CN100427604C

CN100427604C - 声化学基因转染方法

Info

Publication number: CN100427604C
Application number: CNB2005101055515A
Authority: CN
Inventors: 许川山; 王志刚; 李发琪; 冉海涛; 汪海; 杜永洪
Original assignee: Chongqing Ronghai Engineering Research Center of Ultrasonic Medicine Co Ltd
Current assignee: Chongqing Ronghai Engineering Research Center of Ultrasonic Medicine Co Ltd
Priority date: 2005-09-27
Filing date: 2005-09-27
Publication date: 2008-10-22
Anticipated expiration: 2025-09-27
Also published as: CN1940077A

Abstract

本发明涉及一种声化学基因转染方法。该方法包括以下步骤：(1)确定目的基因和靶细胞，培养靶细胞或选择靶组织；(2)选择声敏剂；(3)将声敏剂和目的基因、靶细胞或靶组织放入一起，使声敏剂和目的基因通过吞噬作用以内吞体方式进入靶细胞或靶组织内的靶细胞，使声敏剂能选择性定位于靶细胞或靶组织细胞内的溶酶体；(4)用超声波照射靶细胞或靶组织，使定位于溶酶体内的声敏剂在超声波作用下发生声化学反应生成活性氧物质；(5)活性氧物质破坏溶酶体，使目的基因从溶酶体内逃逸，促进目的基因迅速向胞质内释放，提高其转染率及表达水平。实现了声诱导、定点基因转染，为靶组织细胞内基因转染的基础研究及其实际应用提供一种无创、安全、高效、靶向基因传递的新手段。

Description

声化学基因转染方法

技术领域

本发明涉及一种基因转染方法，且特别涉及一种声化学基因转染方法。

背景技术

在生物学的基因表达和功能等基础研究方面，以及在疾病的治疗和预防等临床应用方面，DNA传递都是一个强劲的普遍应用工具，也是其中的重要技术。DNA传递的效率直接影响到其基础研究和临床应用的成效。

目前，制约DNA传递的主要生物学难点之一是DNA传递效率太低，这是因为：在大多数基因治疗系统中，目的基因是通过靶细胞的吞噬作用进入靶细胞形成内吞体，内吞体迅速被细胞内的溶酶体吞噬，最终绝大多数目的基因被溶酶体内的酶所消化，从而导致DNA传递效率极低。而目的基因要进行表达就必须在被溶酶体酶降解前离开这些细胞器官，因此采用恰当的方法诱导目的基因远离靶细胞的溶酶体，以防止被靶细胞的溶酶体酶降解是至关重要的。

光化学基因转染(photochemical gene transfection)是随着光纤技术、激光医学和生物技术发展而兴起的一种光诱导、定点基因转染的新武器(Hogset A，Prasmickaite L，Engesaeter B.O，et al.Light Directed Gene Transfer by Photochemical Internalisation.Current Gene Therapy，2003；3(2)：89-112.)。其原理就是基于增殖活跃的组织细胞中选择性摄入并滞留的光敏剂能在一定波长光激活下产生光化学反应的特性，以及亲水性或两极性光敏剂(如：磺化四苯基卟啉)胞内吸收主要通过胞饮方式并选择性定位于溶酶体，当目的基因和光敏剂被靶细胞吞噬后，形成光敏剂和目的基因共存的内吞体，内吞体又被溶酶体迅速吞噬，光敏剂能选择的定位于溶酶体，在适当波长光激发下引发光化学反应产生单态氧，选择性破裂溶酶体，促使基因载体迅速逃逸出溶酶体，克服基因转移的体内和细胞内屏障，不仅有利于外源性基因转染入细胞内，而且有利于目的基因在被溶酶体酶分解前逃逸出溶酶体，提高了靶细胞内目的基因的转染率和表达水平，选择性地实现治疗基因的靶向、高效转染。然而，光在生物组织中的穿透性是比较差的，这就严重限制了光化学基因转染方法的实际应用，因此，这迫切要求人们寻找新的激发源或尝试更为高效的基因转染新方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前基因转染所存在的上述问题，提供一种利用超声波作为激发源的无创、安全、适用、高效、靶向基因传递的方法，即声化学基因转染方法。本发明利用超声波作为一种机械波，对生物组织有较强的穿透力，且聚焦超声波更可以无创伤地将声能聚集于深层组织，以及超声波亦可激活声敏剂而产生声化学效应(Suzuki T，Kamada S，Yoshida Y，Unno K.A study ofsonodynamic-antitumor effect on novel sonodynamic compoundsunder ultrasound.Heterocycles，1994；38：1209-11.)，在此基础上，利用超声波作为激发源来实现声化学基因转染。

