CN110914292A

CN110914292A - 使用脂肪酶用于清洁的方法

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Publication number: CN110914292A
Application number: CN201880046631.3A
Authority: CN
Inventors: C·波普; C·埃斯珀; O·斯潘根伯格; K·克兰
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2018-05-10
Publication date: 2020-03-24
Also published as: EP3621443A4; MX2019013532A; US11162086B2; CN110621162B; CN110621162A; US11214777B2; EP3621984A4; US20200208082A1; EP3621443A1; JP2020519288A; RU2019140871A3; US20200205423A1; EP3621984A1; WO2018209018A1; AU2018265136A1; BR112019023695A2; RU2019140871A; WO2018209026A1; CA3061178A1

Abstract

使用脂肪酶从表面除去污渍的方法，以及包含脂肪酶的制剂。

Description

使用脂肪酶用于清洁的方法

序列表

根据“专利合作条约(PCT)下国际专利申请中核苷酸和氨基酸序列表的展示标准”ST.25，本申请包括作为ASC II文本(.txt)文件的计算机可读形式(CRF)的核苷酸和氨基酸序列表。序列表在下面被标识，并且在此处以其整体并出于所有目的通过引用结合到本申请的说明书中。

文件名	创建日期	大小
			171443_ST25.txt	2018年5月8日	4.19KB(4,291字节)

技术领域

基因工程改造的脂肪酶，包含所述酶的组合物以及使用所述酶的方法或包含所述酶的组合物。经基因工程改造的脂肪酶可用于许多不同的应用，例如衣物洗涤剂、餐具洗涤剂以及用于家庭、工业、车辆护理、烘焙、动物饲料、纸浆和纸张加工、淀粉加工和乙醇生产的清洁产品。脂肪酶已用于去除油脂污渍，并已添加到各种组合物例如清洁产品中。当前的清洁和/或织物护理组合物包含许多活性成分的制剂，这些活性成分影响脂肪酶去除油脂污渍的能力。因此，存在对能够在用于清洁的组合物的恶劣环境中起作用的基因工程脂肪酶的需求。

发明简述

1.洗涤剂制剂，其包含：至少一种根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，或至少一种具有脂肪酶活性的多肽，其具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性，以及至少一种洗涤剂组分。

2.根据权利要求1所述的洗涤剂制剂，其中所述多肽在所述氨基酸残基的位置编号处包含对氨基酸序列SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸残基的插入、缺失或取代：23、33、82、83、84、85、160、199、254、255、256、258、263、264、265、268、308、311或其任意组合，并且该多肽具有脂肪酶活性。

3.根据权利要求2所述的洗涤剂制剂，其中所述对氨基酸序列SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸取代选自：Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D；L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S；T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、Y311E，或其任意组合，并且该多肽具有脂肪酶活性。

4.根据权利要求2-3所述的洗涤剂制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有对SEQ ID NO:1氨基酸序列的至少一个单一氨基酸取代，并且所述对氨基酸序列SEQ ID NO:1的一个单一氨基酸取代选自：Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D；L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S；T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、Y311E，或其任意组合，并且该多肽具有脂肪酶活性。

5.根据权利要求2-4所述的洗涤剂制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述变体多肽具有如表1所示的氨基酸取代的组合，并且该多肽具有脂肪酶活性。

6.一种清洁方法，包括以下步骤：

(a)提供要清除油脂污渍的表面；

(b)提供权利要求1-5所述的洗涤剂制剂；

(c)使(a)的要清除油脂污渍的表面与(b)的洗涤剂接触；其中洗涤剂中的多肽将油脂污渍从要清除油脂污渍的表面去除。

7.根据权利要求1-5所述的洗涤剂制剂，其进一步包括添加选自以下的一种或多种的第二种酶：第二脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、漆酶、果胶酶和核酸酶。

8.根据权利要求6所述的方法，其中要清除油脂污渍的表面是：布、纺织品、织物、硬表面或餐具。

9.根据权利要求6所述的方法，其中要清除油脂污渍的表面包含选自以下的污渍：唇膏、皮脂、芥末、橄榄油、可可粉、巧克力、巧克力慕斯、巧克力冰淇淋、巧克力饮料、花生油、牛肉脂肪、印度咖喱、拿坡里番茄酱、化妆品、带血牛肉脂肪、沙拉酱、蛋黄、食品、煎炸脂肪、咖喱、地中海酱汁、咖喱油酱、香脂、汉堡油脂、乳脂。

10.根据权利要求1-5所述的洗涤剂制剂，其中所述制剂是衣物洗涤剂、硬表面清洁剂、餐具洗涤剂或个人卫生产品。

11.权利要求1-10所述的洗涤剂制剂，其中至少一种洗涤剂组分选自：表面活性剂、助剂、聚合物、碱、漂白体系、荧光增白剂、抑泡剂和稳定剂、助水溶物、流变改进剂、防腐剂和腐蚀抑制剂，其量为对洗涤或清洁性能有效或对保持洗涤剂的物理特性有效。

12.根据权利要求1-11所述的洗涤剂制剂，其中洗涤剂是液体、凝胶、糊剂、肥皂、粉末或粒状固体。

发明详述

酶是包含氨基酸残基序列的生物分子(多肽)，其中酶可以催化反应。酶的名称是根据国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会的建议确定的。酶由EC(酶学委员会)编号、推荐名称、替代名称(如果有的话)、催化活性和其它因素定义。酶也称为多肽、蛋白质、肽，或者在专利和专利申请中通过序列标识号(SEQ ID NO.)进行描述。酶的替代名称可以互换使用。

酶得自或衍生自许多不同的来源，包括：植物；动物；细菌、古细菌、真菌、酵母菌；含有编码酶的DNA的环境样品，或者可以在实验室中合成产生的酶。例如，酶的细菌来源包括来自芽孢杆菌属、链霉菌属、大肠杆菌和假单胞菌的酶；酶的真菌来源包括曲霉菌属、镰刀菌属、嗜热菌和木霉菌属的酶；酶的酵母来源包括来自毕赤酵母和酿酒酵母的酶。

已知有不同种类的酶可用于洗涤剂和清洁产品，包括：脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶和核酸酶；但是，工业上需要提供一种脂肪酶，其具有更高活性、温度曲线、pH曲线，具有改善的性能(去除污渍)，在蛋白酶存在下的稳定性，减少洗涤剂制剂中表面活性剂的量，无异味，或其组合。所述变体多肽脂肪酶满足了这些工业需求。

世界知识产权局(WIPO)标准ST.25(1998)规定，氨基酸残基应在序列表中使用以下三个字母的符号表示，首字母大写。下表概述了氨基酸标识符以及使用标准遗传标准编码氨基酸的相应DNA密码子。编码氨基酸残基的DNA密码子可以根据所使用的生物而不同，并且可能适用略有不同的遗传密码翻译表。NCBI维护此类非标准的密码翻译表的汇编。参见例如https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi。

“亲本”多肽氨基酸序列是向序列中引入突变(例如，通过引入一个或多个氨基酸取代、插入、缺失或其组合)的起始序列，从而导致亲本多肽氨基酸序列的“变体”。亲本包括：野生型多肽氨基酸序列或经合成产生的多肽氨基酸序列，其用作引入(进一步)变化的起始序列。

“变体多肽”是指在氨基酸序列上不同于其亲本的酶。尽管下面的定义在氨基酸变化的背景下描述了变体，但是核酸可以被类似地修饰，例如通过取代。

本发明涉及具有脂肪酶活性的多肽，其包含与SEQ ID NO：1的全长氨基酸序列至少80％同一性、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列。

所述多肽可包含选自氨基酸残基插入、缺失或取代的改变。所述多肽可包含在至少一个以下氨基酸残基位置中对SEQ ID NO：1的氨基酸序列的至少一个取代：23、33、82、83、84、85、160、199、254、255、256、258、263、264、265、268、308、311，或其任意组合。位置编号基于SEQ ID NO：1提供的氨基酸序列。

具体而言，本发明的多肽可包含至少一个选自以下的氨基酸取代：Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D；L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S；T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A和Y311E。在一个实施方案中，该多肽包含多于一个的所述取代。

