BR112020013715A2 - vetores de vaccinia modificados - Google Patents

Abstract

A descrição se refere a vetores de vírus vaccinia modificados derivados da cepa Copenhagen do vírus vaccinia, bem como métodos de utilização dos mesmos para o tratamento de vários cânceres. A divulgação fornece vetores modificados do vírus vaccinia derivados de Copenhagen que exibem várias atividades terapêuticas benéficas, incluindo atividade oncolítica aprimorada, disseminação de infecção, evasão imune, persistência de tumor, capacidade de incorporação de sequências de DNA exógenas, conveniência para fabricação em larga escala e segurança.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "VETORES DE VACCINIA MODIFICADOS" Campo

[001] A invenção se refere ao campo de imunoterapia, por exemplo, para o tratamento de distúrbios de proliferação celular, tais como cânceres. Particularmente, a invenção se refere a vírus vaccinia geneticamente modificados, bem como métodos de produção e utilização dos mesmos.

Fundamentos

[002] O sistema imunológico pode ser estimulado para identificar células tumorais e alvejá-las para destruição.

Imunoterapia que emprega vírus vaccinia oncolíticos é uma área de rápido desenvolvimento em pesquisa de câncer. Novas abordagens são necessárias para o engenheiro e/ou melhorar a seletividade tumoral para os vírus oncolíticos, a fim de maximizar a eficiência e a segurança. Esta seletividade é especialmente importante quando agentes terapêuticos potencialmente tóxicos ou genes são adicionados aos vírus.

[003] Embora o uso de vírus vaccinia como vetores oncolíticos clínicos seja um paradigma promissor para o tratamento com câncer, devido à toxicidade, tal como lesões de pox em pacientes, e efeitos colaterais imunossupressores, a maioria dos candidatos clínicos tem mostrado apenas sucesso clínico modesto. Existe a necessidade de métodos para a engenharia de vírus vaccinia que exibam replicação de vírus mais robusta, morte de células cancerosas, e disseminação a partir do ponto de infecção. A presente invenção trata esta necessidade e proporciona uma solução para as limitações de seletividade e segurança pelo emprego de um vírus vaccinia modificado.

Sumário

[004] A presente descrição descreve o uso de vetores virais Vaccinia derivados de Copenhagen para o tratamento de câncer. Em particular, a descrição é baseada em parte na atividade oncolítica surpreendentemente melhorada, disseminação de infecção e resultados de segurança promovidos quando um vírus vaccinia é geneticamente modificado para conter exclusões em alguns ou todos os seguintes genes: C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L, B14R, B15R, B16R, B17L, B18R, B19R, B20R, K ORF A, K ORF B, B ORF E, B ORF F, B ORF G, B21R, B22R, B23R, B24R, B25R, B26R, B27R, B28R E B29R. Especificamente, um vetor derivado dos vírus vaccinia derivados de Copenhagen geneticamente modificados que exibe mutações em um ou mais, ou todos, destes genes pode apresentar um conjunto de características benéficas, tais como capacidade oncolítica melhorada, replicação em tumores, infecciosidade, evasão imune, persistência tumoral, capacidade de incorporação de sequências de DNA exógenas, e acessibilidade para fabricação em grande escala. A presente descrição descreve ainda vírus vaccinia geneticamente modificados para conter exclusões no gene B8R.

[005] Em várias modalidades descritas abaixo, a invenção pode ainda incluir uma exclusão do gene B8R. Em várias modalidades, o vírus vaccinia modificado expressa pelo menos um transgene.

[006] Em um primeiro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos seis genes vaccinia, um gene vaccinia a partir de cada um dos seguintes (a)-(f): (a) F1L; (b) NlL e B14R; (c) M2L, K1L e K7R; (d) C2L, N2L, M1L, K2L, K3L, F3L, B16R e B19R; (e) K4L, K5L, K6L e F2L; (f) B15R, B17L, B18R e B20R.

[007] Em algumas modalidades, a exclusão inclui pelo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 genes, cada um independentemente selecionado do grupo consistindo em C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L, B14R, B15R, B16R, B17L, B18R, B19R, B20R. Em algumas modalidades, a exclusão inclui cada um dos genes C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L, B14R, B15R, B16R, B17L, B18R, B19R, B20R. Em várias modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante pode ainda incluir uma exclusão de B8R.

[008] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus de vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 genes selecionados do grupo consistindo em B14R, B16R, B17L, B18R, B19R E B20R. Em algumas modalidades, a exclusão inclui cada um de B14R, B16R, B17L, B18R, B19R e B20R. Em várias modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante pode ainda incluir uma exclusão de B8R.

[009] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus de vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus de vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 genes selecionados do grupo consistindo em C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L. Em algumas modalidades, a exclusão inclui cada um de C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L. Em várias modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante pode ainda incluir uma exclusão de B8R.

[0010] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor de caspase-9. Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de caspase-9 é F1L.

[0011] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo 1 gene que codifica um inibidor de BCL-2. Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de BCL-2 é N1L.

[0012] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica uma dUTPase. Em algumas modalidades, o gene que codifica uma dUTPase é F2L.

[0013] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica uma glicoproteína secretada tipo IFN-alfa/beta- receptora. Em algumas modalidades, o gene que codifica uma glicoproteína secretada tipo IFN-alfa/beta-receptora é B19R.

[0014] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor de IL-l-beta. Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de IL-l-beta é B16R.

[0015] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica uma fosfolipase-D em algumas modalidades, o gene que codifica uma fosfolipase-D é K4L.

[0016] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor de PKR. Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de PKR É K3L.

[0017] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor de serina protease. Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de serina protease é K2L.

[0018] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor de sinalização de TLR. Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de sinalização TLR é N2L.

[0019] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 ou 2 genes que codifica uma proteína tipo kelch. Em algumas modalidades, os genes que codificam uma proteína tipo kelch são, independentemente, selecionados do grupo consistindo em F3L e C2L.

[0020] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 ou 2 genes que codifica uma lipase de monoglicerídeo. Em algumas modalidades, os genes que codificam uma lipase de monoglicerídeo são, independentemente, selecionados do grupo consistindo em K5L e K6L.

[0021] Em outro aspecto, a invenção distingue um ácido nucleico que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2 ou 3 genes que codifica(m) um inibidor NF-B. Em algumas modalidades, os genes que codificam um inibidor NF-B são selecionados independentemente a partir do grupo consistindo em K7R, K1L e M2L.

[0022] Em algumas modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2 ou 3 genes que codifica(m) uma proteína de repetição Anquirina. Em algumas modalidades, os genes que codificam uma proteína de repetição Anquirina são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em B18R, B20R e M1L.

[0023] Em algumas modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2 ou 3 genes selecionados do grupo consistindo em B15R, B17L e Bl4R. Em várias modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante pode ainda incluir uma exclusão de B8R.

[0024] Em algumas modalidades, o genoma de vírus de vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 genes selecionados do grupo de genes de repetição terminal invertida (ITR) consistindo em B21R, B22R, B23R, B24R, B25R, B26R, B27R, B28R e B29R. Em algumas modalidades, a exclusão inclui cada um de B21R, B22R, B23R, B24R, B25R, B26R, B27R, B28R e B29R. Em várias modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante pode ainda incluir uma exclusão de B8R. Em várias modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante pode ainda incluir uma exclusão de B8R.

[0025] Em algumas modalidades, uma ou mais ou todas as exclusões são uma exclusão do polinucleotídeo inteiro que codifica o gene correspondente. Em algumas modalidades, uma ou mais ou todas as exclusões são uma exclusão de uma porção do polinucleotídeo que codifica o gene correspondente, tal que a exclusão é suficiente para tornar o gene não funcional, por exemplo, pela introdução em uma célula hospedeira.

[0026] Em algumas modalidades, o ácido nucleico inclui, ainda, um transgene que codifica uma proteína que fornece atividade oncolítica melhorada, uma proteína capaz de provocar uma resposta imunológica para uso como uma vacina, um polipeptídeo terapêutico ou um ácido nucleico terapêutico. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína que fornece atividade oncolítica melhorada. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína capaz de provocar uma resposta imunológica para uso como uma vacina. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína que fornece um polipeptídeo terapêutico. Em algumas modalidades, o transgene codifica um polipeptídeo terapêutico.

[0027] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 genes, cada qual independentemente selecionado do grupo que consiste em C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L, B14R, B15R, B16R, B17L, B18R, B19R, B20R, K ORF A, K ORF B, B ORF E, B ORF F, B ORF G, B21R, B22R, B23R, B24R, B25R, B26R, B27R, B28R E B29R. Em algumas modalidades, a exclusão inclui cada um de C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L, B14R, B15R, B16R, B17L, B18R, B19R, B20R, K ORF A, K ORF B, B ORF E, B ORF F, B ORF G, B21R, B22R, B23R, B24R, B25R, B26R, B27R, B28R e B29R. Em várias modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante pode ainda incluir uma exclusão de B8R.

[0028] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus de vaccinia recombinante que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus de vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 genes selecionados do grupo consistindo em B14R, B16R, B17L, B18R, B19R e B20R. Em algumas modalidades, a exclusão inclui cada um de B14R, B16R, B17L, B18R, B19R e B20R. Em várias modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante pode ainda incluir uma exclusão de B8R.

[0029] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que inclui um genoma de vírus vaccinia recombinante, em que o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 genes selecionados do grupo consistindo em C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L.

Em algumas modalidades, a exclusão inclui cada um de C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L. Em várias modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante pode ainda incluir uma exclusão de B8R.

[0030] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor de caspase-9. Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de caspase-9 é F1L.

[0031] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem a exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor de BCL-2. Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de BCL-2 é N1L.

[0032] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica uma dUTPase. Em algumas modalidades, o gene que codifica uma dUTPase é F2L.

[0033] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica uma glicoproteína secretada tipo IFN-alfa/beta-receptor. Em algumas modalidades, o gene que codifica uma glicoproteína secretada tipo IFN-alfa/beta- receptor é B19R.

[0034] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor de IL-1-beta. Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de IL- l-beta é B16R.

[0035] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica uma fosfolipase-D. Em algumas modalidades, o gene que codifica uma fosfolipase-D é K4L.

[0036] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor de PKR. Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de PKR É K3L.

[0037] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor de serina protease.

Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de serina protease é K2L.

[0038] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor de sinalização de TLR. Em algumas modalidades, o gene que codifica um inibidor de sinalização TLR é N2L.

[0039] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica uma proteína tipo kelch.

[0040] Em algumas modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 ou 2 genes que codificam uma proteína tipo kelch. Em algumas modalidades, os genes que codificam uma proteína tipo kelch são, independentemente, selecionados do grupo consistindo em F3L e C2L.

[0041] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica uma lipase de monoglicerídeo.

[0042] Em algumas modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1 ou 2 genes que codificam uma lipase de monoglicerídeo. Em algumas modalidades, os genes que codificam uma lipase de monoglicerídeo são, independentemente, selecionados do grupo consistindo em K5L e K6L.

[0043] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica um inibidor NF-B.

[0044] Em algumas modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2 ou 3 genes que codificam um inibidor de NF-B. Em algumas modalidades, os genes que codificam um inibidor de NF-B são, independentemente, selecionados do grupo consistindo em K7R, K1L e M2L.

[0045] Em outro aspecto, a invenção distingue um vetor de vírus vaccinia recombinante que tem uma exclusão de pelo menos 1 gene que codifica uma proteína de repetição Anquirina.

[0046] Em algumas modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2 ou 3 genes que codificam uma proteína de repetição Anquirina. Em algumas modalidades, os genes que codificam uma proteína de repetição Anquirina são, independentemente, selecionados do grupo consistindo em B18R, B20R e M1L.

[0047] Em algumas modalidades, o genoma de vírus de vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2 ou 3 genes selecionados do grupo consistindo em B15R, B17L E B14R.

[0048] Em algumas modalidades, o vetor de vírus de vaccinia recombinante tem uma exclusão de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 genes selecionados do grupo de genes ITR consistindo em B21R, B22R, B23R, B24R, B25R, B26R, B27R, B28R e B29R. Em várias modalidades, o genoma de vírus vaccinia recombinante pode ainda incluir uma exclusão de B8R.

[0049] Em algumas modalidades, uma ou mais ou todas as exclusões são exclusão do polinucleotídeo inteiro que codifica o gene correspondente. Em algumas modalidades, uma ou mais ou todas as exclusões são uma exclusão de uma porção do polinucleotídeo que codifica o gene correspondente, tal que a exclusão é suficiente para tornar o gene não funcional, por exemplo, pela introdução em uma célula hospedeira.

[0050] Em algumas modalidades, o vetor inclui ainda um transgene que codifica uma proteína que fornece uma atividade oncolítica melhorada, uma proteína capaz de provocar uma resposta imunológica para uso como uma vacina, um polipeptídeo terapêutico ou um ácido nucleico terapêutico. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína que fornece atividade oncolítica melhorada. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína capaz de provocar uma resposta imunológica para uso como uma vacina. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína que fornece um polipeptídeo terapêutico. Em algumas modalidades, o transgene codifica um polipeptídeo terapêutico.

[0051] Em algumas modalidades, mediante o contato de uma população de células de mamíferos (por exemplo, células humanas, tais como células de câncer humano) com o ácido nucleico ou o vetor de vírus vaccinia recombinante, as células apresentam formação aumentada de sincitia relativa a uma população de células de mamíferos do mesmo tipo contatado com uma forma do vetor de vírus vaccinia que não inclui as exclusões, como avaliado, por exemplo, por inspeção visual usando técnicas de microscopia descritas aqui ou conhecidas na técnica.

[0052] Em algumas modalidades, ao contatar uma população de células de mamífero (por exemplo, células humanas, tais como células de câncer humano) com o ácido nucleico ou o vetor de vírus vaccinia recombinante, as células exibem o espalhamento aumentado do vetor de vírus vaccinia em relação a uma população de células de mamíferos do mesmo tipo contatado com uma forma do vetor de vírus vaccinia que não inclui as exclusões, como avaliado, por exemplo, usando ensaios de formação de placa descritos aqui ou conhecidos na técnica.

[0053] Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou vetor de vírus vaccinia recombinante exerce um efeito citotóxico aumentado em uma população de células de mamíferos (por exemplo, células humanas, tais como células de câncer humano) em relação àquela de uma forma do vetor de vírus vaccinia que não inclui as exclusões, como avaliado, por exemplo, usando ensaios de morte celular descritos aqui ou conhecidos na técnica.

[0054] Em algumas modalidades, as células de mamífero são de uma linhagem celular selecionada do grupo consistindo em U2OS, 293, 293T, Vero, HeLa, A549, BHK, BSC40, CHO, OVCAR-8, 786-0, NCI-H23, U251, SF-295, T-47D, SKMEL2, BT-549, SK-MEL-28, MDA-MB-231, SK-OV-3, MCF7, M14, SF-268, CAKI-l, HPAV, OVCAR-4, HCT15, K-562 e HCT-116.

[0055] Em outro aspecto, a invenção distingue uma linhagem de células de empacotamento que contém o ácido nucleico ou o vetor de vírus vaccinia recombinante de qualquer um dos aspectos ou modalidades aqui descritos.

[0056] Em outro aspecto, a invenção distingue um método de tratamento de câncer em um paciente mamífero pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do ácido nucleico ou do vetor de vírus de vaccinia recombinante ao paciente.

[0057] Em algumas modalidades, o paciente mamífero é um paciente humano.

[0058] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo consistindo em leucemia, linfoma, câncer do fígado, câncer ósseo, câncer do pulmão, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer gastrointestinal, câncer de mama, câncer cardíaco, câncer cervical, câncer uterino, câncer de cabeça e pescoço, câncer de vesícula biliar, câncer de laringe, câncer de boca e cavidade oral, câncer ocular,

melanoma, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer colorretal, câncer testicular e câncer de garganta.

