gue se estende desde ó inicio do desenvolvimen to cotiledonar até ao desenvolvimento da folha secundária. Preferem-se sobretudo as plântulas germinativas com cotilédones totalmente desenvolvidos.

De acordo com o presente inven to há vantagem em manter baixo o vértice germinativo das plân tuias. Pode conseguir-se isto, por ex., por uma iluminação : adequada das sementes em fase de germinação ou das plântulas novas. Com vantagem, a intensidade luminosa varia entre cerca de 5 a 145 Einstein.s--1.m-1, e em especial, entre 45 a 60 Eins tein. s-^. m-^". -21-

Quando as plântulas germinativas tiverem atingido uma determi_ nada fase de germinação apropriada para a micro-injecção, pro cede-se primeiro à exposição dos vértices vegetativos, ou dos meristemas axiais. No caso dos vértices vegetativos de gomos, pode conseguir-se isto, por exp., pela remoção de um ou de am bos os cotilédones.

Uma outra possibilidade consiste em separar os cotilédones até se tornar visível o meristema apical.

De preferência, a preparação dos vértices vegetativos se realiza mediante o emprego de escelpe los finos e agulhas ou pinças extremamente ténues bem como dispositivos de fixação (mordaças) especiais, sob observação ao microscópio. 0 dispositivo de aperto ou de fi. xação utiliza-se sobretudo para segurar na sua posição os cotilédones., o que facilita grandemente a subsequente exposição do vértice vegetativo.

As plântulas cujos meristemas a-picais são fácilmente acessíveis, como, por ex., as plântulas obtidas das sementes de soja, algodão, árvores de folha caduca, coníferos, etc., são especialmente apropriados para serem utilizados no âmbito do processo do presente invento.

As plântulas assim tratadas podem seguidamente ser utilizadas para os fins de micro-injecção. -22-

A micro-injecçao da solução ADN nos meristemas apicais e/ou axiais se realiza de acordo com processos conhecidos Per se, e que vêm referidos, inter alia por Sted,nbiss and ..S,tabel, 198 3; Neuhaus et a^L; 1984,1986,198 7; and by Morikawa and Yamada, 1985.

Específicamente, a micro-injecção nas células individuais do meristema apical realiza-se sob ob servação ao micróscopio e mediante uma aparelhagem de micro-injecção especial, cujo equipamento de base é constituído por micro-pipetas controladas/reguladas por micro-manipuladores. 0 diâmetro da ponta do capilar de injecção varia entre _ 1 um e 100 um; Os capilares de injecção cujas extremidades têm um diâmetro de 0 ,5 a 1 um são muito ejs pecialmente apropriados para a utilização no âmbito do procejs so do presente invento. De acordo com os preceitos do presente invento, utilizam-se como capilares de micro-injecção sobretu do capilares de micro-eléctrodos com filamentos vítreos selados de vidro de borossilicato. Estes capilares apresentam um diâmetro exterior de 1,00 mm a 2,00 mm. Prefere-se um diâmetro de 1,2 mm a 1,5 mm. Poder-se-á, naturalmente, também utilizar qualquer outro tipo de vidro ou outros materiais apropriados para a realização da micro-injecção. Geralmente, a pi peta de micro-injecção está ligada através de uma unidade regu ladora de 'pressão, o chamado micro-injector, a uma fonte de gás, em especial uma fonte geradora de azoto ou uma fonte de ar comprimido, que assegura uma transferência muito finamente doseada da solução de injecção a partir da micro-pipeta para o tecido da planta. A seguir à penetração da ponta da micropipeta nas células do(s) meristema(s) apical(ais) e/ou axial(ais), liberta-se a solução contendo o ADN. -23-

Consoante o tamanho da célula va ria o volume de injecção: 1 pl a 100 pl por cada célula injec tada.

No âmbito do presente invento, prefere-se um volume de injecção entre 10 pl e 40 pl por célu la injectada. A fim de assegurar uma transforrna ção tão uniforme quanto possível de todas as células que compreendem a estrutura multicelular que se pretende injectar, estas células são injectadas de 1 a 1000 vezes, mas de preferência, são injectadas 4 a 60 vezes, consoante o número de cé lulas existentes.

Poderá conseguir-se este objecti-vo, por ex., virando as plântulas que se pretendem injectar, por baixo do dispositivo de micro-injecção, entre as várias : operações de injecção, de modo que seja micro-injectado um nú mero de diferentes células tão grande como possível.

Soluções de ADN apropriadas para as finalidades da micro-injecção em células de plantas são, por ex., soluções-tampão contendo ADN transformante numa con^ centração apropriada. A concentração de ADN que se prefe re no âmbito do presente invento varia entre 0,01 ug e 10 ug/ /ul, mas, em especial, varia entre 0,1 ug/ul e 5 ug/ul. Prefe re-se sobretudo uma concentração de ADN entre 0,5 ug e 1,5 ug /ul. 0 valor pH da solução-tampão poderá variar entre 6 e 8; prefere-se uma gama de valores pH entre 7,5 e 7,8. -24-

Para a integração do gene heteró-logo no ADN genómico da célula da planta há vantagem em que o ADN transformante seja acompanhado por sequências de ADN neutras (ADN de suporte). As sequências de ADN neutras que acompa nham o ADN transformante poderão ser de origem sintética ou po dem obter-se a partir de sequências de ADN que ocorrem na natu reza, mediante um tratamento com apropriadas enzimas de restri^ ção. Assim, por ex., são apropriadas como ADN de suporte plas-mídeos naturais que foram abertos por uma enzima restritiva se lectiva.

No entanto, a sequência de ADN pro duzidas para a transferência de genes também poderá ter uma e,s trutura circular (estrutura de um plasmídeo). Estes plasmídeos apresentam um cordão de ADN no qual se integra o ADN transfor-mantes.

Um exemplo de um plasmídeo deste género representa o plasmídeo prontamente acessível pUC8 (de^ crito por Messing, J. e J. Vieira, 1982). Podem também usar--se fragmentos de plasmídeos naturais como ADN de suporte ou vectorial. Assim, por ex., o mutante de delecção para o gene VI do virus do i mosaico da couve-flor (Cauliflowor Mosaic Vi-rus) pode ser utilizado como ADN de suporte.

De acordo com os preceitos do presente invento, o ADN de transformação pode estar presente, quer sob a forma de anéis abertos ou fachados (estrutura de plasmídeo) ou, de preferência, sob a forma linear.

No âmbito do presente invento prefere-se a utilização de uma mistura de foemas lineares e hiper -espiraladas. A verificação óptica de toda a ope ração de micro-injecção realiza-se, normalmente, por meio de observação ao microscópio. Preferem-se microscópios de inversão de imagem ou microscópios estereoscópicos com uma combina^ ção de luz incidente e transmitida. A ampliação escolhida depende das dimensões do material que se pretende injectar, e a respectiva ampliação poderá variar entre 10 x e 300 x. Utili-* za-se, de preferência, uma fonte de luz fria, a fim de evitar a geração de calor.

Assim, o processo de acordo com o presente invento pode ser caracterizado pelas seguintes etapas parciais: a) Fixação das plântulas germinativas na sua posição mediante um dispositivo de fixação b) Injecção da solução de ADN nas células do(s) meristema(s) apical(ais) e/ou axial(ais), mediante os capilares de mi-cro-injecção c) Rotação (viragem) das plântulas e nova injecção. A seguir à injecção, as plântulas são colocadas directamente no solo ou, como alternativa, são transferidas para um apropriado meio de cultura. 0 cultivo das plântulas micro-in-jectadas, que se segue à micro-injecção, poderá corresponder ao cultivo totalmente normal de plântulas no solo, tal como se realiza de forma rotineira no domínio de cultivo de plantas, ou pode ser realizado em meios de cultivo específicos que sejam apropriados para a evolução ulterior das plântulas até se obterem plantas totalmente desenvolvidas.

De acordo com os preceitos de pre sente invento, prefere-se a transferência directa das plântu- -26- las micro-injectadas para o solo.

As plantas assim formadas a partir das plântulas germinativas micro-injectadas podem depois ser tratadas numa estufa da mesma maneira que quaisquer plântulas germinativas normais. Formam-se seguidamente plantas que contêm o material genético micro-injectado apenas nalgumas das suas células e são geralmente designadas por quimeras.

Para a produção de transformantes homozigotas, de linhagem pura, existem sobretudo duas vias a_l ternativas.

No caso de plantas susceptxveis de auto-polinização, isto é, plantas que não apresentem quais quer auto-incompatibilidade, podem obter-se linhagens homozigotas através de auto-polinização repetida de transformantes primários (quimeras) e da produção de linhagens de intra-cru-zamento. Em contraste com os transformantes homozigotas, di-' plóides, em que o gene integrado está presente em cromossomas homólogos e que obdecem às leis da hereditariedade segundo Mendel com base na transmissão dominante deste gene, a auto- . -polinização das quimeras micro-injectadas conduz a um estádio heterozigótico relativamente ao gene integrado (mono-híbrido). E apenas na sequência das auto-polinizações subsequentes das gerações filiais que se obtêm linhagens homozigóticas em relação com o gene alheio inserido.

As sementes que se obtêm como re sultado destes cruzamentos são germinadas, em cada caso, em apropriados meios de selecção, a fim de seleccionar as carac-terísticas herdadas segundo as leis postuladas por Mendel. Em seguida, estas linhas de intra-cruzamento podem ser utilizadas no desenvolvimento de hídridos, desde que estes transformantes primários contenham células de linhas germinativas transformadas. -27-

Plantas que não sejam passíveis directamente de uma autopolinização, quer porque os órgãos sexuais se encontram em plantas diferentes, quer porque a au-to-hidridação, por uma razão qualquer, não dá origem à produção de sementes normais, podem também ser utilizadas para a obtenção de linhagens de intra-cruzamento. Neste caso, procede-se ao cruzamento entre si de plantas com um elevado grau de parentesco entre si, o gue, em última análise, poderá resultar igualmente na consecução do fim requerido, isto é, a existência de linhagens de intra-cruzamento para a criação de híbridos.

