CN103031330A

CN103031330A - 具有改良生长特性的木本植物及其产生方法

Info

Publication number: CN103031330A
Application number: CN2012105064763A
Authority: CN
Inventors: 芒努斯·赫茨贝里; 戈兰·桑德贝里; 亚尔莫·施拉德尔; 大卫·瑟德斯特伦
Original assignee: SweTree Technologies AB
Current assignee: SweTree Technologies AB
Priority date: 2006-12-08
Filing date: 2007-12-04
Publication date: 2013-04-10
Also published as: CA2671656A1; EP2099919A2; EP2559765A1; EP2099919A4; US9018448B2; WO2008067840A1; JP2013162801A; EP2743351A3; US20120180163A1; WO2008069747A2; BRPI0720438A2; AU2007328522B2; ES2571338T3; CN101646773A; CN101646773B; AU2007328522A1; CL2007003530A1; JP2010511405A; WO2008069747A3; US20160145633A1

Abstract

本发明涉及利用生物信息学工具、来自EST测序和DNA阵列的数据从鉴定得到的大批候选基因中选择具有可商用表型之基因的一种新的应用广泛的分析平台。本发明的一方面提供了与其野生型相比生长有所提高的转基因植物的生成方法。该方法包括改变植物中在木质形成不同阶段特异性表达的至少一种基因的基因产物水平。本发明另一些方面提供了包含本发明重组多核苷酸的转基因植物的植物细胞或植物后代。其它一些方面涉及包含本发明核苷酸序列的DNA构建体以及包含所述DNA构建体的植物细胞或植物后代。

Description

具有改良生长特性的木本植物及其产生方法

本申请是申请号为200780045384.7的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/SE2007/050939的中国国家阶段申请。

技术领域

本发明一般地涉及分子生物学领域，涉及用于改良植物生长特性的方法。更具体地说，本发明涉及用于从表型上改良植物和转基因植物的方法，所述植物中在木质形成不同阶段特异性表达之基因的表达发生了改变，从而导致改良的生长表型。本发明还提供了本发明方法中使用的构建体。

背景技术

当前，林木改造和分子育种的主要目标是改进树木的质量和产量。全球对木材制品的需求正以每年约1.7％的速度增长，而这种木材消耗的增长是在已达到或超过世界森林中的最高可持续收获率的情况下发生的。因此，需要在世界范围内提高栽植木材的产量。森林栽植还可具有作为碳汇作物(carbon sequestration crop)应对大气C0₂增加的优点。类似地，也需要提高来自非木本植物的生物量产生，例如为了满足对能源生产原材料的需求。因此，对高等物种细胞发育期间特定过程的改良是具有巨大商业价值的，这不仅包括改良树木的特性，还包括对其它植物的改良。

依靠顶端分生组织进行的植物生长导致了一系列初生组织的发育以及茎和根的伸长。除了这种初生生长之外，树木种类还会经历次生生长并产生来自形成层的次生组织“木质”。所述次生生长增加了茎和根的周长。

Sterky等1998(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998(95)，13330-13335)已公布了针对两个杨属物种的大规模基因探索计划的结果，包括来自欧洲山杨×美洲山杨(Populus tremula L.×tremuloides Michx.)和毛果杨(Populus trichocarpa“Tfichobel”)之木质形成组织的5,629个表达序列标签(EST)。这些EST代表了针对两个cDNA文库的总共3,719种独特的转录物，并且这些转录物中的2,245种具有推定的功能。作者表示，所展示的EST数据对于鉴定参与植物次生木质部和韧皮部形成的基因将具有价值，但对于如何进行鉴定则没有给出清楚的指导。Sterky等1998的文章还揭示了一大批功能未知或未确定的EST的存在。

在现有技术(例如Sterky等1998)中，从分离自活跃生长树木的茎组织构建文库。从多种组织的混合物制备形成层的文库，包括欧洲山杨×美洲山杨的发育中的木质部、分生组织形成层以及发育中及成熟的韧皮部。这些形成层组织是通过剥离树皮并用解剖刀刮擦两个暴露表面而获得的。从毛果杨制备发育中的木质部文库。这些组织是通过剥离树皮并刮擦暴露的木质部一侧而获得的。使用所述方法只可能建立分别代表完整形成层、发育中的木质部以及韧皮部(利用刮擦暴露的树皮来制备)的三个不同文库。现有技术对形成层中的基因表达与发育中木质部组织中的基因表达进行了比较。由于组织制备实验操作带来的局限性，该实验只进行了粗略的比较。用于制备发育中木质部文库的组织包含从扩大中的木质部细胞到晚期木质部发育的组织。

还有一个问题是如何鉴定可能最具重要性的基因并将其与特定发育阶段和细胞最终特性联系起来。另一问题是如何鉴定至今未知的基因，将其与植物中的特定细胞类型和/或功能联系起来。最后，一个特别的问题是如何发现参与细胞分裂、细胞扩大、细胞壁合成、凋亡和程序性细胞死亡以及与决定树木生长和木质特性有关的其它重要过程的特定基因。

Hertzberg等2001(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2001(98)，14372-14737)和Schrader等2005(Plant Cell，(16)，2278-2292)已利用转录物特征谱来揭示木质部发育期间数千种基因的转录层次，并提供了可有助于进一步阐明许多未知功能基因的表达数据(White等1999(Science 1999(286)2187-2184)；Aharoni等2000(Plant Cell 2000(12)647-662)。然而，这对于木本植物(例如树木)来说在技术上很复杂。Hertzberg等和Schrader等已研究了发育中的杨树次生木质部，它是高度组织化的并且在不同发育阶段中具有易识别且独特的边界。木质形成起始于维管形成层。形成层衍生物通过分裂、扩大、次生壁形成、木质化以及最终的程序性细胞死亡过程发育成木质部细胞。树木中大尺寸的维管分生组织为通过切向冷冻切片获取来自确定发育阶段的样品提供了特有的可能性(Uggla等1996Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996(93)，9282-9286)。为了测定欧洲山杨×美洲山杨(杂交山杨)中个体发育的木质形成期间特定阶段的稳定状态mRNA水平，收集贯穿木质发育区的30μm厚切片并随后利用数个由来自杂交山杨的多达20,000个独特EST组成的已点样cDNA微阵列进行分析(Schena等1995Science 1995(270)467-470)。

尽管从EST方法、基因组测序以及利用DNA阵列技术进行的表达研究显然可证实基因在何处和何时表达，但是仅通过这些类型的分析工具不太可能阐明基因在生物学和/或技术上的功能。为了分析以及证实基因的功能，必须进行功能表征，例如通过基因失活和/或基因过表达来实现。然而，为了能鉴定具有令人感兴趣且经常难以预料之可商用特征的基因，需要有新的分析平台来基于多重标准评估候选基因。

发明概述

本发明涉及利用生物信息学工具、来自EST测序和DNA阵列的数据从鉴定得到的大批候选基因中选择具有可商用表型之基因的一种新的应用广泛的分析平台。该分析平台致力于基于多重标准的组合对生长行为进行分析。本发明提供了通过改变满足所述标准的一种或多种基因的表达来产生转基因植物的方法。

因此，本发明的一方面提供了产生与其野生型相比生长有所提高的转基因植物的方法，其包括改变植物中在树木形成不同阶段特异性表达的至少一种基因的基因产物水平。

在本发明的一个具体实施方案中，所述至少一种基因的选择满足该基因的RNAi下调在一组3-8株转基因植物中引起以下效果的标准：

当比较在18小时光周期、22℃/15℃温度(白天/夜晚)以及每周一次施用1∶100稀释的Weibulls Rika S NPK 7-1-5的条件下于温室中培育8周的所述一组转基因植物与相同条件下培育的一组野生型植物时，

a)在最终高度平均值(average final height，AFH)、最终高度最大值(maximum final height，MFH)、最大高度生长速率平均值(averagemaximum height growth rate，AMHGR)和最大高度生长速率最大值(maximum maximum height growth rate，MMHGR)中具有5％或更大的差异；和/或

b)在最终直径平均值(average final diameter，AFD)、最终直径最大值(maximum final diameter，MFD)、直径生长速率平均值(averagediameter growth rate，ADGR)和直径系数最大值(maximum diametercoefficient，MDC)中具有5％或更大的差异；和/或

c)在最终高度平均值(AFH)和/或最终直径平均值(AFD)和/或最大高度生长速率平均值(AMHGR)和/或直径生长速率平均值(ADGR)中具有18％或更大的差异；和/或

d)在最终高度最大值(MFH)和/或最终直径最大值(MFD)和/或最大高度生长速率最大值(MMHGR)和/或直径系数最大值(MDC)中具有18％或更大的差异；

其中最大高度生长速率定义为以4个连续的高度数据点拟合的线性函数的斜率，高度生长速率值是以逐步的方式针对数据点1-4、数据点2-5等计算得到的，而最大高度生长速率值是针对每株植物计算得到的。

利用该新分析平台分析的许多基因显示出令人感兴趣且经常难以预料的可商用特征。因此，本发明的另一方面涉及包含重组多核苷酸(DNA构建体)的转基因植物，所述重组多核苷酸含有能够改变植物中在树木形成阶段特异性表达的至少一种基因之基因产物水平的核苷酸序列，其中所述至少一种基因的选择满足该基因的RNAi下调在一组3-8株转基因植物中引起以下效果的标准：

当比较在18小时光周期、22℃/15℃温度(白天/夜晚)以及每周一次施用N 84g/l、P 12g/l、K 56g/l的条件下于温室中培育8周的所述转基因植物组与相同条件下培育的野生型植物组时，

a)在最终高度平均值(AFH)、最终高度最大值(MFH)、最大高度生长速率平均值(AMHGR)和最大高度生长速率最大值(MMHGR)中具有5％或更大的差异；和/或

b)在最终直径平均值(AFD)、最终直径最大值(MFD)、直径生长速率平均值(ADGR)和直径系数最大值(MDC)中具有5％或更大的差异；和/或

本发明的另一方面提供了根据本发明的转基因植物并且包含重组多核苷酸的植物细胞或植物后代。

本发明的又一方面提供了由具有上述特性的转基因植物产生的木材。

本发明的又一方面提供了包含至少一个如上所述序列的DNA构建体。

最后，本发明的一个方面提供了包含本发明DNA构建体的植物细胞或植物后代。

附图说明

图1显示了树木形成的不同阶段，其中(A)是用甲苯胺蓝染色的杂交山杨茎横切片。黑条指示采样组织的位置。为了给出来自形成层的其它组织中基因表达的低分辨率照片，因而包括了韧皮部样品。(B)是维管发育期间不同细胞类型和阶段的示意图。棒状图表示不同发育阶段的时间和程度以及主要细胞壁成分的出现。(C)显示了在采样组织中对具有差异表达的1791种选定基因的分级聚类分析。底部的颜色标度表示样品之间的倍数变化。(D)(I-X)显示了具有不同的差异表达模式的基因群以Iog2为刻度的表达比。样品示于图底部。

图2显示了来自木质部差异数据的选定基因的表达模式。将选自Hertzberg等(2001)数据之基因的9种主要实例用于对杂交山杨进行功能分析。该样品和图与图1D中相同。该图显示了覆盖木质部差异区的那些基因的表达模式。表达比以log标度表示。

图3显示了来自分生组织实验数据的选定基因的表达模式。将选自Schrader等(2004)数据之基因的6种主要实例用于对杂交山杨进行功能分析。该样品和图与图1D中相同。该图显示了覆盖形成层区域的那些基因的表达模式。表达数据来自Schrader等2004的B辑。表达数值以log标度表示，用于归一化和数据准备(参见Schrader等2004)。

图4显示了用四个不同数据点的线性回归线表示的高度生长曲线实例，黑色回归线显示出最大的高度生长速率。

发明详述

定义

在进一步详细论述本发明之前，首先对以下术语和惯例进行定义：

术语“转基因植物”是指含有在相同物种、品种和栽培变种的野生型植物中未发现的遗传物质的植物。所述遗传物质可包括转基因、插入诱变事件(例如通过转座子或T-DNA插入诱变来实现)、激活标记序列(activation tagging sequence)、突变序列、同源重组事件或者经嵌合修复(chimeraplasty)修饰的序列。通常，通过人为操作将外源遗传物质引入植物中。该术语还指其中已插入行使选择标记功能之遗传物质的植物。这样的选择标记的实例包括卡那霉素、潮霉素、膦丝菌素(phosphoinotricin)、氯磺隆(chlorsulfron)、氨甲蝶呤、庆大霉素、壮观霉素、咪唑啉酮类(imidazolinones)、d-氨基酸和草甘膦(glyphosate)。