本发明涉及具有脂肪酶活性的多肽，其中所述变体多肽是与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少80％同一性，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列，其中变体多肽具有对SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸修饰的组合，所述组合选自：本说明书的实施例1的表1中所述的组合。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO:1的多肽，其在位置83处包含至少一个取代，其中该取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y。优选地，在位置83处的取代选自S83H、S83I、S83N和S83Y。在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO:1的多肽，其在位置85处包含至少一个取代，其中该取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、和I85Y。优选地，在位置85处的取代选自I85L、I85T和I85V。在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO:1的多肽，其在位置255处至少包含一个取代，其中所述取代选自I255A、I255L。在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO:1的多肽，其在位置264处包含至少一个取代，其中该取代选自T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S。优选地，位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1的多肽，其在位置265处包含至少一个取代，其中该取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。优选地，在265位的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO:1所述的多肽，其至少包含在位置83处的取代和在位置85处的取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，并且在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y。优选地，位置83的取代选自S83H和S83I，位置85的取代选自I85L、I85P、I85T和I85V。位置83的取代可以是S83H，位置85的取代可以选自I85L、I85P和I85T。在位置83处的取代可以是S83I，并且在位置85处的取代可以是I85V。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置83处的取代和在位置255处的取代，其中在位置83的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，且在位置255的取代选自I255A和I255L。优选地，在位置83处的取代选自S83H、S83N和S83Y，并且在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。位置83处的取代可以选自S83H、S83N、S83T和S83Y，并且位置255处的取代可以是I255A。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置83处的取代和在位置264处的取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，并且位置264处的取代选自T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N和T264S。优选地，在位置83处的取代选自S83H、S83N和S83Y，并且在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。位置83处的取代可以是S83H，并且位置264处的取代可以选自T264A、T264N和T264S。位置83处的取代可以是S83N，并且位置264处的取代可以选自T264A、T264D、T264N和T264S。位置83处的取代可以是S83Y，并且位置264处的取代可以选自T264A和T264S。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置83处的取代和在位置265处的取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，并且位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。优选地，在位置83处的取代选自S83H、S83I、S83N、S83T和S83Y，并且在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。在位置83处的取代可以是S83H，并且在位置265处的取代可以选自D265A、D265G、D265S和D265T。位置83处的可以是S83I，并且位置265处的取代可以选自D265G和D265S。在位置83处的取代可以是S83N，并且在位置265处的取代可以选自D265A、D265G、D265S和D265T。在位置83处的取代可以是S83T，并且在位置265处的取代可以选自D265A、D265S和D265T。在位置83处的取代可以是S83Y，并且在位置265处的取代可以是D265T。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置85处的取代和在位置265处的取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F，I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，并且位置265的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。优选地，位置85处的取代选自I85A、I85H、I85L、I85P、I85S、I85T和I85V，并且位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。在位置85处的取代可以是I85A，并且在位置265处的取代可以是D265T。在位置85处的取代可以是I85H，并且在位置265处的取代可以是D265A。在位置85处的取代可以是I85L，并且在位置265处的取代可以选自D265A、D265G、D265S和D265T。在位置85处的取代可以是I85P，并且在位置265处的取代可以是D265A。在位置85处的取代可以是I85S，并且在位置265处的取代可以是D265S。在位置85处的取代可以是I85T，并且在位置265处的取代可以选自D265G、D265S和D265T。在位置85处的取代可以是I85V，并且在位置265处的取代可以选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置85处的取代和在位置255处的取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，其中位置255处的取代选自I255A和I255L。变体多肽可包含I85H取代和I255A取代。变体多肽可包含I85L取代和I255A取代。变体多肽可包含I85S取代和I255A取代。变体多肽可包含I85V取代和I255A取代。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置83处的取代、在位置85处的取代和在位置255处的取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，且其中在位置255处的取代选自I255A和I255L。变体多肽可包含S83H取代，在位置85的取代选自I85A、I85L、I85P、I85S、I85T和I85V，以及I255A取代。变体多肽可以包含S83N取代，在位置85处的取代选自I85L和I85V，以及I255A取代。所述变体多肽可以包括S83T取代，在位置85的取代选自I85H和I85V，以及I255A取代。所述变体多肽可以包括S83Y取代，在位置85的取代选自I85A和I85V，以及I255A取代。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置85处的取代和在位置264处的取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，其中位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。变体多肽可包含I85A取代和T264A取代。变体多肽可包含I85L取代和T264S取代。变体多肽可包含I85S取代和T264A取代。变体多肽可包含I85T取代和T264A取代。变体多肽可包含I85V取代，且在位置264的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置255处的取代和在位置264处的取代，其中在位置255处的取代选自I255A和I255L，并且其中在位置264处的取代选自T264A、T264D，T264N和T264S。变体多肽可包含I255A取代，且在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置255处的取代和在位置265处的取代，其中在位置255处的取代选自I255A和I255L，并且其中在位置265处的位置选自T264A、T264D、T264N和T264S。变体多肽可包含I255A取代和在位置265的取代，所述取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。变体多肽可包含I255A取代和在位置265的选自D265A，D265G，D265S和D265T的取代。变体多肽可包含I255A取代和D265S取代。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置264处的取代和在位置265处的取代，其中在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S，其中在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N，D265S和D265T。变体多肽可包含T264A取代，且在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。变体多肽可包含T264D取代，且在位置265处的取代选自D265A和D265T。变体多肽可包含T264N取代，且在位置265处的取代选自D265A和D265T。变体多肽可包含T264S取代，且在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少在位置85处的取代和在位置265处的取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，并且位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T，还包括位置264处的取代，其中该取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。变体多肽可以包含I85A取代、T264A取代和D265T取代。变体多肽可包含I85L取代、T264S取代和在位置265处的取代，其选自D265A、D265G、D265S和D265T。变体多肽可以包含I85S取代、T264A取代和D265T取代。变体多肽可包含I85T取代、T264A取代和在位置265处的取代，其选自D265A、D265G、D265S和D265T。变体多肽可包含I85V取代，在位置264处的取代，其选自T264A、T264D、T264N和T264S，以及在位置265处的取代，其选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置85处的取代和在位置265处的取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，并且位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T，还包含位置255处的取代，其中该取代选自I255A和I255L。变体多肽可以包含I85H取代、I255A取代和D265A取代。变体多肽可以包含185H取代、I255A取代和D265A取代。变体多肽可以包含I85L取代、I255A取代和在位置265处的取代，其选自D265A、D265G、D265S和D265T。变体多肽可以包含I85S取代、I255A取代和D265T取代。变体多肽可以包含I85V取代、I255A取代和在位置265处的取代，其选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置85处的取代、在位置265处的取代、在位置255处的取代和在位置264处的取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，其中位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T，其中在位置255处的取代选自I255A和I255L，并且其中在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。变体多肽可包含I85L取代、I255A取代、T264S取代以及在位置265处的取代，其选自D265A、D265G、D265S和D265T。变体多肽可以包含I85S取代、I255A取代、T264A取代和D265T取代。变体多肽可包含I85V取代、I255A取代、在位置264处的取代，其选自T264A、T264G、T264S和T264T，以及在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置83处的取代、在位置85处的取代以及在位置264和/或位置265处的取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，其中在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S，并且其中在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。变体多肽可包含S83H取代，在位置85处的取代，选自I85A、I85L、I85P、I85S、I85T和I85V，在位置264处的取代，选自T264A、T264N和T264S，以及在位置265处的取代，选自D265A、D265G、D265S和D265T。变体多肽可包含S83H取代、I85L取代和D265G取代。变体多肽可包含S83H取代、I85L取代、T264A取代和D265T取代。变体多肽可以包含S83N取代，在位置85处的取代，选自I85L和I85V，在位置264处的取代，选自T264A、T264D、T264N和T264S，以及在位置265处的取代，选自D265A、D265G、D265S和D265T。变体多肽可包含S83Y取代，在位置85处的取代，选自I85A和I85V，在位置264处的取代，选自T264A和T264S，以及D265T取代。

