CN102146403B - 一种启动子BgIosP596、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种启动子BgIosP596、制备方法及应用。所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列:a、Seq ID No.1所示的核苷酸序列;b、与Seq ID No.1互补的核苷酸序列;c、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列;d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列;e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。本发明启动子能够在单子叶和双子叶植物中调控基因表达,从而为研究植物中目的基因的表达提供了一种新的工具和选择。

Description

—种启动子BglosP596、制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域,特别是涉及一种启动子BgIosP596,含有该启动子的核酸构建体、载体、重组细胞、植物愈伤组织,该启动子的制备方法以及利用该启动子来调控植物中基因表达的方法。

背景技术

[0002]启动子是基因的一个组成部分,通常位于结构基因5’端上游,是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合,活化RNA聚合酶,启动基因转录,从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转基因植物中,启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一,选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。

[0003] 根据启动子的转录模式可将其分为3类:组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下,不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异,因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子。另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus)中分离的。

[0004] 人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV 35S启动子,可以更有效 地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶P亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子,用其代替CaMV 35S启动子,在转基因烟草中也取得了很好的表达效果(Plant biotechnology, 2002,19 (I) :19-26)。

[0005] 单子叶植物基因中常见的启动子有:Ubi启动子(Plant ubiquitin promoter) >Actin 启动子(Plant Actin promoter)和 Adh-1 启动子(Maize alcohol dehydrogenase Ipromoter)。

[0006] Ubi启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目前,已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列,包括玉米基因组中的Ubi-I启动子、水稻泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素UbBl启动子、烟草泛素Ubi. U4启动子、马铃薯泛素Ubi7启动子、番茄泛素Ubil-I启动子,大麦泛素Mubl启动子。玉米泛素Ubi-I启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中,水稻泛素RUBQ2启动子在水稻和甘蔗中也有较多的应用。

[0007] Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现,属于强组成型启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著,但是邻近科属的植物中的基因调控功能却十分不理想。因此,许多相关研究通过其他单子叶植物寻找Actin启动子,并成功在香蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续发现。Actin启动子由于对基因表达的强调控作用,在单子叶植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。

[0008] Adh-I启动子调控乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)基因,对植物在缺氧环境下乙醇脱氢酶的表达至关重要。Adh-I启动子对单子叶植物特别是谷类植物如水稻、燕麦和大麦,和少部分双子叶植物如烟草,基因的调控功能比花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子提高10-50倍。Adh-I启动子主要应用于单子叶植物,对绝大部分双子叶植物基因表达的调控效果都很有限。

[0009] 单子叶植物是被子植物的主要类群,单子叶植物中的禾本科、百合科、棕榈科和天南星等,是非常重要的农业作物。单子叶植物基因的强效启动子,能够调控植物高效率表达具有特殊性状的外源基因,对优良作物的分子育种研究意义重大。

[0010] 在强效启动子相关研究领域,发现并验证了许多单子叶植物的启动子。此外,双子叶植物中的一些强效启动子如CsVMV启动子、番茄E8启动子、白藜芦醇合酶基因Vstl启动子等高效启动子,在单子叶植物中也有很强的基因调控作用。

发明内容

[0011] 本发明的目的是提供一种新的启动子,能够在植物中调控基因的表达。

[0012] 本发明的另一目的在于提供含有上述启动子的核酸构建体、载体、重组细胞、植物愈伤组织、植物外植体及植物。

[0013] 本发明的再一目的在于提供一种制备上述启动子的引物、方法,以及一种利用该启动子来调控植物中基因表达的方法。

[0014] 本发明的再一目的在于提供一种制备转基因植物的方法,以及上述启动子在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途。

[0015] 为实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:

[0016] 本发明公开了一种启动子,所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列:

[0017] a、Seq ID No. I所示的核苷酸序列;

[0018] b、与Seq ID No. I互补的核苷酸序列;

[0019] C、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列;

[0020] d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列;

[0021] e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。

[0022] 本发明还公开了一种核酸构建体,包含上述启动子,以及与启动子可操作连接的基因序列,其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。

[0023] 本发明还公开了一种载体,所述载体含有上述启动子或上述核酸构建体,优选的,所述载体为上述启动子与PMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体。

[0024] 本发明进一步公开了一种重组细胞,所述细胞含有上述启动子、上述核酸构建体或上述载体,优选的,所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。

[0025] 本发明进一步公开了含有上述启动子、核酸构建体、载体或重组细胞的植物愈伤组织、植物外植体或植物,优选的,所述植物为单子叶植物或双子叶植物,再优选的,所述植物为稻属或烟草属,更优选的,所述植物为水稻或烟草,进一步优选的,所述植物为水稻日本晴或烟草NC89。

[0026] 本发明进一步公开了一组引物对,用于扩增得到上述启动子,所述引物对的两条引物分别含有Seq ID No :2和Seq ID No :3所示的序列,优选的,所述引物对的两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基,更优选的,所述引物对的两条引物分别具有Seq ID No :4和Seq ID No :5所示的序列。

[0027] 本发明还公开了制备SEQ ID No :1所示启动子的方法,包括:以水稻日本晴基因组DNA为模板,使用一对扩增引物进行扩增,所述扩增引物根据SEQ ID NO :1在水稻日本晴gDNA中的序列分别针对首尾进行设计,优选是上述的引物对。

