CN1630723A - 树木的遗传转化方法 - Google Patents

树木的遗传转化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1630723A
CN1630723A CNA018176240A CN01817624A CN1630723A CN 1630723 A CN1630723 A CN 1630723A CN A018176240 A CNA018176240 A CN A018176240A CN 01817624 A CN01817624 A CN 01817624A CN 1630723 A CN1630723 A CN 1630723A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plantlet
seed
days
plant
trees
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA018176240A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100379864C (zh
Inventor
M·T·V·拉巴特
C·A·拉巴特
E·R·冈萨雷斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidade de Sao Paulo USP
Original Assignee
Suzano Papel e Celulose SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzano Papel e Celulose SA filed Critical Suzano Papel e Celulose SA
Publication of CN1630723A publication Critical patent/CN1630723A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100379864C publication Critical patent/CN100379864C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及通过将目的外源基因转入树木的细胞以转化和获取转化树木的方法。本发明尤其针对桉属树木(Eucalyptus spp.)。本方法使用除菌的种子，将其与含转化质粒及任何目的基因的土壤杆菌细胞共培养。本转化法运用超声波处理法提高细菌穿透种子表皮和胚胎组织的效率。

Description

树木的遗传转化方法
                             发明领域
本发明涉及通过将目的外源基因转入树木的细胞以转化和获取树木的方法。本发明尤其针对桉属树木(Eucalyptus spp.)。本发明也涉及这种转化的植物的用途
本方法使用灭菌的种子，将其与含转化质粒及任何目的基因的土壤杆菌细胞共培养。本转化技术中运用超声波处理以提高细菌穿透种子表皮和胚胎组织的效率。
该用于树木，尤其是桉树的遗传转化方法属于突变或遗传工程范围的化学技术领域。
                             发明背景
众所周知，桉树广泛种植于亚洲、南美洲和欧洲的一些地区，尤其是地中海区域。这种类型的树木在纤维素工业的应用中在很多方面优于其它林木种，例如快速生长，收获后多发芽再生和能够在瘠土上生长。许多国家的多个公共和私人研究组织已经试图对桉树进行遗传转化。然而只有很少的报告表明在不同的桉树种中获得了稳定的基因转化。
Serrano等在“Genetic transformation of Eucalyptus globulesthrough biollistics：complementary development procedure fororganogenesis form zygotic embryos and stable transformation ofcorresponding proliferation tissue”(J.Exp.Botany，1996，第47(295)卷，第285-290页)一文中公开了一种粒子轰击(即基因枪)的方法。该方法将含有编码β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)蛋白的uidA基因的DNA分子打入到蓝桉(Eucalyptus globulus)的合子胚中。轰击后两个月，获得呈现GUS阳性反应的愈伤组织。尽管Southern印迹杂交实验表明tDNA已整合到基因组中，但是却不能再生出植株。
Moralejo等在“Generation of transgenic Eucalyptus globulesplantlets through Agrobacterium tumefaciens mediatedtransformation”(J.Plant Physiol.，1998，第25卷，第297-312页)一文中用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转化法获取转基因蓝桉。该方法将根瘤土壤杆菌与经粒子轰击而受损的小植株(plantlet)共培养，以进行感染。然而用该方法获取转基因植株的效率很低，大约在1％左右。
Mullins等在“Regeneration and trasformation of Eucalyptuscamaldulensis”(Plant Cell Reports，1997，第16卷，第787-791页)中以根瘤土壤杆菌介导的基因转化系统从叶外植体再生芽中获取再生植株及赤桉(Eucalyptus camaldulensis)克隆的转化。