在一个实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其至少包含在位置83处的取代、在位置85处的取代和在位置255处的取代，还可以包含在位置264和/或位置265处的取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，其中在位置255处的取代选自I255A和I255L，其中在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S，并且其中在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。变体多肽可包含S83H取代，在位置85处的取代，选自I85A、I85L、I85P、I85S、I85T和I85V，I255A取代，在位置264处的取代，选自T264A、T264N和T264S，以及在位置265处的取代，选自D265A、D265G、D265S和D265T。变体多肽可以包含S83N取代，在位置85处的取代，选自I85L和I85V，I255A取代，在位置264处的取代，选自T264A、T264D、T264N和T264S，以及在位置265处的取代，选自D265A、D265G、D265S和D265T。所述变体多肽可包含S83Y取代，在位置85处的取代，选自I85A和I85V，I255A取代，在位置264处的取代，选自T264A和T264S，以及D265T取代。在一项实施方案中，变体多肽是根据SEQ ID NO：1所述的多肽，其除了上文公开的取代的组合之外，还包括至少一种以下其它的取代：K160N、I254L、I256D、D263R、T268G。

本发明涉及具有脂肪酶活性的变体多肽，其中所述变体多肽是与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列，并且所述变体多肽当与SEQ ID NO：1的脂肪酶相比时，具有增加的酶活性、pH稳定性、抗蛋白水解降解的稳定性和在洗涤剂制剂中的稳定性，或其任何组合。

“取代”通过提供原始氨基酸、随后是氨基酸序列内的位置编号、随后是取代的氨基酸来描述。特定的氨基酸残基可以被不同于原始氨基酸残基的19个氨基酸残基中的任何一个取代。例如，将位置120处的组氨酸用丙氨酸取代的命名为“His120Ala”或“H120A”。通过在氨基酸残基之间插入逗号来描述取代的组合，例如：K24E，D25P，L27H，A141R，G203I，S220L，S398P；代表与亲本多肽相比时七个不同氨基酸残基取代的组合。

氨基酸缺失通过提供亲本酶的原始氨基酸、然后是氨基酸序列内的位置编号、再加上*来描述。因此，将位置150处的甘氨酸的缺失指定为“Gly150*”或“G150*”。或者，缺失例如由“删除D183和G184”表示。

氨基酸插入通过提供亲本酶的原始氨基酸、然后是氨基酸序列内的位置编号、然后是原始氨基酸和额外的氨基酸来描述。例如，赖氨酸在位于甘氨酸旁边的位置180处的插入被指定为“Gly180GlyLys”或“G180GK”。当插入一个以上的氨基酸残基时，例如在Gly180之后的Lys和Ala可以表示为：Gly180GlyLysAla或G195GKA。

本发明涉及本文的本发明的多肽变体的片段，其中所述多肽片段具有脂肪酶活性。

本文所用的“片段”或“亚序列”是多核苷酸或氨基酸序列的一部分，其中所述片段或亚序列保留或编码与其相关的序列的至少一种功能活性。

术语“功能性片段”是指分别仅包含全长氨基酸序列的一部分、但仍然具有相同或相似的活性和/或功能的任何核酸或氨基酸序列。片段占原始序列的至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％。与原始核酸或原始氨基酸序列相比，功能性片段分别包含连续的核酸或氨基酸。

本发明涉及具有脂肪酶活性的变体多肽，其中所述变体包含至少一种如权利要求1-6中任一项所述的变体多肽和具有脂肪酶活性的第二多肽的杂合体，其中所述杂合体具有脂肪酶活性。“杂合体”或“嵌合多肽”或“融合蛋白”是指第一个酶的氨基酸序列的片段与第二个酶的氨基酸序列的片段结合以形成杂合酶，其中该杂合体具有酶活性。

杂合酶可以用来自两种以上酶的氨基酸序列的片段进行工程改造。所述片段可以是本发明脂肪酶的催化结构域，可与市售脂肪酶的催化结构域组合，所述市售脂肪酶例如：Lipolase^TM、Lipex^TM、Lipolex^TM和Lipoclean^TM(Novozymes A/S)、Lumafast(最初来自Genencor)和Lipomax(Gist-Brocades/目前DSM)，以形成杂合酶，且该杂合体具有脂肪酶活性。

在一个实施方案中，将本发明脂肪酶的至少一个结构域或片段与选自真菌的三酰基甘油脂酶(EC类别3.1.1.3)的脂肪酶的至少一个结构域组合。真菌的三酰基甘油脂酶可以选自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa)的脂肪酶。在一个实施方案中，至少一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶选自根据US5869438的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的三酰基甘油脂酶。

疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶可以选自当与US5869438的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269相比时至少包含以下氨基酸取代的变体：T231R和N233R。所述脂肪酶变体可以进一步包含一个或多个与US5869438的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269相比的以下氨基酸交换：Q4V，V60S，A150G，L227G，P256K。包含与US5869438的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269相比的T231R和N233R取代的脂肪酶在本文中可以称为Lipex。

疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶可以选自在US5869438的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的多肽序列中至少包含氨基酸取代T231R、N233R、Q4V、V60S、A150G、L227G、P256K的变体。

疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶可以选自包含在US5869438的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269内的氨基酸取代T231R和N233R的变体，并且其与US5869438的SEQ ID NO：2的氨基酸1-269的全长多肽序列相比，至少95％，至少96％，至少有97％，至少98％或至少99％相似。

具有氨基酸取代的变体多肽可以是保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”或“相关氨基酸”是指用与亲本氨基酸序列相比在相同位置具有相似性质的不同氨基酸残基替换氨基酸序列中的一个氨基酸残基。保守氨基酸取代的一些例子包括但不限于用不同的带正电荷的氨基酸残基代替带正电荷的氨基酸残基；用不同的极性氨基酸残基代替极性氨基酸残基；用不同的非极性氨基酸残基代替非极性氨基酸残基，用不同的碱性氨基酸残基代替碱性氨基酸残基，或用不同的芳族氨基酸残基代替芳族氨基酸残基。

“成熟多肽”是指以其最终形式的酶，包括任何翻译后修饰、糖基化、磷酸化、截短、N-末端修饰、C-末端修饰、信号序列删除。成熟的多肽可以根据表达系统、载体、启动子和/或生产过程而变化。

“酶活性”是指酶发挥的至少一种催化作用。酶活性表示为每毫克酶的单位(比活性)或每分子酶每分钟转化的底物分子(分子活性)。酶活性可通过酶的实际功能来指定，例如通过催化肽键的水解裂解而发挥蛋白水解活性的蛋白酶，通过酯键的水解裂解而发挥脂分解活性的脂肪酶等。

在酶的储存或操作使用过程中，酶活性可能会发生变化。术语“酶稳定性”涉及在储存或操作过程中酶活性作为时间函数的保留。术语“存储”在本文中是指从制造时到最终应用中使用的时间点的存储的产品或组合物或制剂的事实。在洗涤剂中储存的期间，酶活性作为时间函数的保留可以称为“储存稳定性”。

为了确定和量化在一定条件下存储或使用的酶的催化活性随时间的变化，在规定的条件下于零时(100％)和稍后的某个时间点(x％)测量“初始酶活性”。通过比较测量值，可以确定其范围内酶活性的潜在损失。酶活性损失的程度决定了酶的稳定性或非稳定性。

影响酶的酶活性和/或储存稳定性和/或操作稳定性的参数例如是pH、温度和氧化性物质的存在：

变体多肽在宽pH范围内在约pH 4.0至约pH 12.0范围内的任何单个点上均具有活性。变体多肽酶可在以下pH范围内具有活性：pH 4.0至pH 11.0、pH 4.0至pH 10.0、pH 4.0至pH 9.0、pH 4.0至pH 8.0、pH 4.0至pH 7.0、pH 4.0至pH 6.0或pH 4.0至pH 5.0。变体多肽可以在以下pH下具有活性：pH 4.0、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH 4.6、pH4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH 5.0、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH5.8、pH 5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9、pH 9.0、pH9.1、pH 9.2、pH 9.3、pH 9.4、pH 9.5、pH 9.6、pH 9.7、pH 9.8、pH 9.9、pH 10.0、pH 10.1、pH 10.2、pH 10.3、pH 10.4、pH 10.5、pH 10.6、pH 10.7、pH 10.8、pH 10.9、pH 11.0、pH11.1、pH 11.2、pH 11.3、pH 11.4、pH 11.5、pH 11.6、pH 11.7、pH 11.8、pH 11.9、pH 12.0、pH 12.1、pH 12.2、pH 12.3、pH 12.4和pH 12.5、pH 12.6、pH 12.7、pH 12.8、pH 12.9及更高。