[0059] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mielógena crônica (CML), carcinoma adrenocortical, linfoma relacionado a AIDS, linfoma do SNC primário, câncer anal, câncer do apêndice, astrocitoma, tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinoma de células basais, câncer de via biliar, câncer extra-hepático, família de sarcoma de Ewing, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno, tumores embrionários do sistema nervoso central, tumores de células germinativas do sistema nervoso central, craniofaringioma, ependinoma, tumores brônquicos, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, linfoma primário, cordoma, neoplasmas mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, câncer de via biliar extra-hepático, carcinoma ductal in situ (DCIS), câncer endometrial, ependimoma, câncer esofágico, estesioneuroblastoma, tumor de células germinativas extracranianas, tumor de células germinativas extragonadais, câncer das trompas de falópio, histiocitoma fibroso de osso, tumor carcinoide gastrointestinal, tumores estromais gastrointestinais (GIST), tumor de célula germinativa testicular, doença trofoblástica gestacional, glioma, glioma de tronco cerebral infantil, leucemia de célula pilosa, câncer hepatocelular, histiocitose de células de Langerhans, linfoma de hodgkin, câncer de hipofaringe, tumores de células de ilhotas, tumores neuroendócrinos pancreáticos, tumor de wilms e outros tumores de rim na infância, histiocitose de células de

Langerhans, câncer de pulmão de célula pequena, linfoma de célula T cutânea, melanoma intraocular, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncer de pescoço escamoso metastático, carcinoma do trato mediano, síndromes de neoplasias endócrinas múltiplas, mieloma múltiplo/neoplasma celular de plasma, síndromes mielodisplásicas, câncer de cavidade nasal e seio paranasal, câncer de nasofaringe,

neuroblastoma, linfoma não-hodgkin (NHL), câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC), câncer ovariano epitelial,

câncer ovariano de células germinativas, câncer ovariano de potencial maligno baixo, tumores neuroendócrinos pancreáticos, papilomatose, paraganglioma, câncer de cavidade nasal e paranasal, câncer da paratireoide, câncer peniano, câncer faríngeo, feocromocitoma, tumor pituitário,

blastoma pleuropulmonar, câncer peritoneal primário, câncer retal, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de glândula salivar, sarcoma de kaposi, rabdomiossarcoma, síndrome de

Sezáry, câncer de intestino delgado, sarcoma de tecido mole, câncer de garganta, timoma e carcinoma tímico, câncer de tiroide, câncer de célula transicional da pelve renal e ureter, câncer uretral, câncer uterino endometrial, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, e macroglobulinemia de Waldenstrom.

[0060] Em outro aspecto, a invenção distingue um kit contendo o ácido nucleico ou vetor de qualquer um dos aspectos ou modalidades aqui descritos e um folheto informativo instruindo um usuário do kit para expressar o ácido nucleico ou vetor em uma célula hospedeira.

[0061] Em outro aspecto, a invenção distingue um kit contendo o vetor de vírus vaccinia recombinante ou ácido nucleico de qualquer um dos aspectos ou modalidades aqui descritos e um folheto informativo instruindo um usuário a administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do vetor de vírus vaccinia recombinante ou de ácido nucleico a um paciente mamífero (por exemplo, um paciente humano) tendo câncer, desse modo em tratamento do câncer.

Definições

[0062] Como usado aqui, o termo "cerca de" se refere a um valor que não é superior a 10% acima ou abaixo do valor que está sendo descrito. Por exemplo, o termo "cerca de 5 nM" indica uma faixa de 4,5 nM a 5,5 nM.

[0063] Como aqui usado, os termos "excluir", "exclusão" e semelhantes referem-se a modificações a um gene ou um elemento regulatório associado com o mesmo ou operativamente ligado ao mesmo (por exemplo, um sítio de ligação do fator de transcrição, tal como um promotor ou elemento intensificador) que removem o gene ou de outra forma torna o gene não funcional. Exclusões exemplares, conforme aqui descritas, incluem a remoção da totalidade de um ácido nucleico que codifica um gene de interesse, a partir do códon inicial para o códon de parada do gene alvo. Outros exemplos de exclusões como aqui descritas incluem a remoção de uma porção do ácido nucleico que codifica o gene alvo (por exemplo, um ou mais códons, ou uma porção do mesmo, tal como uma única exclusão de nucleotídeo) tal que, pela expressão do gene alvo parcialmente suprimido, o produto (por exemplo, transcrição de RNA, produto de proteína ou RNA regulatório, tal como um miRNA) é não funcional ou menos funcional que uma forma do tipo selvagem do gene alvo. As exclusões exemplares aqui descritas incluem a remoção de todo ou uma porção do(s) elemento(s) regulatório(s) associado(s) com um gene de interesse, tal como todo ou uma porção dos ácidos nucleicos promotores e/ou intensificadores que regulam a expressão do gene alvo.

[0064] Como aqui usado, o termo "endógeno" descreve uma molécula (por exemplo, um polipeptídeo, ácido nucleico ou cofator) que é encontrado naturalmente em um organismo particular (por exemplo, um humano) ou em um local particular dentro de um organismo (por exemplo, um órgão,

um tecido ou uma célula, tal como uma célula humana).

[0065] Como usado aqui, o termo "percentual (%) de identidade de sequência" se refere à porcentagem de resíduos de aminoácido (ou ácido nucleico) de uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácido (ou ácido nucleico) de uma sequência de referência após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para obter a percentual máxima de identidade de sequência (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em uma ou ambas as sequências candidatas e de referência para alinhamento ótimo e sequências não homólogas podem ser desconsideradas para propósitos de comparação). O alinhamento com o propósito de determinar a identidade percentual da sequência pode ser obtido de várias maneiras que estão dentro da habilidade na arte da técnica, por exemplo, utilizando um software de computador publicamente disponível, tal como software BLAST, ALIGN, ou Megalign (ONASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo em relação ao comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Por exemplo, uma sequência de referência alinhada para comparação com uma sequência candidata pode mostrar que a sequência candidata exibe de 50% a 100% de identidade de sequência através do comprimento total da sequência candidata ou de uma porção selecionada de resíduos contíguos de aminoácidos (ou ácido nucleico) da sequência candidata. O comprimento da sequência candidata alinhada para fins de comparação pode ser, por exemplo, pelo menos 30% (por exemplo, 30%, 40, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%) do comprimento da sequência de referência. Quando uma posição 5 na sequência candidata é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido que a posição correspondente na sequência de referência, então as moléculas são idênticas nessa posição.

[0066] Conforme usados aqui, os termos "indivíduo" e "paciente" referem-se a um organismo que recebe tratamento para uma doença ou condição particular conforme aqui descrita (tal como câncer ou uma doença infecciosa).

Exemplos de indivíduos e pacientes incluem mamíferos, tais como seres humanos, recebendo tratamento para doenças ou condições, por exemplo, distúrbios de proliferação celular, tais como câncer.

[0067] Como usados aqui, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se ao tratamento terapêutico, em que o objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) uma mudança ou distúrbio fisiológico indesejado, tal como a progressão de um distúrbio de proliferação celular, tal como o câncer. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio de sintomas, diminuição do grau de doença, estabilização (isto é, não piora) do estado da doença, retardo ou redução da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão (seja parcial ou total), seja detectável ou não detectável. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com a condição ou distúrbio, bem como aqueles propensos a ter a condição ou distúrbio ou aqueles nos quais a condição ou distúrbio deve ser evitada.

[0068] Conforme usado aqui, o termo "vetor" se refere a um vetor de ácido nucleico, por exemplo, um vetor de DNA, tal como um plasmídio, um vetor de RNA, vírus ou outro replicon adequado (por exemplo, vetor viral). Uma variedade de vetores tem sido desenvolvida para a distribuição de polinucleótidos que codificam proteínas exógenas em uma célula procariótica ou eucariótica. Exemplos de tais vetores de expressão são descritos, por exemplo, em WO 1994/1 1026, incorporado aqui por referência. Os vetores de expressão da invenção podem conter um ou mais elementos de sequência adicionais usados para a expressão de proteínas e/ou a integração destas sequências de polinucleotídeos no genoma de uma célula hospedeira, tal como uma célula mamífera (por exemplo, uma célula humana). Vetores exemplares que podem ser usados para a expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos descritos aqui incluem plasmídeos que contêm sequências regulatórias, tais como regiões promotoras e intensificadoras, que direcionam a transcrição genética. Os vetores podem conter ácidos nucleicos que modulam a taxa de tradução de um gene alvo ou que melhoram a estabilidade ou exportação nuclear do mRNA que resulta da transcrição do gene. Estes elementos de sequência podem incluir, por exemplo, regiões não traduzidas 5' e 3', um sítio de entrada ribossomal interno (IRES) e sítio de sinal de poliadenilação a fim de direcionar a transcrição eficiente do gene carregado no vetor de expressão. Os vetores aqui descritos podem também conter um polinucleotídeo que codifica um marcador para seleção de células que contêm tal vetor. Exemplos de um marcador adequado incluem genes que codificam a resistência a antibióticos, tais como ampicilina, cloranfenicol, canamicina ou nourseotricina.

Definições de genes

[0069] Como aqui usado, "C2L" se refere a um gene vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma proteína tipo kelch. Um exemplo não limitante de uma sequência de proteína que codifica o gene C2L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "C2L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0070] Conforme aqui usado, "C1L" se refere a um gene de vírus vaccinia. Um exemplo não limitante de uma sequência de proteína que codifica o gene C1L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "C1L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0071] Conforme aqui usado, "NIL" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica um inibidor de BCL-2. Um exemplo não limitante de uma sequência de proteína que codifica o gene N1L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "N1L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0072] Conforme aqui usado, "N2L" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica um inibidor de sinalização de TLR. Um exemplo não limitante de sequências de proteína que codifica o gene N2L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "N2L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos de outra cepa de vírus vaccinia.

[0073] Conforme aqui usado, "M1L" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma proteína de repetição Anquirina. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene M1L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "M1L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0074] Conforme aqui usado, "M2L" se refere a um gene vírus vaccinia, tal como um gene que codifica um inibidor de NF-B. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene M2L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "M2L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos de outra cepa de vírus vaccinia.

[0075] Conforme aqui usado, "K1L" se refere a um gene vírus vaccinia, tal como um gene que codifica um inibidor de NF-B. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene K1L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "K1L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0076] Conforme aqui usado, "K2L" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma proteína de repetição de Anquirina. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene de K2L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "K2L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0077] Conforme aqui usado, "K3L" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica um inibidor de PKR. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene K3L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "K3L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos de outra cepa de vírus vaccinia.

[0078] Conforme aqui usado, "K4L" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma fosfolipase-D. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene K4L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "K4L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0079] Conforme aqui usado, o termo "K5L" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma lipase de monoglicerídeo. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene K5L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "K5L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos de outra cepa de vírus vaccinia.

[0080] Conforme aqui usado, "K6L" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma lipase de monoglicerídeo. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene K6L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "K6L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0081] Conforme usado aqui, "K7R" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica um inibidor NF-B. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene K7R é listado na tabela 2 abaixo. O termo "K7R" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0082] Conforme usado aqui, "F1L" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica um inibidor de caspase-9. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene FlL é listado na tabela 2 abaixo. O termo "F1L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0083] Conforme aqui usado, "F2L" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma dUTPase. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene F2L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "F2L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0084] Conforme usado no presente, "F3L" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma proteína tipo kelch. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene F3L é listado na tabela 2 abaixo. O termo "F3L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0085] Conforme aqui usado, "B14R" se refere a um gene de vírus vaccinia. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene B14R é listado na tabela 3 abaixo. O termo "B14R" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos de outra cepa de vírus vaccinia.

[0086] Conforme usado aqui, "B15R" se refere a um gene de vírus vaccinia. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene B15R é listado na tabela 3 abaixo. O termo "B15R" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0087] Conforme aqui usado, "B16R" se refere a um gene de vírus de vaccinia, tal como um gene que codifica um inibidor de IL-l-beta. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene B16R é listado na tabela 3 abaixo. O termo "B16R" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0088] Conforme aqui usado, o termo "B17L" se refere a um gene de vírus vaccinia. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene B17L é listado na tabela 3 abaixo. O termo "B17L" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos de outra cepa de vírus vaccinia.

[0089] Conforme aqui usado, o termo "B18R" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma proteína de repetição Anquirina. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene B18R é listado na tabela 3 abaixo. O termo "B18R" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos de outra cepa de vírus vaccinia.

[0090] Conforme aqui usado, "B19R" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma glicoproteína secretada tipo IFN-alfa-beta-receptor. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene B19R é listado na tabela 3 abaixo. O termo "B19R" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0091] Conforme aqui usado, o termo "B20R" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma proteína de repetição Anquirina. Um exemplo não limitante de sequência de proteína que codifica o gene B20R é listado na tabela 3 abaixo. O termo "B20R" também pode incluir fragmentos ou variantes da proteína listada na tabela abaixo, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia.

[0092] Conforme aqui usado, "B8R" se refere a um gene de vírus vaccinia, tal como um gene que codifica uma proteína secretada com homologia ao interferon gama (IFN- ). Um exemplo não limitante de uma sequência de proteína codificada por um gene de B8R exemplar em uma cepa Copenhagen do vírus vaccinia é dado na entrada P21004 do banco de dados UniProtKB e é reproduzida abaixo:

MRYIIILAVLFINSIHAKITSYKFESVNFDSKIEWTGDGLYNISLKNYGIKTWQTMYTN VPEGTYDISAFPKNDFVSFWVKFEQGDYKVEEYCTGLCVEVKIGPPTVTLTEYDDHINL YIEHPYATRGSKKIPIYKRGDMCDIYLLYTANFTFGDSEEPVTYDIDDYDCTSTGCSID FATTEKVCVTAQGATEGFLEKITPWSSEVCLTPKKNVYTCAIRKEDVPNFKD KMARVIKRKFNKQSQSYLTKFLGSTSNDVTTFLSMLNLTKYS

[0093] O termo "B8R" também pode incluir fragmentos ou variantes das proteínas listadas acima, ou genes homólogos a partir de uma outra cepa de vírus vaccinia. Variantes incluem sem limitação aquelas sequências tendo 85 por cento ou mais de identidade com as sequências descritas aqui.

Breve Descrição das Figuras

[0094] A Figura 1 mostra a análise filogenética de 59 cepas de poxvirus, incluindo as cepas de vírus de Vaccinia.

[0095] A Figura 2 mostra a abundância de diferentes cepas virais após a passagem de 5 vírus de Vaccinia em diferentes tipos de tumores.

[0096] A Figura 3 mostra a capacidade de replicar em vários núcleos de tumor de paciente diferentes de cepas tipo selvagem de Vaccinia.

[0097] A Figura 4 mostra medições de tamanho de placa de diferentes cepas do tipo selvagem de Vaccinia.

[0098] A Figura 5A mostra o número de sítios de TTAA através de regiões de lkb no genoma de Vaccinia Copenhagen.

[0099] A Figura 5B mostra a frequência de inserções de Transposon através do genoma de Vaccinia Copenhagen. Cada ponto representa um nocaute de transposon de um gene particular. A posição do ponto no eixo y é determinada pela frequência do nocaute.

[00100] A Figura 5C mostra conservação de gene de poxvirus em 59 vírus. A conservação maior indica que o gene está presente em uma quantidade maior de espécies.

[00101] A Figura 6 mostra a frequência de vários nocautes de transposon após a passagem em células cancerosas permissivas.

[00102] A Figura 7 mostra medições de tamanho de placa de transposons purificados.

[00103] A Figura 8 mostra a estrutura genômica de uma exclusão de 5p (CopMD5p) e uma exclusão de 3p (CopMD3p). Ambos CopMD5p e CopMD3p foram cruzados para gerar CopMD5p3p.

[00104] A Figura 9 mostra um mapa térmico que mostra a morte da célula cancerosa após a infecção com Copenhagen ou CopMD5p3p em várias doses.

[00105] A Figura 10 mostra as curvas de crescimento de Copenhagen e replicação CopMD5p3p em 4 linhagens de células cancerosas diferentes.

[00106] A Figura 11 mostra a capacidade de Copenhagen e CopMD5p3p para replicar em amostras ex vivo do paciente, como mostrado por titulação.

[00107] A Figura 12 mostra que o vírus CopMD5p3p modificado forma placas diferentes do que o vírus parental.

As placas de CopMD5p3p são muito mais claras no meio e pode-se ver sincitia (fusão celular).

[00108] A Figura 13 mostra que CopMD5p3p induz a sincitia (fusão celular) em células 786-O.

[00109] A Figura 14 mostra que CopMD5p3p é capaz de controlar o crescimento tumoral similarmente ao tipo selvagem Copenhagen, mas não causa perda de peso.

