CN102146407A

CN102146407A - 一种启动子BgIosP534及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102146407A
Application number: CN 201010623155
Authority: CN
Inventors: 张耕耘; 李宁; 倪雪梅; 张印新
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Huada Gene Agriculture Holding Co ltd
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2030-12-30
Also published as: CN102146407B

Abstract

本发明涉及一种启动子BgIosP534及其制备方法和用途，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：a、SED ID NO：1所示的核苷酸序列；b、与SED ID NO：1互补的核苷酸序列；c、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的置换、缺失、添加修饰的核苷酸序列；e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。本发明还涉及所述启动子在调控单子叶植物或双子叶植物中目的基因表达以及育种的用途。

Description

一种启动子BgIosP534及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因调控领域。具体而言，本发明涉及一种启动子，具体是水稻的启动子BgIosP534，以及所述启动子的制备方法。本发明还涉及所述启动子在调控单子叶植物或双子叶植物中目的基因表达的用途。

背景技术

启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。

根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus)中分离的。

人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果(Plant biotechnology，2002，19(1)：19-26)。

单子叶植物基因中常见的启动子有：Ubi启动子(Plant ubiquitin promoter)、Actin启动子(Plant Actin promoter)和Adh-1启动子(Maize alcohol dehydrogenase 1promoter)。

Ubi启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，包括玉米基因组中的Ubi-1启动子、水稻泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素UbB1启动子、烟草泛素Ubi.U4启动子、马铃薯泛素Ubi7启动子、番茄泛素Ubi1-1启动子，大麦泛素Mub1启动子。玉米泛素Ubi-1启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中，水稻泛素RUBQ2启动子在水稻和甘蔗中也有较多的应用。

Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现，属于强组成型启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著，但是邻近科属的植物中的基因调控功能却十分不理想。因此，许多相关研究通过其他单子叶植物寻找Actin启动子，并成功在香蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续发现。Actin启动子由于对基因表达的强调控作用，在单子叶植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。

Adh-1启动子调控乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)基因，对植物在缺氧环境下乙醇脱氢酶的表达至关重要。Adh-1启动子对单子叶植物特别是谷类植物如水稻、燕麦和大麦，和少部分双子叶植物如烟草，基因的调控功能比花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子提高10-50倍。Adh-1启动子主要应用于单子叶植物，对绝大部分双子叶植物基因表达的调控效果都很有限。

单子叶植物是被子植物的主要类群，单子叶植物中的禾本科、百合科、棕榈科和天南星等，是非常重要的农业作物。单子叶植物基因的强效启动子，能够调控植物高效率表达具有特殊性状的外源基因，对优良作物的分子育种研究意义重大。

在强效启动子相关研究领域，发现并验证了许多单子叶植物的启动子。此外，双子叶植物中的一些强效启动子如CsVMV启动子、番茄E8启动子、白藜芦醇合酶基因Vst1启动子等高效启动子，在单子叶植物中也有很强的基因调控作用。

尽管已经有上述已知的单子叶植物的启动子，本发明人通过对水稻基因组的深入研究，提供了一种新的单子叶植物启动子，所述启动子能够用于调控单子叶植物和双子叶植物中目的基因表达，同时为研究单子叶植物和双子叶植物中目的基因表达提供了一种新的工具和选择。

发明内容

在第一方面中，本发明提供了一个具有启动子活性的启动子基因BgIosP534。所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