“pH稳定性”是指酶在特定pH范围内发挥酶活性的能力。

变体多肽在宽温度范围下具有活性，其中温度在约10℃至约60℃范围内的任何点。变体多肽可以在以下温度范围内有活性：10℃至55℃、10℃至50℃、10℃至45℃、10℃至40℃、10℃至35℃、10℃至30℃或10℃至25℃。变体多肽可以在以下温度范围内有活性：20℃至55℃、20℃至50℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃或20℃至25℃。变体多肽可在至少以下温度下具有活性：10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃，或更高的温度。

术语“热稳定性”和“热稳定”是指蛋白质在特定温度或温度范围内发挥催化活性的能力。酶通常在一定温度范围内发挥催化活性。除了在中等温度(例如室温)下发挥催化活性的酶外，还有能够在非常高或非常低的温度下发挥催化活性的酶。热稳定性可以通过称为T₅₀的值来表征(也称为半衰期，见上文)。T₅₀表示与未进行热处理的参照样品相比，在一定时间的热灭活后仍存在50％的残留酶活性的温度。

术语“耐热性”和“耐热”是指蛋白质在暴露于特定温度(例如非常高或非常低的温度)后发挥催化活性的能力。耐热蛋白在暴露温度下可能不会发挥催化活性，但一旦恢复到合适的温度，则会发挥催化活性。

多肽变体可以描述为与各个亲本酶的氨基酸序列至少n％相同(同一性)的氨基酸序列，其中“n”是10至100之间的整数。当与亲本酶的全长氨基酸序列比较时，变体多肽具有至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，其中所述酶变体具有酶活性。

本发明进一步涉及编码本发明的变体多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用，是指任何长度的聚合直链形式的核苷酸，无论它是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸或两者的组合。“基因”是带有特定遗传信息的DNA片段。

“亲本”多核苷酸序列是用于将突变引入该序列的起始序列，导致了所述亲本多核苷酸序列的“变体”。“变体多核苷酸”是指编码与亲本多核苷酸相同的酶的多核苷酸。在这种情况下，变体多核苷酸在其核酸序列上不同于其亲本多核苷酸，但是编码的多肽保持不变。

一方面，本发明的多核苷酸具有与SEQ ID NO：2的全长多核苷酸序列相比至少80％相同的核酸序列。与SEQ ID NO：2的全长多核苷酸序列相比，本发明的多核苷酸可以具有至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO：2的全长多核苷酸序列相比，至少80％相同的变体多核苷酸编码具有脂肪酶活性的多肽序列，该多肽序列包含与SEQ ID NO：1的全长氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。

本发明的多核苷酸编码具有脂肪酶活性的多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：1的全长氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。本发明的多核苷酸可以编码具有脂肪酶活性的多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：1的全长氨基酸序列具有至少80％相同、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码具有脂肪酶活性的多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：1的全长氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，其包含对SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸残基插入、缺失或取代。所述氨基酸残基插入、缺失或取代可以位于氨基酸残基的位置编号：23、33、82、83、84、85、160，199、254、255、256、258、263、264、265、268、308、311或其任何组合。氨基酸取代可以选自：Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D；L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S；T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A和Y311E，或其任何组合。

本发明涉及编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽具有与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％，至少98％或至少99％的同一性，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列包括至少一个选自以下的取代：Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D；L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S；T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A和Y311E。

本发明涉及编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽具有与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％，至少98％或至少99％的同一性，其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列包括至少一个选自以下的取代：Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D；L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S；T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A和Y311E。SEQ ID NO：1的氨基酸序列可以包含选自本说明书的实施例1、表1中所述的任何组合的组合。

在一个实施方案中，多核苷酸编码在位置83处包含至少一个取代的SEQ ID NO：1的多肽，其中该取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y。优选地，在位置83处的取代选自S83H、S83I、S83N和S83Y。在一个实施方案中，多核苷酸编码在位置85处包含至少一个取代的SEQ ID NO：1的多肽，其中该取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y。优选地，在位置85处的取代选自I85L、I85T和I85V。在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，该多肽在位置255处至少包含一个取代，其中该取代选自I255A、I255L。在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其在位置264处包含至少一个取代，其中该取代选自T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S。优选地，位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，该多肽在位置265处至少包含一个取代，其中所述取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。优选地，在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其至少在位置83处具有取代和在位置85处具有取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，并且在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置83处的取代选自S83H和S83I，并且在位置85处的取代选自I85L、I85P、I85T和I85V；在位置83处的取代为S83H；且在位置85处的取代选自I85L、I85P和I85T；在位置83处的取代为S83I；且在位置85处的取代是I85V。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其至少在位置83处具有取代和在位置255处具有取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，以及在位置255处的取代选自I255A和I255L。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置83处的取代选自S83H、S83N和S83Y，并且在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S；在位置83处的取代选自S83H、S83N、S83T和S83Y，在位置255处的取代为I255A。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其至少在位置83处具有取代和在位置264处具有取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，并且位置264处的取代选自T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N和T264S。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中至少发生以下取代的组合：在位置83处的取代选自S83H、S83N和S83Y，并且在位置264处的取代基选自T264A、T264D、T264N和T264S；在位置83处的取代基为S83H，在位置264处的取代选自T264A、T264N和T264S；在位置83处的取代基为S83N，在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S；在位置83处的取代为S83Y，在位置264处的取代选自T264A和T264S。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，该多肽至少在位置83处具有取代并且在位置265处具有取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，并且位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置83处的取代选自S83H、S83I、S83N、S83T和S83Y，在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；在位置83处的取代为S83H，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；位置83处的取代为S83I，位置265处的取代选自D265G、D265S；位置83处的取代为S83N，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；位置83处的取代为S83T，位置265处的取代选自D265A、D265S和D265T；位置83处的取代为S83Y，位置265处的取代为D265T。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其至少在位置85处具有取代并且在位置265处具有取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，并且位置265上的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置85处的取代选自I85A、I85H、I85L、I85P、I85S、I85T和I85V，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；在位置85处的取代为I85A，位置265处的取代为D265T；位置85处的取代为I85H，位置265处的取代为D265A；位置85处的取代为I85L，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；在位置85处的取代是I85P，在位置265处的取代是D265A；在位置85处的取代是I85S，在位置265处的取代是D265S；在85位的取代是I85T，在265位的取代选自D265G、D265S和D265T；在位置85处的取代是I85V，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，该多肽至少在位置85处具有取代和在位置255处具有取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，其中位置255处的取代选自I255A和I255L。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置85处的取代是I85H取代，并且在位置255处的取代是I255A取代；位置85处的取代是I85L取代；位置255处的取代是I255A取代；位置85处的取代是I85S取代；位置255处的取代是I255A取代；位置85处的取代是I85V取代，位置255处的取代是I255A取代。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其至少在位置83处具有取代、在位置85处具有取代和在位置255处具有取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，并且其中在位置255处的取代选自I255A和I255L。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置83处的取代是S83H取代，在位置85处的取代选自I85A、I85L、I85P、I85S、I85T和I85V，位置255处的取代是I255A取代；在位置83的取代是S83N取代，在位置85的取代选自I85L和I85V，且在位置255处的取代为I255A取代；位置83处的取代为S83T取代，位置85处的取代选自I85H和I85V，位置255处的取代为I255A取代；位置83处的取代为S83Y取代，在位置85处的取代选自I85A和I85V，并且在位置255处的取代是I255A取代。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，该多肽至少在位置85处具有取代和在位置264处具有取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，其中位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置85处的取代是I85A取代，并且在位置264处的取代是T264A取代；位置85处的取代是I85L取代，位置264处的取代是T264S取代；位置85处的取代是I85S取代，位置264处的取代是T264A取代；位置85处的取代是I85T取代，位置264处的取代为T264A取代；位置85处的取代为I85V取代，位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，该多肽至少在位置255处具有取代和在位置264处具有取代，其中在位置255处的取代选自I255A和I255L，并且其中在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置255处的取代是I255A取代，而在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，该多肽至少在位置255处具有取代和在位置265处具有取代，其中在位置255处的取代选自I255A和I255L，并且其中在位置265处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中至少发生以下取代的组合：位置255处的取代为I255A取代，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T；位置255处的取代为I255A取代，位置265位的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；位置255位的取代为I255A取代，位置265处的取代为D265S取代。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其至少在位置264处具有取代和在位置265处具有取代，其中在位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S，并且其中位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中至少发生以下取代的组合：位置264处取代为T264A取代，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；位置264处的取代为T264D取代，位置265处的取代选自D265A和D265T；位置264处的取代是T264N取代，并且位置265处的取代选自D265A和D265T；位置264处的取代是T264S取代，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其至少在位置85处具有取代并且在位置265处具有取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，并且位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T，还包括在位置264处的取代，其中该取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置85处的取代是I85A取代，在位置264处的取代是T264A。在位置265处的取代为D265T取代；位置85处的取代为I85L取代，位置264处的取代为T264S取代，且位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；位置85处的取代为I85S取代，位置264处的取代为T264A取代，位置265处的取代为D265T取代；位置85处的取代为I85T取代，位置264处的取代为T264A取代，且位置265处的取代选自D265G、D265S和D265T；位置85处的取代为I85V取代，位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其至少在位置85处具有取代并且在位置265处具有取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，并且位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T，还包括位置255处的取代，其中该取代选自I255A和I255L。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置85处的取代是I85H取代，在位置255处的取代是I255A取代，且位置265处的取代为D265A取代；位置85处的取代为I85L取代，位置255处的取代为I255A取代，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；位置85处取代为I85S取代，位置255处取代为I255A取代，位置265处取代为D265T取代；位置85处取代为I85V取代，位置255处取代为I255A取代，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其至少包含在位置85处的取代、在位置265处的取代、在位置255处的取代和在位置264处的取代，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，其中在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T，其中位置255处的取代选自I255A和I255L，其中位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置85处的取代是I85L取代，在位置255处的取代是I255A取代，位置264处的取代为T264S取代，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；位置85处取代为I85S取代，位置255处取代为I255A取代，位置264处取代为T264A取代，位置265处取代为D265T取代；位置85处取代为I85V取代，位置255处的取代是I255A取代，在位置264处的取代选自T264A、T264G、T264S和T264T，在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其至少在位置83处具有取代、在位置85处具有取代以及在位置264和/或位置265处具有取代，其中位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，其中位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S，并且其中位置265处的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置83处的取代是S83H取代，在位置85处的取代选自I85A、I85L、I85P、I85S、I85T和I85V，在位置264处的取代选自T264A、T264N和T264S，在位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；在位置83处的取代是S83H取代，位置85处为I85L取代，位置265处为D265G取代；位置83处取代为S83H取代，位置85处取代为I85L取代，位置264处取代为T264A取代，位置265处取代为D265T取代；位置83处取代为S83N取代，位置85的取代选自I85L和I85V，位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S，位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；位置83处为S83Y取代，位置85处的取代选自I85A和I85V，位置264处的取代选自T264A和T264S，以及D265T取代。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其至少在位置83处具有取代、在位置85处具有取代以及在位置255处具有取代，还可以在位置264和/或位置265处进一步包含取代，其中在位置83处的取代选自S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T和S83Y，其中在位置85处的取代选自I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V和I85Y，其中位置255处的取代选自I255A和I255L，其中位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S，其中位置265的取代选自D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S和D265T。在本发明的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中在编码的多肽中发生至少以下取代的组合：在位置83处的取代是S83H取代，在位置85处的取代选自I85A、I85L、I85P、I85S、I85T和I85V，位置255处的取代是I255A取代，位置264处的取代选自T264A、T264N和T264S，且位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；位置83处的取代是S83N取代，位置85处的取代选自I85L、I85V，和I255A取代，位置264处的取代选自T264A、T264D、T264N和T264S，且位置265处的取代选自D265A、D265G、D265S和D265T；位置83处的取代为S83Y取代，位置85处的取代选自I85A和I85V，位置255处的取代为I255A取代，位置264处的取代选自T264A和T264S，并且在位置265处的取代是D265T取代。