[0028] 本发明进一步公开了一种调控植物中基因表达的方法,所述方法包括,将上述启动子、核酸构建体、载体或重组细胞导入植物细胞。优选导入植物愈伤组织。进一步优选的,启动子或核酸构建体导入植物细胞是利用农杆菌转化植物愈伤组织,所述植物优选为单子叶植物或双子叶植物,所述植物再优选为稻属或烟草属,所述植物更优选为水稻或烟草,所述植物进一步优选为水稻日本晴或烟草NC89。本发明还公开了一种制备转基因植物的方 法,包括在有效产生植物的条件下培养上述的重组细胞或植物愈伤组织或植物外植体或植物。

[0029] 本发明还公开了上述启动子、核酸构建体、载体、重组细胞或植物愈伤组织或植物外植体或植物在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途,优选植物是单子叶植物或双子叶植物,再优选的植物为稻属或烟草属,更优选植物为水稻或烟草,进一步优选植物为水稻日本晴或烟草NC89。

[0030] 由于采用了以上技术方案,使本发明具备的有益效果在于:

[0031] 本发明提供的新的启动子能够在植物中调控基因表达,并且,在单子叶植物如水稻和双子叶植物如模式植物-烟草的根和叶中均具有启动子功能,能够调控外源基因的表达,从而为研究植物(包括单子叶植物和双子叶植物)中目的基因的表达提供了一种新的工具和选择。

[0032] 保藏信息

[0033] 培养物名称:烟草NC89种子

[0034] 保藏日期:2010年11月12日

[0035] 保藏单位:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心,即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

[0036]保藏编号:CCTCC No :P201017附图说明

[0037] 图I为用于构建p8质粒的pCAMBIA-1301质粒示意图。

[0038] 图2为p8质粒示意图。

[0039] 图3为经转化的水稻愈伤组织的GUS染色结果。其中,由带有本发明所述启动子P596序列的重组根癌农杆菌P8+P596转化的水稻愈伤组织(右)经⑶S染色后呈现蓝色;不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌P8质粒的水稻愈伤组织(对照,左)经⑶S染色后颜色未发生变化。

[0040] 图4为经转化的水稻苗根的⑶S染色结果。经含有启动子的P8+P596重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根(图4右)经染色后呈现蓝色,经不含有启动子的P8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根(作为对照,图4左)经GUS染色后颜色未发生变化。

[0041] 图5A、5B和图6A、6B分别为经转化的烟草苗根和叶的⑶S染色结果,在光学显微镜放大3倍下拍摄。经含有启动子的p8+P596重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的烟草苗的根(图5B)和叶(图6B)经染色后呈现蓝色,经不含有启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的烟草苗的根(作为对照,图5A)和叶(图6A)经GUS染色后颜色未发生变化。

具体实施方式

[0042] 本发明涉及一种能够在植物中调控基因表达的启动子序列,本发明的启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列:

[0043] a、序列表中Seq ID No. I所示的核苷酸序列;

[0044] b、与Seq ID No. I互补的核苷酸序列;

[0045] C、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列;

[0046] d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列;

[0047] e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。

[0048] 在本发明一个具体的实施方式中,本发明的启动子优选具有Seq ID No. I所示的核苷酸序列,并在本发明中被称为启动子BgIosP596,或者简称为P596启动子。

[0049] 在本发明中,典型地,“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如,“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5°C (低于探针Tm 5°C )高等严紧性”发生在Tm以下约5_10°C;“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20°C ;“低严紧性”发生在Tm以下约20_25°C。作为替代,或者进一步地,杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如,6XSSC =极低严紧性;3XSSC =低至中等严紧性;1XSSC =中等严紧性;0. 5XSSC =高等严紧性。从功能上说,可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列;或采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多序列同一性的核酸序列。

[0050] 对于要求高选择性的应用,典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体,例如选择相对低的盐和/或高温条件。Sambrook等(Sambrook, J.等(1989)分子克隆,实验室手册,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N. Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

[0051] 为了便于说明,用于检测本发明的杂交的合适的中等严紧条件包括:用5XSSC、0.5% SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)溶液预洗;在50_65°C下在5XSSC中杂交过夜;随后用含0. 1% SDS的2X、0. 5X和0.2XSSC在65°C下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解,能容易地操作杂交严紧性,如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如,合适的高等严紧杂交条件包括上述条件,不同之处在于杂交温度升高到例如60-65°C或65-70°C。

[0052] 在本发明中,所述在高等严紧条件下与Seq ID No. I所示或与其互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列,其具有与Seq ID No. I所示核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

[0053] 在本发明中,所述对Seq ID No. I或与其互补的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列,是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端,和/或序列内部进行例如不超过2-45个,或者不超过3-20个,或者不超过3-20个,或者不超过4-15个,或者不超过5-10个,或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。

[0054] 在本发明中,所述对Seq ID No. I或与其互补的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列,具有与Seq ID No. I所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

[0055] 通过一种多核苷酸进行说明,其所具有的核苷酸序列例如与Seq ID No. I的参考核苷酸序列至少90% “同一性”是指:在Seq ID No. I的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中,该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达10个核苷酸的不同外,该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说,为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少90%相同的多核苷酸,参考序列中多达10%的核苷酸可以被删除或被另一核苷酸替代;或可将一些核苷酸插入参考序列中,其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的10% ;或在一些核 苷酸中,存在删除、插入和替换的组合,其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的10%。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置,或在这些末端位置之间的任意地方,它们或单独散在于参考序列的核苷酸中,或以一个或多个相邻的组存在于参考序列中。

[0056] 在本发明中,用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST2. 0 算法,它们分别描述在 Altschul 等(1977) Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和Altschul等(1990) J. Mol. Bio. 215 :403-410o采用例如文献中所述或默认参数,BlAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