Ho等在“Agrobacterium tumefaciens mediated transformation ofEucalyptus camaldulensis and production of transgenic plants”(PlantCell Rep.，1998，第17卷，第675-680页)一文中也描述赤桉的转化和再生方法。该方法利用根瘤土壤杆菌介导的基因转化系统转化下胚轴。上述这些例子都是将外源基因转化到桉树中，而低转化率则是限制大规模使用这些方法的主要因素。
目前，可以使用多种方法来优化根瘤土壤杆菌介导的桉树转化系统的效率。最近开发了一种新的转化系统。该系统利用超声波和超声处理来提高土壤杆菌在目标组织中的穿透率，以提高整体转化效率。这种方法被称为SAAT(“Sonication Assisted AgrobacteriumTransformation”(超声处理协助的土壤杆菌转化)已被广泛用于提高大豆、豌豆、小麦和玉米中基因转化效率(Trick和Finer，“SAATSonication assisted Agrobacterium mediated transformation”，Transg.Res.，1997，第6卷，第329-336页。“Sonicated assisted Agrobacteriummediated transformation of soybean[Glycine max(L.)Merrill]embryogenic suspension culture tissue”Plant Cell Rep.，1998，第17卷，第482-488页，Santar ém et al.，“Sonication assisted Agrobacteriummediated transformation of soybean immature cotyledons：optimization of transient expression”，Plant Cell Rep.，1998，第17卷，第752-759页
在植物组织中，运用超声波诱导声学空洞所制造的微观创伤形成组织通道，有助于土壤杆菌接触暴露的内部组织。(Joersbo和Brunstedt，“Sonication：A new method for gene transfer to plants”，Physiol.Plant.1992，第85卷，第230-234页)，从而提高tDNA瞬时表达水平。桉树中大部分可用于基因转化的组织是子叶、下胚轴、未成熟的胚以及从不同组织中获取的愈伤组织。
另一个众所周知的方法是基因枪法。该方法由发射表面裹有DNA的金或铂微粒构成。发射物携带DNA穿过细胞壁和细胞膜。该装置利用一个类似于压力枪的装置来发射微粒，而其中压力由惰性气体产生。这个方法被广泛用于植物和动物的遗传转化。
仍旧和该问题有关，作为一种化学分析过程，超声波产生系统可以用于准备样品。因为其可以提取化学物质，也可以溶解固体样品。将超声波运用于此过程的基础与将声学场运用在物质中介上而产生的振动波有关。此振动波可以增加溶剂和溶质表面的相互作用，从而增加溶剂中被研究物质的浓度。超声波产生的振动缩小了位于暴露的介质中固体表面周围的浓度梯度，并且使将固体表面的盐和氧传送到介质中成为可能。然而当使用超声波探针时，磁力搅拌器的协同作用就不应被忽视。因为只有含有探针的一小部分溶液将会被赋予由该处理器产生的高强度，而剧烈的搅拌作用则为整体溶液提供了相同的水平的相互作用。
超声波处理法用超声波破碎细胞，进而允许基因导入以实现最终的遗传转化。使用超声波的目的在于提高转化效率，因为其能造成组织创伤，将组织中的酚类化合物释放出来，从而提高这些区域对细菌的吸引力并有助于基因转化。
先前所使用的桉树转化的基因枪法没有包括利用GUS再生筛选最终植株的方法。
以低效率利用土壤杆菌转化赤桉而最终再生的例子也被报道过。
08/22/1996的专利申请WO 9625504描述了利用嵌入稳定的目的基因以获取转基因植物的方法。该方法用土壤杆菌介导将DNA转化入桉树的细胞和组织中，而后在遗传霉素(GA18)存在下以苯基脲衍生物诱导愈伤组织形成。该方法用于转化由成熟桉树直接或间接衍生的克隆。
                        发明简述
由于所有已知方法的局限性，使得这些方法在将外源基因转入桉树的大规模应用中受到限制。因而我们对本方法进行了研究和发展，并最终获得了一个遗传转化树木，尤其是桉属树木的方法。该方法是是该产业领域内的全新技术，出人预料的推动了树木，尤其是桉属树木的遗传转化。
为实现这个目的，该树木，尤其是桉属树木的遗传转化方法有着一个主要的和未公开的技术特征，即通过树木尤其是桉属树木的种子进行遗传转化，从而可能大大提高这一过程的转化效率。
                          附图简述
从所附略图中本领域技术人员可以清楚看到本发明的这些和其他一些的目的。
-图1显示发芽2天的种子(A to C)和15天的小植株中GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)基因的表达；
-图2显示在苯基脲(溶液1)的处理下，由下胚轴、子叶和叶子再生成的外植体：(A)芽的产生，和(B)芽的伸长。
定义
如在此所用，不限制本发明的范围并且除非特别指明，下列词语的定义如下：
-下胚轴：子叶下的一小段植物茎。
-子叶：储有或不储有营养物质的胚胎叶。
-叶子：代表茎的片层延伸的测生器官。
-种子：由胚珠受精后发育而来的器官。
-小植株：小的带根的茎或发芽的胚胎。