[00110] A Figura 15 mostra que a CopMD5p3p não causa a formação da lesão de pox quando comparada a duas outras cepas Vaccinia (Copenhagen e Wyeth) abrigando o nocaute oncolítico da timidina quinase.

[00111] A Figura 16 mostra a biodistribuição IVIS Vaccinia após administração sistémica em camundongos nude CD-l. A luciferase que codifica CopMD5p3p (TK KO) é específica para tumor e não se replica em tecidos fora dos alvos.

[00112] A Figura 17 mostra a biodistribuição de Vaccinia depois da administração sistémica. CopMD5p3p se replica similarmente a outras Vaccinia oncoocíticas no tumor, mas se replicam menos em tecidos/órgãos que não sejam alvos.

[00113] A Figura 18 mostra a imunogenicidade de Vaccinia em PBMCs humanas. A capacidade de CopMD5p3p para induzir a ativação da célula imune inata humana é mais forte do que aquela do Copenhagen do tipo selvagem.

[00114] A Figura 19 mostra a imunogenicidade de Vaccinia em esplenócitos de camundongo. A capacidade de CopMD5p3p para induzir a ativação da célula imune inata do camundongo é mais forte do que aquela de Copenhagen.

[00115] A Figura 20 mostra a imunogenicidade de Vaccinia em células humanas. A capacidade de CopMD5p3p para ativar o fator de transcrição imune NF-B é mais forte do que aquela de Copenhagen ou VVdd, mas similar ao de MG-l.

[00116] A Figura 21 mostra uma representação esquemática da estratégia de direcionamento de recombinação homóloga empregada para gerar exclusões principais 5p (esquerda) e 3p (direita) em várias cepas de vaccinia.

[00117] A Figura 22 mostra a capacidade do vírus vaccinia Copenhagen do tipo selvagem e vários virions vaccinia Copenhagen modificados de proliferar em várias linhagens celulares.

[00118] A Figura 23 mostra os efeitos citotóxicos do vírus de vaccinia de Copenhagen do tipo selvagem e vários virions vaccinia de Copenhagen modificados em várias linhagens de células, como avaliado por violeta de cristal (painel superior) e um ensaio de azul Alamar (painel inferior). A ordem das cepas listadas para cada linhagem celular ao longo do eixo x do gráfico mostrado no painel inferior é como segue: da esquerda para a direita, CopMD5p, CopMD5p3p, CopMD3p e CopWT.

[00119] A Figura 24 mostra a distribuição de vírus vaccinia Copenhagen do tipo selvagem e vários virions vaccinia de Copenhagen modificados mediante administração a camundongos.

[00120] A Figura 25 mostra a capacidade do vírus de vaccinia de Copenhagen do tipo selvagem e vários virions vaccinia de Copenhagen modificados para ativar células Natural Killer (NK) e promover imunidade antitumoral.

[00121] A Figura 26 mostra a capacidade do vírus vaccinia do tipo selvagem e vários virions vaccinia de Copenhagen modificados para aumentar a degranulação mediada por células NK contra células HT29, uma medida de atividade de células NK e imunidade antitumoral.

[00122] A Figura 27 mostra a capacidade do vírus vaccinia de Copenhagen do tipo selvagem e vários virions vaccinia de Copenhagen modificados para preparar células T para iniciar uma resposta imunológica antitumoral.

[00123] A Figura 28 mostra a capacidade do vírus vaccinia do tipo selvagem e vários virions vaccinia Copenhagen modificados para espalhar para locais distantes a partir do ponto inicial de infecção.

[00124] A Figura 29 mostra a capacidade do vírus vaccinia Copenhagen do tipo selvagem e vários virions vaccinia de Copenhagen modificados para formar placas, uma medida de proliferação viral.

[00125] A Figura 30 mostra a capacidade do vírus vaccinia de Copenhagen do tipo selvagem e vários virions vaccinia de Copenhagen modificados para formar placas em células 786-O.

[00126] A Figura 31 mostra a porcentagem de genes deletados em CopMD5p3p em vários genomas de poxvirus.

[00127] A Figura 32 mostra a infecção de linhagens de células normais versus cancerígenas do vírus SKV-B8R+.

[00128] A Figura 33 mostra que SKV-B8R+ não prejudica a sinalização de interferon.

[00129] A Figura 34 mostra que SKV (CopMD5p3-B8R-) tem eficácia similar em controle de tumor comparado com SKV-B8R+.

[00130] A Figura 35 mostra exclusões duplas principais modificadas em várias cepas de vaccinia, acentuando a morte de células cancerosas in vitro.

[00131] A Figura 36 mostra a distingueção fenotípica das células HeLa infectadas com várias cepas vaccinia.

[00132] A Figura 37 mostra que as cepas de vaccinia 5p3p não induzem a perda de peso comparada às cepas do tipo selvagem.

[00133] A Figura 38 mostra que as cepas de vaccinia 5p3p não induzem lesões de pox em comparação com cepas do tipo selvagem.

Descrição detalhada

[00134] A presente invenção distingue vírus vaccinia derivados de Copenhagen geneticamente modificados, bem como o uso do mesmo para o tratamento de vários cânceres. A invenção baseia-se em parte na descoberta surpreendente de que os vírus de vaccinia, tais como Copenhagen, apresentam atividade oncolítica marcadamente melhorada, replicação em tumores, infectividade, evasão imune, persistência tumoral, capacidade de incorporação de sequências de DNA exógenas, e acessibilidade para fabricação em grande escala quando os vírus são modificados para conter exclusões em um ou mais, ou todos, de C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L, B14R, B15R, B16R, B17L, B18R, B19R, B20R, K ORF A, K ORF B, B ORF E, B ORF F, B ORF G, B21R, B22R, B23R, B24R, B25R, B26R, B27R, B28R e B29R.

Em várias modalidades da invenção, os vírus vaccinia modificados contêm uma exclusão do gene B8R. Embora inativo em camundongos, o gene B8R neutraliza a atividade antiviral do IFN- humano. Em várias modalidades, pelo menos um transgene é subsequentemente inserido no locus do gene B8R (agora excluído) através de uma estratégia de direcionamento de recombinação homóloga.

[00135] Os vírus de vaccinia aqui descritos podem ser administrados a um paciente, tal como um paciente mamífero (por exemplo, um paciente humano) para tratar uma variedade de distúrbios de proliferação celular, incluindo uma ampla gama de cânceres. As seções que seguem descrevem vírus de vaccinia e modificações genéticas aos mesmos, assim como métodos de produção e propagação de vírus de vaccinia geneticamente modificados e técnicas para administração dos mesmos a um paciente.

Vírus Vaccinia

[00136] Vírus vaccinia é um membro da família do ortopoxvírus ou Poxviridae, a subfamília de

Chordopoxvirinae, e o gênero Orthopoxvirus. O Orthopoxvirus é relativamente mais homogêneo do que outros membros da subfamília de Chordopoxvirinae e inclui 11 espécies distintas mas estritamente relacionadas, que incluem vírus vaccinia, vírus de varíola (agente causador de varíola), vírus de varíola bovina, vírus de buffalopox, vírus de varíola de macaco, vírus de varíola do rato e espécies de vírus de varíola de cavalo, bem como outros (ver Moss, 1996).Certas modalidades da invenção, conforme aqui descritas, podem ser estendidas a outros membros do gênero Orthopoxvirus, bem como Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Suipoxvirus, Molluscipoxvirus e Yatapoxvirus. Um gênero da família do Orthopoxvirus é geralmente definido por meios sorológicos, incluindo neutralização e reatividade cruzada em animais de laboratório. Vários membros do gênero Orthopoxvirus, bem como outros membros da subfamília de Chordovirinae, utilizam moléculas imunomoduladoras, cujos exemplos são aqui fornecidos para neutralizar as respostas imunes de um organismo hospedeiro.

[00137] Vírus vaccinia é um vírus encapsulado complexo, grande, tendo um genoma de DNA de fita dupla linear de cerca de 190K e codificação para aproximadamente 250 genes. O vaccinia é bem conhecido por seu papel como uma vacina que erradicou a varíola. Após a erradicação da varíola, cientistas têm explorado o uso do vaccinia como uma ferramenta para a distribuição de genes em tecidos biológicos (terapia genética e engenharia genética). O vVírus vaccinia é único entre os vírus de DNA pois ele se replica apenas no citoplasma da célula hospedeira.

Portanto, o grande genoma é necessário para codificar várias enzimas e proteínas necessárias para replicação viral de DNA. Durante a replicação, o vaccinia produz várias formas infecciosas que diferem em suas membranas externas: o vírion maduro intracelular (IMV), o vírion encapsulado intracelular (IEV), o vírion encapsulado associado à célula (CEV), e o vírion encapsulado extracelular (EEV). IMV é a forma infecciosa mais abundante e acredita-se que seja responsável por distribuição entre hospedeiros. Por outro lado, acredita-se que o CEV desempenhe um papel na distribuição célula-a-célula e acredita-se que a EEV é importante para a disseminação de longo alcance dentro do organismo hospedeiro.

[00138] Vírus vaccinia está intimamente relacionado com o vírus que causa a varíola bovina. A origem precisa vaccinia é desconhecida, mas a visão mais comum é que vírus vaccinia, vírus de varíola bovina e vírus de varíola (o agente causador para varíola) foram todos derivados de um vírus ancestral comum. Também há especulação de que o vírus vaccinia foi originalmente isolado de cavalos. A infecção por vírus vaccinia é leve e tipicamente assintomática em indivíduos saudáveis, mas pode causar uma erupção e febre leves, com uma taxa extremamente baixa de fatalidade. Uma resposta imune gerada contra uma infecção por vírus de vaccinia protege a pessoa contra uma infecção letal de varíola. Por esta razão, o vírus de vaccinia foi usado como uma vacina de vírus vivo contra varíola. A vacina de vírus vaccinia é segura porque ela não contém o vírus de varíola, mas ocasionalmente certas complicações e/ou efeitos adversos de vacina podem surgir, especialmente se a vacina for imunocomprometida.

[00139] Cepas exemplares do vírus de vaccinia incluem o vírus de vaccinia derivado de Copenhagen.

Mutantes de Timidina Quinase

[00140] Diversos estudos clínicos atuais para o teste de vírus de vaccinia como um vírus oncolítico abrigam exclusões no gene de Timidina Quinase viral (TK). Esta exclusão atenua o vírus, tornando o vírus dependente da atividade da timidina quinase celular para replicação de DNA e, assim, propagação viral. A timidina quinase celular é expressa em um baixo nível na maioria dos tecidos normais e em níveis elevados em muitas células cancerosas. Através do direcionamento metabólico, os vírus TK podem crescer em células que têm uma alta taxa metabólica (por exemplo, células saudáveis ou células tumorais) e não irão crescer bem em células que têm baixos níveis de timidina quinase.

Uma vez que existem células de tumor quiescentes (por exemplo, células-tronco de câncer), os vírus TK são provavelmente comprometidos na sua capacidade de matar esta população de células cancerosas, bem como quimioterapia é amplamente ineficaz. Os vetores virais modificados descritos nesta divulgação retêm mecanismo sintético de vírus (incluindo TK) e podem se propagar em células de câncer quiescentes. As modificações virais desta divulgação podem permitir que o vírus seja altamente seletivo sem excluir TK ou outras enzimas metabolizantes de DNA (por exemplo, redutase de ribonucleotídeo) e poderia ser mais eficaz em tumores com uma baixa taxa metabólica.

Propagação de Vírus

[00141] A presente invenção distingue vírus de vaccinia, incluindo aqueles construídos com uma ou mais exclusões de genes em comparação com o tipo selvagem, de modo que o vírus exiba propriedades desejáveis para uso contra células cancerosas, ao mesmo tempo sendo menos tóxico ou não tóxico para células não cancerosas. Esta seção resume vários protocolos, por meio de exemplo, para a produção de vírus vaccinia recombinantes descritos aqui, tais como métodos para a geração de vírus mutados através do uso de tecnologia de DNA recombinante.

[00142] Por exemplo, para gerar mutações no genoma do vírus vaccinia, polipeptídeos nativos e modificados podem ser codificados por uma molécula de ácido nucleico compreendida em um vetor. Vetores incluem plasmídeos, cosmídeos, vírus (bacteriófago, vírus animais e vírus vegetais), e cromossomos artificiais (por exemplo, YACs).

Uma pessoa versada na técnica seria bem equipada para construir um vetor através de técnicas recombinantes padrão, que são descritas em Sambrook et al. (1989) e Ausubel et al. 1994, ambas aqui incorporadas por referência. Além de codificar um polipeptídeo modificado tal como gelonina modificada, um vetor pode codificar sequências de polipeptídeo não modificadas tais como uma molécula de marcação ou alvo.

[00143] A fim de propagar um vetor em uma célula hospedeira, ela pode conter uma ou mais origens de sítios de replicação (muitas vezes denominadas "ori"), que é uma sequência específica de ácido nucleico na qual a replicação é iniciada. Alternativamente, uma sequência de replicação autónoma (ARS) pode ser empregada se a célula hospedeira for levedura.

[00144] No contexto de expressar uma sequência heteróloga de ácido nucleico, a "célula hospedeira" se refere a uma célula procariótica ou eucariótica, e inclui qualquer organismo transformável que seja capaz de replicar um vetor e/ou expressar um gene heterólogo codificado por um vetor.

Uma célula hospedeira pode ser, e tem sido usada como um receptor para vetores ou vírus (que não se qualifica como um vetor se não expressa polipeptídeos exógenos). Uma célula hospedeira pode ser "transfectada" ou

"transformada", o que se refere a um processo pelo qual o ácido nucleico exógeno, tal como uma sequência de codificação de proteína modificada, é transferido ou introduzido na célula hospedeira.

Uma célula transformada inclui a célula em questão primária e sua progênie.

Células hospedeiras podem ser derivadas de procariotas ou eucariotas, incluindo células de levedura, células de insetos e células de mamíferos, dependendo se o resultado desejado é replicação do vetor ou expressão de parte ou de todas as sequências de ácido nucleico codificadas por vetor.

Numerosas linhagens de células e culturas são disponíveis para uso como uma célula hospedeira, e elas podem ser obtidas através da American Type Culture

Collection (ATCC), que é uma organização que serve como um arquivo para culturas vivas e materiais genéticos

(www.atcc.org). Um hospedeiro apropriado pode ser determinado por uma pessoa versada na técnica com base na cadeia principal do vetor e no resultado desejado.

Um plasmídeo ou cosmídeo, por exemplo, pode ser introduzido em uma célula hospedeira procariota para replicação de muitos vetores.

Células bacterianas usadas como células hospedeiras para replicação de vetor e/ou expressão incluem DH5, JM109 e KCB, bem como um número de hospedeiros bacterianos comercialmente disponíveis, tais como SURE® Competent Cells e SOLOPACKTM Gold Cells (STRATAGENE®, La Jolla, Califórnia). Alternativamente, células bacterianas como E. coli LE392 poderiam ser usadas como células hospedeiras para vírus de fagos. Células de leveduras apropriadas incluem Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe e Pichia pastoris. Exemplos de células hospedeiras eucarióticas para replicação e/ou expressão de um vetor incluem HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos e PC12.

Muitas células hospedeiras de vários tipos de células e organismos estão disponíveis e podem ser conhecidas por aqueles versados na técnica. Similarmente, um vetor virai pode ser usado em conjunto com uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica, particularmente uma que é permissiva para replicação ou expressão do vetor. Alguns vetores podem empregar sequências de controle que permitem que ela seja replicada e/ou expressa em ambas células procarióticas e eucarióticas. Aquele versado na técnica compreenderia ainda as condições sob as quais incubar todas as células hospedeiras descritas acima para mantê-las e permitir a replicação de um vetor. Também entendidas e conhecidas são técnicas e condições que permitiriam a produção em larga escala de vetores, bem como a produção dos ácidos nucleicos codificados por vetores e seus polipeptídeos, proteínas ou peptídeos cognatos.

Modificações Genéticas ao Genoma do vírus Vaccinia Métodos de Modificação Genética.