Os processos gue se referem agui como exemplo para a produção de plantas homozigóticas são conhecidos dos técnicos do ramo do cultivo de plantas e vêm des^ critos, em pormenor, por ex. , na seguinte publicação: "'Bfeédinç Eield Crops, Third Edition, JM Poehlman, AVI Publishing Compan^ Inc. , Westport , Connecticut, 1987".

No caso de plantas susceptíveis de regeneração, por ex., mediante embriogénese secundária ou formação de gomos adventícios, torna-se possível isolar célu las individuais transformadas ou tecido transformado a partir das plantas transformadas de modo heterogéneo e regenerá-los in vitro, sob pressão selectiva, até se formarem plantas puras trans-genéticas.

Mais precisamente, o processo po derá consistir, por ex., em gue, após a micro-injecção, se pro cede ao cultivo, in vitro, do meristema apical ou axial trata do, em meios de' cultivo apropriados para a regeneração das células ou tecidos até se obterem plantas totalmente desenvol. vidas.

No que se refere à sua composição, que é muito bem conhecida dos peritos nesta especialidade os referidos meios de cultivo se distinguem sobretudo pelo -28- facto deles conterem sob a forma dos seus compostos em especial as substâncias ou elementos minerais que são essenciais para o crescimento e o desenvolvimento da célula vegetal (macro-elemento) , tais como, por ex., azoto, fósforo, enxofre, potássio, cálcio, magnésio e ferro, para além dos chamados elementos vestigiais (micro-elementos), tais como, por ex., sódio, zinco, cobre, manganês, boro, vanádio, selénio e moli-bdénio. Enquanto os macroelementos estão geralmente presentes em quantidades entre 10 mg/1 e algumas centenas de mg/1, a concentração dos micro-elementos se situa, geralmente em valo res máximos de alguns poucos mg/1.

Outros constituintes dos referidos meios incluem uma série de vitaminas essenciais, tais como ácido nicotínico, piridoxina, tiamina, inositol, biotina, ácido lipónico, riboflavina, Ca-pantotenato, etc., uma fonte de carbono apropriada, prontamente assimilável, tal como,por ex., sacarose ou glucose , e vários reguladores do crescimento sob a forma de fito-hormonas naturais ou sintéticas da clas^ se das auxinas e citoguininas, numa gama de concentração entre 0,01 mg/1 e 20 mg/1 em cada caso, de preferência entre 0,05 mg/1 e 10 mg/1 e, muito especialmente, entre 0,1 e 1,2 mg/1.

De acordo com os objectivos do presente invento deverá ter-se especial cuidado para que a composição dos meios e as relações de concentração dos seus constituintes individuais possam ser alterados consoante o estádio'evolutivo das plantas que se pretendem regenerar. Isto é especialmente válido em relação aos reguladores do crescimento, que deverão ser adicionados numa relação equilibrada entre si, a fim de garantir - caso isto seja desejável - um decurso controlado do processo de regeneração. Não existe qualquer método prático empírico, generalizado, neste contexto, uma vez que tan- -29- to as concentrações individuais como as relações de concentração de auxinas/citoquininas poderão variar muito largamente em função do material de plantas empregado. Os peritos nesta especialidade conhecem suficientemente bem o método para a determinação de apropriadas concentrações das substancias que promovem o crescimento e das adequadas relações de concentrações das várias substâncias reguladoras do crescimento entre si.

No âmbito do presente invento, a gama de concentrações preferida para as fito-hormonas da classe das auxinas e citoguininas, varia entre 0,01 mg/1 e 20 mg/1 em cada caso, de preferência, entre 0,05 mg/1 e 10 mg/1 e, em especial, varia entre 0,1 mg/1 e 1,2 mg/1.

Além disso, os meios de cultura estão osmóticamente estabilizados pela adição de álcoois de açúcares (por ex., manitol), açúcares (por ex., glucose) ou iões de sais, e são ajustados a valores de pH entre 4,5 e 7,5, de preferência, entre 5,2 e 6,5.

Para além dos meios sintéticos com uma composição exactamente definida dos vários constituintes individuais, de concentração conhecida, é também possível utilizar meios de nútrientes complexos, que são constituídos por inteiro ou, pelo menos, em parte, por componentes naturais Neste contexto, chama-se a atenção, por ex., para extracto de batata, leite de coco e endòsperma liquido que se pode obter por meio de sucção a partir do saco embrionário de plantas.

Enquanto que as primeiras etapas de cultivo, que se seguem imediatamente à micro-injecção se realizam, de preferência, meios de cultura líquidos, poderá recorre-se, para as etapas seguintes da regeneração, quer a meios de cultura líquidos, quer a meios de cultura sólidos, que se podem preparar pela adição de um dos agentes de solidi- -30-

ficação habitualmente utilizado na tecnologia microbiológica, ou se pode recorrer a uma combinação de meios de cultura líquidos e sólidos.

Agentes solidificantes apropria dos incluem, por ex., ágar-ágar, agarose, alginato, pectinato, Gelrite , gelatina, etc. Preferem-se ágar-ágar, em especial ágar-ágar e agarose do tipo "Low-melting-type" (LMT).

Quando se empregam meios líquidos poderá ser vantajoso, nalguns casos, adicionar ao meio de cultura em agente espessante osmóticamente neutro, de modo que possa aumentar a densidade (consistência) do meio sem elevação do seu valor de pressão osmótica. Como resultado disso, o material a regenerar sobrenada à superfície do meio, o que assegura uma permuta gasosa óptima com a atmosfera circundante. De acordo com o presente invento prefere-se a utilização de polímeros sintéticos, por ex., copolímeros de sacarose e de epicloridrina com um peso molecular entre 70.000 e 400.00, embora a escolha não se limite aos referidos copolímeros.

Segundo uma forma de realização específica do processo de acordo com a presente invenção, os meristemas, micro-injectados da maneira atrás referida, são expostos imediatamente a seguir à operação de micro-injecção e são transferidos, de preferência, para placas para cultivo em escala micro, comercializadas, quer contidos em ou sobre meios de cultura que tenham uma composição apropriada para o cultivo in vitro do referido tecido meristemático.

De preferência, o cultivo dos meristemas micro-injectados se realiza sobre um meio sólido contendo como aditivo um agente de gelificação escolhido do grupo formado por ágar-ágar, agarose, alginato, pectinato, GejL nte e gelatina. -31-

A densidade de cultivo varia, de preferência, entre 1 ffieristema/ul e 50 meristemas/ul de meio de cultura, mas a densidade muito especialmente preferida oscila entre 1 meristema/ul e 5 meristemas/ul de meio de cultura. A densidade de cultivo escolhida depende do tamanho e do estádio evolutivo dos meristemas usados.

No âmbito do presente invento verificou-se ser vantajoso realizar o cultivo dos meristemas apicais e/ou axiais micro-injectados, pelo menos durante algum tempo, dentro de um sistema de 2 compartimentos, que actua como câmara húmida; neste caso, o compartimento externo é con£3 tituido, por ex., po água meio de cultura ou uma solução aguo sa de manitol, enquanto os meristemas se encontram no comparti, mento interno.

Após um período de cultivo de 5 a 15 dias, mas, de preferência, decorridos cerca de 10 dias, os meristemas apicais e/ou axiais em vias de crescimento são transferidos para a superfície de um meio de cultura selecti-vo, em que os meristemas isolados são submetidos a uma pressão de selecção positiva, de modo a que apenas aquelas células que, como resultado da transformação anterior, são capazes de resistirem a esta pressão de selècção, possam sobreviver e desenvolver-se posteriormente. Por outro lado, todas as células não-.transformadas ou morrem ou são "asfixiadas" pelo cres cimento das células transformadas.

Como aditivos selectivos para os meios de cultura podem utilizar-se, por ex., herbicidas, in secticidas, fungicidas e outros compostos cito-tóxicos, tais como, por ex., vários antibióticos ou outros agentes biocidas. No entanto, também outros parâmetros, tais como, por ex., a concentração de sais, a concentração de C^. a luz, valor do pH, etc., poderão actuar como agente selectivo. -32-

consoante a natureza do respectivo marcador selectivo utilizado e introduzido na planta.

Quando os meristemas cultivados em escala micro, da maneira atrás descrita, tiveram atingido uma fase específica de desenvolvimento, geralmente decorridos 10 a 30 dias, mas, em especial, após um período de 10 a 20 dias, eles são transferidos, com vantagem, para meios sólidos que podem eventualmente ser recobertos por uma camada de um meio líquido. Geralmente, esses meios são os meios de cultura normalmente utilizados para a regeneração de plantas e que dão origem a uma maior regeneração de gomos adventícios ou a uma embrio-génese adventícica aumentada em virtude do seu equilibrado teor em fito-hormonas, em especial fito-hormonas perten centes à classe das auxinas e citoquininas. Preferem-se sobre^ tudo concentrações de auxinas e de citoquininas entre 0,01 mg/1 e 20 mg/1, em cada caso, e preferem-se muito especialmente con centrações entre 0,1 mg/1 e 1,0 mg/1, tal como se verifica, por ex., nos meios de cultura T3, T4 e T5, que mais adiante serão descritos em mais pormenor.

Após um período de cultivo total de cerca de 4 a 8 semanas, consoante o material de plantas utilizado, os meristemas podem ser transferidos para meios só lidos com nenhuma concentração hormonal ou apenas com uma bai^ xa concentração de hormonas, podendo ali ser cultivados até à formação de pequenas plantas (plântulas).

Para apoiar uma rápida regeneração das plantas, poderá ser vantajoso desencadear a indução da formação radicular, por ex., pela transferência dos embriões para meios indutores da formação radicular, conhecidos per se (cf. por ex., meio T5). -33-

As plantas transgénicas formadas desta maneira podem seguidamente ser transplantadas no so lo e ser tratadas posteriormente numa estufa, da mesma maneira que as plântulas normais. 0 processo , atrás referido,. para a produção de plantas transgénicas mediante a técnica de micro-injecção, incluindo todas as etapas parciais, é objecto do presente invento. 0 processo de acordo com o pre sente invento pode ser aplicado, universalmente, a todas as plantas que formem sementes e plântulas germinativas (germes). 0 processo abrange a micro-injecção tanto de sequências de ADN naturais, como de unidades de genes híbridas produzidas artificialmente por meio da tecnologia de recombinação de ADN. 0 extenso âmbito do presente in vento inclui sobretudo moléculas de ADN de recombinação, que contêm sequências de ADN que, nas plantas que se pretendem transformar, conduzem a propriedades úteis e desejáveis.