-愈伤组织：高等植物中的未分化细胞群，可由人工培养细胞形成，也可由创伤或侵染反应而自然形成。
-标记基因：其效应能够在生物体中观测到的基因。
-β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)：编码酶的标记基因
-Col或聚集区或过渡区：根茎之间的很小的中间部分。它是分类学上的重要区域，因为疏导组织在此逐步重组，从辐射维管束变为外韧维管束、双韧维管束或中心维管束。
-t-Student测试：参(变)量假设测试，用于测试一个给定结果是否在统计学上显著。
-外植体：用于起始体外培养的器官或部分植物组织。
-生长素：一类能够引起细胞伸长、顶端优势、根的发生(生根)等多种生里现象的植物激素。吲哚乙酸就是一种组织培养常用的生长素。
-MS培养基：Murashige和Skoog，“A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”，Physiol.Plantarum，1962，第15卷，第473-497页。
-MSW：由MS培养基中的大量和微量营养元素，和White培养基中的维生素组成的培养基。“A handbook of plant tissue culture”，Lancaster，1943；
MS+BAP：请参见Machado等，“Agrobacterium stain specificityand shooty tumor formation in eucalyptus(E.grandis x E.urophylla)”，Plant Cell Rep.，1997，第16卷，第299-303页。
-MM：增殖(multiplication medium)培养基
-MA：伸长(Elongation)培养基
-ME：生根培养基
-A培养基，B培养基，C培养基：请参见Serrano等，“Genetictransformation of Eucalyptus globulus through biollistic：complementary development of procedures for organogenesis formzygoteic embryos and stable transformation of correspondingproliferation tissue”，J.Exp.Botany，1996，第45卷，第295页。
-G：请参见Goncalves等，“Reversion to juvenility and cloningof Eucalyptus urophylla S.T.，Blake in cell in tissue culture systems”，Symposium IUFRO em melhoramento genético e productividade deespécies florestais de rápido crescimento，巴西，1980，第25-30页。
                            发明详述
本发明涉及利用种子为转化途径，将任何目的基因转入树木，尤其是桉属树木中的方法。
依照本发明，一般说来，用刚刚开始发芽的时候的种子进行转化实验，这时子叶的叶(cotyledonary leaves)中会发生激烈的细胞分裂活动，因而有助于土壤杆菌的侵入。小植株一旦产生，就将其切掉。而后由子叶产生出新的愈伤组织。向培养基中加入抗生素、除草剂和其他化学物质筛选再生的转化植株。
本发明方法涉及基因，即所有目的基因的遗传转化。植物的最终特征取决于所转入的基因。以下提及的例子不限制本发明范围。
-抗除草剂基因能够最终赋予其所转入的植物对给定除草剂的抗性。
-编码具有抑制蛋白酶功能的蛋白基因能够最终赋予所转入的植物对给定昆虫的抵抗性。
最终产品的描述可以仅取决于目的基因的特征。而可将改变目的植物表型特征的基因转入到该植物中。
被引入的特征可能自然存在或不自然存在于植物中。一个用于验证本发明方法的实验表明，将豌豆中的Lhcb1*2基因转入烟草中，会导致烟草生物量的增加。本发明方法的有效性和适用性在一个使用树木，例如本申请的目标-桉属树木的实验中得到了确证。
因此我们研究发展了一个运用超声波处理和土壤杆菌介导相结合的方法，用以转化树木，尤其是桉属树木。  更具体地说，大桉(E.grandis )，E.urophylla和杂种：大桉×E.urophylla(HGU)是较难再生的品种，因此我们获得了较高的转化效率。
本发明的方法由下列步骤组成(在此以桉树为例以便于解释，但是可本方法可适用于一般树木)：
-将桉树的种子进行除菌，例如用乙醇和次氯酸钠处理种子，然后将其洗掉；
-将这些种子转入合适的培养基；
-发芽约2至17天；
-收集已发芽的植物材料；
-将包含目的基因及可选的标记基团的土壤杆菌，具体为根癌土壤杆菌，接种到上述植物材料中，接种浓度为107-109个细胞/毫升；
-在液体培养基中接种处理约20-30小时；
-将接种后的植物材料转移至固体培养基中，在25-31和湿度与周围环境相同的条件下，暗处理38-50小时；
-将植物材料转至光下，开始小植株生长；
-取一片光生长下5-17天的小植株的叶子；
-将小植株叶转入含有脲衍生的生长素，具体为苯基脲的MS培养基；
-等待大约20天直至植物组织发芽；
-鉴别并筛选转化的小植株；
-在伸长培养基上培养转化的小植株约20天；
-由以下区域：下胚轴、子叶、初生叶和col再生出最终的转化植株。
可选择地在种子萌发以后，在用土壤杆菌接种收集的植物材料前，将其用超声波处理30-90秒。
本发明所描述的方法与以前所有方法的不同在于使用种子，其主要目的是有助于遗传转化。由于很多种子能被感染，从而大大增加了这一过程的转化效率。