TGGCAACTCTCTCCCTTTCGCTCTCCGTTTCCACGGGCCATACCATATGCCCCCGTCCACGCGAGCGAGTACGCTAAAATCCTCCTATAGCCCGTGCGCCCACCACTCCGCCGACTCCCTTCCCATACGAGAGCACAGTGTCACGCCATGCCAAGGCCACAAGTCCCGCCAGTGTGTGTGACCCCCCCCACCCCACCACGACAAGTGAATATGCGATGCACCACCGTTTTTTGCGCTTGCACCCACCACCCCCCGCGTAGTACGCGGGGCAGTACGCGCGGGCATCGGCTTCTTCGCGGCTTGGCGGTTCGGTCGACCGATCGGTGAGGTCCACCGGATCAGCCGCTGCTGGCGCCCAGGACGAGGGATCCACCGGATCAGCGGATCAGAGGCAAGGCAGGCGGGCGCGCGCGGCGCGCTGCCGGGTGAGCGATCGCGACGCGGGGTGGGGTTGTGGCCGTGTGCGGCGCGCGACACGTACGCGTGCGCACGCGGGGCTTTGCCGCGAGGAAACAACCAACGGACGGACGGGGTCACGCGGATCCGGCGATTTCACACTCGAGAGCTAGCTAGCACTGGAGTAAATGCGAGTCATGGAGGAGATGCCTTCCCCGGTTACTAGCCACGCGCGTTCGCTCGAAGAGTAATTACGGGGGCTATAATCGATCTGTGTATTACTACTACTACTGTATTTTGAAAATGGAATTCGCGGACAAAAATCGTCGTGACGACGATAACAGGTTGTTTGTGTGGAGAGCGCGAATTTCCCCAAGTCAATAAAGATCCACCCAGCAGGAGTTCAACATATGATTCGGGTCGTTCGAATGCAGTTGTGTTGGATCGTCCCAACCGGAAGGGATATGTATCAGGCACAGGAATGCAAACATCCAACTAGAGACAAAACTCCCCGTACGGAAAACGGAGCAGTCCATTAGCACGTGATTAATTAAGTATTTATAAAAAAAATTCAAAAATGGATCAATATGATTTTTTTTAAACAACTTTTGTATAAATTTTTTTTTTTTGTAAAAAACGCACCGTTTAGTAGTTTGAAAAACGTGCGTGTAGAAAATGAGGGAGGGAGATACAGGACAGGGCGCAGCGCGACGTGCGTCGCGATCGCACTTGCCTCCCTCCGTCCGTCCGTCCCCGCCCGCACGTCCCTCCGATAGAGAGAGCGGAGTCCCCACCCCCGCCCCGCGCACTCTGATGTGCCTCGGGCCCTCGGCTCTCACTCGCTTTCGCCTCCACGGCACGGATGACGCGCCGCACACGCACTACGCACGCAGCGCAGCCGATGGTGCGCTCCGTTGCGAGACAGCGAGAGACGTGCCCGCTGGCCACTTGTGCTGCTCCATCTGAGTGACCATCGTACGTGTCAATCACTCTGGCGTTCGTTGCAAAAAACAAGGTGGTTTGCAGTGCATCCGGAATTCCGGATCAATCGTGCATGTACGGCCCGTCGAGTTGGATCGCAGCATGTGTGCTACACCACGCGGGGGACTCGAACCACTTATTTTTTGACACTACGAAAAAGGAGCTTAGAATAATACTAGGGTTTTATTTGGACAGTTTAAGAAACAGCCGATGAAAATATATGAACCTCGATTTTTGGTTTCTAATTTATTTTCTGGATTATACGGCTACAACTTTTCATAATTCAAGGCTATGTTTAGTTCAACGCAAAGTTTGGATTTTGGTTAAAATTGAAGATGATGTGACTGAAAAGTTGTGTGTATGACATGTTGATGTGATGGAAAATGACTGAAGTTTGCATCCAAACTTTGGATCTAAACACAGTAAAAATTAGGATGGTTTGTTTGACAGCTGCAGCTTCTAAAAGATTCTCTATTTGCTAGAAGCTCTCCAAACATATCCTAGTACATGTGTGCAAGCTTAGCTCGGGTGTAGGAGCTTGAGAGTTACGGCTGCGTTTAGTTCCACCGGTAAAAAAATTTATTGGGTCACATCAGATATACGGGCAAGTATTTAAAGTATTAAACATAGACTAATAACAAAACAAATTACATAATAGGTAAACTGCGAGACGGATTTATTAAGCCTAATTAATCCATCGTTAGTAAATGTTTACTGTAGCACTATATTGTCAGATCATGGCGCAATTAGGCTTAAAAAATTCGTCTCGCAATTTACACGCAAACTGTGTAGTTAGTTTTTTTTTTTCAATATTTAATAATATGTACATGTGTTCAAACATTCGATATGCCGGGGAAAAAATTGCCAACCCCGTCACATCCATGTAAAAAAGAAAGGAGCATGATTTTATTCTGTATCTTTTTCTTTAGCTCGAAAAAAAGGAGATTAGTTTCAGCTACCTAGCCTTTTCTTTTCAGACGGTAACACCAAGCATAGTGTACTCTCCACTCGTACCCCGCATCCTTTCGTTATCTGTACGGCAGTGACGTCCACGACTCGATGCATCACAGCTGGCTGGCTCTTGCTGATCGGTCGTGTTCCAAAGCGGCCCAACAATGAACACGTCACTTGTATTCACTAACACAATCTCTCATTAGACTAGACTAGTGTAAGTAATCCTATCCCATCTTCCAGAAGAAGACGCCGTTGAACTGAAGTGAACAATCAGCAGCAGCACGGACGCGTTTTCGCCACCTTCGCCGAAGCTTCCCTCGTCGCGCTTTGCTTTGCGCACGGTGATTTCGCCCTTGTCCCGGTCGAAATTACGACCAAAACTCGTATCCACCCGAGACCACCACCACTCACCAACCAACCAACCGAGCCGAGCCGCGTCGCACAGTCTCCTCCTGCCCCGATAAAACCACTCGCCTCCCGCCCCGTCTCCTTTCCCATTCCGCGCCCCCTAGCCAAGCAGCACGAGCACACGAGAAAACAA(SEQ ID NO：1)。

在一个实施方案中，本发明涉及含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列的启动子：

a、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列；

c、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的置换、缺失、添加修饰的核苷酸序列；以及

e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

在第二方面中，本发明提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含本发明的启动子以及与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。

在第三方面中，本发明提供了一种载体，所述载体包含本发明的启动子或核酸构建体。在一个实施方案中，所述质粒是pMD18-T质粒或p8质粒。在一个实施方案中，所述启动子或核酸构建体序列位于KpnI酶切位点和SbfI酶切位点之间。

在第四方面中，本发明提供了一种包含本发明的启动子、核酸构建体或载体的重组细胞。在一个实施方案中，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。在另一个实施方案中，所述菌株是根癌农杆菌EHA105-P534。在一个实施方案中，本发明提供了一种包含本发明的启动子、核酸构建体、载体或重组细胞的植物愈伤组织、植物外植体或植物。在一个实施方案中，所述植物愈伤组织是水稻愈伤组织。在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物，优选稻属或烟草属，更优选水稻或烟草，最优选水稻日本晴或烟草NC89。