[0057] 在本发明中,所述与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO :1所公开序列基本同一的多核苷酸序列,例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时,与本发明多核苷酸序列相比含有至少90%序列同一性、优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。在本发明中,所述与SEQ ID No. I或其互补的核苷酸序列具有至少90%的序列同一丨丨生的核苷酸序列具有与Seq ID No. I所不的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

[0058] 本发明还涉及一种核酸构建体,包括基因以及与该基因可操作地连接的上述启动子。在本发明中,“可操作地连接”是指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。在本发明的核酸构建体中,例如,启动子被置于所述基因的核酸序列的特定位置,例如启动子位于所述基因核酸序列的上游位置,使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导,从而,启动子区域被“可操作地连接”到该基因的核酸序列上。所述基因一般是需要提高转录水平的任何核酸序列,或者,可设计本发明所述启动子和基因以便下调特定核酸序列。也就是通过将启动子与反义方向的基因相连来实现。在本发明一个具体的实施方式中,所述基因优选为GUS基因。

[0059] 本发明还涉及一种含有上述启动子或上述核酸构建体的载体。本发明的载体可以是通过将上述启动子或上述核酸构建体插入到克隆载体或表达载体而得到的重组载体。适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于,例如:pUC18、pUC19、PUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19_T Simple Vecter 等。适于构建本发明所述重组载体的表达载体包括但不限于,例如:pMI121、pl3W4、pGEM等。在本发明具体的实施方式中,本发明含有所述启动子的载体为上述启动子与PMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体,优选的,本发明的重组载体为pMD18-T+P596重组载体或者p8+P596重组载体。

[0060] 本发明的又一方面,还涉及含有本发明所述启动子的重组细胞。本发明的重组细胞可以通过将上述含有本发明启动子的重组载体转化宿主细胞而得到。适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于,例如:大肠杆菌细胞DH5ci,根癌农杆菌细胞LBA4404、EHA105、GV3101等。在本发明一个具体的实施方式中,所述重组细胞为重组根癌农杆菌 EHA105-P596。

[0061] 本发明的再一方面,还涉及一种植物愈伤组织或植物外植体或植物,所述愈伤组织、植物外植体或植物含有有本发明的上述启动子。本发明的植物愈伤组织可以是单子叶 植物愈伤组织例如水稻愈伤组织,或者双子叶植物愈伤组织例如烟草愈伤组织。

[0062] 本发明的再一方面,还涉及用于PCR扩增得到本发明所述启动子的一组引物对,该组引物对含有序列表中Seq ID No.2及Seq No.3所示的序列。为了便于操作,通常优选在引物的5’端含设计连接有限制性酶切位点和/或保护碱基,在本发明具体的实施方式中,所述引物对的两条引物分别具有Seq ID No :4和Seq ID No :5所示的序列。

[0063] 采用上述引物,以水稻日本晴基因组DNA为模板进行PCR扩增,能够制备得到本发明的启动子。

[0064] 本发明进一步公开了一种调控植物中基因表达的方法,所述方法包括,将上述启动子导入植物细胞。优选的是通过将同时含有外源基因以及本发明启动子的核酸构建体导入植物细胞来达到调控基因表达的目的。所述核酸构建体中,外源基因与本发明的启动子可操作地连接。在本发明优选的实施方式中,可以利用含有目的外源基因与本发明启动子的重组载体转化农杆菌,再将得到的重组农杆菌转化植物愈伤组织,从而实现将所述外源基因与本发明启动子一起导入植物细胞的目的。在本发明一个具体的实施方式中,外源基因优选为GUS基因。本发明的植物可以是单子叶植物,例如水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等,也可以是双子叶植物,例如烟草,大豆,马铃薯、蚕豆、萝卜、花生等。

[0065] 烟草是典型的基因工程模式植物。故本发明选择烟草进行转基因研究,以研究本发明的启动子在双子叶植物中的效果。实验结果表明,该启动子能在转基因烟草中起作用。

[0066] 在本发明中,可采用植物基因转化技术将目的基因及所述启动子插入到植物基因组中,包括农杆菌介导转化、病毒介导转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知,农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化,但其它转化技术也可用于本发明启动子及外源基因的导入。当然,适于本发明的启动子及外源基因导入的另一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外,还可以采用的转化植物细胞的方法是原生质体转化。基因转化后,采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。

[0067] 为实现上述调控基因表达的目的,本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多拷贝的形式应用,可以与现有技术中已知的启动子联用。

[0068] 本发明的启动子以及调控植物中基因表达的方法,可以应用于植物品种的选育。如,可以用于水稻或烟草的育种。所述水稻可以为日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22、黔优88、II优416、II优107、II优128,11优718、准两优527、川农I号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207,以及津原101等。在本发明一个具体的实施方式中,所述水稻为日本晴。所述的烟草可以为K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中烟90、Cokerl76,以及CV87等。在本发明另一个具体的实施方式中,所述烟草为烟草NC89。

[0069] 本发明的启动子可成为一种新的启动子,作为植物(包括单子叶植物和双子叶植物,尤其是水稻和烟草)转基因的工具启动子,为开展低表达基因转化苗筛选、植物花器官败育等分子育种研究提供便利,从而极大地缩短优良品种的选育时间。本发明的启动子可广泛用于培育水稻、烟草、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦、大豆,马铃薯、蚕豆、萝卜、花生等。 [0070] 在本发明中,术语“单子叶植物”,具体地,可以为禾本科植物,更具体地,可以为稻属植物例如水稻,包括但不限于日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22、黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农I号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207,以及津原101等。

[0071] 在本发明中,术语“双子叶植物”,具体地,可以为茄科植物,更具体地,可以为烟草属植物(烟草),包括但不限于烟草1(326、1(346、1(394、从:82、从:89、6140、628、680、中烟90、Cokerl76,以及 CV87 等。