De preferência, as referidas moléculas são moléculas de ADN de recombinação contendo uma ou várias sequências de genes que codificam uma propriedade útil e desejável e que se encontram sob controlo regulador de sinais de expressão activos em plantas, de modo que estaja assegurada uma expressão das referidas sequências de genes na célula vegetal transformada.

Assim, genes apropriados para serem utilizados no âmbito do processo do presente invento são sobretudo todos aqueles genes que são exprimidos na célula da planta e que conferem à planta uma propriedade útil e/ou desejável, tal como, por ex., uma resistência aumentada relativamente a agentes patogénicos (por ex., relativamente a vírus, bactérias, fungos fitopatogénicos, etc) uma resistência a produtos químicos /por ex., frente a herbicidas (tais co mo, por ex., triazinas, sulfonil-ureias, imidazolinonas, tri-azol-pirimidinas, Bialaphos, glifosato, etc), insecticidas ou outros agentes biocidas/; resistência a influências nocivas (endáficas ou atmosféricas) climatéricas (por ex., calor, frio vento, condições especialmente extremas do dolo, humidade, seca, stress osmótico, etc.); ou que dão origem à formação aumen tada ou qualitativamente melhorada de substâncias de reserva ou de depósito nas folhas, sementes, tubérculos, raízes, caules, etc. Substâncias desejáveis que se podem produzir por plan tas transgénicas incluem, por ex., proteínas, amideos, açúcares aminoácidos, alcaloides, substâncias odoríferas, substâncias corantes, gorduras, etc.

Segundo o processo do presente in vento se podem também utilizar genes que codificam substâncias activas, farmacêuticamente aceitáveis, tais como, por ex., alcaloides, esteróides, hormonas, moduladores imulológicos, bem como outras substâncias fisiológicamente activas.

Poderá conseguir-se uma resistência frente às cito-toxinas, por ex., pela transferência de um gene que seja capaz, aquando da expressão na célula da planta, de produzir uma enzima que inutiliza (desintoxica) a citotoxi na, tal como, por ex., a neomicina-fosfotransferase tipo II ou amino-glicósidofosfotransferase tipo IV, que contribuem pa ra a "neutralização" de canamicina, higromicina e outros antibióticos à base de amino-glicósidos, ou uma glutationa-S-tran^ ferase, citocrómio, P-450 ou outras enzimas de acção catabóli-ca, de que se sabe serem capazes de inutilizar triazinas, sul^ funil-ureias ou outros herbicidas. Uma resistência frente a citotoxinas pode também ser conferida por um gene que exprime numa planta uma forma específica de uma "enzima-alvo" (local de ataque da acção da citotoxina), que seja resistente à actividade da citotoxina, tal como, por ex., uma variante da sintetase do ácido hidroxiacético, que é insensível à acção inibitória de sulfonilureias, imidazolinonas ou de outros herbicidas que entram em interacção com esta fase metabólica espe cífica; ou uma variante da EPSP-sintetase, que provocou ser in sensível à acção inibitória de glifosato. Poderá ser vantajoso exprimir estas enzimas-alvo modificadas numa forma que permita o seu transporte para o compartimento celular correcto como, por ex., no caso atrás apresentado, para dentro dos cloroplas-tos.

Em determinados casos poderá haver vantagens em orientar os genes produzidos para as mitocôn-drias, os vacúolos, o retículo endoplásmico ou outras regiões celulares, e, possivelmente, até para dentro das cavidades in-tercelulares (apoplastos).

Poderá conseguir-se uma resistência a determinadas classes de fungos, por ex., pela inserção d2 um gene capaz de exprimir quitinase nos tecidos vegetais. Nume rosos fungos fitopatogénicos contêm quitina como componente in tegrante das suas estruturas de hifas e esporos, por ex., os basidiomicetes (fungos causadores da ferrugem ou mangra), as-comicetes e Fungi imperfecti (incluindo Alternaria e Bipolaris Exerophilum turcicum, Colletotricum, Gleocercospora e Cercospo ra) . A quitinase consegue inibir o crescimento micelar de determinados agentes patogénicos, in vitro. Uma folha ou uma raiz de uma planta que vier a exprimir a quitanase de forma construtiva ou como resposta à penetração de um agente patogé \ nico, deverá, assim, estar protegida contra um ataque de um grande número de diferentes fungos. (Consoante a situação espe cífica, uma expressão constituída poderá ser vantajosa em comparação com uma expressão indutível, que ocorre em muitas piar. tas como reacção normal a um ataque patogénico, dado que, no primeiro caso, a quitanase estará presente imediatamente numa elevada concentração, pelo que se pode prescindir de um período de espera (fase de retardamento; lag-phase) para a nova síntese. -36-

(fase de retardamento; lag-phase) para a nova síntese.

Uma resistência a insectos pode ser transferida , por ex., por um gene gue codifica um poli-péptido gue é tóxico para ensectos e/ou as suas larvas, tal como, por ex., a proteína cristalina de (cf.pag.24). Uma según da classe de proteínas que conferem resistência a insectos são os inibidores da protease. Os inibidores de proteases formam um constituinte normal de estruturas de armazenagem em plantas (Ryan, 1973). Ficou demonstrado de que um inibidor da protease de Bowman-Birk, isolado e purificado a partir da soja, injl be a protease intestinal de larvas de Tenebrio (Birk etal., 1963). 0 gene que codifica o inibidor de tripsina da ervilha da vaca é descrito por Hilder et al., (1987)).

Num vector apropriado, um gene c que codifica um inibidor de protease pode ser lavado ao controlo de um promotor vegetal, em especial, um promotor constitutivo, tal como, por ex., o promotor CaMV 35S /que vem des: crito por Odell et al., (1985)/. O gene, por ex., a sequência de codificação do inibidor da protease de Bowmann-Birk da soja pode obter-se mediante o método de clonação de c-ADN, descrito por Hammond et al (1984).

Outro método para a produção de um inibidor de protease consiste na preparação sintética do inibidor, desde que não contenha mais de 100 amino-ácidos, tal como, por ex., o inibidor de tripsina do feijão de Lima. Pode prever-se a sequência de codificação através da re-tradução da sequência de aminoácidos. Além disso, introduzem-se locais de clivagem de restrição em ambas as extremidades, locais esses que são apropriados para o respectivo vector desejado. Produz--se o gene sintético mediante a sintese de fragmentos de oli-gonucleótidos sobrepostos com 30 a 60 bases emparelhadas; em primeiro lugar, submete-se os fragmentos a uma reacção com quinase, e, em seguida, procede-se à sua ligação entre si 37-

(Maniatis et al., 1982), e por fim, procede-se à sua clonação num vector apropriado. Com o auxílio da detecção das sequências de ADN, torna-se possível identificar o material inserido numa orientação correcta. Para a sua inserção nos meristema;; utiliza-se, de preferência, ADN isolado de plasmídios. O presente invento abrange igualmente genes capazes de codificar constituintes farmacológicamente activos, por ex . , alcaloides, esteróides, hormonas e ou tras substâncias fisiológicamente activas, e ainda flavina, vitaminas e substâncias corantes. Assim, no âmbito do presente invento, genes apropriados são - sem que a seguinte enumeração implique qualquer limitação - genes específicos para plantas por ex., o gene para a zeína, (Wienand et al., 1981), genes específicos para mamíferos, tal como o gene da insulina, o ge ne da somatostatina, os genes de interlecuina, o gene de t-PA (Pennica et al., 1983). etc., ou gnes de origem microbiana, tal como o gene NPT II, e genes sintéticos, tal como o gene da insulina (Itakura et al., 1975).

Para além de genes naturais, que codificam uma propriedade útil e desejável, o âmbito do presen te invento prevê também a utilização de genes que foram modificados préviamente de forma especifica, mediante métodos qui. micos ou métodos inspirados na engenharia genética. 0 âmbito vasto do presente inven to abrange também genes que foram obtidos exclusivamente atra vés de síntese quimicas. São também apropriados para o processo de acordo com o presente invento outras sequências de ADN úteis, em especial sequências de ADN sem acção codificante que exercem apenas funções reguladoras. Estas sequências de ADN nâo-codif icantes sãe. capazes, por ex. , de regular a tranjs crição de uma sequência de ADN associada em tecidos de plantas. -38-

Neste contexto, podem ser mencionados, por ex., o pormotor do gene hps70 , que pode ser induzi, do por um choque térmico (Spena et al., 1985); a sequência flanquadora da região 5'. da sequência, codificada no núcleo, da pequena subunidade do gene da ribulose-1,5-bifosfato-carbo xilase (RUBISCO) /Morelli et al., .1985/ ou da proteína de ligação a/b da clorofila, que se pode induzir pela acção de luz; ou a região flanquedora da região 5' do gene da álcool-desidrogenase (adhl-s) do milho que, em condições anaeróbias induz a transcrição de um gene "relator" associado /por ex., o gene da cloranfenicol-acetil-transferase (CAT) / (Howard et al. , 1977).

Um outro grupo de sequências de ADN reguláveis são sequências reguláveis quimicamente, que estão presentes, por ex., nos genes de proteínas PR ("protejí nas relacionadas com a patogénese") do tabaco, e que podem ser induzidos com o auxilio de reguladores químicos.

As sequências de ADN reguláveis atrás mencionadas a titulo de exemplos poderão ser de origem natural ou sintética ou poderão ser constituídas por uma mistura de sequências de ADN naturais e sintéticas.

Assim, genes ou sequências de ADN que são apropriados no âmbito do presente invento, são gene(s) ou ADN homólogo(s) e gene(s) ou ADN segundo a defini_ ção apresentada no âmbito do presente invento. A sequência de ADN pode ser esta. belecida exclusivamente a partir de ADN genómico, c-ADN ou a partir de ADN sintético. Uma outra possibilidade consiste na constituição de uma sequência de ADN híbrida, apresentando tanto c-ADN como ADN genómico e/ou ADN sintético. -39-

Neste caso, o c-ADN poderá ser derivado do mesmo gene que o ADN genómico, ou tanto o c-ADN como o ADN genómico podem provir de genes diferentes. No entanto, em qualquer um dos casos apresentados, tanto o ADN genómico e/ou o c-ADN podem ser preparados, individualmente, a partir do mesmo gene ou a partir de genes diferentes.

