CN1445368A - 植物抗病关键基因突变体的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗病关键基因突变体的筛选方法。步骤包括转植物抗病基因和病原物无毒基因的植物的分别获取，含植物抗病基因和与之互补的病原物无毒基因的杂交一代植物种子的获取、及该种子发育成的苗不产生过敏性坏死反应的突变体的诱变筛选。现有的植物抗病相关基因突变体的筛选方法人力物力耗费大，适用对象有限，与抗性无关的假阳性突变体产生较多。本发明方法无需育苗，省力省时，筛选简易方便，不产生假阳性突变体，所获突变体均为植物抗病关键基因的突变体。可用于所有抗病基因和互补无毒基因已被克隆的植物抗病关键基因突变体的筛选研究，为克隆植物抗病关键基因奠定基础。

Description

植物抗病关键基因突变体的筛选方法

                           技术领域

本发明涉及植物抗病基因工程领域技术，尤其涉及一种植物抗病关键基因突变体的筛选方法。

                           背景技术

1、植物转基因技术

用于将外源基因导入目的植物，从而获取携带外源基因的转基因植物。包括基因枪法，农杆菌介导法等。农杆菌介导法包括目的基因克隆入双元载体，对农杆菌的转化，及其对目的植物组织的感染，和转基因植株的再生等步骤。

2、含植物抗病基因和互补病原物无毒基因的植物种子的获取技术以分别转植物抗病基因(resistance gene)和与之互补的病原物无毒基因(avirulence gene)的纯合子植物作父本和母本进行杂交，所获杂交一代种子同时含有植物抗病基因和病原物无毒基因。该种子发芽后，植物抗病基因和病原物无毒基因分别转录翻译，产物相互识别，激活抗病信号传导，导致抗病性的产生，表现为植物苗的各组织迅速产生肉眼可见的过敏性坏死斑，最终整苗枯死。

3、植物突变体的化学诱导技术

植物种子等经某些化学诱变剂处理后，某个或某些基因的部分核苷酸序列发生突变。常用的植物化学诱变剂包括ethyl methanesulfonate(EMS)，1，2：3，4-diepoxybutane(DEB)等。

4、植物抗病基因和病原物无毒基因在植物中的杂交法互补检测技术将转化了已知功能性植物抗病基因的纯合子植物与转化了未知功能性的病原物无毒基因的纯合子植物进行杂交，或将转化了已知功能性的病原物无毒基因的纯合子植物与转化了未知功能性的植物抗病基因的纯合子植物进行杂交，观察杂交一代苗期是否表现过敏性坏死，并最终整苗枯死，即可分别判断该病原物无毒基因和植物抗病基因是否已丧失功能。

5、现有植物抗病相关基因突变体筛选方法

主要有两类：(1)症状观察法。即先诱变处理植物种子，育苗后，再接种病原物，通过观察病害发生情况，获取抗性改变的突变体植株。(2)防卫反应基因表达检测法。即先构建植物防卫反应基因启动子和报告基因开放阅读框架的融合表达结构，导入目标植物，再诱变处理该转基因植物种子，育苗后，通过检测报告基因的表达情况，获取防卫反应基因表达可能改变、从而抗性也可能改变的突变体植株。

                          发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗病关键基因突变体的筛选方法。

它的步骤如下：

1)转植物抗病基因和病原物无毒基因的植物的分别获取

通过农杆菌介导法将植物抗病基因或病原物无毒基因导入目的植物，获取转植物抗病基因或病原物无毒基因的植物；

2)含植物抗病基因和互补病原物无毒基因的植物种子的获取

以转植物抗病基因的纯合子植物和转与之互补的病原物无毒基因的纯合子植物分别作父本和母本进行杂交，获取杂交一代种子。该种子同时含有植物抗病基因和互补的病原物无毒基因；

3)含植物抗病基因和互补病原物无毒基因的植物不产生过敏性坏死反应的突变体的化学诱变筛选

以植物化学诱变剂处理含植物抗病基因和互补病原物无毒基因的植物种子，出苗后绝大多数产生过敏性坏死斑，最终整苗枯死，留下不产生过敏性坏死反应可正常生长发育的突变苗。

本发明的优点：

1.筛选简易方便。现有的症状观察法筛选突变体需要接种病原物，涉及接种用病原物的培养、接种方法的选择(如真菌孢子悬浮液喷雾接种，细菌菌液注射接种，病毒汁液摩擦接种等)、接种后植物的生长条件的控制(如温度，相对湿度，光照等)、被接种植物表现症状情况的记录，而且接种对象为植物苗或成株，因突变率低，需筛选的植物对象至少要几千以上，因此该法筛选需耗费大量人力并需要用于培养植物的生长条件可控制的设备和场所。现有的防卫反应基因表达检测法筛选突变体需要构建植物防卫反应基因启动子和报告基因开放阅读框架的融合表达结构，且需要检测报告基因的表达情况，如检测报告基因GUS的表达需测定葡糖苷酸酶(β-glucuronidase)在植物组织中的活性；检测报告基因GFP(green fluorescent protein)或LUC(luciferase)的表达则需专门仪器测定荧光强度。此外，该法也需植物苗或成株，所以同样需耗费大量人力物力。而本发明方法只需将经诱变处理的种子播于育苗盘或普通搪瓷盘中，待出苗后，观察苗生长情况。凡能正常生长发育的苗即为突变体。因非突变体苗迅速死亡，因此采用本发明方法只需几个普通育苗盘或搪瓷盘，无需育苗，无需特殊操作和设备场所，省力省时，简易方便。