[0072] 下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。

[0073] 实施例I :P596启动子片段的PCR扩增和DMD18-T+P596重组载体的构津PCR扩增

[0074] 使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒,目录号:DP320-02)提取水稻日本晴(已在申请号为200910238992. O、发明名称为“一种启动子BgIosP587、其制备方法及用途”的发明申请中保藏,并于2010年9月22日公开,保藏编号为CCTCC NO :P200910)的基因组DNA,根据该启动子在水稻日本晴gDNA中的序列,分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F1,加限制性酶切位点EcoR I和保护碱基,下游引物R1,加限制性酶切位点SbfI和保护碱基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA为模板,使用高保真Ex Taq(TaKaRa, DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表I所示。

[0075] 表I基因启动子扩增的PCR体系

Figure CN102146403BD00111

[0077] PCR扩增程序为:94°C预变性5min,然后以94°C变性45s,55°C退火50s,72°C延伸 90s,进行35个反应循环,最后72°C延伸7min。

[0078]其中,上游引物Fl (SEQ ID NO :4) :GGAATTIgCCGTCCTAGCCTCTGAC丨,其中下戈Ij

线代表EcoR I酶切位点,方框内为SEQ ID No :2。

[0079]下游引物 Rl (SEQ ID NO :5) :TGCCTGCAC :|QACCACCTCCCGA.TGGTC丨,其中下戈j

线代表SbfI酶切位点,方框内为SEQ ID No :3。

[0080] PCR扩增产物经I. 0%琼脂糖凝胶电泳分离,得到大小约为950bp左右的条带,使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号:DP209_03)进行纯化回收。

[0081] PMD18-T+P596重组载体的构津

[0082] 将如上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒,TaKaRa,D103A),转化大肠杆菌,挑取阳性克隆测序,证明准确。

[0083] 其中,T/A克隆的连接条件如下:

[0084] T/A 连接体系:10 ill

[0085] pMD18-T IU I

[0086] 2*solution I 5 U I

[0087] PCR扩增产物(回收插入片段)IOng〜20ng,根据其浓度定

[0088] ddH20 补齐至 10 U I

[0089] 于16 °C在节能型智能恒温槽(宁波新芝,SDC-6)中连接8h以上,得到PMD18-T+P596重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌:

[0090] 从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版,科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞IOOiil DH5a (中国科学院昆明动物研究所董杨提供;或者可从例如:上海生工购得),冰上融化后,加入IOu I如上所得的连接产物,即pMD18-T+P596重组载体,轻轻搅匀,冰浴30min,42°C热激60s,冰浴5min,加入600 u I 4°C预冷的SOC培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社),37°C 220rpm复苏45min,8000rpm离心30s,去上清,留取150 y I,用剩下的150 y I上清重悬沉淀后的混合物,轻轻吹匀,玻璃珠涂布LB (卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社),37°C倒置培养16h〜24h。获得含有pMD18-T+P596克隆载体的重组大肠杆菌,命名为DH5 a -P596。深圳华大基因科技有限公司对pMD18_T+P596克隆载体中的P596进行测序。

[0091] 测序结果表明,获得的pMD18-T+P596克隆载体中P596启动子序列正确。P596启动子的序列如序列表中Seq ID No :1所示。

[0092] CCCGTCCTAGCCTCTGACGATCTTGACATCCTGACCAGACCAAAAGAAGAGAGAGAAGGGAGGGAGCGAAGAGGGGAGGAGCCGCTGGAGCCCTTCCTAGCTCCGGTTCACCGTCATTGCTGCCCTCTCGGCTTCTCAAGTCGCTACTGCTCCTGGAAGGTTTGAGAGGAGCCAGAGAAGGCAAATTGAACCAAAATTGATAGTTGACTAGTTGAGGGAGGCGATATACTCGGTTTTGTTATTGAGGCATGTCAATTAGATCCTGTCAATAGTCGAGGGACTCAGAATGAACTTTTTCCAACTAAAAGATTCAACTAGAATTGCCCAAATCCAAATAGGCCCATAGCCCATCATCGTCCGCGCCCCTCGCTCCCTCGCGCGGGGTGTGTTCTAGGGTTTAGGCGGTTCACCCGCTAGGCAGCAGTATATAAACTGCTCTCTTCCTCGCCGCCATCTAGGGTTTCCTCTCCGCCGCGCCGCCTCCCTCGTACCTCGTCGCGGTAAGCTGCCCTGCGCCCCGCTTCCTGTCTCCTTTCTCTCTCGTACTCGATGGTGGCGCTTGCTCCTTTCGTCTCATCCTGCCTTCTTCTCCCTCTCGCTGTGCAGGATCTGTGCTCGCACCACCGGCGGCGCCATGAGGTACGGATTTCACTTGTTCACAGTTTCTCAGTGTTCGTTCTGCCCATTCGTAGTTGCCTGACTAGGCGCCGCATTTGCCTGCGGAGCTGCGCCGCCGCGAATTGGGGGTAAAAAAAAATCTGG GGATTTAGGTAGGAAGAGCGGCCTCGGCAAATGTAGGAGCGTTGGATCTAGGCGGGTTGATTGAACTACATGCCAGATTTGGCCGGCTGCACCGCGGATTGCGGCGTTGGTCGTGGGTGTGGGGTGGTGGGAAATGATTTTCGATGCTGCATCACCTGCGGGCAACAACCATAGAAGACCATCGGGAGGTGGTC(SEQ ID NO:I)