在第五方面中，本发明提供了一种制备SEQ ID NO：1所示的启动子序列的方法，包括：以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增。在一个实施方案中，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在水稻日本晴gDNA中的序列分别针对首尾进行设计。在另一个实施方案中，所述扩增引物是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。在一个实施方案中，所述扩增引物5’端还连接一段限制性酶切位点和/或保护碱基。例如，所述扩增引物是SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，其中SEQ ID NO：4和SEQID NO：5的5’端分别含有KpnI酶切位点和SbfI酶切位点。

在第六方面中，本发明提供了SEQ ID NO：1所示的序列用作启动子的用途。在一个实施方案中，所述用途是调控植物中目的基因表达的用途，所述目的基因优选是GUS。在另一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物，优选稻属或烟草属，更优选水稻或烟草，最优选水稻日本晴或烟草NC89。

在第七方面中，本发明提供了一种调控基因表达方法，所述方法包括步骤：将本发明的启动子、核酸构建体、载体或重组细胞转化至植物，优选转化至植物愈伤组织，使所述启动子位于所述基因的5’端。在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物，优选稻属或烟草属，更优选水稻或烟草，最优选水稻日本晴或烟草NC89。

为实现上述调控基因表达的目的，本发明所述的启动子可以以单拷贝和/或多拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子联用。

在第八方面中，本发明提供了一种制备转基因植物的方法，包括在有效产生植物的条件下培养本发明的重组细胞、植物愈伤组织、植物外植体或植物，所述植物是单子叶植物或双子叶植物，优选稻属或烟草属，更优选水稻或烟草，最优选水稻日本晴或烟草NC89。

在第九方面中，本发明提供了本发明的启动子、核酸构建体、载体、重组细胞、植物愈伤组织、植物外植体或植物用于调控植物目的基因表达和育种的用途，所述植物是单子叶植物或双子叶植物，优选稻属或烟草属，更优选水稻或烟草，最优选水稻日本晴或烟草NC89。

保藏信息

培养物名称：烟草NC89种子。

保藏日期：2010年11月12日。

保藏单位：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

保藏编号：CCTCC NO：P201017。

附图说明

图1示出质粒pCAMBIA-1301的图谱。

图2示出含有需要构建的多克隆位点及GUS序列的p8质粒的图谱。

图3示出水稻愈伤组织gus染色的照片。以含有启动子的p8+P534重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织经染色后呈现蓝色(右)。作为对照，经不含启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织经GUS染色后颜色未发生变化(左)。

图4示出水稻转基因苗的根gus染色的照片。以含有启动子的p8+P534重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根经染色后呈现蓝色(右)。作为对照，经不含启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根经GUS染色后颜色未发生变化(左)。

图5示出水稻转基因苗叶gus染色照片。以含有启动子的p8+P534重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的叶经染色后呈现蓝色(右)。作为对照，经不含启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的叶经GUS染色后颜色未发生变化(左)。

图6示出转基因烟草的叶gus染色的显微照片(光学显微镜，×3)。以重组根癌农杆菌EHA105-P534转化的烟草的叶经染色后呈现蓝色(右)。对照烟草的叶经GUS染色后颜色未发生变化(左)。

图7示出转基因烟草根gus染色的显微照片(光学显微镜，×3)。以重组根癌农杆菌EHA105-P534介导转化的烟草的根经染色后呈现蓝色(右)。对照烟草的根经GUS染色后颜色未发生变化(左)。

具体实施方式

在第一方面中，本发明提供了一个具有启动子活性的启动子基因BgIosP534。在一个实施方案中，本发明涉及含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列的启动子：

a、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列；

d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的置换、缺失、添加修饰的核苷酸序列；

在本发明中，所述的启动子来源于单子叶植物。具体而言，所述单子叶植物为水稻，例如所述水稻为日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare)。本发明的启动子可以调控基因在植物、特别是单子叶植物中的表达。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为稻属。在本发明的又一实施方案中，所述稻属是水稻。在本发明的又一实施方案中，所述为水稻日本晴。

本发明的启动子还可以控制基因在双子叶植物，所述双子叶植物有例如烟草，大豆，马铃薯、蚕豆、萝卜、花生等。烟草是典型的基因工程模式植物。在实施例中选择烟草进行转基因研究，以验证本发明的启动子在双子叶植物中的效果。实验结果表明，该启动子能在转基因烟草中起作用。

本领域技术人员已知获得一个核苷酸序列的互补序列的方法。而且，为了实现启动子对基因的调控，可以将所述基因的互补序列连接至所述启动子的互补序列的5’形成核酸构建体，然后获得所述核酸构建体的互补序列，从而可以利用所述核酸构建体的互补序列实现启动子对一个基因的调控。

利用核苷酸杂交进行核苷酸的鉴定和筛查是本领域技术人员公知的。典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

在本发明中，所述在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

在本发明中，所述对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的置换、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的置换、缺失、添加修饰。

在本发明中，所述对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的置换、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQ ID NO：1的参考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在SEQ ID NO：1的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5％。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5或3末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。

在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

在本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

在本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

在本文中，所述核酸构建体可以包含SEQ ID NO：1所示的启动子序列或其互补序列的核苷酸序列。所述核酸构建体可以通过将SEQ ID NO：1所示的启动子序列或其互补序列与所需的其他序列可操作地连接进行制备。或者，所述核酸构建体可以通过直接合成制备。

在第三方面中，本发明提供了一种载体，所述载体包含本发明的启动子或核酸构建体。在一个实施方案中，所述质粒是pMD18-T质粒或p8质粒。在一个实施方案中，所述启动子或核酸构建体序列位于KpnI酶切位点和SbfI酶切位点之间。构建质粒的方法是本领域中已知。例如，在本发明的实施例中构建了pMD18-T质粒和p8质粒。