除此以外，本发明也进一步包括用超声波处理种子的步骤，使下胚轴的再生能力得到了更大的提高。根据本方法，这一区域被认为具有更大的再生率。下胚轴的再生率高于40％。举例子来说，超声波处理步骤可将转化区的再生率从1-17％提至4-37％。
与先前的方法相比，本方法最终获得了较高的再生率。
对转化植株的筛选借助于标记基因的使用。这通常是生物技术的方法。将标记基因和目的基因一起转入土壤杆菌中，从而可证实本方法的效率，并且可使转化的植株区别于其他植株。这是本方法能够进行大规模生产的一个重要因素。
借助于本发明所获得的最终的转基因植物有多种应用，例如：
-增加生物量；
-改变木质素的百分含量；
-增强抗虫性和抗病性；
-增强抗旱性；
-改变木质的化学组成(例如：木质素，半纤维素，纤维素，提取物)；
-木质的物理变化，例如木质/树皮的基本密度的变化；
-除草剂抗性；
-植物在造纸和纤维素工业、木材转化业、建筑业和燃料工业的全部或部分应用。
                     发明实施方案详述
准备组织培养工具
通过以下具体步骤，对大桉，E.urophylla和杂种大桉×E.urophylla(HGU)的种子进行灭菌处理。
用约70％的乙醇洗涤种子1分钟左右，再用无菌水把乙醇洗掉，然后将种子转移到次氯酸钠(约8％v/v)和Tween(由去水山梨聚糖酯衍生的非离子表面活性剂)(约0.1％v/v)中大约10分钟；而后用无菌水将材料洗4遍。种子在含有MS培养基的培养皿中发芽。表1列出了不同实验中使用的各种培养基。
                           表1
             再生不同植物组织所用的培养基
成分   MS   MM   ME   MA   培养基1   培养基2
常量营养   MS   MS   G   MS   MS   MS
微量营养   MS   MS   G   MS   MS   MS
Na/Fe EDTA   MS   MA   1,5MS   MS   MS   MS
维生素   MS   White   G   White   MS   MS
蔗糖(％)   2.0   2.0   2.0   2.0   2.0   2.0
pH   5.8   5.8   5.8   5.8   5.8   5.8
BAP   -   0.2mg/l   -   0.1mg/l   -   -
NAA   -   10μg/l   -   -   0.465mg/l   0.465mg/l
IBA   -   -   1.0mg/l   0.2mg/l   -   -
AGAR(％)   0.6   0.6   0.6   0.6   0.6   0.6
苯基脲   -   -   -   -   0.5mg/l   1.0mg/l
准备用根癌土壤杆菌株LBA4404进行接种
将单克隆菌株接种到含有100毫克/升卡那霉素的液体Rhizo培养基中，在大约200rpm的摇动培养条件下培养48小时。当菌液浓度达到1-5×108个细胞/毫升的光密度时停止培养。将细胞在5000rpm的条件下离心10分钟，将沉淀物用含有约100mM ketoseringone的MS液体培养基重悬。这些细胞悬液将用于种子接种。
         用超声处理方法转化种子的具体步骤
以下介绍的方法使用根癌土壤杆菌系统转化种子。在使用该方法之前，超声破碎作为进行根癌土壤杆菌转化的预处理步骤，请参考Sawahel的工作“Ultrasound-mediated stable transformation ofpotato tuber discs，”Biotech Techniq.1996，第10卷：第821-824页，Trick & Finer 1997，1998和Santarem等人1998，组织超声处理导致外表皮表面和皮层组织的一系列微损伤，而这样利于细菌侵入组织和内部胚组织的暴露。
按照前面描述的方法对种子进行除菌处理，然后将其转移到盛有包含约3％蔗糖的MS培养基的培养皿中，在26℃的温度条件下，在光周期为16小时光照和8小时黑暗的培养室中进行培养。取不同时间间隔(0，2，5，15，和17天)的发芽种子进行大约30至90秒的超声处理。之后采用LBA4404菌株接种，它含有受花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子控制的GUS基因。在超声处理的过程中，将种子浸于盛有大约35毫升的MS液体培养基的100ml洋红玻璃烧杯中，处理的频率是40HZ。超声处理后，用含有LBA4404根癌土壤杆菌的液体MS培养基对种子进行接种。接种的条件：菌液浓度为大约107-109细胞/ml，时间为24小时，以大约100rpm持续搅动。对照组(没有进行超声处理的)种子在灭菌处理后立即进行接种。接种后，将种子转移到含有固体MS培养基的培养皿中，在28℃黑暗条件下进行大约48小时的共培养。随后，用含有200mg/L头孢氨噻(cefotaxim)的无菌水洗涤种子，在用灭菌的滤纸干燥后转移到含有100mg/L头孢氨噻的固体培养基中。在约7-10天后，种子充分发芽，这时可以利用GUS基因的表达评估小植株。转化效率考虑两个参数：至少含有一个兰点的芽的百分率；和转化梯度。这后一个参数代表在所有转化的芽中兰点(转化区域)的平均数。转化梯度显示转化效率。
统计学的描述是在每次处理后随机取样重复两次进行的。每一次处理用50粒种子，而非所有发芽种子。发芽的平均数和t-Student测验进行比较，概率为5％。表2显示了通过利用超声处理系统后以土壤杆菌侵染的方法进行种子转化的结果。
                          表2
超声处理对大桉种子转化率的影响。其后跟有字母的数字指示在t-Student测试中的显著性(P＜0.05)。括号中的数字指示标准平均偏差。