解决本发明技术问题所采用的技术方案是该声化学基因转染方法，包括以下步骤：1.确定目的基因和靶细胞或靶组织，培养靶细胞或选择靶组织；2.选择声敏剂，该声敏剂是一种安全无毒、能选择性定位于溶酶体的亲水性或两极性声敏剂；3.将声敏剂和目的基因、靶细胞或靶组织放入一起，使声敏剂和目的基因通过吞噬作用以内吞体方式进入靶细胞或靶组织内的靶细胞，内吞体被溶酶体的迅速吞噬致使声敏剂能选择性定位于靶细胞或靶组织细胞内的溶酶体；4.用超声波照射靶细胞或靶组织，使定位于溶酶体内的声敏剂在超声波作用下发生声化学反应生成活性氧物质；5.活性氧物质破坏溶酶体，使得靶细胞内或靶组织细胞内的目的基因从溶酶体内逃逸，促进目的基因迅速向胞质内释放，从而显著提高靶组织细胞中基因转染效率及表达水平。

其中，上述的安全无毒、能选择性定位于溶酶体的亲水性或两极性声敏剂优选：磺化四苯基卟啉、酞菁铝、竹红菌素衍生物、单天门冬酰胺二氢卟酚、得克萨菲啉镥、玫瑰红、血卟啉单甲醚之中任何一种或几种；上述活性氧物质为单态氧；上述超声波为能聚焦或不能聚焦的治疗或诊断用的超声波，可以是脉冲波或连续波，其参数：频率为20KHz～2.5MHz，声强为0.25～2.5W/cm²，作用时间0.25～10分钟，优选1～3分钟；所述从溶酶体内逃逸的目的基因为生物大分子，如裸DNA、基因载体、寡核苷酸片段等之任何一种或任何几种。

所述靶细胞为有待进行基因转染的细胞，如：动物细胞或植物细胞，或者可以是培养细胞也可是生物体内细胞。

所述的基因载体为病毒载体、非病毒载体。

与现有技术比较，本发明利用超声波作为激发源，可以有效地激活声敏剂产生声化学反应选择性损伤预先定位有声敏剂的溶酶体膜，从而促使进入靶细胞的目的基因迅速有效地从溶酶体内逃逸，避免被溶酶体酶降解，促进目的基因迅速向胞质内释放，显著提高靶组织或靶细胞内目的基因的转染效率及表达水平。本发明的声化学基因转染方法极大地提高了目的基因在靶细胞内的转染效率及表达水平，实现了声诱导、定点基因转染，为靶细胞内基因转染的基础研究及其实际应用提供了一种无创、安全、靶向基因传递、高效的基因转染新手段。经实验证实，可以使得目的基因在靶细胞内转染率提高20～100倍。

附图说明

图1为本发明实施例1的声化学基因转染方法的流程图

图2为超声波激活声敏剂发生声化学反应生成单态氧的示意图；

图3为声化学基因转染原理的示例图；

图4为本发明实施例2的声化学基因转染方法的流程图

图3中：S为声敏剂，G为目的基因；A：声敏剂S和目的基因G通过吞噬作用以内吞体方式进入靶细胞；B：内吞体被溶酶体的迅速吞噬致使声敏剂S能选择性定位于靶细胞内的溶酶体内；C：在超声照射作用下，声敏剂S发生声化学反应生成活性氧物质，选择性地破坏靶细胞的溶酶体使其破裂，从而使靶细胞内的目的基因G得以从溶酶体内顺利的逃逸，促进目的基因迅速向胞质内释放。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明内容详细说明。

实施例1：

本实施例1为利用培养靶细胞进行声化学转染的方法，具体是按照图1所示的步骤进行的。

如图1、图2和图3所示，首先，于步骤S11，培养靶细胞：选择基因转染研究最常用的HEK293细胞，用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液常规培养于37℃含5％二氧化碳、饱和水汽的培养箱中；接着，因对数生长期细胞正处于分裂增殖状态有利于基因转染的实现和研究观察，于步骤S12取对数生长期的靶细胞107个细胞，加入声敏剂S(如磺化四苯基卟啉)于37℃含5％二氧化碳、饱和水汽的培养箱中孵育12～16小时，而后加入绿色荧光蛋白表达质粒作为目的基因G与靶细胞于37℃含5％二氧化碳、饱和水汽的培养箱中孵育12～16小时共同孵育5～10分钟，磺化四苯基卟啉和目的基因G通过吞噬作用以内吞体方式进入靶细胞(如图3中A所示)，内吞体被溶酶体的迅速吞噬致使声敏剂S磺化四苯基卟啉能选择性定位于靶细胞内的溶酶体内(如图3中B所示)，由于有部分声敏剂S磺化四苯基卟啉及目的基因G可能没有被靶细胞吞噬，还游离在培养液中，所以在超声波照射前，洗涤数次将培养液中残余的磺化四苯基卟啉及目的基因G去除；然后，于步骤S13，应用超声波照射靶细胞。在超声照射作用下，声敏剂S磺化四苯基卟啉发生声化学反应生成活性氧物质(如图2所示)，选择性地破坏靶细胞的溶酶体使其破裂(如图3中C所示)，从而使靶细胞内的目的基因G得以从溶酶体内顺利的逃逸，促进目的基因迅速向胞质内释放，显著提高靶组织细胞内基因转染效率及表达水平。(如图3示)。