Se a seguência de ADN contiver fragmentos de mais de um gene, estes genes podem originar do mesmo organismo, de vários organismos pertencentes a diferentes estirpes ou variadades da mesma espécie ou de várias espécies do mesmo género, ou de organismos pertencentes a mais de um género da mesma unidade taxionómica ou de uma unidade taxionómica diferente (reino).

Para garantir a expressão dos referidos genes estruturais na célula da planta, há vantagem em ligar primeiro, de maneira funcional, as sequências de genes codificantes a sequências de expressão capazes de exercerem funções em células vegetais.

Assim, no âmbito do presente invento, os conjuntos de genes hídribos contêm, para além do(s) ge-ne(s) estrutural(ais), sinais de expressão que também abrangem sequências promotoras e terminantes e ainda outras sequências reguladoras das regiões 3' e 5' não-traduzidas. Qualquer sequência promotora e terminante capaz de induzir a expressão de uma sequência de ADN codificante (gene estrutural) pode ser utilizada como componente da sequência de genes hídribos. São especialmente apropriados sinais de expressão que originam de genes de plantas ou de vírus de plantas. Exemplos de apropria das sequências promotoras e terminantes são aqueles dos genes da nopalina-sintetase (nos), dos genes da octopina-sintetase (ocs) e dos genes do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), ou sequências de ADN homólogas que ainda possuem as propriedades características dos referidos sinais de expressão.

No âmbito do presente invento preferem-se os sinais de expressão 35S e 19S do genoma de CaMV ou os seus homólogos, que se podem isolar a partir do referido genoma mediante técnicas da biologia molecular, tal como as des creve, por ex., Maniatis et al., 1982, e ligar à sequência de ADN codificante.

No âmbito do presente invento, entendem-se por homólogos dos sinais de expressão 35S e 19S sequências que, não bastante ligeiras diferenças na sequência, são essencialmente homólogas das sequências de partida e ainda são capazes de desempenhar a mesma função que aquelas sequências de partida.

De acordo com o invento se pode utl lizar como material de partida para as sequências de controlo de transcrição 35S, por ex., o fragmento de Seal da estirpe "S" de CaMV, que abrange os nucleótidos 6808-7632 do mapa genético (Frank G. , et al, 1980 ), A região promotora e 5'-não-tradu-zida de 19S encontra-se num fragmento do genoma entre o local de PstI (posição 5386) e o local de HindIII (posição 5850) do mapa genético de CaMV (Hohn et al, 1982). A correspondente região terminante e 3'-não-traduzida encontra-se num fragmento de EcoRV/BglIl, entre as posições 7342 e 7643 do genoma de CaMV.

No âmbito do presente invento preferem-se também os sinais de expressão da estirpe CM 1841 de CaMV, cuja sequência nucleotidica completa vem indicada por Gardner R.C. et al, 1981.

Um outro exemplo efectivo ou representante efectivo de um promotor para uma planta, que se pode utilizar, é um promotor para plantas de "sobre-produção". Quando ligado de forma funcional a uma sequência de genes que codifica um desejado produto de gene, este tipo de promotor deverá ser capaz de promover ou mediar a expressão da referida sequência de genes.

Promotores de sobre-produção para plantas, que podem ser utilizadas no âmbito do presente invento incluem o promotor da pequena sub-unidade (ss) da ribulo-sel,5-bifosfato-carboxilase da soja /Berry-Lowe et al., J. Mole cular e App. Gen., 1: 583-498 (1982)/ e o promotor da proteína de ligação a/b da clorofila. Estes dois promotores são conhecidos pela sua característica de serem induzidos pela acção da luz em células de plantas eucariotas /cf. por ex., Genetic En-gineering of Plants, an Agricultural Perspective, A Cashmore, Plenum, New York 1983, pages 29-38; Coruzzi, G et al., The Jour nal of Biological Chemistry, 258; 1399 (1983) e Dunsmuir, P et al.·, Journal of Molecular e Applied Genetics, 2: 285 (1983)/.

As diferentes secções de sequências de ADN podem ser unidas entre si, para se formar uma sequência de ADN completa codificante, por meio de métodos conhecidos per se., Métodos apropriados incluem, por ex., a recombi-nação in vivo de sequências de ADN, que apresentam secções homó Iogas e a união in vitro de fragmentos de restrição.

Utilizam-se como vectores de clo-nação geralmente vectores de plasmídeos ou de vírus (bacterió-fagos) com sequências de replicação e de controlo, e que derivam de espécies compatíveis com a célula-hospedeira.

Geralmente, o vector de clonação apresenta uma fonte de replicação (origem de replicação), e também genes específicos que resultem na formação de caracte-rísticas de selecção fenotípicas na célula-hospedeira transformada, em especial resistências a antibióticos ou a herbicidas específicos. A seguir a uma transformação, os vectores transformados podem ser seleccionados numa célula-hospedeira com ba

se naqueles marcadores fenotipicos.

Marcadores fenotipicos seleccioná-veis, que podem ser utilizados no âmbito do presente invento, incluem sem limitação do objecto do presente invento resistências frente à ampicilina, tetraciclina, higromicina, canamiciníL metotrexato, G 418 e neomicina.

De acordo com o presente invento são células-hospedeiras apropriadas os procariotas, incluindo hospedeiros bacterianos, tais como, por ex., (Cf. pag.28), e também ciano-bactérias. Podem também utilizar-se no âmbito do presente invento os hospedeiros eucariotas, tais como leveduras , fungos que formem micélios, bem como células de plantas. A inserção da estrutura génica híbrida de acordo com o invento num apropriado vector de clona-ção realiza-se mediante métodos usuais, estandardizados, tais como aqueles descritos, por ex., por Maniatis et al., 1982.

Geralmente, o vector e a sequência de ADN que se pretendem inserir são primeiro clivados com apropriados enzimas restritivas. Enzimas restritivas adequadas, são por ex., aquelas dando origem a fragmentos com extremidades obtusas ou lisas, tais como, pro ex., Smal, Hpal e EcoRV ou enzimas que formem extremidades coesivas, tais como, por ex., EcoRI, Saci e BamHI.

Tanto os fragmentos com extremida des obtusas ou lisas como aqueles'contendo extremidades coesivas, e que sejam complementares um do outro, podem ser unidos novamente mediante ADN-ligases apropriadas para a formação de uma molécula de ADN uniforme e contínua.

Podem obter-se extremidades obtusas ou lisas também por meio do tratamento de fragmentos de -43-

ADN com extremidades coesivas salientes com o fragmento de Klenow da ADN-polimerase de E. coli, preenchendo as lacunas com os correspondentes nucleótidos complementares.

Por outro lado, podem também obter -se extremidades coesivas por processos artificiais, -por ex., pela adição de caudas homo-polxmeras complementares às extremidades de uma desejada sequência de ADN e da molécula vectori. al clivada, utilizando uma desoxinucleotidil-transferase terminal, ou pela junção de sequências oligonucleotidicas sintéticas (ligantes), que apresentem um local para a clivagem restritiva, e clivagem subsequente por meio da enzima apropriada.

Geralmente, utilizam-se o vector de clonagem e a célula-hospedeira transformada por aquele vec tor para aumentar o número de cópias (réplicas) do vector. Com um número aumentado de cópias ou réplicas torna-se possível isolar o vector que apresenta a estrutura génica híbrida e utilizá-la, por ex., para a inserção da sequência génica quimérica na célula da planta.

De acordo com uma outra etapa do processo do invento, estes plasmídeos são utilizados para inserir os genes estruturais que codificam ' um determinado produto génico, ou as sequências de ADN não-codificantes com funções reguladora, na célula da planta e para integrá-la no ge-noma da planta. 0 extenso âmbito do presente inven to abrange também plantas transgénicas transformadas mediante o processo do invento, atrás referido, isto é aquelas que contenham e exprimam de forma comprovável, o material genético introduzido bem como a sua descendência assexuada e/ou sexua-da, que ainda contenha o material genético introduzido e, que por isso, apresente, regra geral , a(s) nova(s) e desejável (veis) propriedade(s) condicionada(s) pela propagação vegetal -44- em geral. A expressão de "descendência asse xuada e/ou sexuada de plantas transgenéticas", tal como definida do âmbito do presente invento, abrange, assim, também todos os mutantes e variantes que ainda contêm o material genético introduzido e gue, por conseguinte, e em regra, apresentam as propriedades características da planta de partida transformada bem como abrange todos os produtos de hidridação e de fusão con tendo o material vegetal transformado. 0 termo de "material de propagação vegetativa" tal como vem definido no âmbito do presente invento, abrange , por ex., elementos vegetativos de plantas, tais como protoplastos, células, clones celulares, aglomerados celulares, culturas de calos, culturas de tecidos e/ou culturas de órgãos, e ainda sementes, pólen, óvulos, zigotas,embriões ou outro material de propagação que deriva de células de linhagens germinativas; esta lista que se apresenta apenas a titulo de exemplo não constitui qualquer limitação ao abjecto do presente invento. 0 presente invento refere-se tam bém a partes de plantas, tais como,por ex., botões, caules, frutos, folhas e raízes, que devem a sua origem a plantas transgénicas ou à descendência delas, que foram transformadas préviamente mediante o processo do presente invento, e que, por isso, estão constituídas, pelo menos em parte, por células transgénicas. 0 processo de acordo com o presente invento é apropriado para a transformação de todas as plantas, em especial daquelas pertencentes às sub-divisões ta-xionómicas de plantas angiospérmicas e gimnospérmicas.

De entre as plantas gimnospérmicas revestem-se de especial interesse as plantas da classe das coníferas.

Revestem-se de especial interesse entre as plantas angiospérmicas para além das árvores decíduas e arbustos.as plantas das familias de Solanaceae, -.-Crucif erae, Compositae, , Liliaceae, Vitaceae, , Chenopodiaceae, Rutaceae, Alliaceae, Amaryllidaceae, Asparagaceae, Orchidaceae, Palmae, Bromeliaceae, Rubiaceae, Theaceae,Musaceae, Malvaceae, ou Gramineae, e da ordem de Luguminosas e, destas, em especial as da familia Papilionaceae. Preferem-se representantes das familias de Solanaceae, Cruciferae, Leguminose, Malvaceae e Gramineae.