2.所获突变体均为植物抗病关键基因的突变体。现有的症状观察法筛选依据是植物表现出的病害症状严重程度，而这受到用于接种的病原物菌株的致病性、接种物的浓度、接种量、接种后植物的生长条件的控制(尤其是温度和相对湿度)等多种人为因素的影响。防卫反应基因表达检测法筛选依据是防卫反应基因在植物组织中的表达。但导致防卫反应基因表达改变的因素不仅仅限于抗病性，另外报告基因的表达水平检测也易受人为因素影响。因此通过上述方法筛选到的突变体并非一定是植物抗病相关基因突变体，也可能是假阳性目的突变体，至少不一定是植物抗病关键基因的突变体。而本发明方法筛选对象只有两种表型，所有抗病性信号传导基因未受功能性突变的植物苗均因强烈表现过敏坏死而全株死亡，否则植物保持健康生长发育。因此采用本发明方法所获的突变体均为植物抗病关键基因的突变体。

3.适用于对各类病原物的抗性基因突变体的筛选。现有的症状观察法不适宜于筛选难以人工接种，或虽可以人工接种但工作量太大消耗人力物力太大等的病原物的抗性基因突变体。如该法不适宜于筛选对病毒病的抗性基因突变体，因为病毒需通过轻微摩擦接种或介体昆虫刺吸所造成的微伤口侵入植物，前者工作量太大，后者难以控制接种量等。而本发明方法适用于所有无毒基因已被克隆的病原物，包括病毒，的抗性基因突变体筛选。

4.所获突变体突变位点的功能明确。现有的防卫反应基因表达检测法筛选到的突变体突变位点的功能不甚明确，可能与抗病无关，即使与抗病有关，也不清楚到底与那种病害的抗性有关。而采用本发明方法所获的突变体突变位点的功能非常明确，即该位点必定是用于筛选的目的植物抗病基因决定的对含目的无毒基因的病原物(小种)的抗性产生中起关键作用的基因。

                       具体实施方式

本发明在植物抗病基因和互补的病原物无毒基因相互作用激活基因对基因(gene-for-gene)抗性的学术理论指导下，将现有的转基因、杂交、化学诱变和分子生物学方法技术应用于植物病理学的研究，建立了一种新的植物抗病关键基因突变体的筛选方法体系。主要步骤包括：

1、转植物抗病基因和病原物无毒基因的植物的分别获取通过农杆菌介导法将植物抗病基因或病原物无毒基因导入目的植物，获取转植物抗病基因或病原物无毒基因的植物。主要步骤包括：

1)构建表达载体。将植物抗病基因，及病原物无毒基因的开放阅读框架(open reading frame)与花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的连接产物，分别与双元载体相连，所获连接产物分别为植物抗病基因和病原物无毒基因在植物中的表达载体。

2)双元表达载体对农杆菌的转化。可用方法包括电激法，热激法等。

3)农杆菌对目的植物组织外植体的感染。

4)转基因植株的再生。包括抗性芽的筛选，生根，抗性植株的获取和鉴定。

5)纯合转基因植株的筛选。

2、含植物抗病基因和互补病原物无毒基因的植物种子的获取

以转植物抗病基因的纯合子植物和转与之互补的病原物无毒基因的纯合子植物分别作父本和母本进行杂交，获取杂交一代种子。该种子同时含有植物抗病基因和互补的病原物无毒基因，发芽后形成的苗各组织产生肉眼可见的过敏性坏死斑，最终整苗枯死。

3、含植物抗病基因和互补病原物无毒基因的植物不产生过敏性坏死反应的突变体的化学诱变筛选

以植物化学诱变剂处理含植物抗病基因和互补病原物无毒基因的植物种子，出苗后绝大多数产生过敏性坏死斑，最终整苗枯死，留下不产生过敏性坏死反应可正常生长发育的突变苗。

4、突变体突变位点的鉴定不产生过敏性坏死的突变苗可能在植物抗病基因和/或病原物无毒基因发生了功能性突变，也可能是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变。将转化了已知功能性植物抗病基因或病原物无毒基因的纯合子植物分别与突变体植株杂交，若杂交一代苗全部不产生过敏性坏死，则分别说明突变体中的病原物无毒基因和植物抗病基因发生了功能性突变。否则，突变体突变位点不在病原物无毒基因和植物抗病基因，而在其他导致抗病性产生的关键基因。实施例1番茄抗病基因Cf-9决定的抗性产生关键基因的番茄突变体筛选

主要操作步骤包括：

1.转番茄抗病基因Cf-9和番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)无毒基因Avr9的番茄植株的分别获取

1)构建表达载体。将Cf-9基因，及Avr9的开放阅读框架与花椰菜花叶病毒35S启动子的连接产物，分别与双元载体pCHF3相连，所获连接产物分别为番茄抗病基因Cf-9和叶霉菌无毒基因Avr9在番茄中的表达载体。

2)双元表达载体对农杆菌的转化。吸取1～2μl表达载体，加入40μlEHA105农杆菌感受态细胞中，迅速混匀，以Bio-Rad Gene Pulser II电激仪在电压12.5kV/cm、电容25μF和电阻400Ω条件下电激约9ms，迅速加入1ml YEP培养基，28℃下180rpm摇动恢复培养1h。吸取100μl菌液均匀涂布含100mg/L链霉素和100mg/L壮观霉素的YEP培养基，获取可能转化子，以PCR进一步验证表达载体和目的基因Cf-9和Avr9的存在。