适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如：pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19-T SimpleVecter等。

适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如：pBI121、p13W4、pGEM等。

在第四方面中，本发明提供了一种包含本发明的启动子、核酸构建体或载体的重组细胞。在一个实施方案中，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。将质粒导入细菌的方法是本领域中已知的。例如，所述重组细胞可以通过将含有本发明启动子的所述重组载体转化至宿主细胞而得到。在本发明的实施例中，质粒被导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，具体是根癌农杆菌EHA105-P534。

适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如：根癌农杆菌细胞LBA4404、EHA105、GV3101等

在第五方面中，本发明提供了一种制备SEQ ID NO：1所示的启动子序列的方法，包括：以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增。

可以使用本发明中公知的方法制备SEQ ID NO：1所示的启动子，例如化学合成法直接从头合成或者从基因组中扩增所述启动子序列。在一个实施方案中，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在水稻日本晴gDNA中的序列分别针对首尾进行设计。本领域技术人员可以根据待扩增的目的核苷酸序列按照碱基互补原则设计相应的PCR扩增引物对。例如，本发明的引物可以是TGGCAACTCTCTCCCTTTCGC(SEQIDNO：2)和TTGTTTTCTCGTGTGCTCGTG(SEQ ID NO：3)。在一个实施方案中，所述扩增引物5’端还连接一段限制性酶切位点和/或保护碱基。例如，在实施例中使用的扩增引物是SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，其中SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的5’端分别含有KpnI酶切位点和SbfI酶切位点。在扩增引物5’端连接一段限制性酶切位点和/或保护碱基是基因扩增中常用的方法，本领域技术人员可以通过常规的方法实现。

将核苷酸序列、构建核酸构建体、质粒或细菌导入植物可以使用本领域中常用的方法。例如，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然，适于本发明的转化单子叶植物的另一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外，还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。

为实现上述调控目的基因表达的目的，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子联用。

在第九方面中，本发明提供了本发明的启动子、核酸构建体、载体、重组细胞、植物愈伤组织或植物用于调控植物目的基因表达和育种的用途。本发明的启动子可成为一种新的启动子作为单子叶植物、尤其是水稻转基因的工具启动子，为开展低表达基因转化苗筛选、植物花器官败育等分子育种研究提供便利，从而极大的缩短优良品种的选育时间。本发明的启动子可广泛用于培育水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等单子叶植物。例如，可使用本领域中常用的基因重组方法，将本发明的启动子导入植物基因组中希望表达量增加的目标基因5’端，实现目标基因的表达增加。

在本发明中，术语“单子叶植物”，具体地，可以为禾本科植物，更具体地，可以为稻属植物例如水稻，包括但不限于，例如包括但不限于水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等。

在本发明中，术语“水稻”包括但不限于，日本晴，中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101(上述水稻品种均可购自安徽徽商农家福有限公司)等。

在本发明中，术语“双子叶植物”，具体地，可以为茄科植物，更具体地，可以为烟草属植物(烟草)，包括但不限于K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中烟90、Coker176、CV87等等

实施例

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：P534启动子片段的PCR扩增和pMD18-T+P534重组载体的构建 PCR扩增

使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号：DP320-02)提取水稻日本晴(已在申请号为200910238992.0、发明名称为“一种启动子BgIosP587、其制备方法及用途”的发明申请中保藏，并于2010年9月22日公开，保藏编号为CCTCC P200910)的基因组DNA，根据该启动子在水稻日本晴gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F1，加限制性酶切位点KpnI和保护碱基，下游引物R1，加限制性酶切位点SbfI和保护碱基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA为模板，使用高保真Ex Taq(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表1所示。

表1基因启动子扩增的PCR体系

PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟，然后以94℃变性45秒，55℃退火50秒，72℃延伸90秒，进行35个反应循环，最后72℃延伸7分钟。

其中，上游引物F1：GGGGTACCTGGCAACTCTCTCCCTTTCGC，其中下划线代表KpnI酶切位点，(SEQ ID NO：4)。

下游引物R1：TGCCTGCAGGTTGTTTTCTCGTGTGCTCGTG，其中下划线代表SbfI酶切位点，(SEQ ID NO：5)。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为2870bp左右的条带，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)进行纯化回收。

pMD18-T+P534重组载体的构建

将如上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序，与SEQ ID NO：1所示序列比较，证明其是准确的。

其中，T/A克隆的连接条件如下：

T/A连接体系： 10μl

pMD18-T 1μl

2*solution I 5μl

PCR扩增产物(回收插入片段)10ng～20ng，根据其浓度定

ddH₂O 补足至10μl

在16℃下，在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8小时以上，得到pMD18-T+P534重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可购自例如上海生工)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pMD18-T+P534重组载体，轻轻搅匀，冰浴30分钟，42℃热激60秒，冰浴5分钟，加入600μl在4℃下预冷的SOC培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，在37℃下于220rpm复苏45分钟，8000rpm离心30秒，去上清，留取150μl，用剩下的150μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养16小时～24小时。获得含有pMD18-T+P534克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-P534。深圳华大基因科技有限公司对pMD18-T+P534克隆载体中的P534进行测序。