No âmbito do presente invento, as culturas-alvo incluem também, por ex., aquelas escolhidas da série Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigo-nella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabi-dopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hemerocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Penni·· setum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum e Sorghum, Gossypium, Ipomoea, Passiflora, Cyclamen, Malus, Prunus, Rosa, Rubus, Populus, San-talum, Allium, Lilium, Narcissus, Ananas, Arachis, Phaseolus e Pisum. A realização de uma transformação bem conseguida pode ser verificada de maneira conhecida per, se, por ex., por meio de pesquisas de biologia molecular., que incluem, sobretudo, a análise designada por "Southern blot".

Segundo a referida análise, o ADN extraído é primeiro tratado com enzimas restritivas, e, em seguida, é submetido a electroforese, num gele de agarose a 0,8% -1%, transferido para uma membrana de nitrocelulose /Southern EM,J. Mol.Biol.98,.50 3-517 (1975), e hibridado com o ADN que -46- se pretende dosear (detectar), e que tinha sido submetido a uma tradução sobre interrupção (nick translation) /Righy, WJf Dieckmann, M, Rhodes, C e P Berg, J.Mol. Biol.113, 237-251/ (actividades específicas de ADN de 5 x 10^ a 10 x 10^ cp.m./ /Ng). Os filtros são lavados 3 vezes, durante 1 hora de cada vez, com uma solução aquosa de 0,03M de citrato de sódio e 0,3 M de cloreto de sódio, a 56°C. Consegue-se visualizar o ADN hi bridado pela exposição (enegrecimento) de'uma película de raios -X durante 24 a 48 horas.

Para ilustrar a presente especificação, um tanto generalizada, e para assegurar uma melhor compreensão do presente invento, apresentam-se, seguidamente, exemplos práticos específicos que, no entanto, não têm carácter limitativo, a não ser que haja uma menção especial neste sentido. O mesmo critério se aplica também a todas as listas apresentadas a titulo de exemplos, na referida especificação.

Exemplos não-limitativos:

Exemplo 1: constituição do plasmídeo pABDI

Os plasmídeos , prontamente acessíveis, pKm21 e pKm244 /Beck, E, et al., Gene jL9, 327-336 (1982)/ são clivados com a endonuclease restritiva PStI. Os fragmentos de plasmídeos que se utilizam para a recombinação são purificados mediante electroforese em gel de agarose, a 0,8%. O plasmídeo pKm 21244, obtido pela junção dos fragmentos contém uma combinação das delecções de 51 - e 3'-Bal21 do gene NPT-II, tal como descreve Beck et al., em Gene JJ?; 327-336 (1982). Para a junção do sinal promotor do vírus do mosaico da couve-flor ao fragmento HindIII do plasmídeo pKm 212144, proce de-se ã constituição do plasmídeo de acoplamento pJPAX. O pias mídeo de acoplamento pJPAX obtém-se a partir dos plasmídeos pUC8 e pUC9 /Messing, J. e J. Vieira, Gene 19_, 269-276 (1982)/ 10 pares de bases da sequência ligante do plasmídeo pUC9 são separados por clivagem nos locais de HindIII e Sall e em se- -47- -47- e gunda se procede à colmatação das extremidades coesivas, mediant o fragmento de Klenow da polimerase I /Jacobsen, H, et al., Eur. J. Biochem. 45, 523, (1974)/, e acoplamento da cadeia polinuclec tídica, pelo que se reconstitui o : local de HindIII. Um elemento de acoplamento sintético com 8 pares de bases (Xhol) é in- troduzido no local de Smal desta sequência de acoplamento separada. A recombinação dos apropriados fragmentos de XorI e de Hin dlll do plasmídeo pUC8 e do plasmídeo pUC9 dá origem ao plasmí-deo pJPAX com uma sequência de acoplamento parcialmente assimétrica e apresentando os seguintes locais restritivos sucessivos: EcoRI, Smal, BamHI, Sall, PstI, HindIII, BamHI, Xhol e EcoRI. A região promotora VI do gene de CaMV, que se liga ao gene estrutural NPT-II, deriva do genoma da estirpe CM 4-184 de CaMV, uma variante da estirpe CM 1841 de CaMV, cuja sequência nucleotídica completa vem descrita por Gardner, R.C. et al, 1981. A clonação da região promotora de CaMV efectua-se no cosmídeo pHC79, que contém 6 KBp (KBp: 1000 pares de bases (basepairs) e que é deri^ vado do plasmídeo pBR322 de E. coli /Hohn, B e Collins,J, 19801/ sendo o genoma de CaMV e o cosmideo pHC79 clivados com BstII, e os fragmentos resultantes são unidos entre si. O sinal de expressão 5' do gene VI do vírus do mosaico da couve-flor e o fraç mento HindIII do gene NPT-II são unidos no plasmídeo pJPAX pela inserção da região promotora do gene VI do vírus do mosaico da couve-flor entre o local de PstI e o local de HindIII. O plasmídeo resultante é clivado no único local HindIII e o fragmento HindIII do plasmídeo 21244 é introduzido neste local de clivagem em ambos os sentidos de orientação, dando origem aos plasmídeos pJPAXCaKm+ e pJPAXCaKm. Para a criação de uma sequência de EcoRV na proximidade do sinal terminante no sentido 3' do gene hibridc NPT-II, ensere-se um fragmento BamHI do plasmídeo pJPAXCaKm+ no local de BamHI do plasmídeo pBR327 /Soberon,X et al.,Gene 9_, 287-305 (1980 )./. Obtém-se o plasmídeo pBR327CaKm. Utiliza-se o fragmento EcoRV do plasmídeo pBR327CaKm, que contém a nova cons tituição de ADN, para substituir a região de EcoRV do gene VI do virus do mosaico pUC8, pelo que a sequência de ADN, capaz de codificar proteínas, do gene NPT-II passa a ser controlado pelos -48-

sinais de expressão no sentido 51 e 31 do gene VI do vírus do mosaico da couve-flor. Os plasmídeos obtidos são designados por pABDI e pABDII.

Exemplo 2: Constituição do plasmídeo pDH51 O plasmídeo pDH51 foi descrito por Pietrzak et al., 1986. Este plasmídeo contém a região promotora 35S e a região de terminação de CaMV, gue estão separadas por uma região de poli-ligantes (poly-linker) inserida que apresenta numerosos locais de clonação. 0 material de partida utilizado para a região terminante promotora 35S é um fragmento Seal de CaMV "S", que inclui os nucleótidos 6808-7632 do mapa genético (Frank, G, et al., Cell, 21; 285-294, 1980) e que é introduzido no local Smal de pUC18 (Norrander, J, et al., Gene, 26.101--106, 1983), para a formação do plasmídeo pDB21. Este é seguidja mente digerido com a enzima restritiva Hphl. Removem-se as extremidades coesivas mediante tratamento com T4-ADN-polímerase.

Um fragmento contendo a região promotora 35S /pUC18 pos. 21 (Hphl)-412 (smal) + CaMV pos. 6808-7437 (Hphl) / é unido a unidades de acoplamento Kpnl, é clivado com Ncol (pos. 6909 CaMV), as extremidades coesivas são colmatadas mediante o fragmento de Klenow de ADN-polimerase, unidos a ligantes de EcoRI e, por fim, digeridos com EcoRI e Kpnl. 0 fragmento de EcoRI/Kpnl resultante, que contém a sequência promotora de CaMV, é inserido no plasmídeo pUC18, entre os locais de clivagem de restrição kpnl e EcoRI. Obtém-se desta forma o plasmídeo pDG2.

Um segundo fragmento que apresenta os sinais de terminação (CaMV pos. 7439 (Hphl)-7632 + pUC 18 pos. 413-1550 (Hphl) é clivado com EcoRI, as extremidades coesivas são colmatadas mediante o fragmento de Klenow, munidas de ligantes de HindIII e degiridas com HindIII e Sphl.

0 fragmento Sphl-HindIII resultante, que contém a sequência terminante de CaMV é seguidamente unido ao plasmídeo pDG2, nos locais de clivagem de restrição de HindIII e Sphl.

Exemplo 3: Constituição do plasmídeo pHP23

Procede-se à constituição do plasmídeo pHP23 pela inserção de um fragmento de EcoRV do plasmídeo pABDI, que contém o gene estrutural APH(3')II e ainda uma parte da sequência promotora 19S de ARN do CaMV, no local de clj: vagem de Smal do plasmídeo pDH51.

Exemplo 4: Preparação e micro-injecção de plântuias germinati-vas de tabaco 4.1 Sementes de Nicotiana tabacum c.v. Petite Havanna SR 1 são germinadas num solo não estéril, sendo cultivadas até se formarem as correspondentes plântuias germinativas. A iluminação incide, da parte de cima, ao passo que as partes laterais e a base são protegidos de qualquer irradiação através da colocação de uma cobertura negra. Desta maneira mantém-se curto o vértice germinativo. 0 período de germinação depende da actividade germinativa das sementes utilizadas. Geralmente, este período varia entre 3 e 6 dias. 4.2 Preparação das plântuias germinativas para a micro-injecção

Quando os cotilédones tiverem atingido um tamanho de cerca de 1,5 mm, removem-se as plântulas do solo e expõem-se os cones vegetativos. Remove-se um ou removem-se ambos os -50-

cotilédones, ou separam-se os cotilédones, desdobrando-os,por meio de um dispositivo de fixação, até se tornar visível o me-ristema apical. 4.3 Micro-injecção de ADN do plasmídeo pHP23 em plântulas ger-minativas de tabaco 4.3.1. Aparelhagem A microinjecção no cone vegeta-tivo das plântulas de tabaco realiza-se com observação ao mi- ' croscópio de imagem invertida ou um microscópio estereoscópico, com uma combinação de luz incidente e luz transmitida. Utiliza--se uma fonte de luz fria como luminação a fim de evitar o desprendimento de calor. A ampliação depende do tamanho das plântulas e varia entre 10X e 300 X. A manipulação das plântulas realiza-se mediante micro-manipuladores, que se podem fixar a mesa do microscópio (manipuladores accionados por motor ) ou gue podem ficar ao lado do microscópio (manipuladores , manuais) Os micromamipuladores são equipados com suportes para capilares.