3)农杆菌对番茄外植体的感染。品种为Moneymaker Cf0的番茄种子经表面消毒后，播于不含激素的1/2MS培养基上，发芽生长后的无菌苗的子叶和胚轴分别切成5mm大小和1cm长，作为无菌外植体。先置于含1～2mg/L玉米素，3.0mg/L 6-BA和0.2mg/L IAA的分化培养基上预培养2-3d，再转入终浓度为OD₆₀₀0.2～0.5的农杆菌菌液中，浸泡8～15min，吸干后将外植体重新转入分化培养基中共培养2d，洗净后置于含100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的转基因选择培养基中继续培养。

4)转基因植株的再生。待转基因选择培养基中培养的外植体上长出的不定芽长2～3cm时，将不定芽转入含100mg/L卡那霉素和250mg/L羧苄青霉素的生根培养基中，培养至长出主根后，将无菌苗开盖炼苗，最后移入土壤正常培育，获取种子。同时对抗性植株进行PCR扩增检测Cf-9和Avr9的存在，以及Southern和Northern分析转基因的拷贝数和表达。

5)纯合转基因植株的筛选。将T₀代转基因植株上收获的种子播种，发育成苗后，PCR检测Cf-9和Avr9的存在。收获种子后，对该代苗进行同样分析。分别获取后代没有产生转基因分离现象的纯合Cf-9和Avr9转基因番茄植株。

2.含抗病基因Cf-9和互补叶霉菌无毒基因Avr9的番茄种子的获取

以转Cf-9的纯合子番茄和转与之互补的Avr9的纯合子番茄分别作父本和母本进行杂交，所获杂交一代种子同时含有番茄抗病基因Cf-9和叶霉菌无毒基因Avr9。该种子发芽后形成的苗中各组织(包括下胚轴，子叶和真叶)产生肉眼可见的过敏性坏死斑，最终整苗枯死。

3.含抗病基因Cf-9和互补无毒基因Avr9的番茄不产生过敏性坏死反应的突变体的化学诱变筛选

将含Cf-9/Avr9这一互补基因对的番茄种子在无菌水中浸泡8h，再转入0.8％ethyl methanesulfonate(EMS)，24℃下100rpm摇动放置15～16h。以无菌水冲洗干净后播入土中，出苗后绝大多数产生过敏性坏死斑，最终整苗枯死。留下不产生过敏性坏死反应可正常生长发育的苗即为目的突变苗。通过此法对约4000颗同含Cf-9/Avr9这一互补基因对的番茄种子进行了突变处理，筛选到了2株不产生过敏性坏死反应的番茄突变体，分别称为LeC9A9nhr1( Lycopersiconesculentum  Cf- 9/ Avr 9 plant with  no  hypersensitive  response 1)和LeC9A9nhr2。

4.突变体突变位点的鉴定

不产生过敏性坏死的番茄突变苗可能是Cf-9和/或Avr9发生了功能性突变，也可能是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变。将功能性Cf-9和Avr9的纯合转基因番茄植株分别与突变体植株杂交，杂交一代苗有一半产生过敏性坏死，说明突变体中的Avr9和Cf-9没有发生功能性突变。而是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变，导致了含Cf-9/Avr9这一互补基因对但不产生过敏性坏死反应的番茄突变体。实施例2  番茄抗病基因Cf-9决定的抗性产生关键基因的烟草突变体筛选

主要操作步骤包括：

1.转番茄抗病基因Cf-9和叶霉菌无毒基因Avr9的烟草植株的分别获取

1)构建表达载体。将Cf-9基因，及Avr9的开放阅读框架与花椰菜花叶病毒35S启动子的连接产物，分别与双元载体pCHF3相连，所获连接产物分别为番茄抗病基因Cf-9和叶霉菌无毒基因Avr9在烟草中的表达载体。

2)双元表达载体对农杆菌的转化。吸取1～2μl表达载体，加入40μlEHA105农杆菌感受态细胞中，迅速混匀，以Bio-Rad Gene Pulser II电激仪在电压12.5kV/cm、电容25μF和电阻400Ω条件下电激约9ms，迅速加入1ml YEP培养基，28℃下180rpm摇动恢复培养1h。吸取100μl菌液均匀涂布含100mg/L链霉素和100mg/L壮观霉素的YEP培养基，获取可能转化子，以PCR进一步验证表达载体和目的基因Cf-9和Avr9的存在。

3)农杆菌对烟草外植体的感染。品种为Petite Havana SR1的烟草种子经表面消毒后，播于不含激素的1/2MS培养基上，发芽生长后的无菌苗的叶片切成0.5～1cm大小，作为无菌外植体。先置于含1.0mg/L 6-BA的分化培养基预培养2-3d，再转入终浓度为OD₆₀₀0.2～0.5的农杆菌菌液中，浸泡8～15min，吸干后将外植体重新转入分化培养基中共培养2d，洗净后置于含100mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的转基因选择培养基中继续培养。

4)转基因植株的再生。待转基因选择培养基中培养的外植体上长出的不定芽长2～3cm时，将不定芽转入含100mg/L卡那霉素和250mg/L头孢霉素的生根培养基中，培养至长出主根后，将无菌苗开盖炼苗，最后移入土壤正常培育，获取种子。同时对抗性植株进行PCR扩增检测目的基因Cf-9和Avr9的存在，以及Southern和Northern分析转基因的拷贝数和表达。

5)纯合转基因植株的筛选。将T₀代转基因植株上收获的种子播种，发育成苗后，PCR检测Cf-9和Avr9的存在。收获种子后，对该代苗进行同样分析。分别获取后代没有产生转基因分离现象的纯合Cf-9和Avr9转基因烟草植株。

2.含抗病基因Cf-9和互补叶霉菌无毒基因Avr9的烟草种子的获取

以转Cf-9的纯合子烟草和转与之互补的Avr9的纯合子烟草分别作父本和母本进行杂交，所获杂交一代种子同时含有番茄抗病基因Cf-9和叶霉菌无毒基因Avr9。该种子发芽后形成的苗中各组织产生肉眼可见的过敏性坏死斑，最终整苗枯死。