测序结果表明，获得的pMD18-T+P534克隆载体中P534启动子序列与SEQ IDNO：1相同正确。

实施例2：载体-p8+P534重组载体的构建

按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号：DP103-03)的操作手册，从实施例1构建的转化有启动子P534的大肠杆菌DH5α-P534中提取带有本发明P534启动子序列的克隆载体pMD18-T+P534；纯化后用相应的限制性内切酶KpnI和SbfI进行酶切，回收相应的启动子插入片段，并分别与p8质粒用相同的限制性内切酶酶切后回收的载体大片段进行连接。

将所得连接产物p8+P534重组载体转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞DH5α，在37℃下倒置培养16～24小时，待转化子长出菌落后，挑取单克隆进行PCR检测和酶切鉴定。

p8质粒构建

本发明中所使用的p8质粒是由pCAMBIA-1301质粒(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得，该公司的pCAMBIA-1301质粒的原始来源是CAMBIA Bios(biological open source)Licensee，Australia)按照如下方式改造并构建的，具体说明如下：

用Kpn I/Nco I(NEB)双酶切质粒pCAMBIA-1301(参见图1)，回收大片段。根据所采用的限制性内切酶位点合成如下序列：GGTACCAAGCTTACTAGTCCTGCAGGTCTAGAGGATCCGTCGACCATGG(SEQ IDNO：6)(包含的酶切位点是Kpn I/HindIII/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/SalI/Nco I)，用Kpn I/Nco I双酶切后回收，与上述所回收的大片段连接后转化top10细胞(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可购自例如北京索莱宝科技有限公司)。用引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT(SEQ ID NO：7)/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(SEQ ID NO：8)筛选转化子，通过PCR检测方法，带有扩增片段为350bp的转化子即为含有需要构建的多克隆位点及GUS序列的p8质粒的转化子(参见图2)。

所述p8质粒中的多克隆位点和GUS序列的长度2353碱基，如SEQ ID NO：9所示：

GTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCA

GTCCGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCTGTGGGCATTCAGTCTGGATCGCGAAAACTGTGGAATTGATCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTACAAGAAAGCCGGGCAATTGCTGTGCCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGCCGATGCAGATATTCGTAATTATGCGGGCAACGTCTGGTATCAGCGCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTGGGCAGGCCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGATGCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAAGTGATGGAGCATCAGGGCGGCTATACGCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTATTGCCGGGAAAAGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAACAACGAACTGAACTGGCAGACTATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGACGAAAACGGCAAGAAAAAGCAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTAACTATGCCGGAATCCATCGCAGCGTAATGCTCTACACCACGCCGAACACCTGGGTGGACGATATCACCGTGGTGACGCATGTCGCGCAAGACTGTAACCACGCGTCTGTTGACTGGCAGGTGGTGGCCAATGGTGATGTCAGCGTTGAACTGCGTGATGCGGATCAACAGGTGGTTGCAACTGGACAAGGCACTAGCGGGACTTTGCAAGTGGTGAATCCGCACCTCTGGCAACCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTCGAAGTCACAGCCAAAAGCCAGACAGAGTCTGATATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCAGTGGCAGTGAAGGGCCAACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGATGCGGACTTACGTGGCAAAGGATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCACGCATTAATGGACTGGATTGGGGCCAACTCCTACCGTACCTCGCATTACCCTTACGCTGAAGAGATGCTCGACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCGGCTTTCAGCTGTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAACTGTACAGCGAAGAGGCAGTCAACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTGGTGATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGGAATATTTCGCGCCACTGGCGGAAGCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCATCAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATGTCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAGAGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTGGCAGGAGAAACTGCATCAGCCGATTATCATCACCGAATACGGCGTGGATACGTTAGCCGGGCTGCACTCAATGTACACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATATGTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGCAAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTCTGCTGCAAAAACGCTGGACTGGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAAGCTAGCCACCACCACCACCACCACGTGTGA(SEQ ID NO：9)。

如上序列所示本发明中所构建的p8质粒，其多克隆位点中的EcoR I/Sac I/Kpn I/HindIII/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/Sal I/Nco I限制性酶切位点分别用加框和下划线表示，筛选转化子所用的引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT(SEQ ID NO：7)/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(SEQID NO：8)用双下划线表示，GUS序列用斜体表示，其内含子序列分别用斜体加底纹示出。

重组载体p8+P534的构建

根据限制性内切酶KpnI和SbfI操作说明，按照如下条件处理实施例1中所得到的克隆载体pMD18-T+P534，以及如上所述构建的p8质粒。

其中，克隆载体pMD18-T+P534及p8质粒的酶切条件如下：

酶切体系： 50μl

无菌蒸馏水 34.8μl

10×buffer H 5μl

KpnI 0.1μl(10U)

SbfI 0.1μl(10U)

克隆载体pMD18-T+P534或p8质粒10μl(＜1000ng)

使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)分别回收经酶切的p8质粒，以及启动子P534插入片段，根据T4连接酶(TaKaRa，D2011A)操作说明，按照如下条件进行连接：

连接体系： 10μl

10×T4缓冲液 1μl

酶切后的p8质粒 1μl(20ng)

回收的启动子P534插入片段 10～20ng，根据其浓度确定

无菌蒸馏水补足至9.5μl

T4连接酶(TaKaRa，D2011A) 0.5μl

T4缓冲液冰上融化，酶切后的p8质粒载体加入量约20ng，本发明中的P534片段加10ng。于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8小时以上。