发芽后天数                  对照a           超声处理过的b
       ％转化的区域      转化率   ％转化的区域       转化率
    0c     2.17(1.53)     2.0(1)     4.02(1.52)     2.0(1)
    2b     14.0(4.0)     4.18(1.93)     21.72(0.72)     5.93(0.33)
    5d     1.51(1.51)     1.5(1.5)     5.54(2.34)     2.83(1.83)
    15a     17.14(2.86)     1.12(0.12)     37.38(6.61)     2.27(0.27)
    17b     11.0(1.9)     1.12(0.12)     19.54(1.89)     4.0(1)
实验结果显示转化种子和小植株的能力，超声处理阳性作用是增加转化效率。超声波处理的种子发芽2和15天获得了较高的转化效率(分别为21.7和37.38％)。另外，根据种子年龄的不同，转化的区域有不同的反应。对于发芽2天的种子来说，大约有90％的兰色部分存在于子叶和col区域(下胚轴和根之间的区域)；对于发芽5天的种子来说，大约70％葡萄糖苷酶活性存在于子叶中(图2，A-C)；然而，对于发芽15天到17天的小植株来说，大约60％的转化区存在于第一对叶中。(图1，D-F)。
                      转化组织的再生系统
在向植物转化外源基因的过程中，转化组织的再生是非常重要的一步。下面介绍两个可被用于再生转化的组织，如子叶和初生叶的再生系统的例子。
现在提供几个本发明的实施方案，这些实施方案并不限制本发明的特征。
                           实施例1
通过使用苯基脲，获得组织再生。针对每个桉树种使用不同浓度，从约0.5到大约1.0mg L-1(分别对应培养基1和培养基2)。大桉和杂种HGU的种子在MS培养基中发芽20天。随后取下每个小植株的子叶，第一对叶子，下胚轴和col部分。然后将这些外植体等同地转移到培养基1和培养基2中。
暗培养外植体30天左右，大约每15天换一次培养基。然后将外植体转移到一个光周期约为16小时光照/8小时黑暗的培养室中，在诱导发芽的培养基上培养20天。诱导发芽的培养基为培养基3(参见表1)，其中含有约0.2mg·L-1的苯基脲。在诱导发芽的培养基上培养约20天后，将材料移至增殖培养基(MM)中培养约20天，随后移至伸长培养基(MA)。对两个种的生芽数量进行评估。在这个例子中，不考虑这两个基因型的再生率的差别。每个处理中用到了杂种HGU的13个外植体和大桉的26个外植体。结果表明，在所用的两种基因型的全部外植体中，在含有0.5mg·L-1的苯基脲的培养基1中，成芽率较高，为27.3％；而在培养基2中，发芽率为16.1％。两种基因型的不同组织的芽再生率为：子叶16.2％、初生叶35.7％、下胚轴43.59％和co1部分2.3％。
                         实施例2
基于先前的结果，仅从具有最高成芽率的培养基1中获得再生植株。所用的植物材料都是相同的。按照前述实施例方法对种子进行除菌，然后将其转入含有MS培养基的培养皿中，在温度为26℃和光周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下培养2天。发芽后的种子经超声波处理30秒后用LBA 4404菌株对其接种。该LBA 4404菌株含有β-葡糖醛酸糖苷酶基因和NPTII基因，NPTII基因具有抗卡那霉素(Kanamicin)和抗遗传霉素G-418的抗性。将种子浸入在一个装有35ml液体MS培养基的洋红烧瓶中，进行超声波处理。而后用含有土壤杆菌的液体MS培养基(参见实施例1)，在持续搅拌(约100rpm)下，接种大约24小时。将接种后的种子转入含有固体MS培养基的培养皿中，在28℃下暗培养大约48小时。然后用含有200mg·L-1头孢氨噻的无菌水洗涤种子，于灭菌滤纸上干燥后转移至含有100mg·L-1头孢氨噻的固体MS培养基上，培养约15天，以供小植株发育。
将每一株外植体的子叶取下，转入含有约0.5mg.L-1苯基脲、约100mg.L-1卡那霉素和约100mg.L-1头孢氨噻的培养基1中，暗下保持约30天。约每15天更换一次培养基。然后将外植体转入相同培养基，含有约10mg.L-1遗传霉素G-418和约100mg.L-1头孢氨噻，光下诱导发芽30天。在这个培养基中，材料受到了强烈的选择，所用不同种的存活率介于70％-90％。将在本处理中所产生的愈伤组织和芽转移至含有约10mg.L-1遗传霉素G-418和约100mg.L-1头孢氨噻的增殖培养基(MM)中，培养约20天，这时候大部分的芽会死亡。将剩余活着的芽转至MA培养基上培养至长度为约3至4厘米。继而将他们转至ME培养基上暗培养约10天，再将其转至生长室培养约20天。将植物移至土和蛭石的混合培养土中，在温室中进行环境适应。
表3给出了大桉和杂种HGU的成芽率的百分比
              表3-芽形成百分率
    植物结构     大桉     HGU
    下胚轴     25.0±8.4     29.2±4.2
    子叶     20.8±4.2     24.5±3.7
    叶     10.4±2.1     8.3±4.2
在本发明当前的描述或在此所公开的实践的启示下，本领域的技术人员很容易理解本发明的其他实施方案。需要强调的是，当前的实施例只是本发明的特殊实施方案，而本发明适用的真正范围将在以下权利要求中阐明。