3.含抗病基因Cf-9和互补无毒基因Avr9的烟草不产生过敏性坏死反应的突变体的化学诱变筛选

将含Cf-9/Avr9这一互补基因对的烟草种子在无菌水中浸泡8h，再转入0.5％ethyl methanesulfonate(EMS)，24℃下100rpm摇动放置15～16h。以无菌水冲洗干净后播入土中，出苗后绝大多数产生过敏性坏死斑，最终整苗枯死。留下不产生过敏性坏死反应可正常生长发育的苗即目的突变苗。通过此法对约20000颗同含Cf-9/Avr9这一互补基因对的烟草种子进行了突变处理，筛选到了6株不产生过敏性坏死反应的烟草突变体，分别称为NtC9A9nhr1( Nicotianatabacum  Cf- 9/ Avr 9 plant with  no  hypersensitive  response 1)，NtC9A9nhr2，NtC9A9nhr3，NtC9A9nhr4，NtC9A9nhr5和NtC9A9nhr6。

4.突变体突变位点的鉴定

不产生过敏性坏死的烟草突变苗可能是Cf-9和/或Avr9发生了功能性突变，也可能是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变。将功能性Cf-9和Avr9的纯合转基因烟草植株分别与突变体植株杂交，杂交一代苗有一半产生过敏性坏死，说明突变体中的Avr9和Cf-9没有发生功能性突变。而是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变，导致了含Cf-9/Avr9这一互补基因对但不产生过敏性坏死反应的烟草突变体。实施例3番茄抗病基因Cf-4决定的抗性产生关键基因的番茄突变体筛选

主要操作步骤包括：

1.转番茄抗病基因Cf-4和叶霉菌无毒基因Avr4的番茄植株的分别获取

1)构建表达载体。将Cf-4基因，及Avr4的开放阅读框架与花椰菜花叶病毒35S启动子的连接产物，分别与双元载体pCHF3相连，所获连接产物分别为番茄抗病基因Cf-4和叶霉菌无毒基因Avr4在番茄中的表达载体。

2)双元表达载体对农杆菌的转化。吸取1～2μl表达载体，加入40μlEHA105农杆菌感受态细胞中，迅速混匀，以Bio-Rad Gene Pulser II电激仪在电压12.5kV/cm、电容25μF和电阻400Ω条件下电激约9ms，迅速加入1ml YEP培养基，28℃下180rpm摇动恢复培养1h。吸取100μl菌液均匀涂布含100mg/L链霉素和100mg/L壮观霉素的YEP培养基，获取可能转化子，以PCR进一步验证表达载体和目的基因Cf-4和Avr4的存在。

3)农杆菌对番茄外植体的感染。品种为Moneymaker Cf0的番茄种子经表面消毒后，播于不含激素的1/2MS培养基上，发芽生长后的无菌苗的子叶和胚轴分别切成5mm大小和1cm长，作为无菌外植体。先置于含1～2mg/L玉米素，3.0mg/L 6-BA和0.2mg/L IAA的分化培养基上预培养2-3d，再转入终浓度为OD₆₀₀0.2～0.5的农杆菌菌液中，浸泡8～15min，吸干后将外植体重新转入分化培养基中共培养2d，洗净后置于含100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的转基因选择培养基中继续培养。

4)转基因植株的再生。待转基因选择培养基中培养的外植体上长出的不定芽长2～3cm时，将不定芽转入含100mg/L卡那霉素和250mg/L羧苄青霉素的生根培养基中，培养至长出主根后，将无菌苗开盖炼苗，最后移入土壤正常培育，获取种子。同时对抗性植株进行PCR扩增检测Cf-4和Avr4的存在，以及Southern和Northern分析转基因的拷贝数和表达。

5)纯合转基因植株的筛选。将T₀代转基因植株上收获的种子播种，发育成苗后，PCR检测Cf-4和Avr4的存在。收获种子后，对该代苗进行同样分析。分别获取后代没有产生转基因分离现象的纯合Cf-4和Avr4转基因番茄植株。

2.含抗病基因Cf-4和互补叶霉菌无毒基因Avr4的番茄种子的获取

以转Cf-4的纯合子番茄和转与之互补的Avr4的纯合子番茄分别作父本和母本进行杂交，所获杂交一代种子同时含有番茄抗病基因Cf-4和叶霉菌无毒基因Avr4。该种子发芽后形成的苗中各组织(包括下胚轴，子叶和真叶)产生肉眼可见的过敏性坏死斑，最终整苗枯死。

3.含抗病基因Cf-4和互补无毒基因Avr4的番茄不产生过敏性坏死反应的突变体的化学诱变筛选

将含Cf-4/Avr4这一互补基因对的番茄种子在无菌水中浸泡8h，再转入0.8％ethyl methanesulfonate(EMS)，24℃下100rpm摇动放置15～16h。以无菌水冲洗干净后播入土中，出苗后绝大多数产生过敏性坏死斑，最终整苗枯死。留下不产生过敏性坏死反应可正常生长发育的苗即为目的突变苗。通过此法对约4000颗同含Cf-4/Avr4这一互补基因对的番茄种子进行了突变处理，筛选到了2株不产生过敏性坏死反应的番茄突变体，分别称为LeC4A4nhr1( Lycopersiconesculentum  Cf- 4/ Avr 4 plant with  no  hypersensitive  response 1)和LeC4A4nhr2。