[0093] 实施例2 :载体-D8+P596重纟目载体的构律

[0094] 按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号:DP103_03)的操作手册,从实施例I构建的转化有启动子P596的大肠杆菌DH5 a -P596中提取带有本发明P596启动子序列的克隆载体PMD18-T+P596 ;纯化后用相应的限制性内切酶KpnI和SbfI进行酶切,回收相应的启动子插入片段,并分别与P8质粒用相同的限制性内切酶酶切后回收的载体大片段进行连接。

[0095] 将所得连接产物p8+P596重组载体转化按照《分子克隆实验指南》(第三版,科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞DH5a,37°C倒置培养16〜24h,待转化子长出菌落后,挑取单克隆进行PCR检测和酶切鉴定。

[0096] p8质粒构津

[0097] 本发明中所使用的p8质粒是由pCAMBIA-1301质粒(中国科学院昆明动物研究所董杨提供;或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得,该公司的pCAMBIA-1301质粒的原始来源是 The CAMBIA Bios (biological open source) Licensee, Australia)按照如下方式改造并构建的,具体说明如下:

[0098] 用Kpn I/Nco I (NEB)双酶切质粒pCAMBIA-1301 (参见图I),回收大片段。根据所采用的限制性内切酶位点合成如下序列:GGTACCAAGCTTACTAGTCCTGCAGGTCTAGAGGATCCGTCGACCATGG(SEQ ID NO :6)(包含的酶切位点是Kpn I/HindIII/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/Sal I/Nco I),用Kpn I/Nco I双酶切后回收,与上述所回收的大片段连接后转化toplO细胞(中国科学院昆明动物研究所董杨提供;或者可从例如:北京索莱宝科技有限公司购得)。用引物 GCTTCCGGCTCGTATGITGT (SEQ ID NO :7) /GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(SEQ IDNO :8)筛选转化子,通过PCR检测方法,带有扩增片段为350bp的转化子即为含有需要构建的多克隆位点及GUS序列的p8质粒的转化子。P8质粒图谱见图2

[0099] 所述p8质粒中的多克隆位点和⑶S序列的长度2353碱基,如SEQ ID N0:9所示:

Figure CN102146403BD00131

CACCACCACCACGTGTGA (SEQ ID NO :9)

[0101] 如上序列所示本发明中所构建的p8质粒,其多克隆位点中的EcoR I/Sac I/KpnI/HindIII/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/Sal I/Nco I 限制性酶切位点分别用加框和下划线表示,筛选转化子所用的引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(即SEQ ID NO :7和8)用双下划线表示,GUS序列用斜体表示,其内含子序列分别用斜体加底纹示出。

[0102] 重鉬载体D8+P596的构律

[0103] 根据限制性内切酶KpnI和SbfI操作说明,按照如下条件处理实施例I中所得到的克隆载体PMD18-T+P596,以及如上所述构建的p8质粒。 [0104] 其中,克隆载体pMD18-T+P596及p8质粒的酶切条件如下:

[0105] 酶切体系: 50 Ul

[0106]无菌水 34. 8 ill

[0107] 10*buffer H 5 U I

[0108] KpnI 0. Iu I(IOU)

[0109] SbfI 0. Iu I(IOU)

[0110]克隆载体 pMD18-T+P596 或 p8 质粒 10 y I ( < IOOOng)

[0111] 使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号:DP209_03)分别回收经酶切的P8质粒,以及启动子P596插入片段,根据T4连接酶(TaKaRa,D2011A)操作说明,按照如下条件进行连接:

[0112] 连接体系: 10 U I

[0113] 10*T4buffer Iul

[0114] 酶切后的p8质粒 I ii I (20ng)

[0115] 回收的启动子P596插入片段 10〜20ng,根据其浓度确定

[0116] 无菌水补齐至 9. 5 ill

[0117] T4 ligase (TaKaRa,D2011A) 0. 5 U I

[0118] T4 buffer冰上融化,酶切后的p8质粒载体加入量约20ng,本发明中的P596片段加10ng。于16°C在节能型智能恒温槽(宁波新芝,SDC-6)中连接8h以上。

[0119] 将100 U I氯化钙法制得的感受态细胞DH5 a从超低温冰箱取出,冰上融化后,力口A IOu I上面的连接产物,轻轻搅匀,冰浴30min,42°C热激60s,冰浴5min,加入600iil4°C预冷的S0C, 37度220rpm复苏45min, 8000rpm离心30s,去上清,留取150 y I,轻轻吹勻,玻璃珠涂布LB (kan),37°C倒置培养16〜24h。得到重组载体p8+P596。

[0120] 分别以Fl (即SEQ ID NO :4)和Rl (即SEQ ID NO :5)为引物对所得重组载体P8+P596进行PCR检测,以确证所得重组载体p8+P596中含有所需启动子P596。通过KpnI和SbfI酶切筛选含有重组载体p8+P596转化子。

[0121] 实施例3重组根癌农杆菌EHA105-P596细胞的制备

[0122] 将如实施例2所述方法构建的p8+P596重组载体和作为对照的p8质粒分别转化按照《分子克隆实验指南》(第三版,科学出版社)中所述氯化钙方法制备的根癌农杆菌EHA105(已在申请号为200910238992. O、发明名称为“一种启动子BgIosP587、其制备方法及用途”的发明申请中保藏,并于2010年9月22日公开,保藏编号为CCTCC NO :M 209315)的感受态细胞,具体方法如下:

[0123] 将根癌农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出,至于冰上解冻。融化后,分别加入5 ill的p8+P596重组载体和p8质粒以及作为对照的p8空载体,轻轻混匀,冰浴lOmin,放入液氮中冷冻5min,37°C解冻5min,加入800 yl常温的LB液体培养基,28°C 160rpm复苏3h,8000rpm离心30s,吸去上清,留下200 吹匀,涂布于加有kan-rif (卡那霉素-利福平)双抗的YM培养基平板上(50mg/lKan,IOmg/1 Rif,具体配方参见下文说明)。28°C倒置培养2-3天。

[0124] 以Fl (即SEQ ID NO :4)和Rl (即SEQ ID NO :5)为引物进行PCR检测和通过EcoRI/SbfI酶切筛选转化子。

[0125] PCR扩增出约950bp左右条带和酶切出约950bp左右条带的为重组载体p8+P596的重组根癌农杆菌。

[0126] 本发明中,按照如上述方法得到的带有重组载体P8+P596的重组农杆菌,命名为重组根癌农杆菌EHA105-P596。

[0127] 按照本发明所述方法,得到的带有p8质粒的对照重组农杆菌,命名为重组根癌农杆菌 EHA105-p8。

[0128] 实施例4 :水稻愈伤组织的诱导和转化 [0129] 按照如下步骤诱导水稻愈伤组织,并分别用重组根癌农杆菌EHA105-P596和重组根癌农杆菌EHA105-p8转化所述愈伤组织。

[0130] I)将水稻日本晴种子去壳,70%乙醇表面消毒30s,然后用有效氯I. 5%的次氯酸钠消毒30min,期间剧烈摇动,消毒后用灭菌水清洗5次;将消毒后的种子置于N6D培养基(具体配方参见下文说明)上,用封口膜封口 ;29.5°C光照培养3〜4周;

[0131] 2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色,干燥,直径I〜3mm),在新N6D培养基上29. 5°C光照培养3天;

[0132] 3)分别挑取如实施例3所构建的重组根癌农杆菌单菌落(重组根癌农杆菌EHA105-P596或重组根癌农杆菌EHA105_p8),于添加抗生素(50mg/l Kan, I Omg/1 Rif)的YM培养基(具体配方参见下文说明)上划线培养3天,培养温度28°C ;分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了 30 ii I IOOmM的AS (Acetosyringone,乙酰丁香酮)的30ml AAM培养基(具体配方参见下文说明)中,温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞(重组根癌农杆菌EHA105-P596或重组根癌农杆菌EHA105_p8);

[0133] 4)将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中;将如步骤3制备的重组根癌农杆菌悬液倒入培养皿中,将愈伤组织浸入其中15min ;

[0134] 5)倒掉重组根癌农杆菌悬液,将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体;于N6-AS培养基(配方参见下文说明)上放一张灭菌滤纸,加Iml如上述含AS的AAM培养基,将愈伤组织转移至滤纸上;密封培养皿,28°C暗培养48〜60h ;

[0135] 6)将受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中,用灭菌水摇动清洗,直至上清液变澄清;将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌水中以杀死重组根癌农杆菌;用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分,然后将其转移至含lmg/1潮霉素B (HmB)和50mg/l Carb的N6-AS培养基上;用封口膜密封培养皿,29. 5°C光照培养3〜4周。

[0136] 实施例5 :水稻愈伤组织中的⑶S的表汰[0137] 为检测经过实施例4所述转化的水稻愈伤组织中目的基因⑶S的表达情况,按照Chen S Y 等在 Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50 (6) :742-751 所述的方法,对分别用重组根癌农杆菌EHA105-P596或重组农杆菌EHA105_p8转化的水稻愈伤组织进行染色。

[0138] GUS 染色液的配方(Iml) :610 U I 0. 2M Na2HPO4 溶液(pH = 7. 0) ;390 U I 0. 2MNaH2PO4 溶液和 IOu I 0. IM X-gluc。

[0139] 将分别用重组根癌农杆菌EHA105-P596或重组根癌农杆菌EHA105_p8转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中,37°C保温至出现蓝色,拍照,结果如图3所示,经含有启动子的p8+P596重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(图3右)经染色后呈现蓝色,经不含有启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(作为对照,图3左)经⑶S染色后颜色未发生变化。结果显示,本发明的P596启动子对⑶S基因表达具有调控作用。

[0140] 实施例6 :转基因水稻苗中GUS的表达

[0141] 将实施例4中得到的愈伤组织转移至含50mg/l潮霉素B (HmB)的MS-R分化培养基(具体配方见表2)分化苗;用封口膜密封培养皿,29. 5°C光照培养3-4周;待幼苗长至3-4cm时转移到含50mg/l潮霉素B (HmB)的1/2MS生根培养基(具体配方参见表3)进行生根筛选。

[0142] 转基因水稻苗的GUS染色过程同实施例5中愈伤组织的染色过程。结果如图4所示,经含有启动子的P8+P596重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根(图4右)和叶经染色后呈现蓝色,经不含有启动子的P8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根(作为对照,图4左)和叶经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示,本发明的P596启动子对⑶S基因表达具有调控作用。

[0143] 实施例7 :转基因烟草小苗中⑶S表汰

[0144] I.烟草无菌苗获得:

[0145] •烟草种子浸泡:将烟草NC89种子(2010年11月12日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心,即中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC No :P201017)装入I. 5ml的离心管中(< 50粒/管),加入Iml无菌水,用移液器吸打几次,更换无菌水后,在常温下浸泡24小时;

[0146] •烟草种子消毒:用移液器吸出浸泡种子的水,加入Iml 75%的酒精浸泡30秒,用移液器吸出酒精;加入Iml 10% H2O2浸泡10分钟后,用移液器吸出H2O2 ;

[0147] •洗涤:用无菌水清洗五次,每次加入Iml无菌水摇动Imin ;