[00145] Métodos para a inserção ou exclusão de ácidos nucleicos a partir de um genoma alvo incluem aqueles descritos aqui e conhecidos na técnica. Um tal método que pode ser usado para incorporar polinucleotídeos que codificam genes alvos em um genoma alvo envolve o uso de transposons. Transposons são polinucleotídeos que codificam enzimas de transposase e contêm uma sequência de polinucleotídeo ou gene de interesse flanqueado por sítios de excisão de 5' e 3'. Uma vez que um transposon tenha sido enviado a um ácido nucléico alvo (por exemplo, em uma célula hospedeira), a expressão do gene de transposase começa e resulta em enzimas ativas que clivam o gene de interesse do transposon. Esta atividade é mediada pelo reconhecimento sítio-específico de sítios de excisão transposon pela transposase. Em certos casos, estes sítios de excisão podem ser repetições terminais ou repetições terminais invertidas.Uma vez excisados do transposon, o gene de interesse pode ser integrado no genoma alvo por clivagem catalisada por transposase de sítios de excisão similares que existem dentro do genoma nuclear da célula.

Isto permite que o gene de interesse seja inserido no DNA nuclear clivado nos sítios de excisão complementares, e a subsequente ligação covalente das ligações de fosfodiéster que unem gene de interesse ao DNA do genoma alvo completa o processo de incorporação. Em certos casos, o transposon pode ser um retrotransposon, tal que o gene que codifica o gene alvo é primeiramente transcrito a um produto de RNA e então transcrito em sentido inverso ao DNA antes da incorporação no genoma da célula mamífera. Sistemas de transposon incluem o transposon piggybac (descrito em detalhe em, por exemplo, WO 2010/085699) e o transposon da beleza do sono (descrito em detalhe em, por exemplo, US2005/0112764), cujas descrições são aqui incorporadas por referência.

[00146] Métodos adicionais para a entrega de ácido nucleico para efetuar a expressão das composições da presente invenção são tidos como incluindo virtualmente qualquer método pelo qual um ácido nucleico (por exemplo, DNA, incluindo vetores virais e não virais) pode ser introduzido em uma organela, uma célula, um tecido ou um organismo, conforme descrito aqui ou como seria conhecido por aqueles versados na técnica. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, entrega direta de DNA tal como por injeção (patentes US Nos. 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100,

5.780. 448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 e

5.580.359, cada uma incorporada aqui por referência),

incluindo microinjeção (Harland e Weintraub, 1985; patente US No. 5.789.215, incorporada aqui por referência); por eletroporação (patente US No. 5.384.253, incorporada aqui por referência); por precipitação de fosfato de cálcio (Graham e Van Der Eb, 1973; Chen e Okayama, 1987; Rippe et al, 1990); por meio do uso de DEAE-dextrano seguido por polietileno glicol (Gopal, 1987); por carregamento sônico direto (Fechheimer et al., 1987); por meio de transfecção mediada por lipossoma (Nicolau e Sene, 1982; Fraley et al, 1979; Nicolau et al, 1987; Wong et al, 1980; Kaneda et al, 1989; Kato et al, 1991); por bombardeamento de microprojéteis (pedidos PCT Nos WO 94/09699 e 95/06128; US

5.610.042; 5.322.783, 5.563.055, 5.550.318, 5.538.877 e

5.538.880, e cada qual incorporada aqui por referência); por agitação com fibras de carboneto de silício (Kaeppler et al, 1990; patentes US Nos. 5.302.523 e 5.464.765, cada uma incorporada aqui por referência); por transformação mediada por Agrobacterium (patentes US Nos. 5.591.616 E

5.563.055, cada uma incorporada aqui por referência); ou por transformação mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh et al, 1993; Patentes US Nos. 4.684.611 e

4.952.500, cada um incorporado aqui por referência); por absorção de DNA mediada por dessecação/inibição (Potrykus et al, 1985). Através da aplicação de técnicas tais como estas, organela(s), célula(s), tecido(s) ou organismo(s)

podem ser estavelmente ou transitoriamente transformadas.

Exclusões de CopMD5p, CopMD3p E CopMD5p3p

[00147] Em várias modalidades, vários genes são suprimidos para aumentar a atividade oncoítica do vírus vaccinia. A maioria das exclusões aqui descritas está envolvida no bloqueio de uma resposta hospedeira à infecção viral ou, de outra forma, tem uma função desconhecida. Em várias modalidades, pelo menos um dos genes representados na Tabela 1 é suprimido do genoma de vírus vaccinia recombinante. Em várias modalidades, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31 dos genes representados na Tabela 2 são suprimidos do genoma vaccinia recombinante. Em várias modalidades, todos os genes representados na Tabela 2 são excluídos do genoma de vírus vaccinia recombinante. Três modalidades exemplares da presente invenção, CopMD5p, CopMD3p e CopMD5p3p, são descritas aqui. Na Tabela 1 abaixo estão grupos de genes suprimidos e sua função em vírus CopMD5p, CopMD3p e CopMD5p3p. Em várias modalidades, quando duas cópias de um ITR existem, somente a ITR direita do genoma é excluída e a ITR esquerda permanece intacta. As exclusões foram confirmadas por sequenciamento de genoma inteiro.

Tabela 1: Genes excluídos em vírus Vaccinia Nome Categoria Função Exclusões do Vírus

Interação com C2L hospedeiro Inibe NFkB C1L Desconhecida Desconhecida Interação com Inibe NFkB e N1L hospedeiro Apoptose Interação com N2L hospedeiro Inibe IRF3 M1L Desconhecida Desconhecida Interação com Inibe NFkB e M2L hospedeiro Apoptose Interação com K1L hospedeiro Inibe PKR e NF-kB Interação com Previne fusão CopMD5p K2L hospedeiro celular Interação com K3L hospedeiro Inibe PKR Replicação Nuclease K4L de DNA modificadora de DNA K5L Pseudogene Pseudogene CopMD5p3p K6L Pseudogene Pseudogene Interação com K7R hospedeiro Inibe NFkB e IRF3 Interação com F1L hospedeiro Inibe Apoptose Replicação Desoxiuridina F2L de DNA trifosfatase Interação com F3L hospedeiro Fator de virulência B14R Pseudogene Pseudogene B15R Desconhecida Desconhecida Interação com B16R hospedeiro IL-1-beta-inibidor B17L Desconhecida Desconhecida B18R Desconhecida Tipo Anquirina CopMD3p Interação com Sequestrador de IFNa B19R hospedeiro secretado B20R Desconhecida Tipo Anquirina B21R-ITR* Desconhecida Desconhecida B22R-ITR* Desconhecida Desconhecida

B23R-ITR* Desconhecida Desconhecida B24R-ITR* Desconhecida Desconhecida B25R-ITR* Desconhecida Desconhecida B26R-ITR* Desconhecida Desconhecida B27R-ITR* Desconhecida Desconhecida B28R-ITR* Pseudogene Receptor de TNF-a Interação com Sequestrador de CC- B29R-ITR* hospedeiro quimiocina secretada Exclusões de Genes B8R

[00148] Em várias modalidades, os vírus vaccinia são ainda geneticamente modificados para conter exclusões no gene B8R. O gene B8R de vírus de vaccinia codifica uma proteína secretada com homologia ao receptor de interferon gama (IFN-). In vitro, a proteína B8R liga-se a e neutraliza a atividade antiviral de várias espécies de interferon gama, incluindo interferon gama humano e de rato; entretando, ela não se liga significativamente a IFN-  murino. A exclusão do gene B8R previne a deterioração de IFN- em humanos. A exclusão do gene B8R resulta em segurança melhorada sem uma redução concomitante na imunogenicidade.

Inserções de Transgene

[00149] Em várias modalidades, transgenes adicionais podem ser inseridos no vetor. Em várias modalidades, um, dois ou três transgenes são inseridos no locus do gene B8R excluído. Em algumas cepas, além do(s) transgene(s) presente(s) no sítio de exclusão de B8R, a cepa também tem pelo menos um transgene que é inserido em um locus adicional no vírus vaccinia que não é o local do gene B8R deletado. Em várias modalidades, pelo menos um transgene é inserido nos limites das exclusões de 5p, pelo menos um transgene é inserido nos limites das exclusões de 3p ou ambos. Em várias modalidades, pelo menos três, quatro, cinco ou mais transgenes são inseridos no genoma do vírus de vaccinia modificado.

Métodos de tratamento Composição farmacêutica, Administração e Doses

[00150] Composições terapêuticas contendo vetores de vírus de vaccinia recombinantes da invenção podem ser preparadas usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, tais composições podem ser preparadas usando, por exemplo, veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Edição, Osol, A. Ed. (1980); incorporado aqui por referência), e na forma desejada, por exemplo, na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.

[00151] Para induzir a oncólise, matar células, inibir o crescimento, inibir metástases, diminuir o tamanho do tumor e de outro modo reverter ou reduzir o fenótipo maligno de células tumorais, usando os métodos e composições da presente invenção, pode-se contatar um tumor com o vírus de vaccinia modificado, por exemplo, por administração do vírus de vaccinia a um paciente tendo câncer por meio de, por exemplo, uma ou mais das vias de administração descritas aqui. A via de administração pode variar com a localização e natureza do câncer, e pode incluir, por exemplo, intradérmica, transdérmica, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutânea, regional (por exemplo, na proximidade de um tumor, particularmente com a vasculatura ou vasculatura adjacente de tumor), percutânea, intratraqueal, intraperitoneal, intra-arterial, intravesical, intratumoral, inalação, perfusão, lavagem e administração oral e formulação.

[00152] Entende-se que o termo "intravascular" se refere a administração na vasculatura de um paciente, significando, dentro ou em um vaso ou vasos do paciente. Em certas modalidades, a administração é em um vaso considerado como uma veia (intravenosa), enquanto em outras aplicações é em um vaso considerado como uma artéria. As veias incluem, mas não estão limitadas a, veia jugular interna, veia periférica, veia coronária, veia hepática, veia portal, veia safena, veia pulmonar, veia cava superior, veia cava inferior, veia gástrica, veia esplénica, veia mesentérica inferior, veia mesentérica superior, veia cefálica e/ou veia femoral. As artérias incluem, mas não estão limitadas a, artéria coronária,

artéria pulmonar, artéria braquial, artéria carótida interna, arco aórtico, artéria femoral, artéria periférica e/ou artéria ciliar. Contempla-se que o fornecimento pode ser através ou a uma arteríola ou capilar.

[00153] A injeção intratumoral, ou injeção diretamente na vasculatura tumoral, é especificamente contemplada para tumores discretos, sólidos, acessíveis.

Administração local, regional ou sistêmica também pode ser apropriada. As partículas virais podem ser vantajosamente contatadas administrando múltiplas injeções ao tumor, espaçadas, por exemplo, em intervalos de aproximadamente 1 cm. No caso de intervenção cirúrgica, a presente invenção pode ser usada pré-operacionalmente, tal como para tornar um tumor inoperável sujeito a ressecção. A administração contínua também pode ser aplicada onde apropriado, por exemplo, por implantação de um cateter dentro de um tumor ou na vasculatura tumoral. Tal perfusão contínua pode ocorrer, por exemplo, por um período de cerca de 1-2 horas, cerca de 2-6 horas, cerca de 6-12 horas, ou cerca de 12-24 horas após a iniciação do tratamento. Geralmente, a dose da composição terapêutica através de perfusão contínua pode ser equivalente àquela dada por uma única ou múltiplas injeções, ajustada durante um período de tempo durante o qual ocorre a perfusão. Contempla-se ainda que a perfusão do membro pode ser usada para administrar as composições terapêuticas da presente invenção, particularmente no tratamento de melanomas e sarcomas.

[00154] Os regimes de tratamento podem variar, e frequentemente dependem do tipo tumoral, da localização tumoral, da progressão da doença e da saúde e da idade do paciente. Certos tipos de tumor requererão tratamento mais agressivo, enquanto ao mesmo tempo, certos pacientes não podem tolerar mais protocolos de taxação. O médico será mais bem adequado para tomar tais decisões com base na eficácia e toxicidade conhecidas (se houver) das formulações terapêuticas. Em certas modalidades, o tumor que está sendo tratado pode não ser, pelo menos inicialmente, ressecável. Os tratamentos com o agente terapêutico da invenção podem aumentar a ressecabilidade do tumor devido à contração nas margens ou pela eliminação de certas porções particularmente invasivas. Após os tratamentos, a ressecção pode ser possível. Os tratamentos adicionais subsequentes à ressecção servirão para eliminar a doença residual microscópica no sítio tumoral.

[00155] Os tratamentos podem incluir várias "doses unitárias". A dose unitária é definida como contendo uma quantidade predeterminada da composição terapêutica. A quantidade a ser administrada, e a via e formulação particulares, estão dentro da habilidade daqueles versados nas técnicas clínicas. Uma dose unitária não precisa ser administrada como uma única injeção, mas pode compreender infusão contínua durante um período de tempo estabelecido.

A dose unitária da presente invenção pode ser convenientemente descrita em termos de unidades formadoras de placa (pfu) para uma construção viral. As doses unitárias podem variar de 10 3, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, a 1013 pfu e mais altas. Adicionalmente ou alternativamente, dependendo do tipo de vírus e do título obtenível, pode-se distribuir de 1 a 100, 10 a 50, 100- 1000, ou até cerca de ou pelo menos cerca de lxl0 4, lxl05, lxl06, lxl07, lxl08, lxl09, lxl010, lxl01l, lxl012, lxl013, lxl014 ou lxl015 ou partículas virais infecciosas mais altas (vp), incluindo todos os valores e faixas entre o tumor ou o sítio tumoral.

[00156] Outro método de distribuição do genoma de vírus vaccinia recombinante descrito aqui para câncer ou células tumorais pode ser via injeção intratumoral.

Entretanto, as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas de forma parenteral, intravenosa, intradérmica, intramuscular, transdermicamente ou mesmo intraperitonealmente como descrito na patente US No.

5.543.158, patente US No. 5.641.515 e US 5.399.363 (cada uma especificamente incorporada aqui por referência em sua totalidade). A injeção de construtos de ácido nucleico pode ser liberada por seringa ou qualquer outro método usado para a injeção de uma solução, contanto que o construto de expressão possa passar através do calibre particular da agulha necessária para a injeção. Um sistema de injeção sem agulha exemplar que pode ser usado para a presente invenção para a administração de vírus vaccinia recombinantes aqui descritos é exemplificada na patente US No. 5.846.233. Este sistema distingue um bocal definindo uma câmara de ampola para conter a solução e um dispositivo de energia para empurrar a solução para fora do bocal até o local de entrega. Um outro sistema de seringa exemplar é um que permite múltiplas injeções de quantidades predeterminadas de uma solução precisamente em qualquer profundidade (Patente US 5.846.225).

[00157] Misturas das partículas virais ou ácidos nucleicos aqui descritos podem ser preparadas em água adequadamente misturadas com um ou mais excipientes, veículos ou diluentes. Dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições comuns de armazenamento e uso, estas preparações podem conter um conservante para evitar o crescimento de microrganismos. As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis (Patente US No. 5.466.68,

especificamente incorporada aqui por referência em sua totalidade). Em todos os casos, a forma pode ser estéril e pode ser fluida até o ponto em que exista um fácil uso da seringa. Pode ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e semelhantes), misturas adequadas dos mesmos e/ou óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser provocada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00158] Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução pode ser adequadamente tamponada se necessário e o diluente líquido é tornado isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intratumoral e intraperitoneal. Nesta conexão, meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos por aqueles versados na técnica à luz da presente descrição. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução de NaCl isotônica e adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto. Alguma variação na dosagem irá necessariamente ocorrer dependendo da condição do indivíduo que está sendo tratado. A pessoa responsável pela administração, em qualquer caso, determinará a dose apropriada para o indivíduo individual. Além disso, para administração humana, as preparações devem satisfazer os padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza, conforme requerido pelo FDA Office of Biologics standards.

[00159] Conforme aqui utilizado, o termo "veículo" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção, tampões, soluções carreadoras, suspensões, coloides e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto no caso em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas é contemplado.

Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. A frase "farmaceuticamente aceitável" ou "fisiologicamente aceitável" se refere a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica ou similar, quando administrada a um ser humano. A preparação de uma composição aquosa que contém uma proteína como ingrediente ativo é bem conhecida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis, tanto como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, líquido antes da injeção também podem ser preparadas.