4.突变体突变位点的鉴定

不产生过敏性坏死的番茄突变苗可能是Cf-4和/或Avr4发生了功能性突变，也可能是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变。将功能性Cf-4和Avr4的纯合转基因番茄植株分别与突变体植株杂交，杂交一代苗有一半产生过敏性坏死，说明突变体中的Avr4和Cf-4没有发生功能性突变。而是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变，导致了含Cf-4/Avr4这一互补基因对但不产生过敏性坏死反应的番茄突变体。实施例4番茄抗病基因Cf-4决定的抗性产生关键基因的烟草突变体筛选

主要操作步骤包括：

1.转番茄抗病基因Cf-4和叶霉菌无毒基因Avr4的烟草植株的分别获取

1)构建表达载体。将Cf-4基因，及Avr4的开放阅读框架与花椰菜花叶病毒35S启动子的连接产物，分别与双元载体pCHF3相连，所获连接产物分别为番茄抗病基因Cf-4和叶霉菌无毒基因Avr4在烟草中的表达载体。

2)双元表达载体对农杆菌的转化。吸取1～2μl表达载体，加入40μlEHA105农杆菌感受态细胞中，迅速混匀，以Bio-Rad Gene Pulser II电激仪在电压12.5kV/cm、电容25μF和电阻400Ω条件下电激约9ms，迅速加入1ml YEP培养基，28℃下180rpm摇动恢复培养1h。吸取100μl菌液均匀涂布含100mg/L链霉素和100mg/L壮观霉素的YEP培养基，获取可能转化子，以PCR进一步验证表达载体和目的基因Cf-4和Avr4的存在。

3)农杆菌对烟草外植体的感染。品种为Petite Havana SR1的烟草种子经表面消毒后，播于不含激素的1/2MS培养基上，发芽生长后的无菌苗的叶片切成0.5～1cm大小，作为无菌外植体。先置于含1.0mg/L 6-BA的分化培养基预培养2-3d，再转入终浓度为OD₆₀₀0.2～0.5的农杆菌菌液中，浸泡8～15min，吸干后将外植体重新转入分化培养基中共培养2d，洗净后置于含100mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的转基因选择培养基中继续培养。

4)转基因植株的再生。待转基因选择培养基中培养的外植体上长出的不定芽长2～3cm时，将不定芽转入含100mg/L卡那霉素和250mg/L头孢霉素的生根培养基中，培养至长出主根后，将无菌苗开盖炼苗，最后移入土壤正常培育，获取种子。同时对抗性植株进行PCR扩增检测目的基因Cf-4和Avr4的存在，以及Southern和Northern分析转基因的拷贝数和表达。

5)纯合转基因植株的筛选。将T₀代转基因植株上收获的种子播种，发育成苗后，PCR检测Cf-4和Avr4的存在。收获种子后，对该代苗进行同样分析。分别获取后代没有产生转基因分离现象的纯合Cf-4和Avr4转基因烟草植株。

2.含抗病基因Cf-4和互补叶霉菌无毒基因Avr4的烟草种子的获取

以转Cf-4的纯合子烟草和转与之互补的Avr4的纯合子烟草分别作父本和母本进行杂交，所获杂交一代种子同时含有番茄抗病基因Cf-4和叶霉菌无毒基因Avr4。该种子发芽后形成的苗中各组织产生肉眼可见的过敏性坏死斑，最终整苗枯死。

3.含抗病基因Cf-4和互补无毒基因Avr4的烟草不产生过敏性坏死反应的突变体的化学诱变筛选

将含Cf-4/Avr4这一互补基因对的烟草种子在无菌水中浸泡8h，再转入0.5％ethyl methanesulfonate(EMS)，24℃下100rpm摇动放置15～16h。以无菌水冲洗干净后播入土中，出苗后绝大多数产生过敏性坏死斑，最终整苗枯死。留下不产生过敏性坏死反应可正常生长发育的苗即目的突变苗。通过此法对约20000颗同含Cf-4/Avr4这一互补基因对的烟草种子进行了突变处理，筛选到了6株不产生过敏性坏死反应的烟草突变体，分别称为NtC4A4nhr1( Nicotianatabacum  Cf- 4/ Avr 4 plant with  no  hypersensitive  response 1)，NtC4A4nhr2，NtC4A4nhr3，NtC4A4nhr4，NtC4A4nhr5和NtC4A4nhr6。

4.突变体突变位点的鉴定

不产生过敏性坏死的烟草突变苗可能是Cf-4和/或Avr4发生了功能性突变，也可能是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变。将功能性Cf-4和Avr4的纯合转基因烟草植株分别与突变体植株杂交，杂交一代苗有一半产生过敏性坏死，说明突变体中的Avr4和Cf-4没有发生功能性突变。而是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变，导致了含Cf-4/Avr4这一互补基因对但不产生过敏性坏死反应的烟草突变体。实施例5烟草抗病基因N决定的抗性产生关键基因的烟草突变体筛选

主要操作步骤包括：

1.转烟草抗病基因N和烟草花叶病毒(TMV)无毒基因p50的烟草植株的分别获取

1)构建表达载体。将N基因，及p50与花椰菜花叶病毒35S启动子的连接产物，分别与双元载体pCHF3相连，所获连接产物分别为烟草抗病基因N和烟草花叶病毒无毒基因p50在烟草中的表达载体。

2)双元表达载体对农杆菌的转化。吸取1～2μl表达载体，加入40μlEHA105农杆菌感受态细胞中，迅速混匀，以Bio-Rad Gene Pulser II电激仪在电压12.5kV/cm电容25μF和电阻400Ω条件下电激约9ms，迅速加入1ml YEP培养基，28℃下180rpm摇动恢复培养1h。吸取100μl菌液均匀涂布含100mg/L链霉素和100mg/L壮观霉素的YEP培养基，获取可能转化子，以PCR进一步验证表达载体和目的基因N和p50的存在。