在一个实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO：1的多肽，其中除了以上公开的取代的组合之外，还编码以下另外的取代中的至少一个：K160N、I254L、I256D、D263R、T268G。

一方面，本发明的多核苷酸编码具有脂肪酶活性的变体多肽，其中所述变体多肽是具有与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列至少80％相同、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：1的脂肪酶相比，所述变体多肽具有更高的酶促活性、pH稳定性、对蛋白酶水解降解的稳定性或其任何组合。

本发明涉及编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多肽是上述的本发明的全长氨基酸序列的片段。

本发明涉及编码具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽是至少一种本发明的多肽和至少一种不同于本发明的多肽的多肽的杂合体。在一个实施方案中，所述多核苷酸编码具有脂肪酶活性的多肽，其中该多肽是至少一种本发明的多肽和至少一种不同于本发明的多肽的脂肪酶的杂合体。

当与亲本序列相比时，变体多核苷酸和变体多肽序列可以通过它们的“序列同一性”来定义。序列同一性通常以“序列同一性％”或“同一性％”提供。为了计算序列同一性，第一步必须产生序列比对。根据本发明，必须产生成对的总体比对，这意味着必须在两个序列的整个长度上进行比对，这通常是通过使用称为比对算法的数学方法来产生的。

根据本发明，通过使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(1979)48,443-453页)产生比对。优选地，出于本发明的目的，使用程序“NEEDLE”(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite(EMBOSS))，并使用程序默认参数(多核苷酸：空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5，并且矩阵＝EDNAFULL；多肽：空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5，矩阵＝EBLOSUM62)。

在比对两个序列之后，在第二步骤中从产生的比对中确定同一性值。

在一个实施方案中，同一性％通过将相同残基的数目除以比对区域的长度(其在全长上显示本发明的各个序列)，再乘以100来计算：同一性％＝(相同残基/在全长上显示本发明各序列的比对区域的长度)*100。

在一个优选实施方案中，同一性％通过将相同残基的数目除以比对区的长度(其在全长上显示两个比对的序列)，再乘以100来计算：同一性％＝(相同残基/在全长上显示两个比对序列的比对区域的长度)*100。

当与亲本序列相比时，变体多肽可以由它们的“序列相似性”来定义。序列相似性通常以“序列相似性％”或“相似性％”提供。序列相似性％考虑了限定的氨基酸组具有相似的特性，例如，通过大小、疏水性、电荷或其它特性。在此，一个氨基酸与相似氨基酸的交换可称为“保守突变”。根据本发明的类似氨基酸定义如下：

氨基酸A与氨基酸S类似

氨基酸D与氨基酸E、N类似

氨基酸E与氨基酸D、K、Q类似

氨基酸F与氨基酸W、Y类似

氨基酸H与氨基酸N、Y类似

氨基酸I与氨基酸L、M、V类似

氨基酸K与氨基酸E、Q、R类似

氨基酸L与氨基酸I、M、V类似

氨基酸M与氨基酸I、L、V类似

氨基酸N与氨基酸D、H、S类似

氨基酸Q与氨基酸E、K、R类似

氨基酸R与氨基酸K、Q类似

氨基酸S与氨基酸A、N、T类似

氨基酸T与氨基酸S类似

氨基酸V与氨基酸I、L、M类似

氨基酸W与氨基酸F、Y类似

氨基酸Y与氨基酸F、H、W类似

保守的氨基酸取代可以在功能性蛋白质如酶的多肽序列的全长上发生。在一个实施方案中，这种突变不涉及酶的功能结构域。在一个实施方案中，保守突变不涉及酶的催化中心。

为了计算序列相似性，第一步必须如上所述进行序列比对。

在一个实施方案中，相似性％通过将相同残基的数量加上相似残基的数量除以比对区域的长度(其在全长上显示本发明的各个序列)，再乘以100来计算：相似性％＝[(相同残基+相似残基)/在全长上显示本发明的各个序列的比对区的长度]*100。

在一个优选的实施方案中，相似性％通过将相同残基的数量加上相似残基的数量除以比对区域的长度(其在全长上显示两个比对的序列)，再乘以100来计算：相似性％＝[(相同残基+相似残基)/在全长上显示两个比对的序列的比对区的长度]*100。