Câncer

[00160] O vírus vaccinia recombinante descrito aqui pode ser administrado a um indivíduo mamífero, tal como um ser humano, sofrendo de um distúrbio de proliferação celular, tal como câncer, por exemplo, para matar células cancerosas diretamente por oncólise e/ou melhorar a eficácia da resposta imunológica adaptativa contra as células cancerosas alvo. Em algumas modalidades, o distúrbio de proliferação celular é um câncer, tal como leucemia, linfoma, câncer de fígado, câncer de ossos, câncer de pulmão, câncer de cérebro, câncer de bexiga,

câncer gastrointestinal, câncer de mama, câncer de coração,

câncer cervical, câncer uterino, câncer de cabeça e pescoço, câncer de vesícula biliar, câncer de laringe,

câncer de boca e cavidade oral, câncer ocular, melanoma,

câncer pancreático, câncer de próstata, câncer colorretal,

câncer testicular, ou câncer de garganta.

Em casos particulares, o distúrbio de proliferação celular pode ser um câncer selecionado do grupo consistindo em leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML),

leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mielógena crônica (CML), carcinoma adrenocortical, linfoma relacionado a AIDS, linfoma do SNC primário, câncer anal,

câncer do apêndice, astrocitoma, tumor de teratoide/rabdoide atípico, carcinoma de células basais,

câncer da via biliar, câncer extra-hepático, família do sarcoma de ewing, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno, tumores embrionários do sistema nervoso central,

tumores de células germinativas do sistema nervoso central,

craniofaringioma, ependimoma, tumores brônquicos, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, linfoma primário, cordoma,

neoplasmas mieloproliferativos crônicos, câncer do cólon,

câncer de via biliar extra-hepática, carcinoma ductal in situ (DCIS), câncer endometrial, ependimoma, câncer esofágico, estesioneuroblastoma, tumor de células germinativas extracranianas, tumor de células germinativas extragonadais, câncer da trompa de falópio, histiocitoma fibroso de osso, tumor carcinoide gastrointestinal, tumores estromais gastrointestinais (GIST), tumor de célula germinativa testicular, doença trofoblástica gestacional,

glioma, glioma de tronco cerebral infantil, leucemia de célula pilosa, câncer hepatocelular, histiocitose de células de Langerhans, linfoma de hodgkin, câncer de hipofaringe, tumores de células de ilhotas, tumores neuroendócrinos pancreáticos, tumor de wilms e outros tumores de rim na infância, histiocitose de células de

Langerhans, câncer de pulmão de célula pequena, linfoma de célula T cutânea, melanoma intraocular, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncer de pescoço escamoso metastático, carcinoma do trato mediano, síndromes de neoplasias endócrinas múltiplas, mieloma múltiplo/neoplasma celular de plasma, síndromes mielodisplásicas, câncer de cavidade nasal e seio paranasal, câncer de nasofaringe,

neuroblastoma, linfoma não-hodgkin (NHL), câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC), câncer ovariano epitelial,

câncer ovariano de células germinativas, câncer ovariano de potencial maligno baixo, tumores neuroendócrinos pancreáticos, papilomatose, paraganglioma, câncer de cavidade nasal e paranasal, câncer da paratireoide, câncer peniano, câncer faríngeo, feocromocitoma, tumor pituitário,

blastoma pleuropulmonar, câncer peritoneal primário, câncer retal, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de glândula salivar, sarcoma de kaposi, rabdomiossarcoma, síndrome de Sezáry, câncer de intestino delgado, sarcoma de tecido mole, câncer de garganta, timoma e carcinoma tímico, câncer de tiroide, câncer de célula transicional da pelve renal e ureter, câncer uretral, câncer uterino endometrial, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, e macroglobulinemia de Waldenstrom.

[00161] Um médico que tem habilidade comum na técnica pode prontamente determinar uma quantidade eficaz do vetor de vírus vaccinia recombinante para administração a um indivíduo mamífero (por exemplo, um ser humano) em necessidade do mesmo. Por exemplo, um médico pode iniciar a prescrição de doses de vetor de vírus vaccinia recombinante em níveis inferiores àquele requerido para atingir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja atingido. Alternativamente, um médico pode iniciar um regime de tratamento administrando uma dose de vetor de vírus vaccinia recombinante e subsequentemente administrar doses progressivamente menores até que seja obtido um efeito terapêutico (por exemplo, uma redução no volume de um ou mais tumores). Em geral, uma dose diária adequada de um vetor de vírus de vaccinia recombinante da invenção será uma quantidade do vetor de vírus vaccinia recombinante que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeito terapêutico. Uma dose diária de uma composição terapêutica do vetor de vírus de vaccinia recombinante da invenção pode ser administrada como uma dose única ou como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais doses administradas separadamente em intervalos apropriados ao longo do dia, semana, mês ou ano, opcionalmente, em formas de dosagem unitária. Embora seja possível que o vetor de vírus de vaccinia recombinante da invenção seja administrado sozinho, ele também pode ser administrado como uma formulação farmacêutica em combinação com excipientes, veículos e, opcionalmente, agentes terapêuticos adicionais.

[00162] Vetores de vírus vaccinia recombinante da invenção podem ser monitorados por sua capacidade de atenuar a progressão de uma doença de proliferação celular, tal como câncer, por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um médico pode monitorar a resposta de um indivíduo mamífero (por exemplo, um humano) ao tratamento com o vetor do vírus vaccinia recombinante da invenção analisando o volume de um ou mais tumores no paciente. Alternativamente, um médico pode monitorar a capacidade de resposta de um indivíduo (por exemplo, um humano) ao tratamento com o vetor do vírus da vacina recombinante da invenção analisando a população de células T-reg na linfa de um sujeito em particular. Por exemplo, um médico pode retirar uma amostra de um indivíduo mamífero (por exemplo, um humano) e determinar a quantidade ou densidade de células cancerígenas usando procedimentos estabelecidos, como a classificação de células ativadas por fluorescência. Uma constatação de que a quantidade de células cancerígenas na amostra diminuiu (por exemplo, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) em relação à quantidade de células cancerígenas em uma amostra obtida do sujeito antes da administração do vírus vaccinia recombinante pode ser uma indicação de que a administração do vírus vaccinia está efetivamente tratando o câncer.

Ensaios para Medir Características do Vírus

[00163] Os ensaios conhecidos na técnica para medir a propagação do tumor e a virulência de um vírus incluem, mas não estão limitados a, medir o tamanho da placa, formação de sincitia e/ou ensaios de cometa (EEVs). Os ensaios conhecidos na técnica para medir a atividade imunoestimuladora de um vírus incluem, mas não estão limitados a ativação de NK (medida em % de expressão de CD69), degranulação de NK (medida em aumento de vezes de CDl07a) e/ou ensaios de iniciação de células T. Ensaios conhecidos na técnica para medir a seletividade de um vírus, mas não estão limitados a, lesões de catapora, biodistribuição e/ou medições de massa corporal.

Exemplos de Proteínas Codificadas por Genes de Vírus

Vaccinia

[00164] Como usado abaixo, o termo "localização" se refere à localização do gene com relação aos ácidos nucleicos excluídos em vetores de vírus vaccinia exemplares aqui descritos. Para vários genes, são providas informações de sequência de aminoácidos e números de ID de acesso de proteína.

Tabela 2. Exemplos de proteínas codificadas por genes de Vaccinia Copenhagen excluídos no vetor CopMD5p ID de SEQ Locali- Gene Acesso à Sequência de aminoácido ID NO. zação Proteína

MESVIFSINGEIIQVNKEIITASPYNFFKRIQDHH LKDEAIILNGINYHAFESLLDYIRWKKINITINNV EMILVAAIIIDVPPVVDLCVKTMIHNINSTNCIRM FNFSKRYGIKKLYNASMSEIINNITAVTSDPEFGK LSKDELTTILSHENVNVNHEDVTAMILLKWIHKNP

NDVDIINILHPKFMTNTMRNAISLLGLTISKSTKP C2L VTRNGIKHNIVVIKNSDYISTITHYSPRTEYWTIV SEQ ID Exclusão (26% AAA47999.1 GNTDRQFYNANVLHNCLYIIGGMINNRHVYSVSRV NO:23 Interna 5') DLETKKWKTVTNMSSLKSEVSTCVNDGKLYVIGGL

EFSISTGVAEYLKHGTSKWIRLPNLITPRYSGASV FVNDDIYVMGGVYTTYEKYVVLNDVECFTKNRWIK KSPMPRHHSIVYAVEYDGDIYVITGITHETRNYLY KYIVKEDKWIELYMYFNHVGKMFVCSCGDYILIIA DAKYEYYPKSNTWNLFDMSTRNIEYYDMFTKDETP KCNVTHKSLPSFLSNCEKQFLQ MVKNNKISNSCRMIMSTNPNNILMRHLKNLTDDEF KCIIHRSSDFLYLSDSDYTSITKETLVSEIVEEYP

DDCNKILAIIFLVLDKDIDVDIETKLKPKPAVRFA SEQ ID Exclusão C1L AAA48000.1 ILDKMTEDIKLTDLVRHYFRYIEQDIPLGPLFKKI NO:24 Interna

DSYRTRAINKYSKELGLATEYFNKYGHLMFYTLPI PYNRFFCRNSIGFLAVLSPTIGHVKAFYKFIEYVS IDDRRKFKKELMSK

MRTLLIRYILWRNDNDQTYYNDDFKKLMLLDELVD SEQ ID DGDVCTLIKNMRMTLSDGPLLDRLNQPVNNIEDAK Exclusão N1L AAA48001.1 NO:25 RMIAISAKVARDIGERSEIRWEESFTILFRMIETY Interna

FDDLMIDLYGEK MTSSAMDNNEPKVLEMVYDATILPEGSSMDPNIMD

CINRHINMCIQRTYSSSIIAILNRFLTMNKDELNN SEQ ID Exclusão N2L AAA48002.1 TQCHIIKEFMTYEQMAIDHYGEYVNAILYQIRKRP NO:26 Interna

NQHHTIDLFKKIKRTPYDTFKVDPVEFVKKVIGFV SILNKYKPVYSYVLYENVLYDEFKCFINYVETKYF MIFVIESKLLQIYRNRNRNINFYTTMDNIMSAEYY LSLYAKYNSKNLDVFRNMLQAIEPSGNNYHILHAY CGIKGLDERFVEELLHRGYSPNETDDDGNYPLHIA SKINNNRIVAMLLTHGADPNACDKHNKTPLYYLSG TDDEVIERINLLVQYGAKINNSVDEEGCGPLLACT

DPSERVFKKIMSIGFEARIVDKFGKNHIHRHLMSD SEQ ID NPKASTISWMMKLGISPSKPDHDGNTPLHIVCSKT Exclusão M1L AAA48003.1 NO:27 VKNVDIIDLLLPSTDVNKQNKFGDSPLTLLIKTLS Interna

PAHLINKLLSTSNVITDQTVNICIFYDRDDVLEII NDKGKQYDSTDFKMAVEVGSIRCVKYLLDNDIICE DAMYYAVLSEYETMVDYLLFNHFSVDSVVNGHTCM SECVRLNNPVILSKLMLHNPTSETMYLTMKAIEKD KLDKSIIIPFIAYFVLMHPDFCKNRRYFTSYKRFV TDYVHEGVSYEVFDDYF MVYKLVLLFCIASLGYSVEYKNTICPPRQDYRYWY FAAELTIGVNYDINSTIIGECHMSESYIDRNANIV

LTGYGLEINMTIMDTDQRFVAAAEGVGKDNKLSVL SEQ ID Exclusão M2L AAA48004.1 LFTTQRLDKVHHNISVTITCMEMNCGTTKYDSDLP NO:28 Interna

ESIHKSSSCDITINGSCVTCVNLETDPTKINPHYL HPKDKYLYHNSEYGMRGSYGVTFIDELNQCLLDIK ELSYDICYRE MDLSRINTWKSKQLKSFLSSKDTFKADVHGHSALY YAIADNNVRLVCTLLNAGALKNLLENEFPLHQAAT LEDTKIVKILLFSGMDDSQFDDKGNTALYYAVDSG

NMQTVKLFVKKNWRLMFYGKTGWKTSFYHAVMLND SEQ ID Exclusão HR/K1L AAA48005.1 VSIVSYFLSEIPSTFDLAILLSCIHTTIKNGHVDM NO:29 Interna

MILLLDYMTSTNTNNSLLFIPDIKLAIDNKDIEML QALFKYDINIYSVNLENVLLDDAEITKMIIEKHVE YKSDSYTKDLDIVKNNKLDEIISKNKELRLMYVNC VKKN MIALLILSLTCSVSTYRLQGFTNAGIVAYKNIQDD NIVFSPFGYSFSMFMSLLPASGNTRIELLKTMDLR KRDLGPAFTELISGLAKLKTSKYTYTDLTYQSFVD NTVCIKPLYYQQYHRFGLYRLNFRRDAVNKINSIV

ERRSGMSNVVDSNMLDNNTLWAIINTIYFKGTWQY SEQ ID SPI- Exclusão AAA48006.1 PFDITKTRNASFTNKYGTKTVPMMNVVTKLQGNTI NO:30 3/K2L Interna

TIDDEEYDMVRLPYKDANISMYLAIGDNMTHFTDS ITAAKLDYWSFQLGNKVYNLKLPKFSIENKRDIKS IAEMMAPSMFNPDNASFKHMTRDPLYIYKMFQNAK IDVDEQGTVAEASTIMVATARSSPEKLEFNTPFVF IIRHDITGFILFMGKVESP

MGHIITYCQVHTNISILIRKAHHIIFFVIDCDCIS SEQ ID K ORF Exclusão AAA48007.1 LQFSNYVHHGNRFRTVLISKTSIACFSDIKRILPC NO:31 A Interna

TFKIYSINDCP

MGTVFVPYLLVKLALRVLVISNGYCHVPLKYIVLM SEQ ID K ORF Exclusão AAA48008.1 IAHRVLLSSILESTTLDIPDLRSTIELILLTASRL NO:32 B Interna

KFNLYRPNL

MLAFCYSLPNAGDVIKGRVYEKDYALYIYLFDYPH SEQ ID Exclusão K3L AAA48009.1 SEAILAESVKMHMDRYVEYRDKLVGKTVKVKVIRV NO:33 Interna

DYTKGYIDVNYKRMCRHQ MNPDNTIAVITETIPIGMQFDKVYLSTFNMWREIL SNTTKTLDISSFYWSLSDEVGTNFGTIILNEIVQL

PKRGVRVRVAVNKSNKPLKDVERLQMAGVEVRYID SEQ ID ITNILGGVLHTKFWISDNTHIYLGSANMDWRSLTQ Exclusão K4L AAA48010.1 NO:34 VKELGIAIFNNRNLAADLTQIFEVYWYLGVNNLPY Interna

NWKNFYPSYYNTDHPLSINVSGVPHSVFIASAPQQ LCTMERTNDLTALLSCIRNASKFVYVSVMNFIPII YSKAGKILFWPYIEDELRRSAIDRQVSVKLLISCW QRSSFIMRNFLRSIAMLKSKNIDIEVKLFIVPDAD PPIPYSRVNHAKYMVTDKTAYIGTSNWTGNYFTDT CGASINITPDDGLGLRQQLEDIFMRDWNSKYSYEL YDTSPTKRCKLLKNMKQCTNDIYCDEIQPEKEIPE YSLE

MGATISILASYDNPNLFTAMILMSPLVNADAVSRL SEQ ID NLLAAKLMGTITPNAPVGKLCPESVSRDMDKVYKY Exclusão K5L AAA48011.1 NO:35 QYDPLINHEKIKAGFASQVLKATNKVRKIISKINT Interna

PRLSYSREQTMRLVMFQVHIISCNMQIVIE

MSANCMFNLDNDYIYWKPITYPKALVFISHGAGKH SEQ ID Exclusão K6L AAA48012.1 SGRYDELAENISSLGILVFSHDHIGHGRSNGEKMM NO:36 Interna

IDDFGTARGNY MATKLDYEDAVFYFVDDDKICSRDSIIDLIDEYIT

WRNHVIVFNKDITSCGRLYKELMKFDDVAIRYYGI SEQ ID Exclusão K7R AAA48013.1 DKINEIVEAMSEGDHYINFTKVHDQESLFATIGIC NO:37 Interna

AKITEHWGYKKISESRFQSLGNITDLMTDDNINIL ILFLEKKLN MLSMFMCNNIVDYVDDIDNGIVQDIEDEASNNVDH DYVYPLPENMVYRFDKSTNILDYLSTERDHVMMAV

RYYMSKQRLDDLYRQLPTKTRSYIDIINIYCDKVS SEQ ID Exclusão F1L AAA48014.1 NDYNRDMNIMYDMASTKSFTVYDINNEVNTILMDN NO:38 Interna

KGLGVRLATISFITELGRRCMNPVKTIKMFTLLSH TICDDCFVDYITDISPPDNTIPNTSTREYLKLIGI TAIMFATYKTLKYMIG MFNMNINSPVRFVKETNRAKSPTRQSPGAAGYDLY