3)农杆菌对烟草外植体的感染。品种为Petite Havana SR1的烟草种子经表面消毒后，播于不含激素的1/2MS培养基上，发芽生长后的无菌苗的叶片切成0.5～1cm大小，作为无菌外植体。先置于含1.0mg/L 6-BA的分化培养基预培养2-3d，再转入终浓度为OD₆₀₀0.2～0.5的农杆菌菌液中，浸泡8～15min，吸干后将外植体重新转入分化培养基中共培养2d，洗净后置于含100mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的转基因选择培养基中继续培养。

4)转基因植株的再生。待转基因选择培养基中培养的外植体上长出的不定芽长2～3cm时，将不定芽转入含100mg/L卡那霉素和250mg/L头孢霉素的生根培养基中，培养至长出主根后，将无菌苗开盖炼苗，最后移入土壤正常培育，获取种子。同时对抗性植株进行PCR扩增检测目的基因N和p50的存在，以及Southern和Northern分析转基因的拷贝数和表达。

5)纯合转基因植株的筛选。将T₀代转基因植株上收获的种子播种，发育成苗后，PCR检测目的基因N和p50的存在。收获种子后，对该代苗进行同样分析。分别获取后代没有产生转基因分离现象的纯合N和p50转基因番茄植株。

2.含抗病基因N和无毒基因p50这一互补基因对的烟草种子的获取

以转N的纯合子烟草和转与之互补的p50的纯合子烟草分别作父本和母本进行杂交，所获杂交一代种子同时含有烟草抗病基因N和烟草花叶病毒无毒基因p50。该种子发芽后形成的苗中各组织均产生肉眼可见的过敏性坏死斑，最终整苗枯死。

3.含抗病基因N和无毒基因p50这一互补基因对的烟草不产生过敏性坏死反应的突变体的化学诱变筛选

将含N/p50这一互补基因对的烟草种子在无菌水中浸泡8h，再转入0.5％ethyl methanesulfonate(EMS)，24℃下100rpm摇动放置15～16h。以无菌水冲洗干净后播入土中，出苗后绝大多数产生过敏性坏死斑，最终整苗枯死。留下不产生过敏性坏死反应可正常生长发育的苗即为目的突变苗。通过此法对约20000颗同含N/p50这一互补基因对的烟草种子进行了突变处理，筛选到了5株不产生过敏性坏死反应的烟草突变体，分别称为NtNp50nhr1( Nicotiana  tabacumN/ p50 plant  no  hypersensitive  response 1)，NtNp50nhr2，NtNp50nhr3，NtNp50nhr4和NtNp50nhr5。

4.突变体突变位点的鉴定

不产生过敏性坏死的烟草突变苗可能在N和/或p50发生了功能性突变，也可能是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变。将功能性N和p50的纯合转基因番茄植株分别与突变体植株杂交，杂交一代苗有一半产生过敏性坏死，说明突变体中的N和p50没有发生功能性突变。而是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变，导致了含N/p50这一互补基因对但不产生过敏性坏死反应的烟草突变体。实施例6烟草抗病基因N决定的抗性产生关键基因的番茄突变体筛选

主要操作步骤包括：

1.转烟草抗病基因N和烟草花叶病毒无毒基因p50的番茄植株的分别获取

1)构建表达载体。将N基因，及p50的开放阅读框架与花椰菜花叶病毒35S启动子的连接产物，分别与双元载体pCHF3相连，所获连接产物分别为烟草抗病基因N和烟草花叶病毒无毒基因p50在番茄中的表达载体。

2)双元表达载体对农杆菌的转化。吸取1～2μl表达载体，加入40μlEHA105农杆菌感受态细胞中，迅速混匀，以Bio-Rad Gene Pulser II电激仪在电压12.5kV/cm、电容25μF和电阻400Ω条件下电激约9ms，迅速加入1ml YEP培养基，28℃下180rpm摇动恢复培养1h。吸取100μl菌液均匀涂布含100mg/L链霉素和100mg/L壮观霉素的YEP培养基，获取可能转化子，以PCR进一步验证表达载体和目的基因N和p50的存在。

3)农杆菌对番茄外植体的感染。品种为Moneymaker Cf0的番茄种子经表面消毒后，播于不含激素的1/2MS培养基上，发芽生长后的无菌苗的子叶和胚轴分别切成5mm大小和1cm长，作为无菌外植体。先置于含1～2mg/L玉米素，3.0mg/L 6-BA和0.2mg/L IAA的分化培养基上预培养2-3d，再转入终浓度为OD₆₀₀0.2～0.5的农杆菌菌液中，浸泡8～15min，吸干后将外植体重新转入分化培养基中共培养2d，洗净后置于含100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的转基因选择培养基中继续培养。

4)转基因植株的再生。待转基因选择培养基中培养的外植体上长出的不定芽长2～3cm时，将不定芽转入含100mg/L卡那霉素和250mg/L羧苄青霉素的生根培养基中，培养至长出主根后，将无菌苗开盖炼苗，最后移入土壤正常培育，获取种子。同时对抗性植株进行PCR扩增检测N和p50的存在，以及Southern和Northern分析转基因的拷贝数和表达。

5)纯合转基因植株的筛选。将T₀代转基因植株上收获的种子播种，发育成苗后，PCR检测N和p50的存在。收获种子后，对该代苗进行同样分析。分别获取后代没有产生转基因分离现象的纯合N和p50转基因番茄植株。