Claims (17)

1.树木的遗传转化方法，由以下步骤组成：
-除菌和清洗树木种子；
-将上述种子转移至合适的培养基；
-发芽约2至17天；
-收集发芽后的材料；
-用包含一或多个目的基因及可选一或多个标记基团的土壤杆菌接种，浓度为约107-109个细胞/毫升；
-在液体培养基中接种约20-30小时；
-将材料转移至固体培养基中，在约25-31℃和环境湿度下暗处理约38-50小时；
-将植物材料转至光下，开始小植株生长；
-取一片光生长下约5-17天的小植株的叶子；
-将小植株叶转入含有脲衍生的生长素的MS培养基；
-等待植物组织发芽大约20天；
-鉴定并筛选转化的小植株；
2.树木的遗传转化方法，由以下步骤组成：
-除菌和清洗树木种子；
-将上述种子转移至合适的培养基；
-发芽约2至17天；
-收集发芽后的材料；
-超声波处理收集的材料
-用包含一或多个目的基因及可选一或多个标记基团的土壤杆菌接种，浓度为约107-109个细胞/毫升；
-在液体培养基中接种约20-30小时；
-将材料转移至固体培养基中，在约25-31℃和环境湿度与下暗处理约38-50小时；
-将植物材料转至光下，开始小植株生长；
-取一片光生长下约5-17天的小植株的叶子；
-将小植株叶转入含有脲衍生的生长素的MS培养基；
-等待植物组织发芽大约20天；
-鉴定并筛选转化的小植株；
3.根据权利要求1和权利要求2任一项的方法，表征为由脲衍生的生长素是苯基脲。
4.根据权利要求1和权利要求2任一项的方法，表征为一或多个目的基因选自：赋予植物除草剂抗性的，编码蛋白酶抑制蛋白的或改变目的表型性状的基团。
5.根据权利要求1和权利要求2任一项的方法，表征为一或多个目的基因选自对卡那霉素和遗传霉素G-418，Lhcb1*2有抗性的NPTII。
6.根据权利要求1和权利要求2任一项的方法，表征为标记基因是β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)。
7.根据权利要求1和权利要求2任一项的方法，表征为该方法得到的最终产物具有一或多个如下特点：生物量大大增加；木质素百分含量改变；更强抗虫性和抗病性；更好的抗旱力；木质化学组成改变；木质物理变化；例如木质/树皮的基本密度和除草剂抗性；
8.根据权利要求1和权利要求2任一项的方法，表征为木质化学组成变化涉及一或多种下列物质：木质素，半纤维素，纤维素和提取物。
9.获取转基因树木的方法，由下述步骤组成：
-除菌和清洗树木种子；
-将上述种子转移至合适的培养基；
-发芽约2至17天；
-收集发芽后的材料；
-用包含一或多个目的基因及可选一或多个标记基团的土壤杆菌接种，浓度为约107-109个细胞/毫升；
-在液体培养基中接种约20-30小时；
-将材料转移至固体培养基中，在约25-31℃和环境湿度暗处理约38-50小时；
-将植物材料转至光下，开始小植株生长；
-取一片光生长下约5-17天的小植株的叶子；
-将小植株叶转入含有脲衍生的生长素的MS培养基；
-等待植物组织发芽大约20天；
-鉴定并筛选转化的小植株；
-在增殖和伸长培养基上培养转化的小植株约20天；
-由以下区域：下胚轴、子叶、初生叶和col部分再生出最终的转化植株。
10.根据以上任何一项权利要求的方法，表征为用乙醇和次氯酸钠对种子进行除菌。
11.根据以上任何一项权利要求的方法，表征为该种子为桉属树木的种子。
12.根据权利要求11的方法，表征为该种子选自大桉，E.urophylla和杂种：大桉×E.urophylla(HGU)。
13.根据在前的任何一项权利要求的方法，表征为该土壤杆菌为根癌土壤杆菌。
14.转基因树木的植物，表征为该植物由根据权利要求1至13中任一项的方法得来。
15.根据权利要求1至13的转基因树木植物的用途，表征为其产生一或多个如下特点：生物量大大增加；木质素百分含量改变；更强的抗虫性和抗病性；更好的抗旱能力；木质化学组成改变；木质物理变化；例如木质/树皮基本密度和除草剂抗性；
16.根据权利要求15的用途，表征为木质化学组成变化涉及一或多种下列物质：木质素，半纤维素，纤维素和提取物；
17.根据权利要求15或16的用途，表征为其包括植物在造纸业、纤维素业、木材转化业、建筑业和燃料业的全部或部分用途。
CNB018176240A 2000-08-18 2001-08-16 树木的遗传转化方法 Expired - Lifetime CN100379864C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR00039080 2000-08-18
BR0003908-0A BR0003908A (pt) 2000-08-18 2000-08-18 Método para transformação genética de eucalyptus spp