在本发明的上下文中，术语“生长”包括植物的初生生长(其包括茎和根的伸长)和次生生长(其包括从形成层生成次生组织“木质”以及茎和根周长的增加。因此，表述““提高的生长”在本文中涉及在同样的培养条件下培养时，相对于转基因植物所来源之野生型植物而言的转基因植物的生长提高。如下文所述，如果植物满足下文实施例中所定义之“生长差异选择标准”中的至少一条则认为转基因植物生长有所提高。

术语“表型”在本文中是指植物个体的总体自然表现，例如生长。本文中所用的不同生长表型的实例列于以下表1.2中，包括例如称为“AFH”(其指野生型种群及每种构建组种群的最终高度平均值)或“AFD”(其指野生型种群及每种构建组种群的最终直径平均值)的表型。

在本发明的上下文中，术语“木质形成阶段”是指木质形成的时期，例如细胞分裂和细胞扩大，如以下文献所定义：Wilson，B.F.，Wodzicki，T.J.以及Zhaner，R.(1966)Differentiation 0f cambial derivates：Proposedterminology.Forest Science 12，438-440页。

当论及在木质形成的不同阶段特异性表达的基因时，术语“特异性表达”用于表示在木质形成阶段表达提高的基因。应当理解，在木质形成阶段所述基因的表达可提高10％或更多，例如15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、75％或更多、100％或更多、200％或更多、300％或更多、400％或更多、500％或更多、700％或更多或者1000％或更多。

术语“基因”广义上指与生物学功能相关的任何DNA片段。基因包括编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因还包括非表达的DNA核酸区段，例如，形成针对其它蛋白质的识别序列(例如启动子、增强子或其它调控区)。基因可从多种来源获得，包括从目的来源克隆或者根据已知或预测的序列信息合成，还可包括设计成具有所需参数的序列。

术语“RNA干扰”或“RNAi”一般是指双链RNA分子或短发夹RNA改变与其共有显著或完全同源性之核酸序列的表达的过程。

术语“RNAi下调”是指由一种或多种RNAi介导的核酸序列表达减少。术语“RNAi种类”是指引起RNAi的独特RNA序列。

术语“光周期”是指光照与黑暗的每日循环。

术语“核酸构建体”、“DNA构建体”和“载体”是指用于转化植物或其它生物的遗传序列。核酸构建体或DNA构建体可以能够在转化植物中指导蛋白质或核酸序列(例如反义RNA)的表达。通常，这样的核酸构建体或DNA构建体至少包含针对所需基因产物或所需核酸产物并与5’和3’转录调控元件有效连接的编码区。在一些实施方案中，这样的核酸构建体或DNA构建体是嵌合的，即由不同来源的序列混合组成。然而，非嵌合的核酸构建体或DNA构建体也可用于本发明中。

在涉及例如细胞、核苷酸、载体、蛋白质或多肽时，术语“重组”通常表示已通过引入异源(或外源)核酸或通过改变天然核酸而对细胞、核苷酸或载体进行了修饰，或者通过引入异源氨基酸而对蛋白质或多肽进行修饰，或者所述细胞来源于经如此修饰的细胞。重组细胞表达在天然(非重组)形式细胞中未发现的核酸序列(例如基因)，或者表达在正常情况下会异常表达、低表达或者根本不表达的天然核酸序列(例如基因)。涉及细胞时术语“重组”表示所述细胞复制异源核酸，或表达由异源核酸编码的肽或蛋白质。重组细胞可包含在天然(非重组)形式细胞中未发现的基因。重组细胞还可包含天然形式细胞中存在的基因，其中所述基因被修饰并通过人工手段被重新引入细胞中。该术语还包括含有细胞内源核酸的细胞，所述内源核酸被修饰而未从细胞中取出，所述修饰包括通过基因置换、定点突变和相关技术获得的修饰。

术语“核酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合体。除非特别限制，否则该术语涵盖包含天然核苷酸已知类似物的核酸序列，其具有与参照核酸类似的结合特性并且以与天然核苷酸类似的方式进行代谢。除非另外指明，否则一种具体的核酸序列还暗含其保守性修饰的变体(例如简并密码子替换)和互补序列以及明确指示的序列。

“多核苷酸”是包含众多聚合核苷酸残基的核酸序列，例如至少约15个连续的聚合核苷酸残基，任选地至少约30个连续的核苷酸，至少约50个连续的核苷酸。在许多情况下，多核苷酸包含编码多肽(或蛋白质)或其结构域或片段的核苷酸序列。另外，多核苷酸可包含启动子、内含子、增强子区、多腺苷酸化位点、翻译起始位点、5’或3’非翻译区、报告基因、选择标记等。多核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA。多核苷酸任选地包含经修饰的碱基或经修饰的主链。多核苷酸可以是例如基因组DNA或RNA、转录物(例如mRNA)、cDNA、PCR产物、克隆DNA、合成DNA或RNA等。多核苷酸可包含有义或反义方向的序列。

术语“多肽”以广义使用，用于定义氨基酸残基的线性链，包括天然存在的及其合成类似物。

在本发明的上下文中，“互补”是指在两个核苷酸序列之间彼此精确配对的能力。例如，如果在寡核苷酸中某一位置的核苷酸能够与某DNA或RNA分子相应位置的核苷酸以氢键结合，那么该寡核苷酸与该DNA或RNA就被认为在所述位置彼此互补。当寡核苷酸中有足够数目的核苷酸可与目标DNA或RNA中相应核苷酸形成氢键从而能够形成稳定的复合物时，所述DNA或RNA链被认为是彼此互补的。

因此，在本文上下文中表述“互补序列”或“互补”也指在严格条件下可与本发明核酸分子退火的核苷酸序列。

术语“严格条件”是指具有高、弱或低严格性的一般条件。

术语“严格性”是本领域众所周知的在涉及实施核酸杂交时使用的条件(温度、离子强度以及其它化合物例如有机溶剂的存在)。与“弱严格性”或“低严格性”相比，在“高严格性”条件下，核酸碱基配对只会发生在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间。用于测试杂交的合适条件包括预浸泡于5×SSC中，然后在约40℃下、在含20％甲酰胺、5×Denhardt’s溶液、50mM磷酸钠(pH6.8)和50mg经超声变性处理的小牛胸腺DNA的溶液中预杂交1小时，随后在约40℃下、在补充了100mMATP的同样溶液中杂交18小时，之后在40℃下(低严格性)将滤器用2×SSC、0.2％SDS漂洗30分钟，共3次，优选在50℃下(中等严格性)，更优选在65℃下(高严格性)，更优选在约75℃下(极高严格性)。有关杂交方法的更多细节可参见Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989。

术语“杂交”和“使杂交”以广义使用，用于指互补或部分互补核酸序列之间的结合，例如使其分离之变性过程的逆向过程。杂交通过氢键结合而发生，其可以是在互补核苷或核苷酸碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen、反Hoogsteen氢键结合等。在DNA中常见的四种核酸碱基是G、A、T和C，其中G与C配对，A与T配对。在RNA中，T被尿嘧啶(U)代替，而与A配对。参与标准双链形成的核酸碱基中的化学基团构成Watson-Crick面。几年后，Hoogsteen显示嘌呤核酸碱基(G和A)除了其Watson-Crick面之外还具有Hoogsteen面，该Hoogsteen面可从双链外侧识别并用于通过氢键键合来结合嘧啶寡核苷酸，从而形成三螺旋结构。

“子序列”或“片段”是完整序列的任一部分。因此，片段或子序列是指分别包含较长氨基酸(例如多肽)或核酸(例如多核苷酸)一部分的氨基酸或核酸序列。

在本文中，两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的同源性通过参数“序列同一性”来描述。

术语“序列同一性”表示相等长度的两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间同源程度的定量测量。如果待比较的两个序列不是等长的，则必须对其进行比对以得出最佳的可能匹配，其中允许插入空位或者截短多肽序列或核苷酸序列的末端。序列同一性可根据文献Fei！Objekt kan inteskapas genom redigering aV

进行计算，其中N_dif是在比对时两个序列中不一致残基的总数，并且其中N_ref是序列之一中的残基数目。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75％的同一性(N_dif＝2，N_ref＝8)。空位作为不一致的具体残基来计算，即，DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC具有75％的同一性(N_dif＝2，N_ref＝8)。

在本发明涉及核苷酸序列的所有实施方案中，一个或多个序列之间的序列同一性百分比还可基于利用默认设置的clustalW软件(http:/www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html)进行的序列比对。对于核苷酸序列对比而言，这些设置为：比对(Alignment)＝3Dfull、空位(Gap Open)10.00、空位延伸(Gap Ext.)0.20、空位间隔距离(Gap separation Dist.)4、DNA权重矩阵(DNA weight matrix)：同一性(IUB)。或者，可使用DNASISMax程序对序列进行分析，并可通过http://www.paralign.org/网站进行序列比较。该服务基于称为Smith-Waterman(SW)和ParAlign的两种比较算法。第一种算法由Smith和Waterman(1981)发表，它是一种发现两个序列的最佳局部比对的成熟方法。另一种算法ParAlign是用于序列比对的启发式方法；该方法的详细描述发表于Rognes(2001)中。使用了得分矩阵和空位罚分以及E值的默认设置。

在涉及两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上一致”或“大致相同”是指当进行最大对应的比较和比对时，使用以下序列比较算法之一或通过直观观察来测量，两个或多个序列或子序列分别具有至少约60％、70％、75％，优选80％或85％，更优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更大的核苷酸或氨基酸残基百分比同一性。在一些方面，“基本上一致”存在于长度至少为50个残基的氨基酸序列区域，例如，至少约100、110、120、125、130、135、140、145、150、155、160或165个氨基酸残基。在一些方面，“基本上一致”存在于长度至少约150个核酸残基的核酸序列区域，例如至少约200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800个核酸残基，例如至少约900个核苷酸，或例如至少约1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb，或者例如至少约3kb。在一些方面，氨基酸或核酸序列在全长多肽序列或相应编码区的范围内是基本上一致的。

术语“保守替换”是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)的组内进行的。氨基酸替换通常不改变特定活性是本领域已知的并描述于例如，H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，The Proteins，AcademicPress，New York。最常发生的更替是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及这些的反转。

本文使用的术语“保守替换变体”是指包含一个或多个保守替换的核苷酸序列变体。

一般地以及在本文的上下文中，术语“沉默替换”是指不影响密码子含义因而对多肽结构无影响的碱基替换。如技术人员所知，遗传密码的简并性使沉默替换成为可能。

术语“保守结构域”是指多肽在多个物种之间相似的氨基酸序列或DNA或RNA中这样的核苷酸序列。已知的保守序列集合通过共有序列来表示。氨基酸基序常由保守序列组成。此外，术语“保守序列”还指核酸序列分子中在整个进化中保持基本上未改变的碱基序列或蛋白质中的氨基酸序列。“共有序列”定义为代表最经常出现于核酸序列中各位置的碱基或最经常出现于蛋白质中各位置的氨基酸的理想序列。“共有序列”通过比对所有已知的核酸序列或蛋白质实例使其序列同一性最大化来鉴定。对于待承认为共有序列的序列而言，各具体碱基或氨基酸必须在其位置相当占优势，并且绝大多数序列中须与共有序列一致而只有少量发生替换，例如1个或2个。

本文中使用的术语“启动子”是指位于基因转录起点上游的序列决定区，并且其参与RNA聚合酶及其它蛋白质的识别和结合从而起始和调节转录。植物中可用的启动子不一定是植物来源的。“基本启动子(basalpromoter)”是组装转录起始所需之转录复合物所需的最小序列。基本启动子常包含通常位于转录起始位点上游15～35个核苷酸之间的“TATA盒”元件。基本启动子有时还包含“CCAAT盒”元件(通常为CCAAT序列)和/或GGGCG序列，其通常位于转录起始位点上游的40～200个核苷酸之间，优选60～120个核苷酸之间。

本文中称作“组成型启动子”的启动子在大多数(但不一定是所有的)环境条件以及发育或细胞分化状态下活跃地启动转录。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区以及来源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)TDNA的1’或2’启动子，以及技术人员已知的来自多种植物基因的其它转录起始区，例如玉米泛素(ubiquitin)-1启动子。器官特异性启动子可以是，例如，来自贮藏组织(storage sinktissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子，或者来自代谢组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子，种子特异性启动子例如来自水稻的谷蛋白(glutelin)、谷醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白或白蛋白启动子，来自蚕豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4以及来自蚕豆的未知种子蛋白质基因的启动子，来自种子油体蛋白质的启动子，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白质napA启动子，或者本领域已知的任何其它种子特异性启动子，例如，如WO 91/14772中所述。此外，启动子可以是叶子特异性启动子，例如来自水稻和番茄的rbcs启动子、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子、或来自水稻的aldP基因启动子，或者创伤诱导型启动子例如马铃薯pin2启动子。