2.含抗病基因N和无毒基因p50这一互补基因对的番茄种子的获取

以转N的纯合子番茄和转与之互补的p50的纯合子番茄分别作父本和母本进行杂交，所获杂交一代种子同时含有烟草抗病基因N和烟草花叶病毒无毒基因p50。该种子发芽后形成的苗中各组织产生肉眼可见的过敏性坏死斑，最终整苗枯死。

3.含抗病基因N和无毒基因p50的番茄不产生过敏性坏死反应的突变体的化学诱变筛选

将含N/p50这一互补基因对的番茄种子在无菌水中浸泡8h，再转入0.8％ethyl methanesulfonate(EMS)，24℃下100rpm摇动放置15～16h。以无菌水冲洗干净后播入土中，出苗后绝大多数产生过敏性坏死斑，最终整苗枯死。留下不产生过敏性坏死反应可正常生长发育的苗即为目的突变苗。通过此法对约4000颗同含N/p50这一互补基因对的番茄种子进行了突变处理，筛选到了2株不产生过敏性坏死反应的番茄突变体，分别称为LeNp50nhr1( Lycopersicon  esculentumN/ p50 plant with  no  hypersensitive  response 1)和LeNp50nhr2。

4.突变体突变位点的鉴定

不产生过敏性坏死的番茄突变苗可能是N和/或p50发生了功能性突变，也可能是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变。将功能性N和p50的纯合转基因番茄植株分别与突变体植株杂交，杂交一代苗有一半产生过敏性坏死，说明突变体中的N和p50没有发生功能性突变。而是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变，导致了含N/p50这一互补基因对但不产生过敏性坏死反应的番茄突变体。实施例7番茄抗病基因Pto决定的抗性产生关键基因的番茄突变体筛选

主要操作步骤包括：

1.转番茄抗病基因Pto和番茄斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)无毒基因AvrPto的番茄植株的分别获取

1)构建表达载体。将Pto基因，及AvrPto的开放阅读框架与花椰菜花叶病毒35S启动子的连接产物，分别与双元载体pCHF3相连，所获连接产物分别为番茄抗病基因Pto和斑点病菌无毒基因AvrPto在番茄中的表达载体。

2)双元表达载体对农杆菌的转化。吸取1～2μl表达载体，加入40μlEHA105农杆菌感受态细胞中，迅速混匀，以Bio-Rad Gene Pulser II电激仪在电压12.5kV/cm、电容25μF和电阻400Ω条件下电激约9ms，迅速加入1ml YEP培养基，28℃下180rpm摇动恢复培养1h。吸取100μl菌液均匀涂布含100mg/L链霉素和100mg/L壮观霉素的YEP培养基，获取可能转化子，以PCR进一步验证表达载体和目的基因Pto和AvrPto的存在。

3)农杆菌对番茄外植体的感染。品种为Moneymaker Cf0的番茄种子经表面消毒后，播于不含激素的1/2MS培养基上，发芽生长后的无菌苗的子叶和胚轴分别切成5mm大小和1cm长，作为无菌外植体。先置于含1～2mg/L玉米素，3.0mg/L 6-BA和0.2mg/L IAA的分化培养基上预培养2-3d，再转入终浓度为OD₆₀₀0.2～0.5的农杆菌菌液中，浸泡8～15min，吸干后将外植体重新转入分化培养基中共培养2d，洗净后置于含100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的转基因选择培养基中继续培养。

4)转基因植株的再生。待转基因选择培养基中培养的外植体上长出的不定芽长2～3cm时，将不定芽转入含100mg/L卡那霉素和250mg/L羧苄青霉素的生根培养基中，培养至长出主根后，将无菌苗开盖炼苗，最后移入土壤正常培育，获取种子。同时对抗性植株进行PCR扩增检测Pto和AvrPto的存在，以及Southern和Northern分析转基因的拷贝数和表达。

5)纯合转基因植株的筛选。将T₀代转基因植株上收获的种子播种，发育成苗后，PCR检测Pto和AvrPto的存在。收获种子后，对该代苗进行同样分析。分别获取后代没有产生转基因分离现象的纯合Pto和AvrPto转基因番茄植株。

2.含抗病基因Pto和互补无毒基因AvrPto的番茄种子的获取

以转Pto的纯合子番茄和转与之互补的AvrPto的纯合子番茄分别作父本和母本进行杂交，所获杂交一代种子同时含有番茄抗病基因Pto和斑点病菌无毒基因AvrPto。该种子发芽后形成的苗中各组织(包括下胚轴，子叶和真叶)产生肉眼可见的过敏性坏死斑，最终整苗枯死。

3.含抗病基因Pto和互补无毒基因AvrPto的番茄不产生过敏性坏死反应的突变体的化学诱变筛选

将含Pto/AvrPto这一互补基因对的番茄种子在无菌水中浸泡8h，再转入0.8％ethyl methanesulfonate(EMS)，24℃下100rpm摇动放置15～16h。以无菌水冲洗干净后播入土中，出苗后绝大多数产生过敏性坏死斑，最终整苗枯死。留下不产生过敏性坏死反应可正常生长发育的苗即为目的突变苗。

4.突变体突变位点的鉴定

不产生过敏性坏死的番茄突变苗可能是Pto和/或AvrPto发生了功能性突变，也可能是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变。将转化了已知功能性Pto基因或AvrPto基因的纯合子植物分别与突变体植株杂交，若杂交一代苗全部不产生过敏性坏死，则分别说明突变体中的病原物无毒基因和植物抗病基因发生了功能性突变。否则说明是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变，导致了含Pto/AvrPto这一互补基因对但不产生过敏性坏死反应的番茄突变体。实施例8番茄抗病基因Pto决定的抗性产生关键基因的烟草突变体筛选