可以“表达”编码多肽的多核苷酸。“表达”通常描述编码多肽的多核苷酸序列经历的在生物体中实际产生所述多肽的过程。

酶的工业生产通常通过使用表达系统来完成。本文中的“野生型细胞”是指某些修饰之前的细胞。术语“重组细胞”(在本文中也称为“遗传修饰的细胞”)是指已经被遗传改变、修饰或工程改造的细胞，从而与其所衍生自的野生型细胞相比，其表现出改变的、修饰的或不同的基因型。“重组细胞”可以包含编码某种蛋白质或酶的外源多核苷酸，因此可以表达所述蛋白质或酶。

“表达系统”可以指宿主微生物、表达宿主、宿主细胞、生产生物体或生产菌株，并且这些术语中的每一个可以互换使用。表达系统的实例包括但不限于：黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)、多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)，优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，或地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，假单胞菌属(Pseudomonas)，优选荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，毕赤酵母(Pichia pastoris)(也称为Komagataella phaffii)、嗜热毁丝霉(Myceliopthora thermophile)(C1)、裂殖酵母菌丝(Schizosaccharomyces pombe)、木霉属(Trichoderma)，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)，和酵母菌属(Saccharomyces)，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。使用上面列出的表达系统生产变体多肽。

术语“非天然存在”是指在其原始天然存在的环境或来源中不存在的(多)核苷酸、氨基酸、(多)肽、酶、蛋白质、细胞、生物或其它物质。

在多核苷酸和多肽的上下文中，术语“异源的”(或外源或外来或重组)在本文中定义为：

(a)不是宿主细胞天然的；

(b)宿主细胞天然的；但是，由于通过重组DNA技术操纵宿主细胞的DNA改变了天然序列，结构修饰(例如缺失、取代和/或插入)也包括在内；或

(c)由于通过重组DNA技术(例如更强的启动子)对宿主细胞的DNA进行操作，宿主细胞天然存在但表达被定量改变或表达是从不同于天然宿主细胞的基因组位置进行。

对于两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列，术语“异源”用于表征两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列不是天然地以彼此特异性组合的方式出现的。

如本文所用，“基因构建体”或“表达盒”是由至少一个待表达的目的序列组成的DNA分子，其与如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)可操作地连接。通常情况下，表达盒包含三个元件：启动子序列、开放阅读框和3'非翻译区，在真核生物中通常含有聚腺苷酸化位点。其他调控元件可包括转录增强子和翻译增强子。也可以将内含子序列添加到5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加在胞质溶胶中积累的成熟信息的量。表达盒可以是载体的一部分，或者可以整合到宿主细胞的基因组中并与其宿主细胞的基因组一起复制。表达盒通常能够增加或减少表达。

如本文所用，术语“载体”包括任何类型的构建体，其适合于携带外源多核苷酸序列以转移至另一细胞或用于在给定的细胞内稳定或瞬时表达。如本文所用，术语“载体”涵盖任何种类的克隆载体，例如但不限于质粒、噬菌粒、病毒载体(例如噬菌体)、细菌噬菌体、杆状病毒、粘粒、fosmid、人工染色体或任何其他针对特定目的宿主的特异性的载体。还包括低拷贝数或高拷贝数的载体。外源多核苷酸序列通常包含编码序列，其在本文中可称为“目的基因”。目的基因可以包含内含子和外显子，这取决于宿主细胞的起源或目标。

本文所用的载体可以提供用于在转化到宿主细胞或宿主细胞细胞器中之后外源多核苷酸转录和翻译的片段。此类额外的片段可包括调控性核苷酸序列、在特定细胞类型中维持和/或复制所必需的一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、聚腺苷酸化信号、用于插入外源编码序列的合适位点例如多克隆位点等。一个例子是当需要将载体作为游离基因元件(例如质粒或粘粒分子)维持在细菌细胞中时。合适的复制起点的非限制性实例包括f1-ori和colE1。

载体可以复制而不整合到宿主细胞的基因组中，例如作为细菌宿主细胞中的质粒，或者它可以将其部分或全部DNA整合到宿主细胞的基因组中，从而导致其DNA的复制和表达。

可以通过克隆将外源核酸引入载体。克隆可以指通过以合适的方式和方法(例如限制性内切酶)切割载体(例如在多克隆位点内)和外源多核苷酸，可以在单个核酸内产生匹配的结构，从而使所述外源核酸和载体可控地融合。

一旦引入载体中，包含编码序列的外源核酸可能适合被引入(转化、转导、转染等)到宿主细胞或宿主细胞细胞器中。可以选择适合在宿主细胞或宿主细胞细胞器中表达外源多核苷酸序列的克隆载体。

如本文所指，术语“引入”或“转化”涵盖外源多核苷酸向宿主细胞的转移，无论采用哪种转移方法。即，本文所用的术语“转化”不依赖于载体、穿梭系统或宿主细胞，并且不仅涉及本领域已知的转化的多核苷酸转移方法(参见例如Sambrook，J.等人(1989)分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)，而且涵盖了任何其他种类的多核苷酸转移方法，例如但不限于转导或转染。可以用遗传构建体转化，通过器官发生或胚胎发生而产生能够随后克隆繁殖的植物组织，并从中再生出整株植物。选择的特定组织将根据可用的且最适合于被转化的特定物种的克隆繁殖系统而变化。

在本发明的一个实施方案中，载体用于转化宿主细胞。

可以将多核苷酸瞬时或稳定地引入宿主细胞，并且可以保持非整合状态，例如作为质粒。“稳定的转化”可以指转化的细胞或细胞器将包含外源编码序列的核酸传给下一代细胞或细胞器。通常，稳定的转化归因于将包含外源编码序列的核酸整合到染色体中或作为游离基因(核DNA的独立片段)。

“瞬时转化”可表示细胞或细胞器一旦转化，就在特定时间内表达外源核酸序列，大部分情况是在一代以内。通常，瞬时转化是由于包含外源核酸序列的核酸未整合入染色体或没有作为游离基因。

或者，可以将其整合到宿主基因组中。然后可以以本领域技术人员已知的方式将所得的转化植物细胞用于再生转化的植物。

与相应的野生型细胞相比，重组细胞可表现为“增加”或“减少”的表达。

如本文所用，术语“表达增加”、“增强表达”或“过表达”是指在原始的野生型表达水平(其也可以是缺乏表达或不可测量的表达)之外的任何形式的表达。本文中提及“表达增加”、“增强表达”或“过表达”之处，是指相对于对照生物体，基因表达的增加和/或就多肽而言，多肽水平增加和/或多肽活性增加。表达的增加可以是与对照生物体相比，优选增加至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％或100％或甚至更多。

增加基因或基因产物表达的方法，例如通过适当的启动子驱动的过表达，转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入多核苷酸的非异源形式的适当位置(通常在上游)，以增加编码目的多肽的核酸的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代而在体内改变内源性启动子(参见，Kmiec，US 5,565,350；Zarling等人，WO 93/22443)，或者可以以适合本发明基因的正确方向和距离将分离的启动子引入生物体中，以便控制该基因的表达。

也可以将内含子序列添加到5'非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列中，以增加在胞质溶胶中积累的成熟信息的量。已显示，在表达构建体的转录单位中包含可剪接的内含子可在mRNA和蛋白质水平上将基因表达增加多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Genes Dev 1：1183-1200)。当置于转录单位的5'末端附近时，基因表达的这种内含子增强通常是最大的。

为了获得多肽的增加表达或过表达，最通常地，编码该多肽的核酸在有义方向上用聚腺苷酸化信号过表达。除了适合于以预期的表达模式驱动表达的启动子之外，还可以使用内含子或其他增强元件。

通常通过使用重组细胞在商业上生产酶，所述重组细胞通过在适合所需的酶表达的条件下培养所述细胞来表达所需酶。

培养通常在合适的营养培养基中进行，以使重组细胞生长(此过程可称为发酵)并表达所需蛋白质。在发酵结束时，收集发酵液并可进行进一步处理，其中所述发酵液包含液体部分和固体部分。

目的酶可以从发酵液中进一步纯化。所得产物在本文中可以称为“分离的多肽产物”或“分离的脂肪酶产物”，其中本文中的多肽或脂肪酶是指本发明的多肽或酶。术语“纯化”是指这样的过程，其中至少一种组分，例如目的蛋白质，与至少另一种组分例如发酵液的颗粒物质分离，并转移到不同的隔室或相中，其中所述不同隔室或相不一定需要由物理屏障隔开。所述不同的隔室的例子是由过滤膜或滤布隔开的两个隔室，即滤液和截留物；所述不同相的例子分别是沉淀物和上清液或饼和滤液。