在本实施例1中，选择的声敏剂是一种安全无毒、能选择性定位于溶酶体的亲水性或两极性声敏剂，除了磺化四苯基卟啉外，还可以是酞菁铝、竹红菌素衍生物、单天门冬酰胺二氢卟酚、得克萨菲啉镥、玫瑰红、或血卟啉单甲醚等；目的基因是动物基因或植物基因，且目的基因可以通过非病毒载体或病毒载体来进行携带或直接为裸DNA。

超声波为能聚焦或不能聚焦的治疗或诊断用的超声波，同时，用以作为激发源的超声波是脉冲波或连续波、频率为20KHz～2.5MHz、声强为0.25～2.5W/cm²，用以照射靶组织的作用时间1～3分钟；从溶酶体内逃逸的目的基因为生物大分子，如裸DNA、基因载体、寡核苷酸片段等之任何一种或任何几种。

由于单态氧存在时间短(小于0.04μs)和作用范围小(10～20nm)，超声波激活选择性定位于溶酶体上的声敏剂产生声化学反应损伤仅局限于溶酶体，直接导致溶酶体的破坏，迅速有效地释放目的基因，经实验证实，可以使得目的基因在靶细胞内转染率提高20～100倍。

实施例2：

本实施例2为靶组织内声化学转染的方法，具体按照图4所示步骤进行。

如图2、图3和图4所示，首先，于步骤S41，选择靶组织即待转染组织，本实施例中即裸鼠移植瘤组织：对数生长期的乳腺癌细胞消化后，调整细胞浓度至5×10⁶/ml，取0.2ml接种于5～6周龄BALB/c nu/nu无胸腺裸小鼠腹部皮下。肿瘤长至约1cm×1cm×1cm时，无菌分离瘤体，用含双抗的Hanks液洗两次，剪成1～2mm大小瘤块，再接种于裸小鼠腹部皮下进行传代。传代5次以上，乳腺癌移植瘤稳定生长；接着，于步骤S42，将声敏剂S磺化四苯基卟啉及目的基因G绿色荧光蛋白表达质粒混合液直接瘤内注入；再接着，于步骤S43，磺化四苯基卟啉和目的基因G被靶组织的靶细胞吞噬(如图3中A所示)；最后，于步骤S44，用超声波照射靶组织，在靶组织所包含的靶细胞内磺化四苯基卟啉发生声化学反应生成活性氧物质(如图2所示)，选择性破坏靶细胞的溶酶体使其破裂(如图3中C所示)，从而靶细胞内的目的基因G得以从溶酶体内顺利的逃逸，促进目的基因迅速向胞质内释放，显著提高了靶组织细胞内基因转染效率及表达水平(如图3示)。

本实施例2的其它特征和上述实施例1相似，在此不再赘述。

Claims

1.一种声化学基因转染方法，包括以下步骤：

(1).确定目的基因和靶细胞或靶组织，培养靶细胞或选择靶组织；

(2).选择声敏剂，该声敏剂是一种安全无毒、能选择性定位于溶酶体的亲水性或两极性声敏剂；

(3).将声敏剂和目的基因、靶细胞或靶组织放入一起，使声敏剂和目的基因通过吞噬作用以内吞体方式进入靶细胞或靶组织内的靶细胞，内吞体被溶酶体的迅速吞噬致使声敏剂能选择性定位于靶细胞或靶组织细胞内的溶酶体；

(4).用超声波照射靶细胞或靶组织，使定位于溶酶体内的声敏剂在超声波作用下发生声化学反应生成活性氧物质；

(5).活性氧物质破坏溶酶体，使得靶细胞内或靶组织细胞内的目的基因从溶酶体内逃逸，促进目的基因迅速向胞质内释放，提高其转染率及表达水平。

2.根据权利要求1所述的声化学基因转染方法，其特征在于所述的亲水性或两极性声敏剂为磺化四苯基卟啉、酞菁铝、竹红菌素衍生物、单天门冬酰胺二氢卟酚、得克萨菲啉镥、玫瑰红、血卟啉单甲醚之中任何一种或任何几种。

3.根据权利要求1所述的声化学基因转染方法，其特征在于所述的活性氧物质为单态氧。

4.根据权利要求1所述的声化学基因转染方法，其特征在于所述超声波为能聚焦或不能聚焦的治疗或诊断用的超声波。

5.根据权利要求4所述的声化学基因转染方法，其特征在于所述超声波为脉冲波或连续波，且其频率为20KHz～2.5MHz，声强为0.25～2.5W/cm²，作用时间为0.25～10分钟。

6.根据权利要求1所述的声化学基因转染方法，其特征在于所述从溶酶体内逃逸的目的基因为生物大分子，所述生物大分子为裸DNA、基因载体、寡核苷酸片段之任何一种或任何几种。

7.根椐权利要求6所述的声化学基因转染方法，其特征在于所述的基因载体为病毒载体、非病毒载体。

8.根据权利要求1-7之一所述的声化学基因转染方法，其特征在于所述的靶细胞或靶组织细胞为动物细胞或植物细胞，或者可以是培养细胞也可是生物体内细胞。