SAYDYTIPPGERQLIKTDISMSMPKICYGRIAPRS SEQ ID DUT/F2 Exclusão AAA48015.1 GLSLKGIDIGGGVIDEDYRGNIGVILINNGKCTFN NO:39 L Interna

VNTGDRIAQLIYQRIYYPELEEVQSLDSTNRGDQG FGSTGLR MPIFVNTVYCKNILALSMTKKFKTIIDAIGGNIIV NSTILKKLSPYFRTHLRQKYTKNKDPVTRVCLDLD IHSLTSIVIYSYTGKVYIDSHNVVNLLRASILTSV EFIIYTCINFILRDFRKEYCVECYMMGIEYGLSNL LCHTKNFIAKHFLELEDDIIDNFDYLSMKLILESD

ELNVPDEDYVVDFVIKWYIKRRNKLGNLLLLIKNV F3L SEQ ID IRSNYLSPRGINNVKWILDCTKIFHCDKQPRKSYK Exclusão (75% AAA48016.1 NO:40 YPFIEYPMNMDQIIDIFHMCTSTHVGEVVYLIGGW Interna 3')

MNNEIHNNAIAVNYISNNWIPIPPMNSPRLYATGI PANNKLYVVGGLPNPTSVERWFHGDAAWVNMPSLL KPRCNPAVASINNVIYVMGGHSETDTTTEYLLPNH DQWQFGPSTYYPHYKSCALVFGRRLFLVGRNAEFY CESSNTWTLIDDPIYPRDNPELIIVDNKLLLIGGF

YRGSYIDTIEVYNHHTYSWNIWDGK Tabela 3. Exemplos de proteínas codificadas pelos genes de Vaccinia Copenhagen excluídas no vetor CopMD3p ID de SEQ Locali- Gene Acesso à Sequência de aminoácido ID NO zação Proteína

MNHCLLAISAVYFKAKWLTPFEKEFTSDYPFYVS

PTEMVDVSMMSMYGELFNHASVKESFGNFSIIEL B14R PYVGDTSMMVILPDKIDGLESIEQNLTDTNFKKW SEQ ID Exclusão (41% AAA48211.1 CNSLDAMFIDVHIPKFKVTGSYNLVDTLVKSGLT NO:108 Interna 3') EVFGSTGDYSNMCNLDVSVDAMIHKTYIDVNEEY

TEAAAATCALVSDCASTITNEFCVDHPFIYVIRH VDGKILFVGRYCSPTTNC MTANFSTHVFSPQHCGCDRLTSIDDVKQCLTEYI

YWSSYAYRNRQCAGQLYSTLLSFRDDAELVFIDI SEQ ID Exclusão B15R AAA48212.1 RELVKNMPWDDVKDCTEIIRCYIPDEQKTIREIS NO:109 Interna

AIIGLCAYAATYWGGEDHPTSNSLNALFVMLEML NYVDYNIIFRRMN

MYNSSIHTPEYDVIIHVIEHLKHHKQCVQTVTSG SEQ ID B ORF Exclusão AAA48213.1 MVFTSPVSSSICTKSDDGRNLSDGFLLIRYITTD NO:110 E Interna

DFCTIFDIIPRHIFYQLANVDEH MSILPVIFLPIFFYSSFVQTFNASECIDKGXYFA SFMELENEPVILPCPQINTLSSGYNILDILWEKR GADNDRIIPIDNGSNMLILNPTQSDSGIYICITT

NETYCDMMSLNLTIVSVSESNIDFISYPQIVNER SEQ ID STGEMVCPNINAFIASNVNADIIWSGHRRLRNKR Exclusão B16R AAA48214.1 NO:111 LKQRTPGIITIEDVRKNDAGYYTCVLEYIYGGKT Interna

YNVTRIVKLEVRDKIIHPTMQLPEGVVTSIGSNL TIACRVSLRPPTTDADVFWISNGMYYEEDDGDGD GRISVANKIYMTDKRRVITSRLNINPVKEEDATT FTCMAFTIPSISKTVTVSIT

MVIIPGVRCLSLLFLRRRCPLHIISAFTLLAINA SEQ ID B ORF Exclusão AAA48215.1 LILGHTISPVDLSFTICGYEIKSIFDSETDTIVK NO:112 F Interna

FNDIMSQ MSRKFMQVYEYDREQYLDEFIEDRYNDSFITSPE YYSAEKYMCRYTTLNHNCVNVRRCALDSKLLHDI ITNCKIYNNIELVRATKFVYYLDLIKCNWVSKVG

DSVLYPVIFITHTSTRNLDKVSVKTYKGVKVKKL SEQ ID NRCADHAIVINPFVKFKLTLPNKTSHAKVLVTFC Exclusão B17L AAA48216.1 NO:113 KLRTDITPVEAPLPGNVLVYTFPDINKRIPGYIH Interna

VNIEGCIDGMIYINSSKFACVLKLHRSMYRIPPF PIDICSCCSQYTNDDIEIPIHDLIKDVAIFKNKE TVYYLKLNNKTIARFTYFNNIDTAITQEHEYVKI ALGIVCKLMINNMHSIVGVNHSNTFVNCLLEDNV MSRRLIYVLNINRKSTHKIQENEIYTYFSHCNID HTSTELDFVVKNYDLNRRQHVTGYTALHCYLYNN YFTNDVLKILLNHDVNVTMKTSSGRMPVYILLTR CCNISHDVVIDMIDKDKNHLSHRDYSNLLLEYIK SRYMLLKEEDIDENIVSTLLDKGIDPNFKQDGYT ALHYYYLCLAHVYKPGECRKPITIKKAKRIISLF IQHGANLNALDNCGNTPFHLYLSIEMCNNIHMTK

MLLTFNPNFKICNNHGLTPILCYITSDYIQHDIL SEQ ID Exclusão B18R AAA48217.1 VMLIHHYETNVGEMPIDERRMIVFEFIKTYSTRP NO:114 Interna

ADSITYLMNRFKNINIYTRYEGKTLLHVACEYNN TQVIDYLIRINGDINALTDNNKHATQLIIDNKEN SPYTINCLLYILRYIVDKNVIRSLVDQLPSLPIF DIKSFEKFISYCILLDDTFYDRHVKNRDSKTYRY AFSKYMSFDKYDGIITKCHDETMLLKLSTVLDTT LYAVLRCHNSRKLRRYLTELKKYNNDKSFKIYSN IMNERYLNVYYKDMYVSKVYDKLFPVFTDKNCLL TLLPSEIIYEILYMLTINDLYNISYPPTKV MTMKMMVHIYFVSLSLLLLLFHSYAIDIENEITE FFNKMRDTLPAKDSKWLNPACMFGGTMNDMATLG EPFSAKCPPIEDSLLSHRYKDYVVKWERLEKNRR RQVSNKRVKHGDLWIANYTSKFSNRRYLCTVTTK

NGDCVQGIVRSHIKKPPSCIPKTYELGTHDKYGI SEQ ID Exclusão B19R AAA48218.1 DLYCGILYAKHYNNITWYKDNKEINIDDIKYSQT NO:115 Interna

GKELIIHNPELEDSGRYDCYVHYDDVRIKNDIVV SRCKILTVIPSQDHRFKLILDPKINVTIGEPANI TCTAVSTSLLIDDVLIEWENPSGWLIGFDFDVYS VLTSRGGITEATLYFENVTEEYIGNTYKCRGHNY YFEKTLTTTVVLE

MDEDTRLSRYLYLTDREHINVDSIKQLCKISDPN SEQ ID ACYRCGCTALHEYFYNYRSVNGKYKYRYNGYYQY Exclusão B20R AAA48219.1 NO:116 YSSSDYENYNEYYYDDYDRTGMNSESDSESDNIS Interna

IKTEYENEYEFYDETQDQSTQHNDL

MSLESFIITTFNNNSSTNIDNMCHLYVKVCPSSL SEQ ID Exclusão B21R AAA48220.1 LFRLFVECCDINKLVEGTTPLHCYLMNEGFESSV NO:117 Interna

LKNLLKEYVMNTFNVHDIHYTNI MISLSFLIHNPLKKWKLKPSISINGYRSTFTMAF

PCAQFRPCHCHATKDSLNTVADVRHCLTEYILWV SEQ ID SHRWTHRESAGSLYRLLISFRTDATELFGGELKD Exclusão B22R AAA48221.1 NO:118 SLPWDNIDNCVEIIKCFIRNDSMKTAEELRAIIG Interna

LCTQSAIVSGRVFNDKYIDILLMLRKILNENDYL TLLDHIRTAKY MIAFIIFREIGIISTRIAMDYCGRECTILCRLLD EDVTYKKIKLEIETCHNLSKHIDRRGNNALHCYV SNKCDTDIKIVRLLLSRGVERLCRNNEGLTPLGA YSKHRYVKSQIVHLLISSYSNSSNELKSNINDFD

LSSDNIDLRLLKYLIVDKRIRPSKNTNYAINGLG SEQ ID LVDIYVTTPNPRPEVLLWLLKSECYSTGYVFRTC Exclusão B23R AAA48222.1 NO:119 MYNSDMCKNSLHYYISSHRESQSLSKDVIKCLIN Interna

NNVSIHGRDEGGSLPIQYYWSFSTIDIEIVKLLL IKDVDTCRVYDVSPILEAYYLNKRFRVTPYNVDM EIVNLLIERRHTLVDVMRSITSYDSREYNHYIID NILKRFRQQDESIVQAMLINYLHYGDMVVRCMLD NGQQLSSARLLC MYGLILSRFNNCGYHCYETILIDVFDILSKYMDD

IDMIDNENKTLLYYAVDVNNIQFAKRLLEYGASV SEQ ID Exclusão B24R AAA48223.1 TTSRSIINTAIQKSSYQRENKTRIVDLLLSYHPT NO:120 Interna

LETMIDAFNRDIRYLYPEPLFACIRYALILDDDF PSKVSMISPVIIRN

MRRCIHIKERKIHMTNIVDRNVTFILTVVHKYVR SEQ ID B ORF Exclusão AAA48224.1 YVPHTVANDAHNLVHLAHLIHFIIYFFIIRDVRK NO:121 G Interna

KKKKKKKNRTIYFFSNVYARHIK MSRINITKKIYCSVFLFLFLFLSYISNYEKVNDE MYEMGEMDEIVSIVRDSMWYIPNVFMDDGKNEGH

VSVNNVCHMYFTFFDVDTSSHLFKLVIKHCDLNK SEQ ID RGNSPLHCYTMNTRFNPSVLKILLHHGMRNFDSK Exclusão B25R AAA48225.1 NO:122 DEKGHHYLIHSLSIDNKIFDILTDTIDDFSKSSD Interna

LLLCYLRYKFNGSLNYYVLYKGSDPNCADEDELT SLHYYCKHISTFYKSNYYKLSHTKMRAEKRFIYA IIDYGANINAVTHLPSTVYQT

MEQTLTRLHTYLQQYTKHSPRVVYALLSRGYVII SEQ ID LIVHPSWNDCATGHILIMLLNWHEQKEEGQHLLY Exclusão B26R AAA48226.1 NO:123 LFIKHNQGYTLNILRYLLDRFDIQKDEYIYRLSK Interna

L SEQ ID MLPHTSDTTSTFRLKTVFDLVFENRNIIYKADVV Exclusão B27R AAA48227.1 NDIIHHRLKVSLPMIKSLFYKMSEFSPYDDYYVK NO:124 Interna

KILAYCLLRDESFAELHSKFCLNEDYKSVFMKNI SFDKIDSIIVT

MKSVLYSYILFLSCIIINGRDIAPHAPSDGKCKD SEQ ID NEYKRHNLCPGTYASRLCDSKTNTQCTPCGSGTF Exclusão B28R AAA48228.1 NO:125 TSRNNHLPACLSCNGRRDRVTLLTIESVNALPDI Interna

IVFSKDHPDARHVFPKQNVE MHVPASLQQSSSSSSSCTEEENKHHMGIDVIIKV

TKQDQTPTNDKICQSVTEITESESDPDPEVESED C23L/B DSTSVEDVDPPTTYYSIIGGGLRMNFGFTKCPQI SEQ ID 29R KSISESADGNTVNARLSSVSPGQGKDSPAITREE Exclusão AAA48229.1 NO:126 (44% ALAMIKDCEVSIDIRCSEEEKDSDIKTHPVLGSN Interna 5') ISHKKVSYEDIIGSTIVDTKCVKNLEFSVRIGDM

CKESSELEVKDGFKYVDGSASEGATDDTSLIDST

KLKACV Exemplos

[00165] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a fornecer aqueles versados na técnica com uma descrição de como as composições e métodos reivindicados aqui são realizados, feitos, e avaliados, e destinam-se a ser puramente exemplares da invenção e não se destinam a limitar o escopo do que diz respeito à presente invenção.

Exemplo 1 - Criação do vírus Vaccinia Recombinante CopMD5p3p "SKV-B8R+"

[00166] Os quadros de leitura aberta (ORFs) de 59 cepas de poxvirus foram agrupados em ortólogos e alinhados no nível de aminoácidos (ver Figura 1 para análise filogenética). A análise bayesiana foi realizada para determinar a relação de todas as cepas. Os poxvírus são muito diversos no teor de genes e na faixa de hospedeiros.

Existem várias cepas de Vaccinia de tipo selvagem que ocorrem naturalmente, que são diferentes umas das outras.

[00167] Cinco cepas de Vaccinia do tipo selvagem (Copenhagen, TianTan, Lister, Wyeth e Western Reserve) foram misturadas em contagens de unidade formadoras de placa iguais e sequenciadas com NGS (pool de entrada). A mistura resultante foi passada três vezes em linhagens de células cancerosas diferentes (HeLa, 786-0, HT29, MCF7). A população final foi sequenciada com sequenciamento de NGS ilumina.Leituras (fragmentos curtos de DNA) foram atribuídas a várias cepas baseadas em identidade de sequência e usadas para calcular a porcentagem de cada cepa na população final. A abundância relativa das diferentes cepas virais foi então quantificada. Conforme mostrado na Figura 2, a cepa Copenhagen foi a cepa de vaccinia mais abundante após três passagens em qualquer uma das quatro linhagens de células cancerosas, indicando que esta cepa foi capaz de desenvolver outras cepas e, portanto, se replica mais rápido.

[00168] Diferentes cepas de Vaccinia tipo selvagem também foram usadas para infectar em baixa PFU (1 X 10 4) vários núcleos de tumor do paciente. Cada cepa infectada em média de 4 replicatas, cada uma contendo três núcleos de tumor de 2 x 2 mm. A replicação foi avaliada através de titulação de vírus e é expressa como unidades formadoras de placa (PFU) conforme mostrado na Figura 3. A Cepa de Copenhagen cresce a títulos mais elevados do que outras cepas e, portanto, se replica mais rápido em amostras ex- vivo do paciente. Núcleos ex-vivo do paciente são uma boa imitação do tumor 3D do paciente.

[00169] As cepas de Vaccinia do tipo selvagem foram então submetidas a um ensaio de placa em células U2-OS com uma sobrecamada de CMC de 3%. Dois dias depois da infecção, 20-30 placas para cada cepa foram medidas quanto ao seu tamanho. As medições de tamanho de placa para Copenhagen, Western Reserve, Wyeth, Lister, e Tian Tan são mostradas na Figura 4. A formação da placa é afetada pela capacidade do vírus se replicar, espalhar e matar. Os tamanhos de placa maiores observados para a cepa de Copenhagen sugerem que esta cepa é superior nestas capacidades, que são importantes para o desenvolvimento de um vírus oncolítico.

[00170] Então, o número de sítios de TTAA através de regiões de lkb no genoma de Vaccinia Copenhagen foi contado (ver Figura 5A). O sequenciamento de NGS ilumina foi combinado e usado para identificar sítios de inserção de transposon (Tn-Seq). A biblioteca de entrada foi passada três vezes em células HeLa ou U2-OS, após as quais foram determinadas frequências de nocaute de transposon. A frequência de um nocaute corresponde diretamente à quantidade de leituras que suportam o evento (ver Figura 5B e Figura 6).