[0148] •接种:无菌滤纸吸干种子表面的水分,再用吸头或无菌牙签接种于MS固体培养基(配方参见表4)上萌发,每皿约10粒,置于28°C光照培养室(16h光/8h暗)培养一周,光照强度为20001x(本实验所有的光照培养材料均在此光照强度下培养);

[0149] 籲转接:待长出幼苗后,转入新鲜MS固体培养基,每瓶(06cm,H 9cm,30ml培养基/瓶)3株烟草小苗,28°C光照培养室(16h光/8h暗)培养约5周,获得烟草无菌苗。

[0150] 2.烟草无菌苗的继代和扩繁

[0151] •剪去烟草无菌苗的叶片和根,将茎杆剪成带有腋芽的茎段(2cm-3cm),然后将其形态学下端垂直插入到新鲜MS固体培养基(腋芽不能插入培养基里);[0152] •每瓶接种一个带有腋芽的茎段外植体,置于28°C光照培养室培养约5周,作为待转化材料使用。

[0153] 3.侵染前菌液的制备:

[0154] •挑取含潮霉素抗性目的质粒的农杆菌菌株EHA105单菌落(实施例3所得的重组根癌农杆菌EHA105-P596或重组根癌农杆菌EHA105-p8),接种到IOml YM (含Kan 50mg/L,Rif 30mg/L)液体培养基,28°C,250rpm振荡过夜,待菌液混浊,还未出现沉淀时,将此菌液置4°C保存;

[0155] •取保存于 4°C 的菌液 20 ii I,接种于 IOml YM(含 Kan 50mg/L,Rif 30mg/L)液体培养基于50ml离心管中28°C,250rpm振荡过夜,待菌液混浊,未出现沉淀时,停止培养;

[0156] •取上述菌液3ml加入到50mlYM(不含抗生素)液体培养于三角瓶中28 °C,250rpm摇床震荡培养约2h,OD600 = 0 . 5左右时,作为侵染菌液使用。

[0157] 4.侵染:

[0158] •从培养5周的烟草无菌苗上剪取较大的叶片,保存在一个装有YM (不含抗生素)液体培养基的培养皿中;

[0159] •用直径6mm的打孔机将烟草叶片打成叶圆盘,保存在另一个装有YM(不含抗生素)液体培养基的培养皿中;

[0160] •将烟草叶圆盘转移到装有侵染菌液的培养皿中;

[0161] •轻轻摇动培养皿,确保农杆菌接触到叶盘边缘,浸泡IOmin ;

[0162] •将已侵染的烟草叶盘从农杆菌悬浮液中转移至干燥的无菌滤纸上,吸干菌液直至烟草叶盘不滴菌液为止;

[0163] •将烟草叶盘接种到RMOP固体培养基(配方见表5)上,叶面朝上,每皿约10块;

[0164] •倒置培养皿,28°C暗培养3天。

[0165] 5.筛选:

[0166] •将步骤4的叶圆盘转移到RMOP-TCH(IOmg/L Hyg)培养基(配方参见表6)上,每皿10块,叶面朝上,28°C光照培养2周;

[0167] •每2周继代一次,大约4周出现丛生芽。

[0168] 6•生根:

[0169] •当再生芽长至约l-2cm时,切下芽接种到MST-TCH(10mg/L Hyg)培养基(配方参见表7),每瓶I株烟草苗;

[0170] • 28°C光照培养室培养2周;

[0171] 除去幼苗基部的小叶子,转移到新鲜的MST-TCH培养基,每瓶I株烟草苗,培养2周。之后分别取叶片和根进行GUS染色实验,GUS染色液的配方和方法同水稻。

[0172]⑶S 染色液的配方(Iml) :610u I 0. 2M Na2HP04 溶液(pH = 7. 0) ;390u I0. 2MNaH2P04 溶液和 IOu I 0. IM X-gluc。

[0173] 将转基因和对照(没有转入目的基因的空载体)分别浸泡在⑶S染色液中,37°C保温至出现蓝色,拍照记录,结果如图5A、5B和6A、6B所示。经含有启动子的p8+P596重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的烟草苗的根(图5B)和叶(图6B)经染色后呈现蓝色,经不含有启动子的P8质粒重组根癌农杆菌介导转化的烟草苗的根(作为对照,图5A)和叶(图6A)经⑶S染色后颜色未发生变化。[0174] 本发明实施例中所使用的相关培养基配方说明如下:

[0175] 以下有关培养基中所称的“常规灭菌”是指如下条件的灭菌:121°C下蒸气灭菌20分钟。

[0176] N6D培养基、YM液体培养基、YM固体培养基、AAM培养基及N6-AS共培养基参见中

国专利申请《一种启动子BgIosP587、其制备方法及用途》(申请号200910238992. 0,公布号

CN101838647A)说明书中表2至表6。

[0177] 表2MS-R分化培养基:

[0178]

Figure CN102146403BD00181

[0179] 调PH值至5. 8,常规方式灭菌。

[0180]注:MS macro (20X):硝酸铵 33. Og,硝酸钾 38. Og,磷酸二氢钾 3. 4g,硫酸镁 7. 4g,

氯化钙8. Sg逐一溶解,然后室温下用蒸馏水定容至1L,4°C保存。

[0181] MS micro (1000X):硫酸锰 16. 90g,硫酸锌 8. 60g,硼酸 6. 20g,碘化钾 0. 83g,钥酸

钠0. 25g,硫酸铜0. 025g,氯化钴0. 025g,上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1L,4°C保存。