在本发明的上下文中，“诱导型启动子”是指受某些条件调控的启动子，例如光、化学物质浓度、蛋白质浓度；生物、细胞或细胞器的状态等。诱导型启动子的实例是HSP启动子和PARSK1，后者是来自编码丝氨酸-苏氨酸激酶的拟南芥基因的启动子并且被脱水、脱落酸和氯化钠所诱导。实质上，受诱导型启动子控制的表达响应于所应用的刺激而“开启”或提高。所述刺激的性质依启动子而变化并可包括上述环境因素。无论在不存在刺激时表达水平如何，在正确的刺激存在时由任何诱导型启动子起始的表达都是提高的。

本文中使用的术语“组织特异性的”是指在特定组织中的特性，其一般并非在所有组织中出现，或者可仅在目的组织中出现。在本申请中，“组织特异性的”在涉及基因调控元件(启动子或启动子加增强子和/或沉默子)、其编码的基因或者所述基因的多肽产物时使用。在涉及基因调控元件或“组织特异性启动子”时，该术语意指所述启动子(以及其它调控元件例如增强子和/或沉默子元件)在特定谱系、组织或细胞类型的细胞中指导所连接序列转录，而在非所述谱系、组织或细胞类型的细胞或组织中则基本上失活。就转录物产生而言，本发明可用的组织特异性启动子在特定组织中比在其它组织的细胞中或在同一谱系的转化或恶性细胞中要高出至少5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或甚至1000倍。在涉及基因或基因多肽产物时，术语“组织特异性的”意指所述基因的多肽产物在该特定组织或细胞类型的细胞中可检测到，但在某些其它细胞类型中则基本上检测不到。特别相关的组织特异性启动子包括在植物的木质部形成组织中特异表达或活跃的启动子序列。这样的启动子的实例有Lmp1、Lmx2、Lmx3、Lmx4和Lmx5启动子，参见WO 2004097024。

“终止子序列”是指在用于转录的基因组DNA上标志着基因或操纵子末端的遗传序列部分。终止子序列被蛋白因子识别，所述蛋白因子在多腺苷化信号处共转录切割新生RNA，使RNA聚合酶停止进一步延伸转录物。当某一核酸与另一核酸序列的位置具有功能联系时，所述核酸即为“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子增强了编码序列的转录，则该启动子或增强子与该编码序列有效连接。“有效连接”意指被连接的DNA序列通常是连续的(需要时连接两个蛋白质编码区)且在同一读码框内。然而，由于增强子通常在与启动子相隔数千碱基的情况下发挥作用并且内含子序列的长度可能不定，所以某些多核苷酸元件可以采用非连续的有效连接。

在本发明的上下文中，术语“转化”与“转染”是同义词，其是指将DNA引入细胞的过程。DNA构建体(包含目的基因或启动子的至少一部分)可被引入宿主细胞内，如前所述，可以是单独的细胞、培养中的细胞、作为宿主生物一部分的细胞、已受精的卵母细胞或配子体或胚胎细胞。当涉及宿主细胞时术语“引入”意指本领域已知的用于将重组载体DNA引入靶宿主细胞的标准步骤。这样的步骤包括但不限于转染、感染、转化、自然摄取、电穿孔、生物射弹(biolistics)和农杆菌(Agrobacterium)。

“可再生细胞(regenerable cell)”意指从其可再生出完整植物的植物细胞。应当理解，所述再生细胞是保持其遗传潜能(在本领域内也称为“全能性”)的细胞。还应理解，在培养时所述再生细胞可能需要适当的刺激来表达亲本植物的全部遗传潜能。

转基因植物的产生方法

用于选择基因的功能分析

可使用现有技术的步骤来鉴定用于改变和/或修饰生长相关植物表型的候选基因，例如，如Hertzberg等(2001)和Schrader等(2004)中所述。参与生长调控的候选基因还可例如在具有使用现有技术知识鉴定之特殊特性的转录因子中进行鉴定。为了使针对生长相关特性/功能的功能基因组计划的阳性结果最多，所述候选基因鉴定在本领域中被认为是重要的。因此，本发明的第一方面提供了产生较其野生型而言生长有所提高的转基因植物的方法，该方法包括改变植物中在木质形成阶段特异性表达的至少一种基因的基因产物水平。

基于靶向所述候选基因，本发明提供了产生转基因植物的方法，所述方法包括靶向已通过新方法进一步选定供功能分析的基因。

根据该方面的一个实施方案，所述至少一种基因的选择满足该基因的RNAi下调在一组3-8株转基因植物中引起以下效果的标准：

d)在最终高度最大值(MFH)和/或最终直径最大值(MFD)和/或最大高度生长速率最大值(MMHGR)和/或直径系数最大值(MDC)中具有18％或更大的差异；并且

其中最大高度生长速率定义为以4个连续的高度数据点拟合的线性函数的斜率，高度生长速率值是以逐步的方式针对数据点1-4、数据点2-5等计算得到的，而最大高度生长速率值是最后针对每株植物从生长速率值中选择的。

含有N 84g/l、P 12g/l和K 56g/l的肥料是目前可获得的，商品名为Weibulls Rika S NPK7-1-5。该肥料的成分如下(均为g/l)：总N＝84，N0₃＝55，NH₄＝29，P＝12，K＝56，Mg＝7.2，S＝7.2，B＝0.18，Cu＝0.02，Fe＝0.84，Mn＝0.42，Mo＝0.03，Zn＝0.13。

在另一实施方案中采用了更严格的一组标准。根据该实施方案，所述至少一种基因的选择满足该基因的RNAi下调在一组3-8株转基因植物中引起以下效果的标准：

当比较在18小时光周期、22℃/15℃温度(白天/夜晚)以及每周一次施用N 84g/l、P 12g/、K 56g/l的条件下于温室中培育8周的所述转基因植物组与相同条件下培育的野生型植物组时，

a)在最终高度平均值(AFH)、最终高度最大值(MFH)、最大高度生长速率平均值(AMHGR)和最大高度生长速率最大值(MMHGR)中具有8％或更大的差异；和/或

b)在最终直径平均值(AFD)、最终直径最大值(MFD)、直径生长速率平均值(ADGR)和直径系数最大值(MDC)中具有8％或更大的差异；和/或

c)在最终高度平均值(AFH)和/或最终直径平均值(AFD)和/或最大高度生长速率平均值(AMHGR)和/或直径生长速率平均值(ADGR)中具有22％或更大的差异；和/或

d)在最终高度最大值(MFH)和/或最终直径最大值(MFD)和/或最大高度生长速率最大值(MMHGR)和/或直径系数最大值(MDC)中具有22％或更大的差异；

本发明的一个优点是它提供了用于评估参与决定生长特性之候选基因的极其灵敏的分析平台。先前的基因评估方法基于依照单一标准(例如植物高度或直径)进行表型评估，而本发明的方法允许基于多重标准对表型进行表征，包括最终高度平均值、最终高度最大值、最大高度生长速率平均值和最大高度生长速率的最大值。使用该分析平台允许鉴定和选择在产生生长提高之植物的方法中所用的新的靶基因。如果使用较简单的方法，这些靶标基因将不会被认为参与生长特性的决定或者它们只被认为在产生生长表型中起不重要的作用。

在本发明的一些具体实施方案中，相对于相应野生型植物而言，通过改变根据以上标准评估和选择之候选基因的表达水平来产生具有有利的植物表型。根据这些方面提供的方法包括改变植物中至少一种基因的基因产物水平，所述基因包含选自以下的核苷酸序列：

a)选自SEQ ID NO：1-17、50、51、54-58、60的核苷酸序列；例如SEQID NO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60；

b)与选自SEQ ID NO：1-17、50、51、54-58、60的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)具有至少60％同一性的核苷酸序列；

c)a)或b)的核苷酸序列的子序列或片段。

由序列ID号1-17、50、51、54-58、60指示的序列(例如SEQ ID NO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)代表克隆自杂交山杨的候选基因的部分序列。正如技术人员所应理解地，使用常规克隆技术(例如Sambrook等所述的技术)可容易地获得在SEQID NO：1-17、50、51、54-58、60(例如SEQ ID NO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)中所述的序列5’和3’端的另外的序列。

核酸构建体

根据本发明的一些更具体的实施方案，所述方法包括提供核酸构建体(例如重组DNA构建体)的步骤，所述核酸构建体包含选自以下的核苷酸序列：

d)包含选自SEQ ID NO：1-17、50、51、54-58、60(例如SEQ ID NO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)之序列的核苷酸序列；

e)d)之核苷酸序列的互补核苷酸序列；

f)d)或e)之核苷酸序列的子序列或片段；

g)与d)、e)和f)中的任一序列至少60％一致的核酸序列；以及

h)在严格条件下与d)、e)或f)之核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在本发明的另一些实施方案中，c)或g)中的核酸序列与a)、c)、d)、e)或f)中的任一序列至少65％一致，例如与a)、c)、d)、e)或f)中的任一序列至少70％一致，至少75％一致，至少80％一致，至少85％一致，至少87％一致，至少90％一致，至少95％一致，至少97％一致，至少98％一致，至少99％一致或至少99.5％一致。

在本发明该方面的一些优选实施方案中，a)的核苷酸序列选自SEQ IDNO：1、5、6、9、11、12、15、17、56、57和58。

本领域中存在多种用于产生本发明的核酸序列和核酸/DNA构建体的方法。用于鉴定和分离DNA克隆的步骤是本领域技术人员公知的，参见例如Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第二版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989。或者，本发明的核酸序列可利用适合本发明的多种体外扩增方法通过适当选择特异性或简并性引物来产生。足以指导技术人员实施体外扩增方法的方案实例包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增及其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA)，例如用于产生本发明的同源核酸，参见Sambrook(同上)。

或者，可从固相合成方法所产生的片段组装成本发明的核酸构建体。通常，单独合成多达约100个碱基的片段，然后利用酶促法或化学法连接以产生所需序列，例如编码转录因子全长或部分的多核苷酸。例如，利用亚磷酰胺法进行化学合成是技术人员众所周知的。根据所述方法，寡核苷酸被合成、纯化、与其互补链退火、连接、然后任选地克隆进合适的载体中。

如所提及地，上述序列来自杂交山杨。技术人员应当理解，可从其它物种分离出所述序列的同源物，其非限制性的实例包括金合欢树(acacia)、桉树、角树(hornbeam)、山毛榉树(beech)、桃花心木(mahogany)、胡桃、橡树、白蜡树(ash)、山胡桃树(hickory)、桦树、栗树、赤杨(alder)、枫树、悬铃木(sycamore)、银杏树、棕榈树、香枫(sweet gum)、柏树、花旗松(Douglas fir)、冷杉、红杉(sequoia)、铁杉、雪松、杜松(juniper)、落叶松(larch)、松树、巨杉(redwood)、云杉、紫杉(yew)、苹果树、李子树、梨树、香蕉树、桔树、猕猴桃树、柠檬树、樱桃树、葡萄树、无花果树、棉花、竹子、柳枝稷(switch grass)、草芦(red canary grass)和橡胶植物。所述序列的可用同源物还可从来自杨柳科(Salicaceae)的硬木植物中分离，例如来自柳属和杨属。所述属中的成员的已知常用名为：柳树、杨树和山杨。

具体地，本发明的核苷酸序列包含选自SEQ ID NO：18-38、48、49、51-60(例如SEQ ID NO：20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列或其互补核苷酸序列。

显而易见地，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少15个核苷酸，例如至少16个核苷酸，至少17个核苷酸，至少18个核苷酸，至少19个核苷酸，至少20个核苷酸，至少21个核苷酸，至少22个核苷酸，至少23个核苷酸，至少24个核苷酸，至少25个核苷酸，例如至少30个核苷酸，至少35个核苷酸，至少40个核苷酸，至少45个核苷酸，至少50个核苷酸，至少55个核苷酸，至少60个核苷酸，至少65个核苷酸，至少70个核苷酸，至少75个核苷酸，至少80个核苷酸，至少85个核苷酸，至少90个核苷酸，至少95个核苷酸，或者例如至少100个核苷酸。在某些实施方案中，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少约150个核酸残基，例如至少约200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800个核苷酸，例如至少约900个核苷酸，或者例如至少约1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb或例如至少约3kb。

特别地，本发明的方法可包括提供含有核苷酸序列的核酸构建体(例如重组DNA构建体)的步骤，所述核苷酸序列与所述特定序列相比包含改变所编码多肽中一个或数个氨基酸的保守性变化。因此，本发明的范围中提供和使用重组DNA构建体，其包含编码含有a)中多肽之保守替换变体的多肽的核苷酸序列。