将100μl氯化钙法制得的感受态细胞DH5α从超低温冰箱取出，冰上融化后，加入10μl上面的连接产物，轻轻搅匀，冰浴30分钟，42℃热激60秒，冰浴5分钟，加入600μl 4℃预冷的SOC，在37℃下以220rpm复苏45分钟，8000rpm离心30秒，去上清，留取150μl，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(kan)，37℃倒置培养16～24小时。得到重组载体p8+P534。

分别以F1(即SEQ ID NO：4)和R1(即SEQ ID NO：5)为引物对所得重组载体p8+P534进行PCR检测，以确证所得重组载体p8+P534中含有所需启动子P534。通过KpnI和SbfI酶切筛选含有重组载体p8+P534转化子。

实施例3重组根癌农杆菌EHA105-P534细胞的制备

将如实施例2所述方法构建的p8+P534重组载体和作为对照的p8质粒分别转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)中所述氯化钙方法制备的根癌农杆菌EHA105(已在申请号为200910238992.0、发明名称为“一种启动子BgIosP587、其制备方法及用途”的发明申请中保藏，并于2010年9月22日公开，保藏编号为CCTCC M 209315)的感受态细胞，具体方法如下：

将根癌农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出，置于冰上解冻。融化后，分别加入5μl的p8+P534重组载体和p8质粒以及作为对照的p8空载体，轻轻混匀，冰浴10分钟，放入液氮中冷冻5分钟，37℃解冻5分钟，加入800μl常温的LB液体培养基，在28℃下以160rpm摇晃复苏3小时，以8000rpm离心30秒，吸去上清，留下200μl吹吸均匀，涂布于加有卡那霉素和利福平(50mg/l Kan，10mg/lRif)的YM固体培养基平板上(具体配方参见表2)。28℃倒置培养2-3天。

以F1(即SEQ ID NO：4)和R1(即SEQ ID NO：5)为引物进行PCR检测和通过Kpn I/SbfI酶切筛选转化子。

PCR扩增出约2870bp左右条带和酶切出约2870bp左右条带的为重组载体p8+P534的重组根癌农杆菌。

本发明中，按照如上述方法得到的带有重组载体p8+P534的重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-P534。

按照本发明所述方法，得到的带有p8质粒的对照重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-p8。

实施例4：水稻愈伤组织的诱导和转化

按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并分别用重组根癌农杆菌EHA105-P534和重组根癌农杆菌EHA105-p8转化所述愈伤组织。

1)将水稻日本晴种子去壳，70％乙醇表面消毒30秒，然后用有效氯1.5％的次氯酸钠消毒30分钟，期间剧烈摇动，消毒后用灭菌水清洗5次；将消毒后的种子置于N6D培养基(具体配方参见表3)上，用封口膜封口；29.5℃光照培养3～4周；

2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色，干燥，直径1～3mm)，在新N6D培养基上29.5℃光照培养3天；

3)分别挑取如实施例3所构建的重组根癌农杆菌单菌落(重组根癌农杆菌EHA105-P534或重组根癌农杆菌EHA105-p8)，于添加卡那霉素和利福平(50mg/lKan，10mg/l Rif)的YM固体培养基上划线培养3天，培养温度28℃；分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了30μl 100mM的AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30mlAAM培养基(具体配方参见表4)中，温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞(重组根癌农杆菌EHA105-P534或重组根癌农杆菌EHA105-p8)；

4)将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；将如步骤3制备的重组根癌农杆菌悬液倒入培养皿中，将愈伤组织浸入其中15分钟；

5)倒掉重组根癌农杆菌悬液，将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体；于N6-AS培养基(具体配方参见表5)上放一张灭菌滤纸，加1ml如上述含AS的AAM培养基，将愈伤组织转移至滤纸上；密封培养皿，28℃暗培养48～60小时；

6)将受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清液变澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌蒸馏水中以杀死重组根癌农杆菌；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含1mg/l潮霉素B(HmB)和50mg/l Carb的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3～4周。

实施例5：水稻愈伤组织中的GUS的表达

为检测经过实施例4所述转化的水稻愈伤组织中目的基因GUS的表达情况，按照Chen S Y等在Journal ofIntegrative Plant Biology，2008，50(6)：742-751所述的方法，对分别用重组根癌农杆菌EHA105-P534或重组农杆菌EHA105-p8转化的水稻愈伤组织进行染色。

GUS染色液的配方(1ml)：610μl 0.2M Na₂HPO₄溶液(pH＝7.0)；390μl 0.2MNaH₂PO₄溶液和10μl 0.1M X-gluc。

将分别用重组根癌农杆菌EHA105-P534或重组根癌农杆菌EHA105-p8转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中，37℃保温至出现蓝色，拍照，结果如图3所示，经含有启动子的p8+P534重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(图3右)经染色后呈现蓝色，经不含有启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(作为对照，图3左)经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明的P534启动子对GUS基因表达具有调控作用。

实施例6：转基因水稻苗中GUS的表达

将实施例4中得到的愈伤组织转移至含50mg/l潮霉素B(HmB)的MS-R分化培养基(具体配方见表6)分化苗；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周；待幼苗长至3-4cm时转移到含50mg/l潮霉素B(HmB)的1/2MS生根培养基(具体配方参见表7)进行生根筛选。

转基因水稻苗的GUS染色过程同实施例5中愈伤组织的染色过程。结果如图4、5所示，经含有启动子的p8+P534重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根、叶(图4、5右)经染色后呈现蓝色，经不含启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根、叶(作为对照，图4、5左)经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明的P534启动子对GUS基因表达具有调控作用。