[0182] MS维生素贮存液(1000X):维生素B1 0.010g,维生素B6 0. 050g,烟酸0. 050g,甘

氨酸0. 200g,加蒸馏水定容至100ml,过滤除菌,4°C保存不超过I周。

[0183] 铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):见中国专利申请CN101838647A说明书中表2。

[0184] 表31/2MS生根培养基

Figure CN102146403BD00191

[0186] 常规灭菌后加入

MS 维生素(1000X)过滤除菌 0.5 ml 0.25 ml I ml 潮霉素(50mg/ml)_I ml 0. 5 ml_2 ml

[0187]调 PH 值至 5. 8。

[0188]注:MS macro (20X)见表 2。

[0189] MS micro (IOOOX)MS 维生素贮存液(1000X)见表 2。

[0190] 铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):见中国专利申请CN101838647A说明书中表2。表4MS固体培养基:

Figure CN102146403BD00192

[0192] pH 5. 8121°C 下灭菌 20 分钟

[0193]注:MS macro (20X)见表 2。

[0194] MS micro (IOOOX)MS 维生素贮存液(1000X)见表 2。

[0195] 铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):见中国专利申请CN101838647A说明书中表2。

[0196] MS 有机(IOOOx):维生素 Bl,0.01g,维生素 B6,0.05g,烟酸 Bl,0.05g,甘氨酸,

0. 2g,加蒸馏水定容至100ml,过滤除菌,4°C保存不超过I周。

[0197] Myo-inositol (500x) :5g 肌醇溶解于 H20 后,定容至 100ml,4°C保存。

[0198] 表5RM0P固体培养基:

Figure CN102146403BD00201

[0201] pH 5.8121°C 下灭菌 20 分钟

[0202]注:MS macro (20X)见表 2。

[0203] MS micro (IOOOX)MS 维生素贮存液(1000X)见表 2。

[0204] 铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):见中国专利申请CN101838647A说明书中表2。

[0205]表 6RM0P-TCH 培养基

Figure CN102146403BD00202

[0207] pH 5.8121°C 下灭菌 20 分钟

[0208]注:MS macro (20X)见表 2。[0209] MS micro (IOOOX)MS 维生素贮存液(1000X)见表 2。

[0210] 铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):见中国专利申请CN101838647A说明书中表2。

[0211] Myo-inositol (500x):见表 5。

[0212]表 7MST-TCH 培养基:

Figure CN102146403BD00211

[0213] 蔗糖 30g 琼脂粉 8g 115°C灭菌15min后加入:

Claforan (头孢噻I亏钠)(250 mg/ml) Iml

潮霉素(50 mg/ml)_0. 2ml_

[0214] pH5.8

[0215]注:MS macro (20X)见表 2。

[0216] MS micro (IOOOX)MS 维生素贮存液(1000X)见表 2。

[0217] 铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X):见中国专利申请CN101838647A说明书中表2。

[0218] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (22)

1. 一种启动子,所述启动子为Seq ID No. I所示的核苷酸序列,或与Seq ID No. I互补的核苷酸序列。
2. —种核酸构建体,包含权利要求I所述的启动子,与启动子可操作连接的基因序列,其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。
3. 一种载体,其特征在于:所述载体含有权利要求I所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体。
4.权利要求3的载体,其特征在于,所述载体为权利要求I所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体与PMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体。
5. 一种重组细胞,其特征在于:所述细胞含有权利要求I所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3或4所述的载体,所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。
6. 一组引物对,所述引物对用于扩增得到权利要求I所述的启动子,其特征在于:所述引物对的两条引物分别为Seq ID No :2和Seq ID No :3所示的序列。
7. —组引物对,所述引物对用于扩增得到权利要求I所述的启动子,其特征在于,所述引物对的两条引物在Seq ID No :2和Seq ID No :3所示序列的5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。
8.权利要求7所述的引物对,其特征在于,所述引物对的两条引物分别为Seq ID No:4和Seq ID No : 5所不的序列。
9.制备SEQ ID NO :1所示的启动子的方法,包括 以水稻日本晴基因组DNA为模板,使用一对扩增引物进行扩增,所述扩增引物根据SEQID NO :1在水稻日本晴基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计。
10.权利要求9所述的方法,其特征在于,所述扩增引物对是权利要求6-8任一所述的引物对。
11. 一种调控植物中基因表达的方法,所述方法包括,将权利要求I所述的启动子或权利要求2的核酸构建体或权利要求3或4的载体或权利要求5的重组细胞导入植物。
12.权利要求11的方法,其特征在于,所述的导入植物为导入植物愈伤组织。
13.权利要求11的方法,其特征在于,所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
14.权利要求13的方法,其特征在于,所述植物为稻属或烟草属。
15.权利要求14的方法,其特征在于,所述植物为水稻或烟草,
16.权利要求15的方法,其特征在于,所述植物为水稻日本晴或烟草NC89。
17. 一种制备转基因植物的方法,包括在有效产生植物的条件下培养含有权利要求I的启动子或权利要求2的核酸构建体或权利要求3或4的载体或权利要求5的重组细胞的植物愈伤组织或植物外植体或植物。
18.权利要求I所述的启动子、或权利要求2的核酸构建体、或者权利要求3或4的载体、或权利要求5的重组细胞、或含有权利要求I的启动子或权利要求2的核酸构建体或权利要求3或4的载体或权利要求5的重组细胞的植物愈伤组织或植物外植体或植物在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途。
19.权利要求18的用途,其特征在于,所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
20.权利要求19的用途,其特征在于,所述植物为稻属或烟草属。
21.权利要求20的用途,其特征在于,所述植物为水稻或烟草。
22.权利要求21的用途,其特征在于,所述植物为水稻日本晴或烟草NC89。
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