不改变多核苷酸所编码之氨基酸序列的序列改变被称为“沉默替换”。除了分别编码甲硫氨酸和色氨酸的密码子ATG和TGG之外，针对同一氨基酸的任何可能密码子均可通过本领域中可获得的多种技术(例如定点诱变)进行替换。因此，本发明还可提供重组核酸构建体，其中核苷酸序列包含在核苷酸序列中的沉默替换。

在本发明的另一些实施方案中，所述子序列或片段与上述a)或d)中核苷酸序列的保守结构域具有至少65％的序列同一性，例如与上述a)或d)中核苷酸序列的保守结构域至少70％一致，至少75％一致，至少80％一致，至少85％一致，至少87％一致，至少90％一致，至少95％一致，至少97％一致，至少98％一致，至少99％一致或至少99.5％一致。

实现基因产物水平改变的方法

本发明通过降低或在某些情况下消除某些基因的表达来实施，本文中提供了如何实现的非限制性实例。上述核酸构建体或重组DNA构建体可用于鉴定较野生型而言生长特性发生改变的植物。这样的植物可以是例如天然存在的变体或经遗传修饰表现出改变的生长特性的植物。为此目的，本发明的核酸构建体或重组DNA构建体可用作例如常规杂交测定中的探针或用作特异性扩增核酸片段的引物。

尽管本发明的主要部分是基因产物的下调如何得到所需效果，它还显示改变本文所示基因的表达可用于改良所需特性，这是看待所述数据的另一种思路，即增加植物内的所述基因产物也是改良所需性状的一种方式。存在不同的方法来提高基因产物的水平，这些与下调下述基因产物的方法平行描述于下文中。

这些基因还可用作标记辅助育种(marker assisted breeding)的靶标，这是因为基因调控序列中的变化可引起表达模式的改变，而编码序列中的变化可引起基因功能的改变，并且我们已知对这些基因进行操作可引起所述性状的改变。

此外，本发明的核酸构建体或重组DNA构建体可用于基因置换的目的来修饰相应的植物生长表型。

可例如使用核酶来实现内源基因表达的抑制。核酶是具有高度特异性内切核糖核酸酶活性的RNA分子。核酶的制备和使用公开于美国专利No.4,987,071和美国专利No.5,543,508中。反义技术在下文中论述，应注意的是，包含反义RNA的合成核酶序列可用于赋予反义RNA以RNA切割活性，从而使与该反义RNA杂交的内源mRNA分子被切割，进而导致对内源基因表达的反义抑制增强。

还可使用其中由相关基因同源物编码的RNA过表达的载体来实现相应内源基因的共抑制，例如，采用Jorgensen的美国专利No.5,231,020中所述的方法。这样的共抑制(也称为有义抑制)不需要将完整的序列引入植物细胞中，也不需要所引入序列与内源目的序列完全一致。然而，当杂交的特异性增加时(例如，当加长所引入序列时，和/或当所引入序列与内源转录因子基因之间的序列相似性增加时)抑制效率将会提高。

表达不可翻译形式之基因(例如含有一个或多个终止密码子或无义突变的序列)的载体也可用于抑制内源转录因子的表达，从而降低或消除其活性并改良一种或多种性状。用于产生所述构建体的方法参见美国专利No.5,583,021。特别地，这样的构建体可通过在基因中引入提前终止(premature)的终止密码子来制备。

进行靶DNA插入的一种方法是通过利用如W02006/078431中所述的逆转录病毒DNA整合机制来实现。该技术是基于可以通过将整合酶与DNA结合蛋白质(束缚蛋白)有效偶联来改变逆转录病毒和逆转座子整合酶整合位点特异性。对整合酶的改造优选在核酸水平上进行，通过利用PCR来修饰野生型整合酶的编码序列。这样，可将整合酶复合物引导至期望部分或引导其远离基因组DNA的不期望部分，从而产生期望的整合位点特性。

另一种此类技术是“靶向诱导基因组的局部损伤(Targeting InducedLocal Lesions in Genomes)”，这是一种以靶向方式改变基因功能的非转基因方法。该方法包括用例如甲磺酸乙酯(EMS)使植物突变，然后找出其中特定所需基因已被修饰的个体。该技术可参见例如Slade和Knauf，Transgenic Res.2005年4月；14(2)：109-15以及Henikoff，Till和Comai，Plant Physi01.2004年6月；135(2)：630-6。

消除基因表达的另一种方法是通过利用根瘤农杆菌的T-DNA插入突变来实现。在产生了插入突变体之后，可对突变体进行筛选以鉴定那些在适当基因中包含所述插入的突变体。可将在期望基因处包含单个转基因插入事件的植物进行杂交，以生成针对该突变的纯合植物。

对技术人员来说显而易见地，还可通过使用cre-lox系统来修饰植物性状。可将植物基因组修饰为包含第一和第二lox位点，然后将所述lox位点与Cre重组酶接触。倘若所述lox位点的方向相同，则介于这两个位点之间的DNA序列将会被切除。如果所述lox位点的方向相反，则介于其中的序列会被倒置。

本发明的多核苷酸和多肽还可在不存在表达盒的情况下通过以其它方式操控内源基因的活性或表达水平而表达于植物中，例如，通过利用T-DNA激活标签来异位表达基因(Ichikawa等(1997)Nature 390698-701；Kakimoto等(1996)Science 274：982-985)。该方法需要用含有多种转录增强子的基因标签转化植物，并且一旦标签被插入基因组中，两侧基因编码序列的表达就被解除控制。在另一实施例中，可改进植物中的转录机器以便提高本发明多核苷酸的转录水平(参见，例如PCT公开物WO96/06166和WO 98/53057，其描述了通过改变DNA结合基序中的特定氨基酸来修饰锌指蛋白质的DNA结合特异性)。

表达的反义抑制

然而，包含上述核苷酸序列的重组DNA构建体尤其可用于表达的有义和反义抑制，例如，用于下调特定基因的表达，从而获得生长提高的植物表型。也就是说，本发明的核苷酸序列或其子序列或反义序列可用于阻断天然存在同源核酸的表达。传统的有义和反义技术的变体是本领域已知的，例如描述于Lichtenstein和Nellen(1997)，Antisense Technology：APractical Approach IRL Press at Oxford University，Oxford，England。反义方法的目的是利用与靶基因互补的序列来阻断其表达，以及建立其中单个选定蛋白质的水平被选择性降低或消除的突变细胞系或生物体。

例如，为了得到以生长提高为特征的植物表型，可通过引入对应于目的多肽之cDNA的反义构建体来实现转基因植物中基因产物表达的降低或消除(即“敲除”)。对于反义抑制，在表达载体中以相对于启动子序列而言相反的方向(就编码序列而言)安排编码基因产物或其部分的cDNA。所引入的序列不需要是全长的cDNA或基因，也不需要与待转化植物类型中所发现之cDNA或基因完全一致。通常，反义序列只需要能够与靶基因或目的RNA杂交即可。因此，在引入序列长度较短的情况下，为了有效的反义抑制就需要与内源转录因子序列具有较高程度的同源性。尽管可应用各种长度的反义序列，但优选地，在载体中引入的反义序列长度范围是15-30个核苷酸，例如16-28个核苷酸、17-26个核苷酸或18-24个核苷酸，并且随着反义序列长度的增加，通常可观察到反义抑制的提高。优选地，载体中反义序列的长度应大于100个核苷酸。所述反义构建体的转录导致产生与转录自植物细胞内源基因的mRNA分子反向互补的RNA分子。

有关应用于植物细胞中的基因表达反义调控的更详细描述可参见美国专利No.5,107,065，其内容通过引用以整体并入本文。

RNA干扰

由双链RNA引起的基因沉默通常称为RNA干扰或RNAi。RNA干扰是双链核糖核酸(dsRNA)片段干扰与该dsRNA共有同源序列的特定基因表达的一种分子机制。这种由与加工microRNA同样的细胞机制介导的加工已知为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)。该加工由核糖核酸酶蛋白Dicer起始，Dicer结合并切割外源双链RNA分子以产生在各端具有少数未配对突出碱基的20-25个碱基对的双链片段。由Dicer产生的短双链片段称为小干扰RNA(siRNA)，它们被分开并整合入活性RISC复合物中。如果RNA转录物的一部分被RNAi分子或构建体靶向，则所述整个转录物被下调。

RISC复合物的催化活性组分在动物内已知为argonaute蛋白，其为介导siRNA诱导的靶mRNA链切割的内切核酸酶。因为Dicer产生的片段是双链的，因此它们在理论上每条均可产生有功能的siRNA；但是，两条链中只有一条(称为“引导链(guide strand)”)结合argonaute蛋白并导致基因沉默。另一条反引导链(anti-guide strand)或过客链(passengerstrand)在RISC活化过程中被降解成RISC底物。选作引导的链通常为5’端更稳定的链，但链的选择不取决于RISC加入前Dicer切割dsRNA的方向。

实验室中使用的RNA干扰常包括引起mRNA切割的碱基完美配对的dsRNA分子。在整合入RISC中后，siRNA与其靶mRNA碱基配对并诱导RISC组分蛋白argonaute切割mRNA，从而阻止其被用作翻译模板。为了在体外或在体内稳定，siLNA或siRNA化合物的序列不需要与其靶核酸100％互补。siRNA化合物(以及下述的siLNA化合物)与其靶分子互补并可特异性杂交的事实仅仅意味着siRNA(或siLNA)化合物与靶分子的结合足够强及特异，以提供对靶标正常功能的预期干扰，而非靶mRNA的功能则不受影响。

已知掺入寡聚物中的LNA单体会引起寡聚物及其可形成之杂交体的RNA样结构。还显示LNA残基会指导该结构朝LNA掺入的3’端方向加入DNA残基以及朝向5’端的较少延伸。其后果是有可能通过DNA单体修饰RNA链，并且如果一个或多个LNA残基在DNA单体的两侧，它们仍会形成RNA结构。因此，DNA和LNA可替换RNA单体，除此之外，所述寡聚体仍会形成大体的RNA样结构。DNA要比RNA便宜得多，并且更易于合成，对核酸酶也更稳定，因此这样的修饰将提高siRNA的整体用途和适应性。

生物体在其细胞摄取外源dsRNA并将其用于RNAi途径的能力上是不同的。然而，在植物中，由RNAi引起的基因沉默可在植物中的细胞之间蔓延，因此RNA干扰的作用在植物中是系统性的且可遗传的。

有关利用dsRNA转录在植物中进行RNAi基因抑制的详细描述参见美国专利No.6,506,559、美国专利申请公开No.2002/0168707 A1以及美国专利申请系列号No.09/423,143(参见WO 98/53083)、系列号No.09/127,735(参见Wo 99/53050)和系列号No.09/084,942(参见Wo 99/61631)，所有这些文献均通过引用以整体并入本文。

在本发明举例说明的一些具体实施方案中，c)中的子序列或片段包含SEQ ID NO：18-38、48、49、51-60(例如SEQ ID NO：20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列。

载体的构建

一般地，本领域技术人员完全能够构建本发明的载体并设计适于重组基因表达的方案。有关载体制备一般方案的更多细节参见：MolecularCloning：a Laboratory Manual：第二版，Sambrook等，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press。用于反义基因的启动子可影响反义抑制的水平、时间选择、组织、特异性或可诱导性。此外，反义序列可通过选择靶基因的独特区域或者它与其它相关基因共有同源性的区域来操纵其特异性。

一般地，通过RNA干扰抑制基因可使用重组DNA构建体来实现，所述重组DNA构建体具有与含有所述基因之基因组DNA或cDNA片段的有义和反义元件的DNA元件有效连接的启动子，所述片段为例如约25个核苷酸，例如至少30个、至少40个、至少50个、至少75个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个或至少750个核苷酸，或者例如至少1kb，例如至少1.5kb、至少2kb、至少2.5kb或例如至少3kb，其中所述有义和反义DNA组分可直接连接内含子或人工DNA片段，其可在所转录RNA杂交形成发夹结构时形成环。

在本发明的有关实施方案中，所述核酸构建体或重组DNA构建体还包含组成型、诱导型或组织特异性的与所述核苷酸序列有效连接的启动子。

核酸构建体或重组DNA构建体的一个实例具有驱动来自靶基因之DNA片段以及随后的以反相重复形式出现的较短序列转录的启动子，这一切引发了靶基因的RNAi应答。这样的构建体已描述于：Brummel D.A.等Plant Journal 2003，33，第793-800页)。

在另一实例中，人工microRNA的构建是用启动子驱动模拟microRNA功能的RNA分子表达，而设定基因特异性的序列是通过重组方式引入的(参见Niu等，2006.Exp ression of artificial microRNAs intransgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance.Science 2006，24卷，No.11第1420-1428页)。microRNA可以是天然存在而过表达的。