[00171] Finalmente, todos os genomas de 59 poxvírus da Figura 1 foram usados para encontrar ORFs e agrupados em grupos ortólogos. Grupos contendo genes de Copenhagen foram plotados com base na localização do gene no genoma de Copenhagen (eixo x) e tamanho do grupo (eixo y). Quando todas as 59 espécies compartilham o mesmo gene, a conservação é considerada como sendo de 100%. O motivo TTAA é necessário para uma inserção de transposon e este motivo é ubíquo ao longo do genoma, significando transposons que podem inserir em qualquer lugar no genoma. Entretanto, observou-se que a inserção de transposons preferencialmente em áreas de conservação de genes de poxírus. Durante o sequenciamento de nocautes de transposon, as exclusões principais foram identificadas e rotuladas como CopMD5p E CopMD3p (veja a Figura 5C e a Figura 6). Genes que estão presentes no meio do genoma e que têm uma elevada conservação de genes (Figura 5C) são importantes para a replicação viral. Isto é porque o nocaute destes genes fora com inserções de transposon causa uma diminuição na aptidão (menos frequência após a passagem). Descobriu-se que genes que são parte das exclusões principais CopMD5p e CopMD3p são menos importantes para replicação viral, já que sua exclusão não afeta a aptidão.

[00172] O sequenciamento profundo de NGS ilumina revelou a presença de exclusões principais durante o processo de purificação de placa. CopMD5p e CopMD3p representam clones, que foram purificados por placa e encontrados para abrigar grandes exclusões genômicas. Estes 2 clones foram usados para co-infectar uma monocamada de células HeLa em MOI elevado (MOI 10) para induzir recombinação. Coleta de placa aleatória e PCR revelou a presença de uma dupla exclusão de CopMD5p3p que continha ambas as exclusões do genoma (ver Figura 8). Estas 2 exclusões foram combinadas e purificadas para produzir um vírus replicante, referido aqui como "CopMD5p3p", que exibe exclusões nos genes C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L, B14R, B15R, B16R, B17L, B18R, B19R e B20R, bem como exclusões únicas em cada um dos genes ITR, B21R, B22R, B23R, B24R, B25R, B26R, B27R, B28R e B29R. Conforme usado aqui, "CopWT" Se refere a vírus vaccinia Copenhagen do tipo selvagem, e "CopMD5p" se refere a vírus vaccinia Copenhagen abrigando exclusões em genes 5' representativos (C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L) e "CopMD3p" se refere a um vírus vaccinia Copenhagen abrigando exclusões em genes 3' representativos (B14R, B15R, B16R, B17L, B18R, B19R e B20R) bem como exclusões individuais em cada um dos genes ITR B21R, B22R, B23R, B24R, B25R, B26R, B27R, B28R e B29R.

[00173] Os 59 genomas de poxvírus foram então avaliados para a presença destes 32 genes excluídos no

CopMD5p3p. Pesquisas de homologia foram usadas para consultar poxvírus a partir de outros clades com sequências de aminoácidos dos genes da Tabela 2 do genoma do Copenhagen. Conforme mostrado na Figura 31, a percentagem destes 32 genes presentes em várias cepas de poxvírus diminui com o aumento da divergência da cepa Copenhagen (cada ponto no gráfico representa um genoma de poxvírus).

Entretanto, a maioria dos membros da família vaccinia compreende pelo menos 85% dos genes que são excluídos no vetor recombinante CopMD5p3p.

Exemplo 2 - Morte de Células Cancerosas

[00174] As células cancerosas foram infectadas com CopMD5p3p em uma faixa de MOIs (1 a 0,01) em placas de 24 poços em 4 replicatas. Dois dias após a infecção com vírus, as placas foram coradas com violeta de cristal. A mancha violeta de cristal foi dissolvida em SDS e lida por espectrofotometria. Os dados são representados como percentual de células não-infectadas (veja Figura 9). Estes dados mostram que a maioria das linhagens de células cancerosas morrem mais rapidamente quando expostos ao vírus CopMD5p3p.

[00175] A capacidade do vírus vaccinia Copenhagen do tipo selvagem e de vários vídrions vaccinia Copenhagen modificados para induzir uma resposta imune antitumoral e para propagar em várias linhagens de células cancerosas também é mostrada nas Figuras 26, 27 e 29-35.

Exemplo 3 - Crescimento em Células Cancerosas

[00176] Quatro linhagens de células cancerosas foram infectadas com CopMD5p3p a um baixo MOI (0,001) em placas de 24 poços em triplicatas, e em diferentes pontos de tempo, o vírus foi coletado e titulado. O tempo 0h representa a entrada. As curvas de crescimento de HeLa, 786-O, HT-29 e MCF7 são mostradas na Figura 10. Estes dados mostram que o vírus CopMD5p3p modificado não é prejudicado em sua capacidade de crescer in vitro. Isto significa que o vírus é competente na replicação, mesmo na presença de resposta de interferon. A capacidade de replicar em linhagens de células de mamíferos fornece outra vantagem importante. Como tal, os vírus podem ser fabricados com velocidade e eficiência melhoradas.

Exemplo 4 - Crescimento em Amostras de Tumor do Paciente

[00177] Amostras de tumor do paciente foram obtidas imediatamente após a cirurgia e cortadas em núcleos de 2 mm x 2 mm. Três núcleos foram infectados com uma pequena quantidade de vírus (1 x 10 4 PFU), tanto Copenhagen do tipo selvagem quanto CopMD5p3p. Após 72h, a saída do vírus foi avaliada por ensaio de placa e título viral final expresso como PFU (ver Figura 11). Estes dados mostram que o vírus CopMD5p3p modificado pode se replicar em amostras frescas de tumor de paciente. A replicação em amostras de tumor do paciente é um bom modelo de replicação em tumor 3D do paciente.

Exemplo 5 - Sincitia em Células U2-OS

[00178] Monocamadas de células U2-OS foram infectadas com vírus de Copenhagen tipo selvagem ou CopMD5p3p. Após 2h, o meio foi alterado para meio de sobreposição, como feito para um ensaio de placa. Em 48h após a infecção, foram tomadas imagens com EVOS para avaliar o fenótipo da placa (ver Figura 12). Acredita-se que a fusão celular, também conhecida como sincitia, ajuda o espalhamento do vírus, uma vez que as células não infectadas se fundem com as células infectadas.

Adicionalmente, mostrou-se que células fundidas são imunogênicas e, no caso de células cancerosas, podem ajudar a iniciar uma resposta imunológica antitumoral. Veja, por exemplo, http://cansres.aacrjoumals.org/content/62/22/6566.long.

Exemplo 6 - Sincitia em Células 786-O

[00179] Monocamadas de células 786-O foram infectadas com vírus de Copenhagen tipo selvagem ou CopMD5p3p. Após 24h, as imagens foram tiradas com EVOS em aumento de 10X (ver Figura 13). Esta é evidência adicional para a ocorrência de sincitia. Na Figura 12, é mostrado o fenótipo de uma placa. No experimento atual, as monocamadas de células foram infectadas sem sobreposição. A maioria das células infectadas pelo vírus CopMD5p3p se fundiram.

Exemplo 7 - Controle de Tumor e perda de peso no modelo de rato

[00180] Camundongos Nude CD-l (Crl: CDl-Foxn1nu) foram semeados com xenoenxerto de câncer de cólon humano HT -29 (células 5e6). Uma vez que os tumores subcutâneos tiveram um tamanho estabelecido aproximado de 5 mm x 5 mm, os camundongos foram tratados três vezes (linhas tracejadas) 24h separados com 1 x 10 7 PFU de vírus vaccinia intravenosa. Os camundongos foram avaliados aproximadamente a cada outro dia para o tamanho do tumor e perda de peso (veja a Figura 14). Este experimento mostra que CopMD5p3p é um vírus muito mais seguro porque não causa qualquer perda de peso ou outros sinais de doença em camundongos nude imunocomprometidos. Este experimento também mostra CopMD5p3p é capaz de controlar o crescimento tumoral similarmente ao vírus do tipo selvagem Copenhagen parental.

Exemplo 8 - Formação de lesões Pox

[00181] Camundongos CD-l nude foram tratados uma vez com 1 x 107 PFU de vírus vaccinia intravenosa, seis camundongos por grupo. Duas semanas após o tratamento, os camundongos foram sacrificados e as imagens das caudas foram tiradas. As lesões de pox sobre as caudas foram contadas manualmente em cada cauda do rato. Imagens representativas mostradas na Figura 15. Este experimento mostra que CopMD5p3p é um vírus muito mais seguro porque não causa nenhuma lesão pox em camundongos nude imunocomprometidos. Isto é importante uma vez que os dados clínicos anteriores de Vaccinia Oncolíticos mostraram que os pacientes desenvolvem lesões de pox com o tratamento.

Nocaute de timidina quinase (TK) é um modo popular de aumentar a segurança de um OV (vírus oncolítico), atualmente presente em um Vaccinia Oncolítico de Fase III e T-Vec Oncolítico aprovado pela FDA.Os dados mostram que a exclusão de TK não desempenha um papel crucial neste ensaio, onde os camundongos desenvolvem lesões de pox quando desafiados com vírus TK deletados, mas não desenvolvem lesões de pox com CopMD5p3p que tem um TK intacto.

Exemplo 9 - Biodistribuição IVIS de Vaccinia após administração sistêmica

[00182] Vírus Vaccinia Wyeth do tipo selvagem, Copenhagen do tipo selvagem e CopMD5p3p foram modificados para expressar Firefly Luciferase (Fluc) e YFP através da transfecção de células infectadas com um plasmídeo pSEMl substituindo TK com Fluc e YFP. Os vírus foram purificados por placa e expandidos. Todos os vírus são nocautes TK e codificam Fuc funcionais em seu Locus TK.

[00183] Camundongos CD-l nude foram então semeados com xenoenxerto de câncer de cólon humano HT-29. Uma vez que os tumores subcutâneos tiveram um tamanho estabelecido aproximado de 5 mm x 5 mm, os camundongos foram tratados uma vez com le7 PFU de vírus de codificação de Fluc de vaccinia intravenosamente, quatro Camundongos por grupo.

Quatro dias após o tratamento, os camundongos foram injetados i.p. (intraperitoneal) com luciferina e a foi tirada imagem com IVIS para a presença de vírus (ver Figura 16). Este experimento mostra que CopMD5p3p é um vírus muito mais seguro porque é mais específico para o tumor. Outros vírus mostram replicação fora do alvo na cauda, músculo, patas e cavidade intra-nasal. CopMD5p3p é somente localizado no tumor. Conforme mostrado nas Figuras 1 e 16 anteriores, há menos CopMD5p3p detectável na cauda em comparação com as outras cepas. A Figura 17 mostra que CopMD5p3p também tem títulos mais baixos em outros órgãos quando comparado com outros Vaccinia Oncolítica. Visto que o CopMD5p3p se replica no mesmo nível que os outros vírus no tumor mas menos em tecidos fora do alvo, CopMD5p3p se ajusta no perfil de um vírus oncolítico melhor.

[00184] Um exemplo adicional da biodistribuição de vários vetores virais vaccinia, incluindo o vírus vaccinia de Copenhagen do tipo selvagem e vários vírions vaccinia Copenhagen modificados é mostrado na Figura 28.

Exemplo 10 - Imunogenicidade de Vaccinia em PBMCs humanas

[00185] PBMCs foram isoladas do sangue de doadores humanos saudáveis (n = 2). As PBMCs foram incubadas com vaccinia por 24 horas e verificadas quanto aos marcadores de ativação precoce utilizando citometria de fluxo (Ver Figura 18). Este experimento mostra que CopMD5p3p é mais imunogênico e mais facilmente detectável por células imunes. Acredita-se que esta é uma característica desejável, uma vez que OVs que se replicam no tecido tumoral necessitam ativar as células imunes para uma resposta imunológica anti-tumoral bem sucedida.

Exemplo 11 - Imunogenicidade de Vaccinia em Esplenócitos de camundongo

[00186] Camundongos Balb/C competentes imunes foram injetados com 1 x 10 7 PFU de vírus de Vaccinia intravenosamente. Após um ou dois dias, os camundongos foram sacrificados, os baços foram colhidos e analisados quanto à ativação imune usando Citometria de fluxo (Ver Figura 19). Este experimento mostra que CopMD5p3p é mais imunogênico e mais facilmente detectável por células imunes de camundongo. Estes dados complementam a Figura 18 anterior, já que a maior parte dos experimentos in vivo é feita em camundongos.

Exemplo 12 - Imunogenicidade de Vaccinia em células humanas

[00187] Células de câncer humano 786-O foram infectadas em MOI de 0,01 com vírus. No dia seguinte, as células foram colhidas e os núcleos e citoplasma foram separados por fracionamento celular. Proteína foi extraída de cada fração e manchada para subunidades NF-B p65 e p50 (veja a Figura 20). O fator de transcrição imune NF-B iniciou uma resposta imune uma vez que suas subunidades p65 e p50 estão translocadas para o núcleo. Alguns vírus são imunossupressores e bloqueiam esta translocação, evitando uma resposta imune. Suprimir a função de NF-B é contra intuitivo para o objetivo de usar vírus oncolíticos em combinação com abordagens imunoterapêuticas. Assim, CopMD5p3p é um vírus mais vantajoso à medida que ele se comporta similarmente a MG-1.

Exemplo 13 - Administração para o tratamento de um indivíduo

[00188] Usando os métodos aqui descritos, um médico versado na técnica pode administrar a um indivíduo (por exemplo, um paciente) uma composição farmacêutica contendo um vetor de vírus vaccinia recombinante descrito aqui para tratar câncer ou células tumorais. O câncer pode ser, por exemplo, leucemia, linfoma, câncer de fígado, câncer de ossos, câncer de pulmão, câncer de cérebro, câncer de bexiga, câncer gastrointestinal, câncer de mama, câncer cardíaco, câncer cervical, câncer uterino, câncer de cabeça e pescoço, câncer da vesícula biliar, câncer de laringe, câncer de boca e cavidade oral, câncer ocular, melanoma,

câncer pancreático, câncer de próstata, câncer colorretal, câncer testicular, ou câncer de garganta, entre outros.

[00189] Por exemplo, um médico versado na técnica pode avaliar que um paciente está sofrendo de câncer ou tumores e pode administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz (por exemplo, uma quantidade suficiente para diminuir o tamanho do tumor) de uma composição farmacêutica contendo o vetor de vírus de vaccinia recombinante descrito aqui. A composição farmacêutica pode ser administrada ao indivíduo em uma ou mais doses (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou mais) por um intervalo de tempo especificado (por exemplo, semanalmente, diariamente ou por hora). O paciente pode ser avaliado entre doses para monitorar a eficácia da terapia e aumentar ou diminuir a dosagem com base na resposta do paciente. A composição farmacêutica pode ser administrada ao paciente oralmente, parenteralmente (por exemplo, topicamente), intravenosa, intramuscular, subcutaneamente ou intranasalmente. O tratamento pode envolver uma única dosagem da composição farmacêutica. O tratamento pode envolver a dosagem contínua da composição farmacêutica (por exemplo, dias, semanas, meses ou anos).

Exemplo 14 - Exclusões Alvo de CopMD5p e CopMd3p

[00190] O seguinte protocolo para a produção de vetores virais vaccinia modificados utiliza as técnicas descritas, por exemplo, em Rintoul et al. PLoS. One 6 (9): E24643 (2011), cuja descrição é aqui incorporada por referência.

[00191] Resumidamente, CopMD5p (vírus vaccinia Copenhagen abrigando exclusões em genes 5': C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L) e CopMd3p (vírus vaccinia Copenhagen abrigando exclusões em 3' genes: (B14R, B15R, B16R, B17L, B18R, B19R e B20R, assim como exclusões individuais em cada um dos genes ITR B21R, B22R, B23R, B24R, B25R, B26R, B27R, B28R e B29R que alvejam construtos recombinantes foram sintetizados por tecnologia de g-bloco (IDT, Coralville Iowa). Células U2OS foram infectadas com vírus vaccinia do tipo selvagem (Wyeth, Western Reserve, Tian Tan, Lister) em um MOI de 0,01 em DMEM isento de soro por 1,5 horas. O sobrenadante viral foi aspirado e as células U2OS foram transfectadas com a PCR amplificada CopMD5p ou CopMd3p objetivando g-blocos por Lipofectamina 2000 (Invitrogen) em OptiMEM (Gibco). DMEM suplementado com FBS a 10% foi adicionado às células 30 minutos após a transfecção e deixado durante a noite. No dia seguinte, o meio de transfecção foi aspirado e DMEM fresco 10% FBS foi adicionado a células. 48 Horas após a transfecção por infecção, as células U2OS foram colhidas e lisadas por um único ciclo de congelamento-descongelamento. Lisados serialmente diluídos foram plaqueados em uma monocamada confluente de células U2OS e células eGFP positivas (CopMD5p alvo) ou mCherry positivas (CopMd3p alvo) foram isoladas e purificadas através de 5 ciclos de purificações de placa.