目的酶可以被分泌(到发酵液的液体部分中)或可以不从宿主细胞分泌(并因此被包含在发酵液的细胞中)。基于此，可以从发酵液的液体部分或细胞裂解物中回收所需的蛋白质或酶。所需酶的回收使用本领域技术人员已知的方法。从发酵液中回收蛋白质或酶的合适方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取和沉淀。如果目的酶在发酵液中沉淀或结晶或至少部分地与发酵液的颗粒物质结合，可能需要其他处理步骤才能从生物质中释放酶或溶解酶晶体和沉淀。US6316240B1描述了一种从发酵液中回收在发酵过程中沉淀和/或结晶的酶的方法。如果所需的酶包含在发酵液的细胞中，则可能需要从细胞中释放酶。从细胞中释放可以例如但不限于用技术人员熟知的技术进行细胞裂解来实现。

“具有脂肪酶活性的纯多肽”是指相对于分离的多肽产物的总重量，本发明的多肽占分离的多肽产物的量为至少约80重量％。“具有脂肪酶活性的纯多肽”可以指本发明的多肽占分离的多肽产物的量为至少约81重量％、至少约82重量％、至少约83重量％、至少约84重量％、至少约85重量％、至少约86重量％、至少约87重量％、至少约88重量％、至少约89重量％、至少约90重量％、至少约91重量％、至少约92重量％、至少约93重量％、至少约94重量％、至少约95重量％、至少约96重量％、至少约97重量％、至少约98重量％、至少约99重量％、或100重量％，所有这些都相对于多肽产物的总重量而言。优选地，“纯化的”是指材料处于100％纯状态。“具有脂肪酶活性的纯多肽”可以表示分离的多肽产物中包含的与本发明多肽不同的化合物的量小于20重量％、小于19重量％、小于18重量％、小于17重量％、小于16重量％、小于15重量％、小于14重量％、小于13重量％、小于12重量％、小于11重量％、小于10重量％、小于9重量％、小于8重量％、小于7重量％、小于6重量％、小于5重量％、小于4重量％、小于3重量％、小于2重量％、或小于1重量％，所有这些都相对于多肽产物的总重量而言。分离的多肽产物中包含的与本发明多肽不同的化合物可以是例如组分如源自发酵培养基的盐、源自生产宿主细胞的细胞碎片、生产宿主细胞在发酵过程中产生的代谢产物。

分离的多肽产物可以被进一步加工以形成“酶制剂”。

“液体”与在20℃和101.3kPa下的物理外观有关。

“酶制剂”是指包含少数成分的任何非复合制剂，其中所述成分用于稳定酶制剂中包含的酶和/或稳定酶制剂本身的目的。术语“酶稳定性”涉及在储存或操作过程中酶活性作为函数随时间的保留。术语“酶制剂的稳定性”涉及在储存或操作过程中酶制剂的物理外观的维持以及在储存或操作过程中避免微生物污染。

“酶制剂”是指用来配制到复合制剂中的组合物，所述复合制剂本身可以被确定最终用途。本发明的“酶制剂”不是包含几种组分的复合制剂，其中将这些组分配制成复合制剂以在最终应用中各自单独发挥特定作用。复合制剂可以是、但不限于洗涤剂制剂，其中单独的洗涤剂组分以对洗涤剂制剂的洗涤性能有效的量配制。

在本发明的一方面，酶制剂中包含至少一种本发明的淀粉酶变体。

酶制剂可以是固体或液体。酶制剂可以通过使用本领域已知的技术获得。例如但不限于，可以通过挤出或造粒获得固体酶制剂。合适的挤出和造粒技术是本领域已知的，并且描述在例如WO9419444A1和WO9743482A1中。

液体酶制剂可包含的酶量为相对于酶浓缩物的总重量在0.1重量％至40重量％，或0.5重量％至30重量％，或1重量％至25重量％，或3重量％至10重量％的范围内。

液体酶浓缩物可以包含一种以上类型的酶。在一个实施方案中，酶制剂包含一种或多种本发明的脂肪酶。在一个实施方案中，该酶制剂包含一种或多种本发明的脂肪酶和至少一种另外的酶，其选自与本发明的脂肪酶不同的脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、漆酶、果胶酶、核酸酶及其任意组合。本发明的水性酶制剂可包含的水的量按重量计大于约50％，按重量计大于约60％，按重量计大于约70％，或按重量计大于约80％，它们全部都相对于酶制剂的总重量计算。

在一个实施方案中，所述酶制剂除了至少一种本发明的多肽外，还包含一种或多种选自其他酶、防腐剂和稳定剂的化合物。

在一个实施方案中，液体酶制剂包含至少一种本发明的多肽变体和至少一种防腐剂。合适的防腐剂的非限定性实例包括(季)铵化合物、异噻唑啉酮、有机酸和甲醛释放剂。合适的(季)铵化合物的非限定性实例包括苯扎氯铵、聚六亚甲基双胍(PHMB)、十二烷基二甲基氯化铵(DDAC)和N-(3-氨基丙基)-N-十二烷基丙烷-1,3-二胺(二胺)。合适的异噻唑啉酮的非限制性实例包括1,2-苯并噻唑啉-3-酮(BIT)、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(MIT)、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮(CIT)、2-辛基-2H-异噻唑-3-酮(OIT)和2-丁基-苯并[d]异噻唑-3-酮(BBIT)。合适的有机酸的非限定性实例包括苯甲酸、山梨酸、L-(+)-乳酸、甲酸和水杨酸。合适的甲醛释放剂的非限定性实例包括N,N′-亚甲基双吗啉(MBM)、2,2′,2″-(六氢-1,3,5-三嗪-1,3,5-三基)三乙醇(HHT)、(亚乙二氧基)二甲醇、α,α′,α″-三甲基-1,3,5-三嗪-1,3,5(2H,4H,6H)-三乙醇(HPT)、3,3'-亚甲基双[5-甲基噁唑烷](MBO)和顺式1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物(CTAC)。

其它有用的防腐剂包括碘丙炔基丁基氨基甲酸酯(IPBC)、释放卤素的化合物，例如二氯二甲基乙内酰脲(DCDMH)，溴氯二甲基乙内酰脲(BCDMH)和二溴二甲基乙内酰脲(DBDMH)；溴-硝基化合物，例如溴硝丙二醇(即2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇)、2,2-二溴-2-氰基乙酰胺(DBNPA)；醛类，如戊二醛；苯氧基乙醇；联苯-2-醇；和巯氧吡啶锌或钠。

在一个实施方案中，液体酶制剂包含至少一种本发明的多肽变体和至少一种酶稳定剂。酶稳定剂选自能够减少液体酶浓缩物中包含的至少一种酶在储存过程中酶活性损失的物质。在本发明中减少的酶活性损失可意味着与储存前的初始酶活性相比，酶活性的损失降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。

在一个实施方案中，至少一种酶稳定剂选自稳定脂肪酶的化合物。与储存之前的初始脂解活性相比，当“可应用的”其脂解活性等于100％时，本发明的脂酶是稳定的。与储存前的初始脂解活性相比，如果脂肪酶可应用的脂解活性为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％，则在本发明中可以称为稳定的脂肪酶。

脂肪酶可以在至少一种选自例如NaCl或KCl的盐或乳酸和甲酸的碱金属盐的化合物的存在下稳定。

本发明涉及至少一种本发明的变体多肽和至少一种其它酶的组合。在一方面，这种组合是在20℃和101.3kPa下液体酶制剂的一部分。

酶的组合可以是相同类别的，例如包含第一脂肪酶和第二脂肪酶的组合物。酶的组合可以来自不同种类的酶，例如，包含脂肪酶和淀粉酶的组合物。酶的组合可以包含至少一种本发明的变体脂肪酶和一种其他酶。组合可以包含三种酶、四种酶或多于四种酶。

“其他酶”表示不同于本发明的脂肪酶变体的任何酶。至少一种“其他酶”可选自脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂合酶和核酸酶。