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1630723A true CN1630723A (zh) 2005-06-22
CN100379864C CN100379864C (zh) 2008-04-09

Family

ID=37515864

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB018176240A Expired - Lifetime CN100379864C (zh) 2000-08-18 2001-08-16 树木的遗传转化方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7186889B2 (zh)
EP (1) EP1448777A4 (zh)
CN (1) CN100379864C (zh)
AR (1) AR030381A1 (zh)
AU (2) AU2001279510B2 (zh)
BR (2) BR0003908A (zh)
WO (1) WO2002014463A2 (zh)
ZA (1) ZA200301299B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102757970A (zh) * 2012-07-31 2012-10-31 普罗米绿色能源(深圳)有限公司 桉树pgef12基因及其植物表达载体、宿主细胞和应用
CN102888411A (zh) * 2012-07-31 2013-01-23 普罗米绿色能源(深圳)有限公司 桉树pgef13基因及其植物表达载体、宿主细胞和应用
CN103031330A (zh) * 2006-12-08 2013-04-10 瑞典树木科技公司 具有改良生长特性的木本植物及其产生方法

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2299285B2 (es) * 2004-11-26 2009-12-07 Universidad De Vigo Procedimiento para transformar material vegetal procedente de arboles adultos.
CN100427604C (zh) * 2005-09-27 2008-10-22 重庆融海超声医学工程研究中心有限公司 声化学基因转染方法
AP2724A (en) 2006-07-21 2013-08-31 Xyleco Inc Conversion systems for biomass
GB2452543B (en) * 2007-09-07 2012-07-25 Wei Huang Nucleic acid transfer techniques
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
WO2011112570A1 (en) 2010-03-08 2011-09-15 Monsanto Technology Llc Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
UA116089C2 (uk) 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
EP2755467B1 (en) 2011-09-13 2017-07-19 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
EP3434780A1 (en) 2011-09-13 2019-01-30 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CN104160028A (zh) 2011-09-13 2014-11-19 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
MX360866B (es) 2012-05-24 2018-11-09 A B Seeds Ltd Composiciones y métodos para silenciar la expresión genética.
CN104870647A (zh) 2012-10-18 2015-08-26 孟山都技术公司 用于植物害虫控制的方法和组合物
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
UY35251A (es) 2013-01-01 2014-07-31 Seeds Ltd Ab MOLÉCULAS DE dsRNA AISLADAS Y MÉTODOS PARA USARLAS PARA SILENCIAR MOLÉCULAS DIANA DE INTERÉS
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
UY35379A (es) 2013-03-13 2014-09-30 Monsanto Technology Llc ?métodos y composiciones para el control de malezas?.
WO2014164797A2 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
MX359191B (es) 2013-07-19 2018-09-18 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa.
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
UA120426C2 (uk) 2013-11-04 2019-12-10 Монсанто Текнолоджі Елелсі Композиція та спосіб для боротьби з членистоногими паразитами та зараженням шкідниками
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
EP3116303B1 (en) 2014-01-15 2020-07-22 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control using epsps polynucleotides
WO2015153339A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
CA2953347A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
EP3161138A4 (en) 2014-06-25 2017-12-06 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
CN104120145B (zh) * 2014-06-30 2016-06-22 国家林业局桉树研究开发中心 一种桉树遗传转化与再生方法
CN114009454A (zh) 2014-07-29 2022-02-08 孟山都技术公司 用于控制昆虫害虫的组合物和方法
PL3256589T3 (pl) 2015-01-22 2022-02-21 Monsanto Technology Llc Kompozycje i sposoby kontrolowania leptinotarsa
AU2016270870A1 (en) 2015-06-02 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
AU2016270913A1 (en) 2015-06-03 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
CN115216489B (zh) * 2022-06-22 2023-06-13 齐鲁师范学院 一种宽叶独行菜的遗传转化方法及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2298205A (en) * 1995-02-17 1996-08-28 Shell Int Research Genetic transformation of eucalyptus
FR2739395B1 (fr) 1995-10-03 1997-12-05 Centre Nat Rech Scient Sequence d'adn codant pour une cinnamoyl coa reductase, et leurs applications dans le domaine de la regulation des teneurs en lignines des plantes