Como capilares de micro-injecção utilizam-se capilares de micro-eléctrodos com filamentos de vitro selados (fundidos) de borossilicato com um diâmetro exterior de 1,00 a 1,50 mm. Para a fixação das plântulas na sua posição durante a operação de injecção utilizam-se dispositivos de aperto propositadamente concebidos para esta finalidade No dispositivo de aperto, os cotilédones são mantidos na sua posição de forma segura num suporte especial, por ex., um dispc sitivo de retenção metálico; os supotes movem-se relativamente -51- um ao outro, de modo que os cotilédones podem ser desdobrados até se tornar vísivel o cone vegetativo, sendo este portanto acessível à micro-injecção subsequente. 0 capilar de injecção é estirado mediante uma aparelhagem (x) para a estiragem de capilares (comercial), de modo a obterem-se capilares de injec ção apropriados (diâmetro da ponta de cerca de __ 1 um).

Para a exposição do cone vegetativo também poderá utilizar-se qpalquer outro processo apropriado. A solução de ADN é injectada por meio de um micro-injector. Este micro-injector é um dispositivo de pressão accionado por ar comprimido, que permite uma injecção muito finamente oseada nas células do cone vegeta tivo. 0 volume de injecção varia, de acordo com o tamanho da célula, entre 1 pl e 100 pl. Micro-injectores apropriados podem adquirir-se, por ex., às seguintes empresas: Eppendorf (RPA) ou Bachofer (RPA).

4.3.2. Solução de ADN A solução de ADN micro-injecta da é constituída por ADN de pHP23 espiralado ou linear, ou uma mistura de ADN de pHP23 espiralado e linear, numa solução-tampão de Tris-HCl, constituída por 50 mM de Tris-HCl, pH 7 - 7,8, e 50 mM de NaCl. 4.3.3. Micro-injecção A micro-injecção da solução de ADN, descrita atrás, nas células do meristema apical de plântu las de tabaco realiza-se análogamente ao processo indicado por Neuhaus et al., 1984; 1986.

Em primeiro lugar, cada plântu-la é segurada, por apenas um cotilédone ou por ambos os cotilédones, num dispositivo de retenção metálico, existindo para cada cotilédone um dispositivo de retenção.

Dado que os referidos dispositi vos de retenção metálicos podem ser deslocados um relativamente ao outro, o(s) cotilédone(s) pode(m) ser esticado(s) cuidadosamente até o meristema apical ficar exposto de modo a permitir a subsequente microinjecção sem qualquer dificuldade.

Injecta-se cada plântula 4 a 60 vezes, consoante o tamanho do meristema apical exposto, sendo a plântula virada durante as várias operações de injecção, pa ra que um número tão grande como possível de células possam ser injectadas. Em seguida, as plântulas injectadas são de novo transferidas para o solo, onde prossegue a sua cultura. 4.4 Cultivo das plântulas de tabaco micro-injactadas e desenvolvidas de plantas de tabaco completas A seguir à micro-injecção, as plântulas são novamente colocadas no solo contido em recipientes de material plástico com um diâmetro de 9 cm e uma profundidade de 5 cm, onde são cultivados , 25°C - 28°C, com adopção de uma alternativa de luz/escuridão de 16/8 horas (4000 Lux, luz branca fria), e a humidade de 70 a 80% e a pressão normal (pressão atmosférica, cerca de 760 mbar), até as plantas atingirem uma altura de 3 cm, o que demora, geralmente , entre 2 e 5 dias. Em seguida, as plantas são colocadas numa estufa, metidas no solo e cultivadas, da mesma maneira que plântulas de tabaco normais, até à maturação das plantas .

As plantas obtidas da forma atrás descritas são transformantes heterogéneos, cuja natureza quimérica pode ser comprovada mediante os métodos indicados nas secções 7 e 8.

Exemplo 5: Produção e micro-injecção de meristemas apicais isolados de plântuias de tabaco. 5.1 Material vegetal usado

Procede-se à esterilização superficial de sementes de plantas de Nicotiana tabacum c.v. Pe-tite Havanna SR 1. Para este fim lavam-se primeiro as plantas (durante alguns poucos segundos) em etanol, 1 70%, e, em segui_ da, as plantas são enxaguadas com água destilada, esterilizada. Seguidamente, as plantas são tratadas, durante 30 minutos, numa solução de hipoclorito de cálcio, 1 1,5%. Em seguida, as plantas são lavadas, 3 vezes, em água destilada, préviamente esterilizada, e são secas depois. Cerca de 50 sementes são seguidamente introduzidas numa caixa de Petri (diâmetro de 10 cm) contendo um meio nutritivo usual (Tl), onde se induz a sua germinação. A iluminação incide apenas do lado de cima, enquan to as partes laterais e a base ficam protegidas contra qualquer irradiação mediante a aplicação de um revestimento negro. Em consequência destas medidas se mantêm curtos os cones vegetati-vos, o que é vantajoso para a micro-injecção que se segue. 5.2 Micro-injecção de ADN do plasmídeo pHP23 em plântulas de tabaco A preparação das sementes para a micro-injecção e a própia micro-injecção realizam-se análo- -54-

gamente aos métodos referidos nas secções 4.2 e 4.3. 5.3 Isolamento ou extracção do cone vegetativo micro-injectado

Após a micro-injecção, removem-se das plantas sob um microscópio estereoscópico ambos os cotilédones, bem como outras folhas rudimentares eventualmente presentes. 0 vértice vegetativo exposto é separado mediante um esalpelodo resto do gema ou gomo, cerca de 0,5 mm a 2 mm, mas, de preferência 1 mm, abaixo da ponta vegetativa, prosseguindo a sua cultura num apropriado meio de cultura (T2). Geralmente utilizam-se para o cultivo dos vértices vegetativos isolados placas de Terrasaki (Nunc, Dinamarca), efectuando-se o cultivo em 10 ul a 20 ul do meio T2.

Ao fim de aproximadamente 5 a 15 dias, mas de preferência decorridos 10 dias, os meristemas apicais em desenvolvimento são transferidos para um meio de cultura selectivo (T3). Utilizam-se, geralmente, placas de Cos-tar ("24 wells; diâmetro de 16 mm, fabricadas por Tissue Cultu-re Cluster, Cambridge, Mass.), biótico canamicina, numa concentração ao entre 20 ug/ml e 200 ug/ml, mas , de preferência numa concentração de 50 ug/ml (T3). Nestas condições selectivas, irão apenas sobreviver aquelas células contendo incorporado no seu genoma o gene para a respectiva resistência, inserido por micro-injecção, e que também sejam capazes de exprimir este gene, dado que apenas aquelas células serão resistentes ao antibiótico. Após mais um período de cultivo de 10 a 20 dias de preferência 15 dias, as massas celulares em desenvolvimento são transferidas para um outro meio de cultura (T4), que também contém o antibiótico canamicina na mesma concentração, mas que estimula as células a uma regeneração au?entada de gomos adventícios como resultado da concentração hormonas que tinha sido determinaia. Também neste caso apenas irão desenvolver-se -55- aqueles gomos que apresentam o gene de resistências injectado incorporado no seu genoma, uma vez que, tal como atrás se disse, o meio de cultura continua a exercer a sua pressão selec-tiva.

Por fim, induzem-se os gomos regenerados a lançar raizes pela sua transferência para meios apropriados (T5), após o que os gomos são colocados no solo e, por último, cultivados numa estufa até à maturação das sementes .

Exemplo 6: Detecção do gene NPT-II no genótipo da planta

Procede-se à homogenização, a 0°C, e a um pH de 8,0, de tecido foliar das plantas regeneradas em solução de sacarose, a 15%, contendo, 50 mmoles/1 de ácido etilenodiamino-N,N,N1,N'- tetra-acético (EDTA), 0,25 mole/1 de cloreto de sódio e 50 mmoles/1 de hidrocloreto de alfa, alfa, alfa-tris-(hidroximetil)-metilamina (TRIS-HC1). Os núcleos celulares são separados durante, de modo groseiro, pela centri. fugação do material vegetal homogeneizado durante 5 minutos, a 1000 G. Resuspendem-se os núcleos celulares numa solução de sacarose, 15% , contendo 50 mmoles/1 de EDTA e 50 mmoles/1 de TRIS-HCl, a um ph de 8,0; junta-se dodecilsulfato de sódio (SDS) até se atingir uma concentração final de 0,2%, e a mistu ra é aquecida, até 70°C, durante 10 minutos. Depois do arrefecimento da mistura a 20-25°C, adiciona-se acetato de potássio até a concnetração se situar em 0,5 mmoles/1. Esta mistura é incubada durante 1 hora, a 0°C. O precipitado resultante é separado mediante centrifugação (15 minutos), a 4°C, numa mi-cro-centrifuga). Induz-se a precipitação do ADN a partir do líquido que sobrenada, a 20-25°C, pela adição de um volume 2, 5 vezes maior de etanol. O ADN separado é dissolvido numa solu ção de 10 mM TRIS-HC1, contendo 10 ug/ml de ribonuclease A, e é incubado, durante 10 minutos, a 37°C; junta-se proteínas K até se chegar a uma concentração de 250 ug/ml, e a mistura re sultante é incubada por mais 1 hora, a 37°C. Remove-se a pro-^ teínase K mediante processos de extracção com fenol e cloro-fórmio/álcool isoamilico. O ADN precipita a partir da fase aquosa pela adição de 0,6 partes, em volume de uma solução 0,6 Mde acetato de sódio, em isopropanol, e é dissolvido em 50 ul de uma solução contendo 10 mmoles/1 de TRIS-HC1 e 5 mmoles/ /1 de ETA, a um pH de 7,5. Através desta preparação obtêm-se sequências de ADN, a maioria das quais apresentam mais de 50 .000 bases emparelhadas. A restrição deste ADN mediante endonuclease de EcoRV, hibridação dos fragmentos com fragmentos de HindIII, marcados radioactivamente, do gene NPT-II, e comparação com o plasmídeo pABDI, demonstra por meio da análise de "Southern blot" a presença do gene NPT-II no ADN : no núcleo celular das células das plantas transformadas.