实施例7：转基因烟草苗中GUS表达

1.烟草无菌苗获得：

●将烟草NC89种子(2010年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：P201017，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072)浸泡：将烟草种子装入1.5ml的离心管中(＜50粒/管)，加入1ml无菌蒸馏水，用移液器吸打几次，更换无菌蒸馏水后，在常温下浸泡24小时；

●烟草种子消毒：用移液器吸出浸泡种子的水，加入1ml 75％的酒精浸泡30秒，用移液器吸出酒精；加入1ml10％H₂O₂浸泡10分钟后，用移液器吸出H₂O₂；

●洗涤：用无菌蒸馏水清洗五次，每次加入1ml无菌蒸馏水摇动1分钟；

●接种：无菌滤纸吸干种子表面的水分，再用吸头或无菌牙签接种于MS固体培养基(具体配方见表8)上萌发，每皿约10粒，置于28℃光照培养室(16小时光/8小时暗)培养一周，光照强度为2000lx(本实验所有的光照培养材料均在此光照强度下培养)；

●转接：待长出幼苗后，转入新鲜MS固体培养基，每瓶(Ф6cm，30ml培养基/瓶)3株烟草小苗，28℃光照培养室(16小时光/8小时暗)培养约5周，获得烟草无菌苗。

2.烟草无菌苗的继代和扩繁

●剪去烟草无菌苗的叶片和根，将茎杆剪成带有腋芽的茎段(2cm-3cm)，然后将其形态学下端垂直插入到新鲜MS固体培养基(腋芽不能插入培养基里)；

●每瓶接种一个带有腋芽的茎段外植体，置于28℃光照培养室培养约5周，作为待转化材料使用。

3.侵染前菌液的制备：

●挑取实施例3所得的重组根癌农杆菌EHA105-P534单菌落，接种到10ml YM液体培养基(含Kan 50mg/L，Rif30mg/L)(具体配方参见表9)，在28℃下以250rpm振荡过夜，待菌液混浊，还未出现沉淀时，将此菌液置4℃保存；

●取保存于4℃的菌液20μl，接种于10ml YM液体培养基(含Kan 50mg/L，Rif30mg/L)于50ml离心管中28℃，250rpm振荡过夜，待菌液混浊，还未出现沉淀时，停止培养；

●取上述菌液3ml加入到50ml YM液体培养基(具体配方参见表9)于三角瓶中28℃，250rpm摇床震荡培养约2小时，OD₆₀₀＝0.5左右时，作为侵染菌液使用。

4.侵染：

●从培养5周的烟草无菌苗上剪取较大的叶片，保存在一个装有YM液体培养基的培养皿中；

●用直径6mm的打孔机将烟草叶片打成叶圆盘，保存在另一个装有YM液体培养基的培养皿中；

●将烟草叶圆盘转移到装有侵染菌液的培养皿中；

●轻轻摇动培养皿，确保农杆菌接触到叶盘边缘，浸泡10分钟；

●将已侵染的烟草叶盘从农杆菌悬浮液中转移至干燥的无菌滤纸上，吸干菌液直至烟草叶盘不滴菌液为止；

●将烟草叶盘接种到RMOP固体培养基(具体配方见表10)上，叶面朝上，每皿约10块；

●倒置培养皿，28℃暗培养3天。

5.筛选：

●将步骤4的叶圆盘转移到RMOP-TCH培养基(10mg/L Hyg)(具体配方见表11)上，每皿10块，叶面朝上，28℃光照培养2周；

●每2周继代一次，大约4周出现丛生芽。

6.生根：

●当再生芽长至约1-2cm时，切下芽接种到MST-TCH培养基(10mg/L Hyg)(具体配方见表12)，每瓶1株烟草苗；

●28℃光照培养室培养2周；

除去幼苗基部的小叶子，转移到新鲜的MST-TCH培养基(10mg/L Hyg)，每瓶1株烟草苗，培养2周。之后分别取叶片和根进行GUS染色实验，GUS染色液的配方和方法同水稻。

GUS染色液的配方(1ml)：610μl 0.2M Na₂HPO₄溶液(pH＝7.0)；390μl 0.2M NaH₂PO₄溶液和10μl 0.1M X-gluc。

●将转基因烟草的根、叶和对照烟草(没有转入目的基因的空载体)的根、叶分别浸泡在GUS染色液中，37℃保温至出现蓝色，(图6和7)。结果如图6、7所示，以重组根癌农杆菌EHA105-P534介导转化的烟草的根、叶(图6、7右)经染色后呈现蓝色，对照烟草的根、叶(作为对照，图6、7左)经GUS染色后颜色未发生变化。

●本发明实施例中所使用的相关培养基如下：

用双蒸水配制以下培养基，其中所称的“常规灭菌”是指如下条件的灭菌：121℃下蒸气灭菌20分钟；用1N氢氧化钾或1N盐酸调节pH值。

表2-YM固体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)(每L)：

表3-N6D培养基(每L)：

N₆macro母液(20×)：硝酸钾56.60g，磷酸二氢钾8.00g，硫酸铵9.26g，硫酸镁3.70g，氯化钙3.32g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用；

N₆micro母液(1000×)：碘化钾0.80g，硼酸1.60g，硫酸锰3.33g，硫酸锌1.50g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用；

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100×)：将3.73g乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78g FeSO₄.7H₂O分别溶解，混合并用。用蒸馏水定容至1000ml，70℃温浴2小时，冷却后4℃保存不超过1个月；