主要操作步骤包括：

1.转番茄抗病基因Pto和斑点病菌无毒基因AvrPto的烟草植株的分别获取

1)构建表达载体。将Pto基因，及AvrPto的开放阅读框架与花椰菜花叶病毒35S启动子的连接产物，分别与双元载体pCHF3相连，所获连接产物分别为番茄抗病基因Pto和斑点病菌无毒基因AvrPto在烟草中的表达载体。

2)双元表达载体对农杆菌的转化。吸取1～2μl表达载体，加入40μlEHA105农杆菌感受态细胞中，迅速混匀，以Bio-Rad Gene Pulser II电激仪在电压12.5kV/cm、电容25μF和电阻400Ω条件下电激约9ms，迅速加入1ml YEP培养基，28℃下180rpm摇动恢复培养1h。吸取100μl菌液均匀涂布含100mg/L链霉素和100mg/L壮观霉素的YEP培养基，获取可能转化子，以PCR进一步验证表达载体和目的基因Pto和AvrPto的存在。

3)农杆菌对烟草外植体的感染。品种为W38的烟草种子经表面消毒后，播于不含激素的1/2MS培养基上，发芽生长后的无菌苗的叶片切成0.5～1cm大小，作为无菌外植体。先置于含1.0mg/L 6-BA的分化培养基预培养2-3d，再转入终浓度为OD₆₀₀0.2～0.5的农杆菌菌液中，浸泡8～15min，吸干后将外植体重新转入分化培养基中共培养2d，洗净后置于含100mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的转基因选择培养基中继续培养。

4)转基因植株的再生。待转基因选择培养基中培养的外植体上长出的不定芽长2～3cm时，将不定芽转入含100mg/L卡那霉素和250mg/L头孢霉素的生根培养基中，培养至长出主根后，将无菌苗开盖炼苗，最后移入土壤正常培育，获取种子。同时对抗性植株进行PCR扩增检测目的基因Pto和AvrPto的存在，以及Southern和Northern分析转基因的拷贝数和表达。

5)纯合转基因植株的筛选。将T₀代转基因植株上收获的种子播种，发育成苗后，PCR检测Pto和AvrPto的存在。收获种子后，对该代苗进行同样分析。分别获取后代没有产生转基因分离现象的纯合Pto和AvrPto转基因烟草植株。

2.含抗病基因Pto和互补无毒基因AvrPto的烟草种子的获取

以转Pto的纯合子烟草和转与之互补的AvrPto的纯合子烟草分别作父本和母本进行杂交，所获杂交一代种子同时含有番茄抗病基因Pto和斑点病菌无毒基因AvrPto。该种子发芽后形成的苗中各组织产生肉眼可见的过敏性坏死斑，最终整苗枯死。

3.含抗病基因Pto和互补无毒基因AvrPto的烟草不产生过敏性坏死反应的突变体的化学诱变筛选

将含Pto/AvrPto这一互补基因对的烟草种子在无菌水中浸泡8h，再转入0.5％ethyl methanesulfonate(EMS)，24℃下100rpm摇动放置15～16h。以无菌水冲洗干净后播入土中，出苗后绝大多数产生过敏性坏死斑，最终整苗枯死。留下不产生过敏性坏死反应可正常生长发育的苗即目的突变苗。

4.突变体突变位点的鉴定

不产生过敏性坏死的烟草突变苗可能是Pto和/或AvrPto发生了功能性突变，也可能是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变。将转化了已知功能性Pto基因或AvrPto基因的纯合子植物分别与突变体植株杂交，若杂交一代苗全部不产生过敏性坏死，则分别说明突变体中的病原物无毒基因和植物抗病基因发生了功能性突变。否则说明是其他导致抗病性产生的关键基因发生了功能性突变，导致了含Pto/AvrPto这一互补基因对但不产生过敏性坏死反应的烟草突变体。

Claims (2)

1.一种植物抗病关键基因突变体的筛选方法，其特征在于它的步骤如下：

1)转植物抗病基因和病原物无毒基因的植物的分别获取

通过农杆菌介导法将植物抗病基因或病原物无毒基因导入目的植物，获取转植物抗病基因或病原物无毒基因的植物；

2)含植物抗病基因和互补病原物无毒基因的植物种子的获取

以转植物抗病基因的纯合子植物和转与之互补的病原物无毒基因的纯合子植物分别作父本和母本进行杂交，获取杂交一代种子。该种子同时含有植物抗病基因和互补的病原物无毒基因；

3)含植物抗病基因和互补病原物无毒基因的植物不产生过敏性坏死反应的突变体的化学诱变筛选；

以植物化学诱变剂处理含植物抗病基因和互补病原物无毒基因的植物种子，出苗后绝大多数产生过敏性坏死斑，最终整苗枯死，留下不产生过敏性坏死反应可正常生长发育的突变苗。

2.根据权利要求1所述的一种植物抗病关键基因突变体筛选的方法，其特征在于所说的通过农杆菌介导法将植物抗病基因或病原物无毒基因导入目的植物，获取转植物抗病基因或病原物无毒基因的植物；主要步骤包括：

1)构建表达载体

将植物抗病基因，及病原物无毒基因的开放阅读框架与花椰菜花叶病毒35S启动子的连接产物，分别与双元载体相连，所获连接产物分别为植物抗病基因和病原物无毒基因在植物中的表达载体；

2)双元表达载体对农杆菌的转化；

3)农杆菌对目的植物组织外植体的感染；

4)转基因植株的再生包括抗性芽的筛选，生根，抗性植株的获取和鉴定；

5)纯合转基因植株的筛选。