在本发明的一个具体实施方案中，核酸构建体或重组DNA构建体还包含位于转录盒之前的强组成型启动子，所述转录盒由靶基因部分及随后的植物功能性内含子以及再后方向相反的该靶基因部分组成，该转录盒后面是终止子序列。优选的载体是本发明的核苷酸序列之一以反转重复方向插入的这种类型。

在本发明目前一个优选的实施方案中，核酸构建体或重组DNA构建体包含SEQ ID NO：47的序列。

目前优选用于基于RNAi之方法的核酸构建体是被称为pK7GWIWG2(I)的载体。该载体描述于：Gateway vectors forAgrobacterium-mediated plants transformation，Karimi，M.等，Trends Inplant Sciences，第7卷第5期，第193-195页。同一基本类型的载体较早描述于Wesley S.V.等，Construct design for efficient，efiective andhigh-throughput gene silencing in plants.Plant Journal 2001，27，第581-590页。

本领域技术人员应理解，作为基因一部分的任何序列或本文提供的相应mRNA均可用于下调所述mRNA的水平。在所提供序列不代表完整mRNA的情况下，可用本领域技术人员已知的各种技术克隆出完整的mRNA，例如Sambrook等所述的技术。对于发现与杨属基因之mRNA转录物相关的更多序列尤为重要的新近资源是已公开的毛果杨的基因组以及描述于Tuskan等2006(G.A Tuskan等，2006.The genome of BlackCottonwood，Populus tricocarpa(Torr. &Gray).Science 313卷No.5793，第1596-1604页)中的资源。

植物细胞的转化

根据本发明，所述方法包括用所述核酸构建体或重组DNA构建体转化植物可再生细胞并从所述转化细胞再生出转基因植物的另外步骤。当将以上DNA构建体或载体引入植物细胞中时，必须考虑到本领域技术人员众所周知的某些问题。如上所述，待插入的核酸应组装于含有驱动转录之有效调控元件的构建体内。必须有可将构建体转运入细胞内的方法。构建体一旦在细胞内，就会整合或不整合进内源染色体物质。

可使用本领域技术人员众所周知的转化技术将DNA构建体和载体引入植物细胞内以产生具有改良之植物生长特性的转基因植物，尤其是转基因树木。

本领域技术人员将认识到，可利用多种宿主细胞作为本发明DNA构建体和载体的受者。宿主细胞的非限制性实例包括胚胎组织、I、II和III型愈伤组织、下胚轴、分生组织、根组织以及在韧皮部中表达的组织的细胞。

如上所列举的，农杆菌转化是本领域技术人员广泛用于转化树木品种尤其是硬木品种(例如杨树)的一种方法。产生稳定的、可繁育的转基因植物目前在本领域中是常规的技术。当农杆菌转化效率低或无效时(例如在某些裸子植物品种中)，可使用其它方法，例如微粒或颗粒轰击、电穿孔、显微注射、直接的DNA摄取、脂质体介导的DNA摄取或涡旋混合(vortexing)方法。

或者，可采用不同技术的组合来提高转化处理的效率，例如用农杆菌包被的微粒轰击或者微粒轰击引起创伤后与农杆菌共培养。

应当理解，转化技术的具体选择应取决于其转化某植物品种的效率以及本发明实施人员对选择具体方法的经验和偏好。对于技术人员来说显而易见的是，对用于将核酸引入植物细胞的转化体系的具体选择不是本发明的本质问题或对本发明产生限制，对植物再生技术的选择也是如此。

转化后，优选使用掺入转化载体中的显性选择标记来选择转基因植物。通常，这样的标记可使转化植物具有抗生素或除草剂抗性，可通过将植物暴露于适当浓度的抗生素或除草剂中来实现转化子的选择。新型选择标记利用D形(D-form)氨基酸并基于植物只可耐受L形氨基酸的事实，其提供了一种快速、有效并对环境有利的选择体系。该选择体系之所以吸引人是因为它既能选择又能反选择(counter-selection)。

随后，如本领域中的标准一样，植物可从例如单个细胞、愈伤组织或叶盘再生。几乎任何植物都可从植物的细胞、组织和器官完全再生。可用的技术综述于Vasil等1984，Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants，I，II和III卷，Laboratory Procedures。

在选定转化植物并培养至成熟后，鉴定出那些表现出生长提高表型的植物。此外，为了证实所述表型归因于本文公开之多肽或多核苷酸表达水平或活性的改变，可利用Northern印迹、RT-PCR或微阵列分析mRNA表达或利用免疫印迹、Western印迹或凝胶迁移测定分析蛋白质表达来加以确定。

植物品种

根据本发明，所述方法生成了较其来源的野生型植物而言生长有所提高的转基因植物。在本发明方法的一个实施方案中，转基因植物是多年生植物，即存活超过两年的植物。在一个具体实施方案中，所述多年生植物是木本植物，其可定义为具有高度木质化之茎(或多于一条茎)的维管植物。

在一个优选的实施方案中，所述木本植物是硬木植物，即阔叶树或被子植物，其可选自：金合欢树、桉树、角树、山毛榉树、桃花心木、胡桃、橡树、白蜡树、柳树、山胡桃树、桦树、栗树、杨树、赤杨、枫树、悬铃木、银杏树、棕榈树和香枫。来自杨柳科的硬木植物(例如柳树、杨树和山杨)包括其变体是特别令人关注的，因为这两种类型包括生长迅速的树木品种或者为供暖提供木材和生物燃料而专门培育的木本灌木。用作生物能源的纤维质草类(例如柳枝稷和草芦)也是令人关注的。

在另一些实施方案中，所述木本植物是软木或针叶树，其可选自柏树、花旗松、冷杉、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、巨杉、云杉和紫杉。

在可用的实施方案中，所述木本植物是结果植物，其可选自苹果树、李子树、梨树、香蕉树、桔树、猕猴桃树、柠檬树、樱桃树、葡萄树和无花果树。

可用于本发明方法中的其它木本植物还可选自棉花、竹子和橡胶植物。

DNA构建体

根据本发明的另一主要方面，提供了至少包含一个上述序列的DNA构建体(例如重组DNA构建体)。具体地，所述重组DNA构建体可包含选自以下的核苷酸序列：

a)包含选自SEQ ID NO：1-17、50、51、54-58、60(例如SEQ ID NO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)之序列的核苷酸序列；

b)a)之核苷酸序列的互补核苷酸序列；

c)a)或b)之核苷酸序列的子序列或片段；

d)与a)、b)和c)中的任一序列至少60％一致的核酸序列；以及

e)在严格条件下与a)、b)或c)之核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在本发明的一些选定实施方案中，d)中的核酸序列与a)、b)和c)中的任一序列至少65％一致，例如与a)、b)和c)中的任一序列至少70％一致，至少75％一致，至少80％一致，至少85％一致，至少87％一致，至少90％一致，至少95％一致，至少97％一致，至少98％一致，至少99％一致或至少99.5％一致。

在与本发明该方面相关的另一些实施方案中，所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO：18-38、48、49、51-60(例如SEQ ID NO：20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列或其互补核苷酸序列。

同样与本发明的该方面有关，显然地，上述c)中的子序列或片段包含至少15个核苷酸，例如至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸，例如至少30个核苷酸、至少35个核苷酸、至少40个核苷酸、至少45个核苷酸、至少50个核苷酸、至少55个核苷酸、至少60个核苷酸、至少65个核苷酸、至少70个核苷酸、至少75个核苷酸、至少80个核苷酸、至少85个核苷酸、至少90个核苷酸、至少95个核苷酸，或者例如至少100个核苷酸。在某些实施方案中，上述c)中的子序列或片段包含至少约150个核酸残基，例如至少约200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800个核苷酸，例如至少约900个核苷酸，或者例如至少约1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb或例如至少约3kb。

同样，根据以上论述，所述核苷酸序列编码含有a)多肽之保守替换变体的多肽。另外，所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。

在涉及本发明该方面的另一些实施方案中，所述子序列或片段与上述a)中核苷酸序列的保守结构域具有至少65％的序列同一性，例如与上述a)中核苷酸序列的保守结构域至少70％一致，至少75％一致，至少80％一致，至少85％一致，至少87％一致，至少90％一致，至少95％一致，至少97％一致，至少98％一致，至少99％一致或至少99.5％一致。

在一些具体的实施方案中，c)中的子序列或片段包含SEQ ID NO：18-38、48、49、51-60(例如SEQ ID NO：20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列。

在另一些实施方案中并且根据以上描述，重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性的启动子。特别地，所述重组DNA构建体还可包含位于转录盒之前的强组成型启动子，所述转录盒由靶基因部分及随后的植物功能性内含子以及再后方向相反的上述靶基因部分组成。同样如上文所解释地，另一类优选的重组DNA构建体包含驱动来自靶基因之DNA片段转录的启动子以及随后的以反转重复形式存在的较短序列。

在本发明目前示例的一些实施方案中，重组DNA构建体包含SEQID NO：47的序列。

转基因植物

本发明的第三方面提供了包含重组多核苷酸(DNA构建体)的转基因植物，所述重组多核苷酸包含能改变植物中在木质形成阶段中特异性表达的至少一种基因的基因产物水平的核苷酸序列。与上述类似地，应当理解，在某一实施方案中所述至少一种基因的选择满足该基因的RNAi下调在一组3-8株转基因植物中引起以下效果的标准：

根据本发明该方面的另一实施方案，在木质形成阶段表达的基因的选择满足该基因的RNAi下调在一组3-8株转基因植物中引起以下效果的标准：

根据本发明的一些具体实施方案，将包含选自以下核苷酸序列的至少一种基因的基因产物水平相对于各自相应野生型植物中所发现的水平进行改变：

a)选自SEQ ID NO：1-17、50、51、54-58、60(例如SEQ ID NO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)的核苷酸序列；

b)与选自SEQ ID NO：1-17、50、51、54-58、60(例如SEQ ID NO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)的核苷酸序列至少60％一致的核苷酸序列；

c)a)或b)之核苷酸序列的子序列或片段。

根据本方面的另一实施方案，所述转基因植物包含含有选自以下组中的核苷酸序列的重组多核苷酸(DNA构建体)：

e)d)之核苷酸序列的互补核苷酸序列；

f)d)或e)之核苷酸序列的子序列或片段；

g)与d)、e)和f)中的任一序列至少60％一致的核酸序列；以及

在本发明该方面的另一些实施方案中，c)或g)中的核酸序列与a)、b)、d)、e)或f)中的任一序列至少65％完全相同，例如与a)、b)、d)、e)或f)中的任一序列至少70％一致，至少75％一致，至少80％一致，至少85％一致，至少87％一致，至少90％一致，至少95％一致，至少97％一致，至少98％一致，至少99％一致或至少99.5％一致。

如上所提及地，技术人员会认识到本领域中存在多种方法用于得到本发明的核酸序列和多核苷酸构建体，例如，通过克隆技术、将固相合成产生的片段加以组装来实现。此外，技术人员应理解，可从其它物种分离出所述序列的同源物，其非限制性的实例包括金合欢树、桉树、角树、山毛榉树、桃花心木、胡桃、橡树、白蜡树、山胡桃树、桦树、栗树、赤杨、枫树、悬铃木、银杏树、棕榈树、香枫、柏树、花旗松、冷杉、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、巨杉、云杉、紫杉、苹果树、李子树、梨树、香蕉树、桔树、猕猴桃树、柠檬树、樱桃树、葡萄树、无花果树、棉花、竹子、柳枝稷(switch grass)、草芦(red canary grass)和橡胶植物。所述序列的可用同源物还可从来自杨柳科的硬木植物中分离，例如来自柳树、杨树或山杨。

特别地，本发明的核苷酸序列包含选自SEQ ID NO：18-38、48、49、51-60(例如SEQ ID NO：20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列或其互补核苷酸序列。

此外，显然地，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少15个核苷酸，例如至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸，例如至少30个核苷酸、至少35个核苷酸、至少40个核苷酸、至少45个核苷酸、至少50个核苷酸、至少55个核苷酸、至少60个核苷酸、至少65个核苷酸、至少70个核苷酸、至少75个核苷酸、至少80个核苷酸、至少85个核苷酸、至少90个核苷酸、至少95个核苷酸或例如至少100个核苷酸。在某些实施方案中，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少约150个核酸残基，例如至少约200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800个核苷酸，例如至少约900个核苷酸，或者例如至少约1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb或例如至少约3kb。