Exemplo 7: Análise por meio de "Dot-blot" 10 ug de ADN genómico são digeridos, durante uma noite, com EcoRI e, em seguida, são aplicados, sob a forma de pontos (dots), sem separação electroforé-tica prévia, directamente sobre uma membrana de nitro-celulose (cf., as instruções do método de Schleicher & Schuell Gmbh, Dassel, RFA ). A reacção de hibridação e a autor radiografia subsequente realizam-se de maneira análoga à do método da análise de "Southern blot". -57-

Exemplo 8: Análise por"South ern blot" A análise de Southern blot do ADN da planta realiza-se de acordo com um método divulgado por Paszkowski e Saul, 1983.

Cerca de 5 ug de ADN genómico são clivados, quer com EcoRV, quer com HindIII ( enzimas restritivas ), conforme as conveniências, e os fragmentos obtidos são separados mediante electroforese, num gel de agarose-padrão, a 0,8% a 1% (Maniatis, T., et al., 1982). A tradunão "nikc" (tradução por interrupção) é substituída pelo método de "random primer" (activador ao acaso) descrito por Feinberg e Vogelstein, 1983.

Exemplo 9: Determinação da actividade enzimática de aminogli-cósido-fosfotransferase das plantas transformadas

Pedaços de folhas (100 a 200 mg) são homogenizados em 20 ul de uma solução-tampão extractiva, num tubo de centrifugação de Eppendorf. O referido tampão é uma modificação do tampão utilizado por (cf. pag.39), em que se substitui a soroalbumina bovina por 0,1M de sacarose Os extractos são submetidos a centrifugação durante 5 minutos a 12.000 G, juntando-se azul de bromofenol à fase que sobrenada, até se atingir uma concentração final de 0,004%. -58-

As proteínas são separadas de 35 ul da fase que sobrenada mediante electroforese, num gel de poliacrilamida não-desnaturada, a 10%. Uma camada de um gel de agarose contendo Kanamicina e ATP marcado com gama é colocada sobre gel, procede-se a incubação e transferem-se os produtos reaccionais fosforilados pa ra papel de fosfo-celulose p81 de Whatman. O papel é lavado 6 vezes com água desionizada de 90°C, e, em seguida, é submetido a autoradiografia.

Resultados

No caso de plantas de tabaco foi possivel realizar a regeneração de plantas transgénicas, inteiras , a partir de meristemas apicais micro-injectados ~ por meio de cultivo directo de plantas de cultura in vitro, sob pressão de selecção; neste caso, as taxas de regeneração conseguidas eram muito elevadas. No caso de culturas in vitro, com selecção, as plantas regeneradas são utilizadas para a determinação da frequência de transformação (expressão).

Aplica-se o seguinte método a todas as restantes plantas que se podem obter directamente a partir das plântulas micro-injectadas: A seguir à auto-fecundação , as sementes destas plantas são germinadas e a geração des tas plantas é aproveitada para demonstrar a transformação e a expressão do gene. Ainda 6 semanas após a micro-injecção foi possivel detectar o gene de NPT-II injectado, através da acti-vidade de expressão génica. A expressão do gene integrado é comprovada mediante o teste enzimático descrito no exemplo 9 (determinação da actividade de aminoglicósido-fosfotransferase).

As taxas de expressão determinadas desta forma variamente 5 % e 35%. Mediante a análise de -59-

Southern blot do ADN genómico das referidas plantas da geração se torna possível demonstrar a integração estável dos genes micro-injectados completos no ADN de elevado peso molecular, da geração F^, que provém das regenerantes primárias.

Depósito 0 plasmídeo pHP23, utilizado no âmbito do presente invento, foi depositado no "Centro de recolha de microrganismos alemão" (DSM), na cidade de Braunschweig RFA, entidade internacionalmente reconhecida para este fim, de acordo com as estipulação do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional de depósitos de microrganismos para concessão das respectivas patentes. A referida entidade internacional de depósitos emitiu uma certidão concernente a viabilidade das amostras depositadas.

Microrganismo Data de depósito número de data de certidão de depósito viabilidade pHP23 (DH1 de 21/12/1987 DSM 4323 21/12/1987

Escherichia coli transformado com ADN do plamídeo pHP23) *) emitido pela entidade internacional atrás mencionada.

Meios de cultura mg/1 TI T2 T3 T4 T5 Ca(N03)2 (4H20) 1000 - - - - KN03 250 1010 1010 1010 1900 kh2po4 250 136 136 136 170 NH4NO3 - 800 800 . 800 1650 CaCl2-2H20 - 440 440 440 440 MgS04-7H20 250 740 740 740 370 NH^succinaté1 - 50 50 50 - Na2EDTA - 74.6 74.6 74.6 74.6 FeCl3-6H20 - 27.0 27.0 27.0 27.0 Fe-EDTA 6.4 - - - - h3bo3 - 3 3 3 6.2 Kl - 0.75 0.75 0.75 0.83 MnS04-H20 - 10 10 10 16-9 ZnS04-7H20 - 2 2 2 8.6 CuS04-5H20 - 0.025 0.025 0.025 0.025 Na2Mo04’2H20 - 0.25 0.25 0.25 0.25 CoC12-6H20 - 0.025 0.025 0.025 - CoS04-7H20 - - - - 0.03 m-inositol - 100 100 100 100 piridci- .HC, xina - - 1 1 1 - tiamina-HCl - 10 10 10 0.04 ácido nicoti-nico - 1 1 1 - sacarose - 30 g/1 30 g/1 20 g/1 30 g/1 manitol .· - 30 g/1 - - - mg/1 TI · T2 T3 T4 T5 ágar 8000 - 6000 6000 6000 Sea Plaque® agarose - 6000 - - NAA ( ácido nafti] -1-acético 0.1 0.1 - 0.1 B AP ('benzi laminor-purina) - 1 1 0.25 - IBA (ácido 3-indol-butinico) - - 1

Referências bibliográficas 1. Barton CA etal, Plant Physiol,, 85: 1103-1109,1987 2. Beck et ai. Gene, 19: 327-336,1982 3. Berry-Lowe et ai, I Mol., Appl. Genet., 1: 483-498,1982 4. Birky et al, Biochim. Biophvs. Acta, 67: 326-328,1963 5. Cashmore A, "Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective”, Plenun, New York, 1983, pages 29-38 6. Chilton M-D, Scientific American, 248:50-59, 1983 7. Coruzzi G et al, The Journal of Biological Chemistry, 258: 1399,1983 8. De La Pena et al, Nature, 325: 274-276,1987 9. Dunsmuir P et al, J. Mol. Appl, Genet., 2: 285,1983 10. Feinberg and Vogelstein, Analvtical Biochemistrv, 132: 6-13,1983 11. Frank G et al, Cell* 21:285-294,1980 12. Gardner RC et al, Nucl. Acids Res., 9: 2871-2888,1981 13. Grimsley NHetal, Nature, 325:177-179,1987 14. Hammond et al, L Biol. Chem., 259: 9883-90,1984 15. Harris R. et al, Plant Cell Reports, 7: 337-340,1988 16. Hernalsteens JP et al. EMBQI, 3: 3039-3041,1984 17. Herrera-EstrellaLetal,EMBOJ,, 2: 987-995, 1983 18. Hilder VA et al, Nature, 330:160-163,1987 19. Hohn B and Collins J, Gene, 11: 291-298,1980 20. Hohn T et al, "Molecular Biology of Plant Tumors", Academic Press, pages 549-560,1982 21. Hooykaas-Van-Slogteren et al, Nature, 311:763-764,1984 22. Howard et al, Planta, 170: 535, 1977 23. Hakura K et al, J. Am. Chem. Soe., 97: 7327,1975 24. Jacobson H et al, Eur. J. Biochem., 45: 623,1974 25. Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982 26. Messing and Vieira, Gene 19:269-276,1982 27. Morelli et al, Nature. 315: 200,1985 28. Morikawa H and Yamada Y, Plant Cell Phvsiol., 26: 229-236,1985 29. Neuhaus G et al, EMBQ J, 3:2169-2172,1984 63- 30. Neuhaus G et al, EMBO J, 5: 1437-1444,1986 31. Neuhaus G et al, Theor. Appl, Genet., 75: 30-36,1987 32. Nomura K and Koraamine A, Plant Sei., 44: 53-58,1986 33. Norrander J et al. Gene. 26: 101-106,1983 34. Odell JT et d, Nature. 313: 810,1985 35. Paszkowski J et al, EMBO J. 3: 2717-2722,1984 36. Paszkowski J and Saul M, Methods in Enzvmology, 118: 627-646,1986 37. Paszkowski and Saul, "Direct Gene Transfer to Plants" in: Methods for Plant Molecular Biology, eds. A & H Weisbach, Academic Press, 1988, pages 447-463 38. Pennica P et al, Nature, 301:214,1983 39. Pietrzak M et al, Nucl. Acids Res., 14: 5868,1986 40. Poehlman JM, "Breeding Field Crops, Third Edition,, AVI Publishing Company, Inc., Westport, Connecticut, 1987" 41. Potrykus I et al» "Direct Gene Transfer to Protoplasts: An Efficient and Generally Applicable Method for Stable Alterations of Plant Genoms" in: Freeling M (ed.), Plant Genetics, A.R. Liss Inc., New York, pp. 181-199,1986 42. Rhodes CA et al, Biotechnology, 6:56-60,1988 43. Rigby WJ et al, J. Mol. Biol., 113: 237-251,1977 44. Rogers SG et al, "Gene Transfer in Plants: Production of Transformed Plants Using Ti-Plasmid Vectors, in: Methods for Plant Molecular Biology, eds. A & H Weisbach, Academic Press, 1988, pages 423-436 45. Ryan C et al, Ann. Rev. Plant Phvsiol., 24:173-196,1973 46. Soberon X et al, Gene, 9^ 287-305,1980 47. Southern EM, J. Mol. Biol,. 98:503-517,1975 48. Spangenberg G, "Manipulation individueller Zellen der Nutzpflanze Brassica napus L. mit Hilfe von Elektrofusion, Zellrekonstmktion und Mikroinjektion", PhD thesis, University of Heidelberg, 1986 49. Spena et al, EMBO J, 4:2736,1985 50. Steinbiss HH and Stable P, Protoplasma, 116:223-227,1983 51. Toríyama K et al, Theor. Appl. Genet., 73:16-19,1986 52. Vaeck M et d, Nature, 328:33-37, 1987 53. Wienand U et al, Mol. Gen. Genet., 182:440-444,1981 54. Yamada A et al, Plant Çell Rep,, 5: 85-88,1986