IL117139A0 (en) * 1996-02-14 1996-06-18 Volcani Center Method for the induction of genetic parthenocarpy in plants
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
JP4099898B2 (ja) * 1999-05-07 2008-06-11 王子製紙株式会社 ユーカリ属植物の成木を形質転換する方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103031330A (zh) * 2006-12-08 2013-04-10 瑞典树木科技公司 具有改良生长特性的木本植物及其产生方法
CN102757970A (zh) * 2012-07-31 2012-10-31 普罗米绿色能源(深圳)有限公司 桉树pgef12基因及其植物表达载体、宿主细胞和应用
CN102888411A (zh) * 2012-07-31 2013-01-23 普罗米绿色能源(深圳)有限公司 桉树pgef13基因及其植物表达载体、宿主细胞和应用
CN102757970B (zh) * 2012-07-31 2013-08-28 普罗米绿色能源(深圳)有限公司 桉树pgef12基因及其植物表达载体和应用
CN102888411B (zh) * 2012-07-31 2014-07-02 普罗米绿色能源(深圳)有限公司 桉树pgef13基因及其植物表达载体、宿主细胞和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002014463A2 (en) 2002-02-21
EP1448777A2 (en) 2004-08-25
US7186889B2 (en) 2007-03-06
US20040055041A1 (en) 2004-03-18
EP1448777A4 (en) 2005-03-30
WO2002014463A8 (en) 2004-07-01
CN100379864C (zh) 2008-04-09
AU2001279510B2 (en) 2007-04-05
BR0113455A (pt) 2005-06-07
AR030381A1 (es) 2003-08-20
WO2002014463A3 (en) 2004-05-06
BR0003908A (pt) 2002-06-18
ZA200301299B (en) 2005-08-31
AU7951001A (en) 2002-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100379864C (zh) 树木的遗传转化方法
Paz et al. Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation
CN1044919C (zh) 以微粒为媒介的大豆植物和品系的转化
Mayavan et al. Agrobacterium-mediated in planta genetic transformation of sugarcane setts
AU2001279510A1 (en) Method for genetic transformation of woody trees
CN1230547C (zh) 生产和转化木薯原生质体的方法
CN1110562C (zh) 用于产生可育纯合植株的转化的胚发生小孢子
CN105602984A (zh) 一种快速高效的农杆菌介导的小麦茎尖遗传转化方法
Cui et al. A stable Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of cotton (Gossypium hirsutum L.) and plant regeneration from transformed hairy root via embryogenesis
Pathak et al. An effective method of sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of chickpeas
Khemkladngoen et al. Physical wounding-assisted Agrobacterium-mediated transformation of juvenile cotyledons of a biodiesel-producing plant, Jatropha curcas L.
Chen et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation system for the important medicinal plant Dendrobium catenatum Lindl
CN1191364C (zh) 获得含有外源dna的转基因豆科植物(豆科)的方法
Lu et al. A method of genetic transformation and gene editing of succulents without tissue culture
CN110172476B (zh) 一种马缨杜鹃的遗传转化和再生体系建立的方法
CN105132457B (zh) 一种快速遗传转化苜蓿的方法
Wang et al. Fast, simple, efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation system to non-heading Chinese cabbage with transgenic roots
CN1240841C (zh) 用新外植体进行农杆菌介导的棉花转化
Mohan et al. Plant regeneration from decapitated mature embryo axis and Agrobacterium mediated genetic transformation of pigeonpea
Bajaj et al. Optimizing plant regeneration and genetic transformation of Paulownia elongata
Nanasato et al. Efficient genetic transformation of Jatropha curcas L. by means of vacuum infiltration combined with filter-paper wicks
CN1168823C (zh) 甘薯胚性悬浮细胞的遗传转化方法
CN1377421A (zh) 提高植物细胞转基因效率的方法
CN1213404A (zh) 树的基因转化
Subroto et al. Tissue culture media optimization and genetic transformation of Jatropha curcas genotype Jatromas cotyledon explants

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SUZANO BAHIA PAPER AND CELLULOSE COMPANY

Free format text: FORMER OWNER: SUZANO PAPER AND FIBER CO., LTD.

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20050603

Address after: Brazil City, Bahia

Applicant after: Sorzano Bahia paper and cellulose company

Co-applicant after: Universidade de Sao Paulo-Usp

Address before: Brazil St Paul

Applicant before: Suzano Paper And Fiber Co., Ltd.

Co-applicant before: Universidade de Sao Paulo-Usp

C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20080409

CX01 Expiry of patent term