N₆维生素贮存液(1000×)：维生素B₁0.10g，维生素B₆0.05g，烟酸0.05g，甘氨酸0.20g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

表4-AAM培养基(每L)：

AAM macro(10×)：2.5g七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，1.5g二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O)，1.33g二水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.2H₂O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用；

AAM micro(100×)：0.7g单水硫酸锰(MnSO₄·H₂O)，0.2g七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)，0.075g碘化钾(KI)，0.3g硼酸(H₃BO₃)，25mg二水钼酸钠(Na₂MoO₄.2H₂O)，2.5mg五水硫酸铜(CuSO₄.5H₂O)，2.5mg六水氯化钴(CoCl₂.6H₂O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用；

AAM有机(1000×)：0.75g甘氨酸(Glycine)，0.1g烟酸(Nicotinic acid)，0.1gVB₆(Pyridoxine)，1g VB₁(Thiamine)，蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用；

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100×)见表3。

表5-N6-AS培养基(每L)：

N₆macro母液(20×)、N₆micro母液(1000×)、铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100×)和N₆维生素贮存液(1000×)见表3。

表6-MS-R分化培养基(每L)：

MS macro(20×)：硝酸铵33.0g，硝酸钾38.0g，磷酸二氢钾3.4g，硫酸镁7.4g，氯化钙8.8g逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1L，4℃保存；

MS micro(1000×)：硫酸锰16.90g，硫酸锌8.60g，硼酸6.20g，碘化钾0.83g，钼酸钠0.25g，硫酸铜0.025g，氯化钴0.025g，上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1L，4℃保存；

MS维生素贮存液(1000×)：维生素B₁0.010g，维生素B₆0.050g，烟酸0.050g，甘氨酸0.200g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周；

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100×)见表3。

表7-1/2MS生根培养基(每L)：

MS macro(20×)见表6；

MS micro(1000×)和MS维生素贮存液(1000×)见表6；

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100×)见表3。

表8-MS固体培养基(每L)：

Myo-inositol(500×)：5g肌醇溶解于H₂O后，定容至100ml，4℃保存；

MS macro(20×)、MS micro(1000×)和MS维生素贮存液(1000×)见表6；

铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100×)见表3；

MS有机(1000×)：维生素B1，0.01g，维生素B6，0.05g，烟酸B1，0.05g，甘氨酸，0.2g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

表9-YM液体培养基(每L)：

YM液体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)：在冷却的YM液体培养基中加入1ml卡那霉素(Kan)(50mg/ml)、0.2ml利福平(Rif)(50mg/ml)。

表10-RMOP固体培养基(每L)：

MS Macro(20×)和MS Micro(1000×)见表6；

Fe₂EDTA贮存液(100×)见表3；

Myo-inositol(500×)见表8。

表11-RMOP-TCH培养基(10mg/L Hyg)(每L)

MS Macro(20×)和MS Micro(1000×)见表6；

Fe₂EDTA贮存液(100×)见表3；

Myo-inositol(500×)见表8。

表12-MST-TCH培养基(10mg/LHyg)(每L)：

MS Macro(20×)和MS Micro(1000×)见表6；

Fe₂EDTA贮存液(100×)见表3；

Myo-inositol(500×)见表8。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求书及其任何等同物给出。

Claims

1.一种启动子，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：

a、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列；

2.一种核酸构建体，包含权利要求1所述的启动子，以及与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。

3.一种载体，含有权利要求1的启动子或权利要求2的核酸构建体，例如含有权利要求1的启动子或权利要求2的核酸构建体的pMD18-T质粒或p8质粒。

4.一种重组细胞，含有权利要求1的启动子、权利要求2的核酸构建体或权利要求3的载体，所述重组细胞例如为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。

5.一种含有权利要求1的启动子、权利要求2的核酸构建体、权利要求3的载体或权利要求4的重组细胞的植物愈伤组织、植物外植体或植物，所述植物可以为单子叶植物或双子叶植物，优选稻属或烟草属，更优选水稻或烟草，最优选水稻日本晴或烟草NC89。

6.一组引物对，所述引物对用于扩增得到权利要求1所述的启动子，其特征在于：所述引物对的两条引物分别含有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列，优选地，所述引物对的两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基，更优选地，所述引物对的两条引物分别具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的序列。

7.制备SEQ ID NO：1所示的启动子的方法，包括：以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在水稻日本晴gDNA中的序列分别针对首尾进行设计，优选是权利要求6所述的引物对。

8.一种调控基因表达方法，所述方法包括步骤：

将权利要求1的启动子、权利要求2的核酸构建体、权利要求3的载体或权利要求4的重组细胞转化至植物(优选植物愈伤组织或植物外植体)，使所述核苷酸序列位于所述基因的5’端，所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物，优选稻属或烟草属，更优选水稻或烟草，最优选水稻日本晴或烟草NC89。

9.一种制备转基因植物的方法，包括在有效产生植物的条件下培养权利要求4的重组细胞或权利要求5的植物愈伤组织、植物外植体或植物。所述植物可以为单子叶植物或双子叶植物，优选稻属或烟草属，更优选水稻或烟草，最优选水稻日本晴或烟草NC89。

10.权利要求1的启动子、权利要求2的核酸构建体、权利要求3的载体、权利要求4的重组细胞或者权利要求5的植物愈伤组织、植物外植体或植物者用于调控植物目的基因表达和植物育种的用途，所述植物可以为单子叶植物或双子叶植物，优选稻属或烟草属，更优选水稻或烟草，最优选水稻日本晴或烟草NC89。