[00192] Vírus vaccinia deletados principais duplos foram gerados por co-infecção de vírus de vaccinia CopMD5p e CopMd3p excluídos em um MOI de 5 para cada vírus em células U2OS. As células foram colhidas no dia seguinte e lisadas por um ciclo de congelamento-descongelamento. Os lisados foram diluídos serialmente e plaqueados em uma monocamada confluente de células U2OS e selecionados para placas positivas duplas (eGFP + mCherry). As placas foram purificadas por 5 ciclos de purificação de placa.

[00193] Um esquema exemplar para a produção de vetores virais vaccinia modificados (por exemplo, vetores virais vaccinia modificados, tais como vetores virais vaccinia Copenhagen modificados) da descrição é mostrado na Figura 21.

Exemplo 15 - SKV-GFP (CopMD5p3p-B8R-) tem eficácia similar em controle de tumor comparado com SKV-(CopMD5p3p-B8R+)

[00194] O gene B8R de vírus de vaccinia (VV) codifica uma proteína secretada com homologia ao receptor de interferon gama (IFN-). In vitro, a proteína B8R liga-

se a e neutraliza a atividade antiviral de várias espécies de interferon gama, incluindo interferon gama humano e de rato; entretanto, ela não se ligará significativamente a IFN- murino. Aqui nós descrevemos a construção e distingueção de VVs recombinantes s em o Gene B8R. A recombinação homóloga entre o construto alvo e o locus B8R resultou na substituição de 75% do gene B8R com os transgenes eGFP flanqueados por dois sítios loxP (SKV-GFP).

[00195] Os vírus de B8R mostraram eficácia similar aos vírus de B8R+. Figura 34. A sobrevivência de camundongos tratados com SKV ou SKV-GFP foi avaliada. 5 X 106 células CT26-LacZ foram semeadas subcutaneamente no dia

0. Nos dias 14, 16 e 18, tumores foram tratados em uma dose de 107 pfu com uma injeção intratumural tanto de SKV quanto de SKV-GFP. Nenhum decréscimo significativo na eficácia foi visto quando os vírus injetados tiveram uma exclusão do locus B8R.

Exemplo 16 - Infecção de linhagens de células normais versus linhagens de células cancerosas de vírus SKV (CopMD5p3p-B8R+)

[00196] A viabilidade da célula saudável primária foi comparada com a das células cancerígenas. Células de câncer normais ou normais confluentes foram infectadas em uma faixa de MOI (pfu/célula) por 48 horas, após a qual a viabilidade foi quantificada. Como indicado na Figura 32, o vírus SKV (CopMD5p3p-B8R+) preferencialmente infecta as células cancerosas.

Exemplo 17 - SKV(CopMD5p3p-B8R+) não prejudica a sinalização de interferon.

[00197] A sinalização de interferon foi avaliada determinando-se o número de genes na via de interferon que são super-regulados (expressão induzida) ou subregulados (expressão reprimida) em uma variedade de linhagens de células normais e uma linhagem celular de câncer (786-O).

Figura 33. Monocamadas confluentes de 1 milhão de células foram infectadas em um MOI de 3 (3e6 PFU) por l8h com SKV- B8R+ (CopMD5p3p) ou a cepa de vírus de Copenhagen parental tendo o gene TK desabilitado. RNA foi sequenciado usando RNA-seq e expressão genética de genes de interferon foi determinada após o mapeamento de leitura de uma normalização de expressão. Enquanto o vírus SKV-B8R+ (CopMD5p3p), em sua maioria, induz genes na via de interferon dos genes, o Copenhagen parental reprime genes.

Isto sugere que SKV-B8R+ (CopMD5p3p) é capaz de induzir sinalização de Interferon tipo I, que é crítica na depuração viral de células normais.

Exemplo 18 - Exclusões duplas principais em modificados em várias cepas de vaccinia acentuam a morte de células cancerosas in vitro

[00198] Células Hela foram infectadas em um MOI de

0,1 com as seguintes cepas de vírus vaccinia modificadas: (1) vírus do tipo selvagem parental (wt); (2) 5 prime principal deletado (5p), (3) 3 prime principal deletado (3p), e (4) 5 prime e 3 prime recombinados principais duplo deletados (5p3p). A viabilidade celular foi quantificada por ensaio de azul alamar 72 horas após a infecção. Ambas as cepas de vaccinia dupla deletadas principais de 5p e 5p3p são mais citotóxicas em células HelLa quando comparadas com suas cepas excluídas principais 3p e parental do tipo selvagem. Veja a Figura 35. A Figura 36 ilustra um resumo das maiores cepas Vaccinia deletadas, e o efeito de exclusões de 5p, 3p e 5p3p em sincitia, citotoxicidade e replicação. Camundongos nude CD-l foram tratados com 1 x 107 pfu via injeção de veia de cauda intravenosa e medidos nos pontos de tempo indicados. As cepas de vaccinia 5p3p não induziram a perda de peso em comparação com as cepas do tipo selvagem. Figura 38. Os camundongos também foram examinados para lesões de pox 6 dias após a injeção. As cepas de vaccinia de 5p3p não induzem lesões de pox em comparação com as cepas do tipo selvagem. Figura 38.

Algumas modalidades

[00199] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados aqui por referência na mesma extensão, como se cada publicação independente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[00200] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com suas modalidades específicas, deve-se entender que é passível de outras modificações e este pedido é destinado a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção a seguir, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais afastamentos da invenção que vêm dentro da prática conhecida ou costumeira dentro da arte da técnica à qual pertence a invenção, e podem ser aplicados aos aspectos essenciais expostos anteriormente, e seguem no escopo das reivindicações.

[00201] Algumas modalidades estão dentro das reivindicações.

Claims (66)

REIVINDICAÇÕES

1. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende um genoma do vírus vaccinia recombinante, o referido genoma derivado do genoma da cepa Vaccinia Copenhagen, em que o referido genoma do vírus vaccinia recombinante compreende uma exclusão de pelo menos seis genes de vaccinia, um gene de vaccinia de cada um dos seguintes (a) - (f): a) F1L; b) N1L e B14R; c) M2L, K1L e K7R; d) C2L, N2L, M1L, K2L, K3L, F3L, B16R e B19R; e) K4L, K5L, K6L e F2L; e f) B15R, B17L, B18R e B20R e em que os genes TK e HA do referido genoma não são excluídos.

2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida exclusão compreende exclusões de F1L.

3. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de N1L.

4. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de B14R.

5. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de M2L.

6. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de K1L.

7. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de K7R.

8. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de C2L.

9. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de N2L.

10. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de M1L.

11. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de K2L.

12. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de K3L.

13. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de F3L.

14. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de B16R.

15. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de B19R.

16. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de K4L.

17. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de K5L.

18. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de K6L.

19. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de F2L.

20. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de B15R.

21. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de B17L.

22. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de B18R.

23. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de B20R.

24. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma exclusão de C1L.

25. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões compreendem uma exclusão de cada um dos referidos genes C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L, F3L, B14R, B15R, B16R, B17L, B18R, B19R e B20R.

26. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o referido genoma do vírus vaccinia recombinante compreende uma exclusão de pelo menos 1 gene selecionado do grupo que consiste em B14R, B15R, B16R, B17L, B18R, B19R e B20R.

27. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o referido genoma do vírus vaccinia recombinante compreende uma exclusão de pelo menos 1 gene selecionado do grupo que consiste em C2L, C1L, N1L, N2L, M1L, M2L, K1L, K2L, K3L, K4L, K5L, K6L, K7R, F1L, F2L e F3L.

28. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que cada uma das referidas exclusões é uma exclusão de todo o gene que codifica o polinucleotídeo correspondente.

29. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que cada uma das referidas exclusões é uma exclusão de uma porção do gene, e em que a referida exclusão é suficiente para tornar o referido polinucleotídeo codificado pelo referido gene não funcional após a introdução em uma célula hospedeira.

30. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o referido ácido nucleico compreende ainda um transgene.

31. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica uma proteína que fornece atividade oncolítica melhorada, uma proteína capaz de provocar uma resposta imune para uso como vacina, polipeptídeo terapêutico ou ácido nucleico terapêutico.

32. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica uma proteína que fornece atividade oncolítica melhorada.

33. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica uma proteína capaz de provocar uma resposta imune para uso como vacina.

34. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um polipeptídeo terapêutico.

35. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ácido nucleico terapêutico.

36. Vírus vaccinia recombinante caracterizado pelo fato de ser codificado pelo genoma do vírus vaccinia conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35.

37. Vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o referido vírus é um vetor viral que codifica pelo menos um transgene.

38. Vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que as referidas exclusões são exclusões de todo o gene que codifica a proteína correspondente.

39. Vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 37, caracterizado pelo fato de que cada uma das referidas exclusões é uma exclusão de uma porção do gene e em que a referida exclusão é suficiente para tornar o referido polinucleotídeo codificado pelo referido gene não funcional após a introdução em uma célula hospedeira.

40. Vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 39, caracterizado pelo fato de que o referido vetor compreende ainda um transgene que codifica uma proteína que fornece atividade oncolítica aprimorada, uma proteína capaz de provocar uma resposta imune para uso como vacina, polipeptídeo terapêutico ou um ácido nucleico terapêutico ou uma proteína que fornece atividade imunológica oncolítica melhorada.

41. Vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica uma proteína que fornece atividade oncolítica aprimorada.

42. Vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica uma proteína capaz de provocar uma resposta imune para uso como vacina.

43. Vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um polipeptídeo terapêutico.

44. Vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ácido nucleico terapêutico.

45. Vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica uma proteína que fornece atividade imune oncolítica aprimorada.

46. Vírus vaccinia recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 45, caracterizado pelo fato de que o vetor é CopMD5p3p.

47. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, ou o vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que, ao contatar uma população de células de mamíferos com o referido ácido nucleico ou o referido vetor do vírus vaccinia recombinante, as células exibem formação de sincícios aumentada em relação a uma população de mamíferos células do mesmo tipo contatadas com uma forma do vetor do vírus vaccinia que não compreende as referidas exclusões.

48. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, ou o vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que, ao entrar em contato com uma população de células de mamíferos com o referido ácido nucleico ou o referido vetor vírus da vacina recombinante, as células exibem uma propagação aumentada do vetor do vírus vaccinia em relação a uma população de células de mamífero do mesmo tipo em contato com uma forma do vetor do vírus vaccinia que não compreende as referidas exclusões.

49. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, ou o vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o referido ácido nucleico ou o vetor do vírus vaccinia recombinante exerce um efeito citotóxico aumentado em uma população de células de mamíferos em relação à forma de um vetor do vírus vaccinia que não inclui as referidas exclusões.

50. Ácido nucleico ou vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 49, caracterizado pelo fato de que as referidas células de mamíferos são células humanas.

51. Ácido nucleico ou vetor do vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que as referidas células humanas são células cancerígenas.

52. Linhagem de células de empacotamento caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35, ou o vetor do vírus vaccinia recombinante conforme definido na reivindicação 37.

53. Método de tratamento de câncer em um paciente mamífero, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do ácido nucleico conforme definido na reivindicação 1, ou o vírus vaccinia recombinante conforme definido na reivindicação 37 ao referido paciente.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o referido paciente mamífero é um paciente humano.

55. Método, de acordo com a reivindicação 53 ou 54, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é selecionado do grupo que consiste em leucemia, linfoma, câncer de fígado, câncer ósseo, câncer de pulmão, câncer cerebral, câncer de bexiga, câncer gastrointestinal, câncer de mama, câncer cardíaco, câncer cervical, câncer uterino, câncer de cabeça e pescoço, câncer de vesícula biliar, câncer de laringe, câncer de cavidade oral e labial, câncer ocular, melanoma, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer colorretal, câncer de testículo e câncer de garganta.

56. Método, de acordo com a reivindicação 53 ou 54, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é selecionado do grupo que consiste em leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide crônica (LMC), carcinoma adrenocortical, Linfoma relacionado à AIDS, linfoma primário do SNC, câncer anal, câncer de apêndice, astrocitoma, tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinoma basocelular, câncer de ducto biliar, câncer extra-hepático, família de sarcoma de ewing, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno, tumores embrionários do sistema nervoso central, tumores de células germinativas do sistema nervoso central, craniofaringioma, ependimoma, tumores brônquicos,

linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, linfoma primário,

cordoma, neoplasias mieloproliferativas crônicas, câncer de cólon, câncer de ducto biliar extra-hepático, carcinoma ductal in situ (DCIS), câncer endometrial, ependimoma,

câncer de esôfago, estesioneuroblastoma, tumor extracraniano de células germinativas, tumor extragonadal de células germinativas, câncer de trompas de falópio, histiocitoma fibroso de osso, tumor carcinoide gastrointestinal, tumores estromais gastrointestinais (GIST), tumor de células germinativas testiculares, doença trofoblástica gestacional,

glioma, glioma infantil do tronco encefálico, leucemia de células peludas, câncer hepatocelular, histiocitose de células de Langerhans, linfoma de Hodgkin, câncer de hipofaringe, tumor de células ilhotas, tumores neuroendócrinos pancreáticos, tumor de wilms e outros tumores renais na infância, histiocitose de células de

Langerhans, câncer de pulmão de pequenas células, linfoma cutâneo de células T, melanoma intraocular, carcinoma de células merkel, mesotelioma, câncer de pescoço escamoso metastático, carcinoma do trato medular, síndromes de neoplasias endócrinas múltiplas, mieloma múltiplo/neoplasia de células plasmáticas, síndromes mielodisplásicas, câncer de cavidade nasal e seio paranasal, câncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma não Hodgkin (NHL), câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de ovário epitelial, câncer de ovário de células germinativas, baixo câncer de ovário com potencial maligno, tumores neuroendócrinos pancreáticos, papilomatose, paraganglioma, câncer de seio paranasal e cavidade nasal, câncer de paratireoide, câncer de pênis, câncer de faringe, feocromocitoma, tumor da hipófise, blastoma pleuropulmonar, câncer de peritoneal primário, câncer de reto, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de glândula salivar, sarcoma de kaposi, rabdomiossarcoma, síndrome de sézari, câncer de intestino delgado, sarcoma de tecidos moles, câncer de garganta, timoma e carcinoma tímico, câncer de tireoide, câncer de células de transição da pelve e ureter renais, câncer de uretra, câncer de útero endometrial, sarcoma de útero, câncer de vagina, câncer de vulva e macroglobulinemia de Waldenström.

57. Kit caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 1 ou o vírus vaccinia recombinante conforme definido na reivindicação 37 e uma bula instruindo um usuário do referido kit a expressar o referido ácido nucleico ou o referido vetor em uma célula hospedeira.

58. Kit caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 1 ou o vírus vaccinia recombinante conforme definido na reivindicação 37 e um folheto informativo que instrui um usuário a administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do referido vetor do vírus ácido nucleico ou vírus vaccinia recombinante a um paciente mamífero com câncer, tratando desse modo o referido câncer.

59. Kit, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o referido paciente mamífero é um paciente humano.

60. Ácido nucleico ou vírus vaccinia recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o gene B8R é excluído.

61. Ácido nucleico ou vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que pelo menos um transgene é inserido no local do gene B8R excluído.

62. Ácido nucleico ou vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois transgenes são inseridos no local do gene B8R excluído.

63. Ácido nucleico ou vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que pelo menos três transgenes são inseridos no local do gene B8R excluído.

64. Ácido nucleico ou vírus vaccinia recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 63, caracterizado pelo fato de que pelo menos um transgene adicional é inserido no local que não é o local do gene B8R.

65. Ácido nucleico ou vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o local é o limite da exclusão 5p.

66. Ácido nucleico ou vírus vaccinia recombinante, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o local é o limite da exclusão 3p.