特别地，本发明的转基因植物可包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含的核苷酸序列相对于所述特定序列而言含有只改变编码多肽中一个或数个氨基酸的保守变体，这样的转基因植物也可根据本发明提供和使用。因此，提供包含如下重组DNA构建体的转基因植物是在本发明范围内的，即该重组DNA构建体含有的核苷酸序列编码包含a)或d)之多肽之保守替换变体的多肽。

因此，本发明还可提供重组DNA构建体，其中所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换，即，重组DNA构建体可包含不改变该多核苷酸所编码之氨基酸序列的序列变化。

在本发明示例的具体实施方案中，c)中的子序列或片段包含SEQ IDNO：18-38、48、49、51-60(例如SEQ ID NO：20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列。

在另一些实施方案中，本发明所提供的转基因植物包含重组多核苷酸构建体，所述构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性的启动子。

在又一些实施方案中，所述重组多核苷酸构建体还包含位于转录盒之前的强组成型启动子，所述转录盒由靶基因部分及随后的植物功能性内含子以及再后的方向相反的该靶基因部分组成。同样如上文所解释地，另一类优选的重组多核苷酸构建体包含驱动来自靶基因之DNA片段转录的启动子以及随后的以反转重复形式存在的较短序列。

在本发明示例的一些具体实施方案中，所述转基因植物包含重组多核苷酸构建体，其中c)中的子序列或片段包含SEQ ID NO：18-38、48、49、51-60(例如SEQ ID NO：20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列。

在本发明目前优选的一些实施方案中，本发明的转基因植物包含含有SEQ ID NO：47之序列的重组DNA构建体。

植物品种

根据本发明，转基因植物可以是多年生植物，优选木本植物或木质品种。在一个可用的实施方案中，所述木本植物是硬木植物，其可选自：金合欢树、桉树、角树、山毛榉树、桃花心木、胡桃、橡树、白蜡树、柳树、山胡桃树、桦树、栗树、杨树、赤杨、枫树、悬铃木、银杏树、棕榈树和香枫。来自杨柳科的硬木植物(例如柳树、杨树和山杨)包括其变体是特别令人关注的，因为这两种类型包括生长迅速的树木品种或者为供暖提供木材和生物燃料而专门培育的木本灌木。

在另一些实施方案中，所述木本植物是针叶树，其可选自柏树、花旗松、冷杉、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、巨杉、云杉和紫杉。

在一些可用的实施方案中，所述木本植物是结果植物，其可选自苹果树、李子树、梨树、香蕉树、桔树、猕猴桃树、柠檬树、樱桃树、葡萄树和无花果树。

本发明延伸至通过本文所述方法获得的以上转基因植物的任何植物细胞，以及所有的植物部分，包括植物的可收获部分、种子及其繁殖体以及植物外植体或植物组织。本发明还涵盖包含本发明DNA构建体的植物及其部分、植物细胞或植物后代。本发明进一步延伸至涵盖经由上述任何方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的后代，唯一的要求是该后代需表现出与经由本发明方法产生的亲本一样的基因型和/或表型特征。

应当注意的是，在本发明各方面之一中所述的实施方案和特征也适用于本发明的其它方面。

本申请中引用的所有专利和非专利文献均通过引用以整体并入本文。

现在将在以下非限制性的实施例中对本发明进行更详细地描述。

实施例

实施例1鉴定参与木质形成和木材生长的可用基因

1.1介绍

为了发现和阐明参与木质形成和木质生长之基因的功能，实施了广泛的基因发掘计划(gene mining program)，由此鉴定了在木材工业应用中可用的基因。

1.2.材料和方法

1.2.1基因选择

为了缩小待检测功能之基因的范围，该基因发掘方案的第一步是从一个大的基因集合中选择某些基因。该基因选择方法是基于如Hertzberg等(2001)和Schrader等(2004)中所述的基因表达模式。

在Hertzberg等(2001)中描述了对发育中的杨树次生木质部的研究。杨树的次生木质部是高度组织化的，在不同发育阶段具有易识别的且独特的边界。木质形成开始于维管形成层。形成层衍生物通过分裂、扩大、次生壁形成、木质化和最终的程序性细胞死亡过程发育成木质部细胞。

利用树木维管分生组织的大尺寸通过切向冷冻切片获取来自确定发育阶段的样品。为了测定欧洲山杨×美洲山杨(杂交山杨)中个体发育的木质形成期间特定阶段的稳定状态mRNA水平，采集贯穿木质发育区的30μm厚切片的样品，并随后用由来自杂交山杨的2995个独特EST组成的点样cDNA微阵列对样品进行分析(Hertzberg等，2001)。

随后还将这些样品如Schrader等(2004)中所述与已点样的微阵列再次杂交。从这些实验中，在木质形成不同阶段具有明显的特异性表达的基因被挑选出来(参见图1)。这是基于基因通常在其表达部位发挥其功能的推测。因此，在不同的木质形成阶段(例如细胞分裂、细胞扩大和形成层区域中细胞定型)特异性表达的基因以及在在次生细胞壁形成期间表达在成熟区域内的基因(其定义参见Wilson等，1966)比任何随机选择的基因更有可能对于木质形成过程具有重要性。与其它植物分生组织类似，维管形成层(图1，区域A)的主要功能是细胞分裂和起始分化。主要表达于分生组织和早期细胞扩大区域(图1，区域B)中的序列代表了参与细胞周期、细胞扩大、纤维尖端生长和初生细胞壁生物合成的候选基因。区域A和B还预期表达调控细胞命运和细胞身份的基因。细胞扩大发生于分生组织(区域A)中以及区域B和C中。因此，跨越区域A、B和C(图1)表达的基因可能在细胞扩大中发挥作用。细胞扩大一完成，次生细胞壁就沉积于所有木质部细胞内(区域D)。参与次生细胞壁生物合成的绝大多数基因预测存在于区域C(维管在此处起始其次生细胞壁)、D和E(图1)中。在区域E(图1)中显著上调的基因包括贯穿细胞壁形成凹陷(pit)和孔(pore)的最后阶段所需的许多壁降解酶，或者与纤维成熟的晚期阶段(例如木质化和程序性细胞死亡)相关的基因。表达于此区域内的基因还包括参与射线细胞(ray cell)中新陈代谢和转运的基因，所述射线细胞(与纤维相反)保持存活并维持其代谢活性。

选择在木质部发育不同阶段表达的大量不同基因用于通过在转基因杨树植物中的RNAi下调进行功能基因组分析。图2显示了选定并测试其功能之基因的表达模式的实例。

除了这种选择之外，还基于Schrader等(2004)中所述的分生组织阵列基因表达实验来选择基因。在该实验中只有形成层区域被采样。但是，样品更薄，导致了形成层分生组织的更高分辨率，即一个切片相当于形成层区域的约三层细胞，这样，为获得表达图谱提供了接近细胞特异性的分辨率。从该实验中，选择在形成层区域内具有峰值或者在形成层分生组织的表达中有急剧变化的基因(Schrader等2004)用于通过在转基因杨树植物中的RNAi下调进行功能基因组分析。

在基于表达模式进行选择后，基于基因注释对基因进行筛选，并排除了具有显然不感兴趣之基因注释的基因(例如核糖体蛋白基因)。为了降低成本和更快地找到感兴趣的基因，在直接针对生长和木质特性的功能基因组方案中仔细挑选待进行功能测试的基因是非常有益的。

尽管选择用于功能分析的基因是以经济有效的方式发现具有对林木生物技术而言值得关注之功能的基因的一个重要部分，但事实上检测选定基因的基因功能对于发现其在工业应用中的用途而言是关键的步骤。例如在本文中进行的基因选择仅仅对于为了使定向针对某些特性/功能之功能性基因组方案(例如，用突变体或转基因植物/生物进行大规模基因测试)的阳性结果最大化具有重要性。

基因选择的结果是184种可能的基因，最终对其中150种进行了功能分析，其中的17种基因由于其参与以及可用于改变和/或修饰与生长和改良的木质化学性质有关的树木表型而被进一步选择。来自184种选定基因的表达模式的实例如图2和图3所示。

1.2.2选定基因的克隆

随后利用Gateway技术(Invitrogen USA)将选定的基因克隆进受CaMV 35S启动子控制的RNAi载体(RNA干扰载体，pK7GWIWG2(I))中。使用了两套主要的克隆引物，一套是与载体和poly-A尾配对结合的通用引物，另一套是基因特异性引物。首先将PCR产物转移入pDONR载体(Invitrogen USA)中，随后根据制造商的说明(Invitrogen USA)转移入目的载体pK7GWIWG2(I)中。选定基因的序列、其基因库登录编号和PCR引物等列于表1.1中。

表1.1基因库登录编号、序列和PCR引物等

表1.1a

表1.1b

表1.1c

KR121

对KR121的进一步测序分析得到新的序列，称为SEQ ID NO：48。该新序列通过在5’端添加约28个碱基并修正序列内的约10个碱基而对SEQID NO：18进行了补充。

KR125

对KR125的进一步测序分析产生得到新的序列，称为SEQ ID NO：49。该序列通过在5’端添加约32个碱基、修正序列内的约10个碱基以及在3’序列再添加881个碱基而对SEQ ID NO：19进行了补充。

KR129B

SEQ ID NO：50完全取代SEQ ID NO：3，这是因为Gene Model序列中给出了错误的全长序列。

KR140

对KR140的进一步测序分析得到新的序列，称为SEQ ID NO：51。该序列通过在3’端添加约287个碱基而对SEQ ID NO：21进行了补充，并且它还取代SEQ ID NO：4作为KR140的全长序列。

KR152

对KR152的进一步测序分析得到新的序列，称为SEQ ID NO：52。该序列通过修正7个碱基对SEQ ID NO：22进行了补充。

KR163

对KR163的进一步测序分析得到新的序列，称为SEQ ID NO：53。该序列覆盖了整个cDNA，而SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24则分别覆盖了5’端和3’端。SEQ ID NO：53在上述序列之间添加了351个碱基。此外还在5’端添加了约46个碱基并修正了该序列中的约10个碱基。

KR221

对KR221的进一步测序分析得到新的序列，称为SEQ ID NO：54。该序列通过在5’端添加约11个碱基并修正从第500个碱基至3’端的序列而对SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：7进行了补充。

KR224

对KR224的进一步测序分析得到新的序列，称为SEQ ID NO：55。该序列通过在3’端添加约778个碱基并修正了序列中约10个碱基而对SEQID NO：26进行了补充。其还修正了作为224全长序列的SEQ ID NO：8。

KR235

对KR235的进一步测序分析得到新的序列，称为SEQ ID NO：56。该序列覆盖了完整的cDNA，而SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28则分别覆盖了5’和3’部分。SEQ ID NO：56在上述序列之间添加了161个碱基。其还修正了作为KR235全长序列的SEQ ID NO：9。

KR242

对KR242的进一步测序分析得到新的序列，称为SEQ ID NO：57。该序列通过修正序列中约30个碱基而对SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：11进行了补充。

KR292

对KR292的进一步测序分析得到新的序列，称为SEQ ID NO：58。该序列通过在5’端添加约36个碱基并修正序列中约20个碱基而对SEQ IDNO：31和SEQ ID NO：12进行了补充。

KR313

对KR313的进一步测序分析得到新的序列，称为SEQ ID NO：59。该序列覆盖了完整的cDNA，而SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33则分别覆盖5’和3’部分。SEQ ID NO：59在上述序列之间添加了84个碱基并且修正了序列中约6个碱基。

KR318

对KR318的进一步测序分析得到新的序列，称为SEQ ID NO：60。该序列完全取代SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：14。由于克隆混杂，因此第1次提供的序列是错误的。所提供的转基因是基于新的SEQ ID NO：60的。

1.2.3植物转化

CaMV 35S：将反向重复DNA构建体转化进农杆菌，随后转化进杂交山杨(欧洲山杨×美洲山杨，克隆T89，下文称为“杨树”)，主要依照Nilsson等(1992)中所述进行转化和再生。针对每个构建体产生约3-8个独立的株系。用某一构建体产生的这样一组转基因树在下文中被称为“构建组”，例如包含同一种构建体的不同转基因树。在每个构建组(例如KR555-2B KR555-3A、KR555-2B等)中的各转基因株系是不同的转化事件并因而很可能在植物基因组的不同位置插入重组DNA。这使得一个构建组内的不同株系之间具有部分差异。例如，已知当使用本文使用的RNAi构建体时，不同转化事件会生成基因下调水平不同的植物。