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES lã. - Processo para a inserção de material genético em plantas, caracterizado por se introduzir a técnica de micro-injecção, uma solução contendo ADN nas células de meristemas apicais e/ou axiais, préviamente ex postos, de plântulas germinantivas e, partindo das referidas plântulas micro-injectadas ou de partes delas, se criar plantas inteiras e, após a intercalação de um ou vários estádios de multiplicação sexuada ou assexuada, se seleccionar, por meio de processos conhecidos, a progénie assexuada ou sexuada transformada de forma homogénea, assim obtida, das referidas plantas de partida transformadas, heterogéneas. 2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as referidas plantas serem plântulas de germinação, que se encontram numa fase de desenvolvimento vegetal, que se estende desde o desenvolvimento co tiledonar incipiente até ao estádio da segunda folha. 3ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelaseseguintes etapas específicas : a) Germinação de sementes da respectiva planta-alvo e selec-ção de estádios de germinação apropriados; b) Exposição do meristema apical e/ou axial para a subsequente micro-inlecção; -6 5- c) Micro-injecção de uma solução contendo ADN, que encerra um ou vários fragmentos de ADN, nas células do meristema em b>*; d) Cultivação das plãntulas germinativas micro-injectadas até atingirem o estádio de plantas inteiras, transformadas de forma heterógenea; e) Produção de desdendência sexuada ou assexuada das plantas transformadas de forma heterogénea, obteníveis de acordo com o ponto d), e selecção da progénie transformada, homogénea. 4â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas seguintes etapas específicas; a) Germinação de sementes da respectiva planta-alvo e selecção de estádios germinativos apropriados; b) Exposição do meristema apical e/ou axial para a micro-in-jecção seguinte; c) Micro-injecção de uma solução contendo ADN, que encerra um ou vários fragmentos de ADN, nas células do meristema em b); -68- c) Micro-injecção de uma solução contendo ADN, que encerra um ou vários fragmentos de ADN, nas células do meristema em b); d^) Isolamento e regeneração in vitro de meristemas epicais e/ou axiais micro-injectados sem pressão selectiva, até se formarem plantas completas, transformadas de maneira heterogénea; ou d2> Isolamento e regeneração in vitro de meristemas apicais e/ou axiais3 micro-injectados sob pressão selectiva, até se formarem plantas completas, transformadas de forma homogénea; e) Produção de progénie sexuada ou· assexuada das plantas trans^ formadas de forma heterogénea, obteníveis segundo o ponto d^), e selecção da progénie transformada de forma homogénea. 5§. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 ou 4, caracterizado por a operação da micro-injecção passar pelas seguintes etapas parciais : a) Fixação das plântulas mediante um dispositivo de retenção especial b) Injecção da solução contendo ADN nas células do meristema apical e/ou axial com o auxilio dos capilares de micro-in-jecção c) Viragem das plântulas germinativas e nova injecção. 6ã. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por os capilares de micro-injec ção serem micro-eléctricos com filamentos de vidro, encastra-dos por fusão de borossilicato. 4

   -6 7- 7ã. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se realizar a operação da micro-injecção 1 a 1000 vezes por cada meristema. 8ã. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o volume de injecção ser de 1 pl a 100 pl por cada célula injectada. 9â. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a concentração de ADN da solução contendo ADN injectada variar entre 0,1 ug/ul e 10 ug/ul. 10ã. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida solução injecta da, contendo ADN, conter o ADN de transformação sob a forma linear. lli. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida solução injecta da, contendo ADN, conter o ADN de transformação sob a forma hiper-espiralada. A

   -6 *8- 12â. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida solução injecta. da, contendo o ADN de transformação sob a forma de uma mistu ra de ADN hiper-espiralado. 13§. - Processo de acordo com a reivindicação, caracterizado por a referida solução injectada, contendo ADN, apresentar uma molécula de ADN recombinação que, essencialmente, é constituída por um gene estrutural que codi_ fica uma propriedade útil e desejável, e que está ligado, de forma funcional, a sinais de expressão activos na célula vege tal. 14â. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido gene estrutural conferir à planta transformada uma tolerância ou resistência aumentada frente a agentes patogénicos, herbicidas, insecti-cidas ou outros agentes biocidas. 15§. - Processo para a produção de transformantes homozigóticos de linha pura, de acordo com a reividdicação 3, caracterizado por a) se cruzarem entre si, repetidas vezes, plantâs transformadas de forma heterogénea, susceptíveis de auto-polinização, isto é, que não apresentam quaisquer auto-incompatibilidades, para a produção de linhagens de intra-cruzamento, ou -69- b) se cruzarem, repetidas vezes, plantas transformadas de forma heterogénea, que não sejam susceptíveis directamente a uma auto-polinização, com plantas com um elemento grau de parentesco, para a produção de linhas de intra-cruzamento. 16ã. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por as plântuias de germinação após a realização da micro-injecção, serem implantadas directja mente no solo e, tal como plântuias germinativas normais, serem cultivadas até se formarem plantas completas. 17ã. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por as plântulas de germinação após a realização da micro-injecção, serem transferidas para um meio de cultura, que apresenta uma composição adequada para o desenvolvimento ulterior da plântula por uma planta adulta, completa. 18§. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se isolar de plantas, susceptíveis de uma regeneração a partir de meristemas isolados, os meristemas apicais/ e/ou axiais microinjectados, quer imediatamente após a realização da micro-injecção, quer numa altura qualquer posterior, com ou sem pressão selectiva, e se cultivarem estes meristemas até se formarem culturas morfoge-néticos, a partir dos quais se podem regenerar de novo, in vi-tro, plantas completas mediante processos conhecidos.

   4

   19i. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o cultivo dos meristemas apicais e/ou axiais isolados, micro-injectados, se realizar num meio de cultura que promova a formação de botões germina-tivos adventícios ou de embriões adventícios, e que contêm um gelificante ou espessante osmóticamente neutro.
2. 201. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por os referidos espesantes se rem copolímeros de sacarose e de apicloridrina com um peso molecular entre 70 .000 e 400 .000 .
3. 211. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o referido agente de geli ficação ser um composto escolhido do grupo formado por ágar--ágar, agarose, alginato, pectinato, Gelrite ou gelatina.
4. 221. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o meio de cultura conter fito-hormonas do grupo das auxinas e das citoguininas, numa concentração de 0,1 mg/1 a 20,0 mg/1, respectivamente, de acordo com o correspondente estádio evolutivo da cultura mor-fogenética.
5. 231. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o valor pH do meio de cul^ tura variar entre pH 5,2 e pH 6,5.

   -7α-
6. 241. - Processo de acordo cora a reivindicação' 19, caracterizado por a densidade de cultura dos meristemas atingir 1 méristema/ul de meio de cultura a 50 meristemas/ul de meio de cultura.
7. 251. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se efectuar o cultivo dos meristemas - pelo menos temporáriamente - num sistema de dois compartimentos.
8. 261. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por as culturas de meristemas, ao atingirem um determinado estádio evolutivo, se transferirem para a diferenciação dos ápices germinativos e dos ápices radjL culares para meios de cultura sólidos, geralmente utilizados para a regeneração de plantas.
9. 271. - Processo de acordo com a reivindicação 4; caracterizado por os meios de cultura conterem uma substância selectiva que possibilita uma selecção positiva das células trans-genéticas.
10. 281. - Processo de acordo com a reividdicação 4, caracterizado por se introduzir as plântulas regeneradas no solo, tratando-as, seguidamente, tal como plân tuias germinativas normais. -72- * τ 1 «
11. 291. - Processo para a produção de plantas trans-genéticas de acordo com a reivindicação 1. 30i. - Processo para a produção de plantas trans-genéticas, bem como da sua progénie sexuada e assexuada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se seleccionar aguelas plantas das quais a maioria das cé lulas somáticas e/ou dos gâmetas está transformada. 31§. - Processo para a produção de sementes trans-genéticas de plantas transformadas de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se proceder a multiplicação de forma sexuada das referidas plantas e se proceder à extracçao das sementes em desenvolvimento, contendo ainda o material genético inserido, mediante processos conhecidos. 32§. - Processo para a produção de partes transformadas, viáveis, de plantas transformadas de acordo com um processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se partir das plantas referidas, e por meio de processos conhecidos, se extrair partes de plantas transformadas, escolhidos do grupo formado por protoplastos, células, clones celulares, aglomerados celulares, culturas de calos e/ou de tecidos, sementes, pólenes, óvulos, zigotos ou embriões, se leccionando-se aquelas que ainda contenham o material genético inserido. -73- , 331. _ Processo para a produção de produtos de cruzamento ou de fusão com o material vegetal transformado, definido nas reivindicações 30 a 32, que ainda contêm o material genético inserido, caracterizado por se cruzar ou fusionar entre si o referido material vegetal ou com material estranho e se seleccionar aqueles produtos do cruzamento ou da fusão que ainda contenham o material genético inse rido. 34^. - Processo para a produção de variantes e mutantes de plantas transgenéticas transformadas de acordo com um dos processos indicados na reivindicação 1, caracterizado por se proceder a mutação das referidas plantas ou de partes viáveis dessas plantas, e bem assim da sua progénie sexuada e assexuada mediante métodos conhecidos e, em seguida, se seleccionar aquele material que ainda contenha o material genético inserido. 35^. - Processo para a produção de partes de plantas trans-genéticas transformadas de acordo com um dos processos referidos na reivindicação 1, tal como, por exemplo flores (botões), caules, frutos, folhas, raízes, caracterizado por se isolar as referidas partes das plantas e se seleccionar aquelas partes que ainda na maior parte das células contenham o material genético inserido.

    ^ents Oífciaí da Prapriedade industrial *UA VlCTCft COfiDON. 10-A, 1.· 1200 Lisboa, 28 de Maio de 1990