1.2.4植物培养

将转基因杨树株系与其野生型(wt)对照树一起在18小时光周期、22℃/15℃温度(白天/夜晚)的条件下于温室中进行培养。每周用1：100稀释的Weibulls Rika S NPK 7-1-5(终浓度NO₃，55g/l；NH₄，29g/l；P，12g/l；K，56g/l；Mg 7.2g/l；S，7.2g/l；B，0.18g/l；Cu，0.02g/l；Fe，0.84g/l；Mn，0.42g/l；Mo，0.03g/l；Zn，0.13g/L)为植物施肥。植物在收获前培育8-9周。在此期间每周对它们的高度和直径进行1至2次测量。多株野生型树(通常15-25株)和多株包括若干构建组(通常6-20个构建组)的转基因树在如上同样条件下平行培育于温室中。野生型树和构建组之间的所有比较均在各个培育组内进行。

1.2.5采样

主要进行两种类型的收集和采样。一种普通型例如用于化学分析、木质形态分析、基因表达分析、木质密度分析和代谢分析。另一种类型用于树皮、木质、叶子和根的干重测量。

1.2.6构建组的选择

在第一轮培育中，对利用RNAi下调特定基因的各组树木进行多种生长测量分析。对这些数据进行分析以挑选出较之野生型对照树而言显示出表型变化的构建组。

基于生长数据进行多种分析并计算参数以选择构建组以及可能用于改变生长特性的基因。选择标准和方法如下文所述。

生长分析

指数期生长

在上文限定的培养条件下，植物在温室中表现出高达约80cm或长达40天的指数生长模式(植物高度)。对于每株植物来说，用这些界限内的植物高度数据点拟合以下形式的指数函数：

h(t)＝h₀*e^at

其中h₀是常数(t＝0时的高度)，而a则定义为指数生长的速率。

最大高度生长速率

另一高度生长速率的度量(本文称为“最大高度生长速率”)被定义为以4个连续的高度数据点拟合的线性函数的斜率。以逐步的方式针对数据点1-4、数据点2-5等计算高度生长速率值，实例参见图4。计算每株植物的最大生长速率，其定义为由逐步式线性回归分析得到的最大数值。对来自构建组中各转化子中高的最大高度生长速率值的原始数据进行核查，使其不以不好的数值为基础。图4显示了一个高度生长曲线的实例，从中可见高度生长速率在生长的第一部分中提高了，然后植物到达其最大高度生长，继而当植物变得更大时生长速率下降了。因为这些阶段在不同的植物中处于不同的时间段并且在测量植物时存在某些干扰，所以我们上述的使用速率法得到的最大高度生长对计算这些条件下不同树木个体的最大生长速度是非常有用的。

直径生长速率

在上文限定的生长条件下，茎宽随时间显示出相对线性的增长。使用针对直径数据的线性回归来评价直径生长。

d(t)＝c*t+d₀

其中d₀是最初的宽度，c是直径生长速率(斜率)。

最终高度和直径

还用最终高度和直径来选择改变的构建组。这些数值考虑到了树木的生长能力以及当从组织培养物转移至土壤并置于温室中时树木开始其生长的能力。

选择参数

将较之野生型种群而言在上述生长参数(即直径生长速率、最大高度生长速率、最终高度和最终直径)方面显示出显著或突出的提高的构建组评分为生长特性改变了的构建组，因此相应基因可用于改变这些特性。选择标准陈述于下文中。使用了两个不同的选择水平，一个基础水平以及一个用于具有格外有意义之生长表型的构建体的水平。

生长差异选择标准

在表1.2中列出了用于生长选择标准的有关表型的缩写。

表1.2.表型的缩写

生长差异选择标准如下：

1.构建组的AFH、MFH、AMHGR和MMHGR比相应野生型组的AFH、MFH、AMHGR和MMHGR高出至少5％(或在另一更高水平中高出8％)，或

2.构建组的AFD、MFD、ADGR和MDC比相应野生型组的AFD、MFD、ADGR和MDC高出至少5％(或在另一更高水平中高出8％)，或

3.构建组的AFH、AFD、AMHGR或ADGR比相应野生型组的AFH、AFD、AMHGR或ADGR高出至少18％(或在另一更高水平中高出22％)，或

4.构建组的MFH、MFD、MMHGR或MDC比相应野生型组的MFH、MFD、MMHGR或MDC高出至少18％(或在另一更高水平中高出22％)。

运行大规模功能基因组方案在生成的数据中产生了一定程度的变异和不确定性。产生这些变异的来源例如：构建组内的不同株系具有不同量的下调，导致构建组内的一株至全部测试株系可显示所述表型；在实验操作期间发生的生长变化，这是由于当将植物从组织培养物转移至温室时植物状态的小变化，以及在生长周期中不同时间点基于温室中不同位置的变化。这些变异在分析数据时必须进行处理。使用这两个不同的差异阈值(即5％和18％)来选择生长提高的构建组。选择标准1和2使用了5％的提高，不过该提高必须出现在AFH、MFH、AMHGR和MMHGR(对应于高度生长)所有表型中或者AFD、MFD、ADGR和MDC(对应于直径生长)所有表型中。在所述表型只能在某些或某一植物中观察到以及只有某一表型类型的情况下，用18％的较高增长来选择阳性构建组，以便不会基于随机变异来选择构建组(分别选择平均值和最大个体值的选择标准3和4)。利用野生型数据来检查这些数值。没有野生型植物通过筛选标准3和4中18％的水平，例如，在任何生长组中都没有野生型植物的所述生长表型比具有第二最高值的野生型高出大于18％的值。筛查标准1和2中使用的5％水平产生小于4％的假阳性(25个基因中有1个)，例如，从野生型对照种群中随机抽取5株野生型植物，检测它们是否可通过筛选标准1和2，并在所有生长组中进行该操作，重复10次，得出所抽取的野生型植物有4％的概率通过筛查标准。这种估算假阳性的方法非常难于实施，因为所述野生型对照组已缩减至5株植物。对于用于格外有意义之基因的较高数值8％，其产生小于1.5％的假阳性。

选择满足这些标准中的一个或多个的构建组。

节间长度测量

计数从FDL节算起并包括向下60cm茎中的所有节，并计算平均节间长度。

1.3结果

所示构建组和相应野生型组的原始生长数据如表1.3至1.20所示。表中横行包含所示构建组(称为“KR”)和相应野生型组(称为“T89”)个体的高度和直径测量值。测量时间(即在温室中的天数)如表头中所示。

构建组KR221

构建体KR221相应于EST A013P18U基因库编号AI162169。该基因选自Hertzberg等2001的数据，其在D区域中上调。该构建体诱导生长提高。该构建组种群显示出与野生型种群相比直径生长速率平均增长21％。构建组满足生长筛选标准(3)。

表1.3 KR221的生长数据

构建组KR224

构建体KR224相应于EST A013P46U基因库编号AI162193。该基因选自Schrader等2004的数据并在B系列的样品8中具有最高表达。该构建体诱导生长提高。当比较最高个体时该构建组显示出与野生型相比的最终高度增加(11％)。当比较最快生长个体时，该构建组还显示出与野生型相比最大高度生长速率提高11％。所述构建组满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(1)。

表1.4a KR224的生长数据

表1.4b KR224的生长数据

构建组KR240

构建体KR240相应于EST A018P19U基因库编号AI162476。该基因选自Hertzberg等2001的数据并在C和D区域中上调。该构建体诱导生长提高。在比较平均值时，该构建组显示出与野生型对照相比直径生长速率提高20％。KR240构建组满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(3)和(4)。

表1.5 KR240的生长数据

构建组KR292

构建体KR292相应于EST A041P18U基因库编号AI163398。该基因选自Schrader等2004的数据并在B系列的样品6-8中具有其最高表达。该构建体诱导生长提高。在比较最宽个体时，该构建组显示出与野生型相比最终宽度增加14％。当比较最快生长个体时，该构建组还显示出与野生型相比直径生长速率提高15％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(2)。

表1.6 KR292的生长数据

构建组KR313

构建体KR313相应于EST A047P40U基因库编号AI163745。该基因选自Schrader等2004的数据并在B系列的样品8-10中具有其最高表达，在Hertzberg等2001的数据中其在B样品中具有其最高表达。该构建体诱导生长提高。该构建体诱导最大高度生长速度提高了20％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(4)。

表1.7 KR313的生长数据

构建组KR459

构建体KR459相应于EST UB12CPE03基因库编号BU820650。该基因选自Schrader等2004的数据并在B系列的样品6中具有其最高表达。该构建体诱导生长提高。该构建体诱导了高度生长的增加，当将来自构建组和野生型对照组的最快生长个体进行比较时，最终高度增加了24％，最大高度生长速率提高了23％。该构建体符合如下表1.21中所示的生长筛选标准(4)。

表1.8 KR459的生长数据

构建组KR463

构建体KR463相应于EST UB24CPA08基因库编号CK106533。该基因选自Schrader等2004的数据并在B系列的样品6中具有其最高表达。该构建体诱导生长提高。该构建组显示出与野生型对照树相比直径生长速率平均值提高了18％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(3)和(4)。

表1.9 KR463的生长数据

构建组KR465

构建体KR465相应于EST UB29DPE02基因库编号CK106678。该基因选自Schrader等2004的数据并在B系列的样品9中具有其最高表达。该构建体诱导生长提高。该构建组显示出直径生长速率提高23％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(3)。

表1.10 KR465的生长数据

构建组KR121

构建体KR121相应于EST A043P46U基因库编号AI163516。该基因选自Hertzberg等2001的数据并在E区域中下调。该构建体诱导生长提高。该构建组显示出与野生型对照树相比最终高度、最终直径、最终的最大高度生长速率和直径生长速率分别提高了14％、16％、9％、15％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(2)和(3)。

表1.11a KR121的生长数据

表1.11b KR121的生长数据

构建组KR125

构建体KR125相应于EST A045P41U基因库编号AI163624。该基因选自Hertzberg等2001的数据并在D区域中上调。该构建体诱导生长提高。该构建体显示出最终直径和直径生长速率分别提高了12％和6％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(2)。

表1.12 KR125的生长数据

构建组KR140

构建体KR140相应于EST A061P49U基因库编号AI164435。该基因选自Hertzberg等2001的数据并在D区域中上调。该构建体诱导生长提高。该构建体诱导高度生长的增加，在比较构建组和野生型对照组的平均值时，最大高度生长速率提高了12％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(1)。

表1.13a KR140的生长数据

表1.13b KR140的生长数据

构建组KR152

构建体KR152相应于EST A077P51U基因库编号AI165178。该基因选自Hertzberg等2001的数据并在E区域中下调。该构建体诱导生长提高。该构建体诱导高度生长增加，在比较构建组和野生型对照组的平均值时，最终高度增加了10％，最大高度生长速率提高了11％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(1)。

表1.14a KR152的生长数据

表1.14b KR152的生长数据

构建组KR163

构建体KR163相应于EST A086P08U基因库编号AI165576。该基因选自Hertzberg等2001的数据并在C区域中上调。该构建体诱导生长提高。在比较最快生长个体时，该构建体与野生型相比直径生长速率提高高达30％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(2)和(4)。

表1.16a KR163的生长数据

表1.16b KR163的生长数据

构建组KR235

构建体KR235相应于EST A017P24U基因库编号AI162414。该基因选自Hertzberg等2001的数据并在D和E区域中上调。该构建体诱导生长提高。在比较最快生长个体时，该构建体与野生型相比最大高度生长速率提高高达17％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(1)和(4)。

表1.17 KR235的生长数据

构建组KR242

构建体KR242相应于EST A018P65U基因库编号AI162510。该基因选自Schrader等2004的数据并在B系列的样品8-10中上调。该构建体诱导生长提高。该构建组显示出高度生长增加(在比较来自构建组和野生型对照植物的最高个体时高度增加高达16％)和直径生长的增加(在比较构建组和对照植物之间的平均值时直径生长速率提高16％)。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(1)、(3)和(4)。

表1.18a KR242的生长数据

表1.18b KR242的生长数据

构建组KR318

构建体KR318相应于EST A050P08U基因库编号AI163860。该基因选自Schrader等2004的数据并在B系列的样品6-9中上调。该构建体诱导生长提高。该构建体既使高度增加也使直径生长增加。在比较来自构建组和野生型对照组的最高值个体时，最大高度生长速率提高了21％，直径生长速率提高了13％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(1)和(4)。

表1.19KR318的生长数据

构建组KR129B

构建体KR129相应于EST A047P55U基因库编号AI163758。该基因选自Hertzberg等2001的数据并在C和D区域中上调。该构建体诱导生长提高。该构建组显示出高度生长增加，其中最终高度增加14％，最大高度生长速率提高了8％。该构建体满足如下表1.21中所示的生长筛选标准(1)。

表1.20 KR129B的生长数据

在下表1.21中显示了特定构建组相对于相应野生型组的高度和直径生长测量值的比率(例如最终高度平均值(AFH)比率：AFH_构建组/AFH_野生型组)。表1.22包含经计算的生长测量值AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比率。(有关生长测量的描述见上文)。

表1.21：选定构建体的整体结果——针对全部“生长提高”的表型

1.4讨论

通过使用适当数量的数据和信息来选择有待于在功能基因组方案(在本方案中针对生长特性)中进行功能分析的基因，使我们找到了许多可用于改进植物(尤其是树木)生长的基因。

在本方案所测试的所有基因中，少于18％的基因通过了第一层选择，少于9％的基因通过了本发明针对格外有意义之基因设立的第二层生长标准。通过本发明针对格外有意义之基因设立的第二层生长标准的构建组是KR121、KR152、KR163、KR235、KR242、KR292、KR459和KR465。尽管这只是选定待测试基因中的较少部分，但是与从随机选择待测试基因所预期的相比，这个数目还是较大的，这表明我们使用这种选择待测试基因方法的重要性和有效性。

前述实施例还阐明了以下问题：当依照单一标准(例如高度或直径)对表型进行比较时，只能记录和选择引起显著表型的基因(例如通过生长筛选标准3和4所选择的基因)。然而，依照多重标准(例如最终高度平均值、最终高度最大值、最大高度生长速率平均值和最大高度生长速率最大值)进行比较则显示出某些基因表达的下调对整体生长特性的显著较大的影响。如上所述，这使得鉴定出一组基因，其中下调它们的表达导致对植物生长产生相当大的影响。对这组基因的鉴定提供了超越本领域现有技术的明显进步，并大大促进了用于产生表型特性改良的转基因植物的有前景转化事件的产生和选择。

当利用可能下调基因表达的任何不同方式产生商品化株系时，可使用不同方法生成许多株系并针对所需特性进行测试。由于特性基因的不同下调水平常带来不同的结果，因此可以进行这一测试。这在本实施例的数据中可清楚地看到。继而，可选择最具前景的转化事件。

参考文献

1.Sterky et al.1998(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998(95)，13330-13335

2.Hertzberg et al.2001(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2001(98)，14372-14737，

3.Schrader et al.2005(plant Cell，(16)，2278-2292

4.White et al.1999(Science 1999(286)2187-2184

5.Aharoni et al.2000(Plant Cell 2000(12)647-662

6.Uggla et al.1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996(93)，9282-9286.

7.Schena et al.1995 Science 1995(270)467-470

8.Wilson，B.F.，Wodzicki，T.J.and zhaner，R.(1966)，Forest Science 12，pp 438-440

9.Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor，

10.Rognes T，2001，Nucleic Acids Research，29，1647-1652，1989.

11.Smith TF and Waterman MS，1981，Journal of Molecular Biology，147，195-197.

12.H.Neurath and R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York.

13.WO2004097024

14.U.S.Patent No.4,987,071

15.U.S.Patent No.5,543,508.

i6.U.S.patent No.5,231,020

17.U.S.Patent No.5,583,021.

18.WO2006/078431

19.Slade and Knauf，Transgenic Res.2005 Apr；14(2)：109-15

20.Henikoff，Till，and Comai，Plant Physiol.2004 Jun；135(2)：630-6.

21.Ichikawa et al.(1997)Nature 390 698-701；

22.Kakimoto et al.(1996)Science 274：982-985

23.WO 96/06166

24.WO 98/53057

25.Lichtenstein and Nellen(1997)，Antisense Technology：A Practical Approach IRL Press atOxford University，Oxford，England.

26.US Patent.No.5,107,065

27.US Pat.No.6,506,559，

28.US Patent Appllcation Publlcation No.2002/0168707 A1

29.US patent application Ser.No.09/423,143(see WO 98/53083)，

30.US patent application Ser.No.09/127,735(see WO 99/53050)

31.US patent application Ser.No.09/084,942(see WO 99/61631)，

32.Brummel D.A.et al..Plant Journal 2003，33，pages 793-800

33.Karimi，M.et al.，Trends In plant Sciences，Vol 7no 5pp 193-195.

34.Wesley S.V.et al.，Plant Journal 2001，27，pages 581-590.

35.Vasil et al.1984，Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，Vol I，II and III，Laboratory Procedures

36.Niu et al.，Science 2006，vol 24，No.11pp1420-1428)

37.G.A Tuskan et al，，Science vol 313 No.5793，pages 1596-1604.

以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：

1.产生与其野生型相比生长有所提高的转基因植物的方法，其包括改变植物中在木质形成阶段特异性表达的至少一种基因的基因产物水平。

2.根据项1的方法，其中所述至少一种基因的选择满足该基因的RNAi下调在一组3-8株转基因植物中引起以下效果的标准：

3.根据项1或2的方法，其中所述至少一种基因的选择满足该基因的RNAi下调在一组3-8株转基因植物中引起以下效果的标准：

c)在最终高度平均值(AFH)、最终直径平均值(AFD)、最大高度生长速率平均值(AMHGR)或直径生长速率平均值(ADGR)中具有22％或更大的差异；和/或

d)在最终高度最大值(MFH)、最终直径最大值(MFD)、最大高度生长速率最大值(MMHGR)或直径系数最大值(MDC)中具有22％或更大的差异；

4.根据前述项中任一项的方法，其包括改变植物中包含选自以下组中的核苷酸序列的至少一种基因的基因产物水平：

a)选自SEQ ID NO：1-17、50、51、54-58、60例如SEQ ID NO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60的核苷酸序列；

b)与来自SEQ ID NO：1-17、50、51、54-58、60例如SEQ ID NO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60的核苷酸序列至少60％一致的核苷酸序列；

c)a)或b)之核苷酸序列的子序列或片段。

5.根据前述项任一项的方法，其包括提供含有选自以下组中的核苷酸序列的重组DNA构建体的步骤：

d)含有选自SEQ ID NO：1-17、50、51、54-58、60例如SEQ ID NO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60之序列的核苷酸序列；

e)d)之核苷酸序列的互补核苷酸序列；

f)d)或e)之核苷酸序列的子序列或片段；

g)与d)、e)和f)的任一序列至少60％一致的核酸序列；和

6.根据项4或5的方法，其中所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO：18-38、48、49、51-60例如SEQ ID NO：20、29、36、37、38、48、49、51-60的序列或其互补核苷酸序列。

7.根据项4或5的方法，其中所述a)或d)的核苷酸序列选自：1、5、6、9、11、12、15、17、56、57和58。

8.根据项4至6中任一项的方法，其中所述c)或f)的子序列或片段包含至少15个核苷酸。

9.根据项4至8中任一项的方法，其中所述核苷酸序列编码包含a)中多肽之保守替换变体的多肽。

10.根据项4至9中任一项的方法，其中所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。

11.根据项4至10中任一项的方法，其中所述子序列或片段与项4a)中所述核苷酸序列的保守结构域具有至少65％的序列同一性。

12.根据项4至11中任一项的方法，其中所述c)或f)中的子序列或片段包含SEQ ID NO：18-38、48、49、51-60例如SEQ ID NO：20、29、36、37、38、48、49、51-60的序列。

13.根据项4至12中任一项的方法，其中所述重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性的启动子。

14.根据项4至13中任一项的方法，其中所述重组DNA构建体还包含位于转录盒之前的强组成型启动子，所述转录盒包含项4中限定的核苷酸序列、随后是植物功能性内含子、再后是方向相反的项4所限定核苷酸序列。

15.根据项4至14中任一项的方法，其中所述重组DNA构建体包含SEQ ID NO：47的序列。

16.根据项4至15中任一项的方法，其中所述方法还包括用所述重组DNA构建体转化植物可再生细胞并从所述转化细胞再生出转基因植物的步骤。

17.根据前述项中任一项的方法，其中所述转基因植物是多年生植物。

18.根据项17的方法，其中所述多年生植物是木本植物。

19.根据项18的方法，其中所述木本植物是硬木植物。

20.根据项19的方法，其中所述硬木植物选自金合欢树、桉树、角树、山毛榉树、桃花心木、胡桃、橡树、白蜡树、柳树、山胡桃树、桦树、栗树、杨树、赤杨、枫树、悬铃木、银杏树、棕榈树和香枫。

21.根据项19或项20的方法，其中所述硬木植物是杨柳科的植物，包括其变体。

22.根据项16的方法，其中所述木本植物是针叶树。

23.根据项22的方法，其中所述针叶树选自柏树、花旗松、冷杉、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、巨杉、云杉和紫杉。

24.根据项16的方法，其中所述木本植物是结果植物。

25.根据项24的方法，其中所述结果植物选自苹果树、李子树、梨树、香蕉树、桔树、猕猴桃树、柠檬树、樱桃树、葡萄树和无花果树。

26.根据项16的方法，其中所述木本植物选自棉花、竹子和橡胶植物。

27.包含重组多核苷酸的转基因植物，所述重组多核苷酸含有能改变植物中在木质形成阶段特异性表达的至少一种基因的基因产物水平的核苷酸序列，其中所述至少一种基因的选择满足该基因的RNAi下调在一组3-8株转基因植物中引起以下效果的标准：

28.根据项27的转基因植物，其中在木质形成阶段表达的所述基因的选择满足该基因的RNAi下调在一组XX株转基因植物中引起以下效果的标准：

29.根据项27或28的转基因植物，其中包含选自以下组中的核苷酸序列的至少一种基因的基因产物水平被改变：

c)a)或b)之核苷酸序列的子序列或片段。

30.包含含有选自以下组中的核苷酸序列的重组多核苷酸(DNA构建体)的转基因植物：

d)编码含有选自SEQ ID NO：1-17、50、51、54-58、60例如SEQ IDNO：1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60之序列的多肽的核苷酸序列；

e)d)之核苷酸序列的互补核苷酸序列；

f)d)或e)之核苷酸序列的子序列或片段；

g)与d)、e)和f)的任一序列至少60％一致的核酸序列；和

31.根据项28的转基因植物，其中所述核苷酸序列包含选自SEQ IDNO：18-38、48、49、51-60例如SEQ ID NO：20、29、36、37、38、48、49、51-60的序列或其互补核苷酸序列。

32.根据项29至30中任一项的转基因植物，其中所述b)或f)中的子序列或片段包含至少15个核苷酸。

33.根据项29至32中任一项的转基因植物，其中所述核苷酸序列编码包含a)或d)之多肽的保守替换变体的多肽。

34.根据项29至33中任一项的转基因植物，其中所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。

35.根据项29至34中任一项的转基因植物，其中所述子序列或片段与项29的核苷酸序列保守结构域具有至少65％的序列同一性。

36.根据项29至35中任一项的转基因植物，其中所述c)中的子序列或片段包含序列SEQ ID NO：18-38、48、49、51-60例如SEQ ID NO：20、29、36、37、38、48、49、51-60。

37.根据项29至36中任一项的转基因植物，其中所述重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性的启动子。

38.根据项29至37中任一项的转基因植物，其中所述重组DNA构建体还包含位于转录盒之前的强组成型启动子，所述转录盒包含项4中限定的核苷酸序列、随后是植物功能性内含子、再后是方向相反的项4所限定核苷酸序列。

39.根据项29至38中任一项的转基因植物，其中所述重组DNA构建体包含SEQ ID NO：47的序列。

40.根据项27至39中任一项的转基因植物，其中所述植物属于木本种类。

41.根据项40的转基因植物，其中所述植物是硬木植物。

42.根据项40的转基因植物，其中所述植物选自金合欢树、桉树、角树、山毛榉树、桃花心木、胡桃、橡树、白蜡树、柳树、山胡桃树、桦树、栗树、杨树、赤杨、枫树、悬铃木、银杏树、棕榈树和香枫。

43.根据项40的转基因植物，其中所述植物来自杨属类型，包括其变体。

44.根据项40的转基因植物，其中所述植物来自杨柳科，包括其变体。

45.根据项40的转基因植物，其中所述植物是针叶树。

46.根据项44的转基因植物，其中所述植物选自柏树、花旗松、冷杉、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、巨杉、云杉和紫杉。

47.根据项40的转基因植物，其中所述植物选自竹子和橡胶植物。

48.根据项27至47中任一项的转基因植物的植物细胞或植物后代。

49.根据项27至47中任一项的转基因植物产生的木材。

50.包含项3至11中所述之至少一种序列的DNA构建体。

51.包含项49之DNA构建体的植物细胞或植物后代。

Claims

1.通过产生与其野生型相比生长有所提高之转基因植物的方法而产生的转基因植物产生的木材，其中所述方法包括改变植物中来自SEQ IDNO：15的核苷酸序列所编码之基因产物的水平，其中所述转基因植物是木本植物。

2.包含选自以下序列中至少一种序列的DNA构建体：

a)来自SEQ ID NO：15的核苷酸序列；或

b)子序列SEQ ID NO：36；或

c)a)或b)之核苷酸序列的互补核苷酸序列。