脂肪酶

“脂肪酶”、“脂肪分解酶”、“脂类酯酶”都是指EC 3.1.1类的酶(“羧酸酯水解酶”)。脂肪酶(E.C.3.1.1.3，三酰基甘油酯酶)通常将甘油三酯水解为亲水性更高的甘油单酯和甘油二酯、游离脂肪酸和甘油。脂肪酶通常还包括在不同于甘油三酯的底物上有活性或裂解特定脂肪酸的酶，例如磷脂酶A(EC 3.1.1.4)、半乳糖脂酶(EC 3.1.1.26)、角质酶(cutinase)(EC3.1.1.74)和具有固醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC3.1.1.50)的酶。

在专利和公开的专利申请中已经描述了许多脂肪酶，包括但不限于：WO2000032758、WO2003/089620、WO2005/032496、WO2005/086900、WO200600976、WO2006/031699、WO2008/036863、WO2011/046812和WO2014059360。

脂肪酶用于洗涤剂和清洁产品中，以去除油脂、脂肪、油和奶渍。市售的脂肪酶包括但不限于Lipolase^TM、Lipex^TM、Lipolex^TM和Lipoclean^TM(Novozymes A/S)、Lumafast(最初来自Genencor)和Lipomax(Gist-Brocades/现在为DSM)。

本发明的脂肪酶具有“脂分解活性”。测定脂分解活性的方法在文献中有描述(参见例如Gupta等人(2003),Biotechnol.Appl.Biochem.37,p.63-71)。例如，脂肪酶活性可以通过在底物对硝基苯基棕榈酸酯(pNP-棕榈酸酯，C:16)中的酯键水解来测量，其释放黄色的pNP，可以在405nm处检测到。

淀粉酶

α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)酶通常对包含三个或更多(1->4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖进行(1->4)-α-D-糖苷键的内水解。淀粉酶随机地作用于淀粉、糖原及相关多糖和寡糖；还原基团以α-构型释放。淀粉酶的其它实例包括β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)、异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、葡聚糖1,4-α-麦芽六糖苷酶(EC 3.2.1.98)和葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(EC 3.2.1.133)。

许多淀粉酶已经在专利和公开的专利申请中进行了描述，包括但不限于：WO2002/068589、WO 2002/068597、WO 2003/083054、WO 2004/091544和WO 2008/080093。

已知淀粉酶源自如WO 95/10603中所述的具有SEQ ID NO：2的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。合适的变体是与WO 95/10603中所述的SEQ ID NO：2至少90％相同和/或在以下位置包含一个或多个取代的那些变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444，它们具有淀粉水解活性。所述变体描述于WO 94/02597、WO 94/018314、WO 97/043424和WO 99/019467的SEQ ID NO：4中。

已知衍生自具有WO 02/10355中所述的SEQ ID NO：6的嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的淀粉酶或具有淀粉分解活性的与其至少90％相同的淀粉酶。SEQ ID NO：6的合适变体包括与其具有至少90％同一性和/或进一步包含在位置181和/或182处缺失和/或在位置193处取代的那些。

已知衍生自WO 99/19467中公开的具有SEQ ID NO：6的芽孢杆菌属(Bacillus)物种707的淀粉酶或具有淀粉分解活性的与其至少90％相同的淀粉酶。

已知从盐敏芽孢杆菌(Bacillus halmapalus)获得的具有如WO 96/23872(也称为SP-722)中所述的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7的淀粉酶，或具有淀粉分解活性的与所述序列之一至少90％相同的淀粉酶。

已知源自芽孢杆菌物种DSM 12649的具有如WO 00/22103中公开的SEQ ID NO：4的淀粉酶或具有淀粉分解活性的与其至少90％相同的淀粉酶。

已知源自芽孢杆菌菌株TS-23的具有如WO 2009/061380中公开的SEQ ID NO：2的淀粉酶或具有淀粉分解活性的与其至少90％相同的淀粉酶。

已知源自纤维粘菌属物种(Cytophaga sp.)的具有如WO 2013/184577中公开的SEQ ID NO：1的淀粉酶或具有淀粉分解活性的与其至少90％相同的淀粉酶。

已知源自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)DSM 90的具有如2010/104675中公开的SEQ ID NO：1的淀粉酶或具有淀粉分解活性的与其至少90％相同的淀粉酶。

已知具有如WO 00/60060中所述的SEQ ID NO：2的氨基酸1至485的淀粉酶或具有淀粉分解活性的包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1至485的氨基酸至少96％相同的氨基酸序列的淀粉酶。

还已知淀粉酶具有如WO 2006/002643中所述的SEQ ID NO：12或与其具有至少80％同一性且具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO：12相比具有至少80％同一性和/或在位置Y295F和M202LITV处包含取代并具有淀粉分解活性的那些。

还已知具有如WO 2011/098531中所述的SEQ ID NO：6的淀粉酶或与其具有至少80％同一性且具有淀粉分解活性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO：6相比具有至少80％同一性和/或包含在一个或多个选自以下位置的取代：193[G、A、S、T或M]、195[F、W、Y、L、I或V]、197[F、W、Y、L、I或V]、198[Q或N]、200[F、W、Y、L、I或V]、203[F、W、Y、L、I或V]、206[F、W、Y、N、L、I、V、H、Q、D或E]、210[F、W、Y、L、I或V]、212[F、W、Y、L、I或V]、213[G、A、S、T或M]和243[F、W、Y、L、I或V]，且具有淀粉分解活性的那些。

已知具有如WO 2013/001078中所述的SEQ ID NO：1的淀粉酶或具有淀粉分解活性的与其具有至少85％同一性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO：1相比具有至少85％同一性和/或在对应于位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476和G477的两个或更多个(几个)位置处包含改变并具有淀粉分解活性的淀粉酶。

已知具有如WO 2013/001087中所述的SEQ ID NO：2的淀粉酶或具有淀粉分解活性的与其具有至少85％同一性的淀粉酶。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO：2相比具有至少85％同一性和/或具有淀粉分解活性的在位置181+182、或182+183或183+184处包含缺失的那些。合适的淀粉酶包括与SEQ ID NO：2相比具有至少85％同一性和/或在181+182、或182+183、或183+184处包含缺失的淀粉酶，其在对应于以下位置的任何位置包含一个或两个或多个修饰：W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476和G477，且具有淀粉分解活性。

淀粉酶还包括来自上述淀粉酶的杂合的α-淀粉酶，例如描述于WO2006/066594。

市售的淀粉酶包括但不限于

Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme^TM、Stainzyme Plus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X和BAN^TM(来自Novozymes A/S)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM、Powerase^TM、Effectenz^TM(M100来自DuPont)、Preferenz^TM(S1000、S110和F1000；来自DuPont)、PrimaGreen^TM(ALL；DuPont)、Optisize^TM(DuPont)。

本发明的淀粉酶具有“淀粉分解活性”或“淀粉酶活性”，涉及多糖中的糖苷键的(内切)水解。α-淀粉酶活性可以通过测定α-淀粉酶活性的测定法来确定。测量α-淀粉酶活性的测定方法的实例为：α-淀粉酶活性可以通过使用Phadebas片作为底物的方法(Phadebas淀粉酶测试，由Magle Life Science提供)来测定。淀粉被α-淀粉酶水解，产生可溶的蓝色碎片。在620nm处用分光光度法测得的所得蓝色溶液的吸光度是α-淀粉酶活性的函数。在给定的条件下，所测得的吸光度与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/纯α-淀粉酶蛋白的毫克数)成正比。

α-淀粉酶活性也可以通过使用亚乙基-4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷(EPS)的方法来确定。D-麦芽七糖苷是一种封闭的寡糖，可以被内切淀粉酶裂解。切割后，试剂盒中包含的α-葡萄糖苷酶可消化底物以释放黄色的游离PNP分子，因此可以通过可见光分光光度法在405nm处进行测量。含有EPS底物和α-葡萄糖苷酶的试剂盒由Roche Costum Biotech(目录号10880078103)制造。在给定的条件下，时间依赖性的吸收曲线的斜率与所讨论的α-淀粉酶的比活性(每毫克酶的活性)成正比。

蛋白酶

具有蛋白水解活性的酶称为“蛋白酶”或“肽酶”。蛋白酶是发挥“蛋白酶活性”或“蛋白水解活性”的活性蛋白。

蛋白酶是EC 3.4类别的成员，包括氨基肽酶(EC 3.4.11)、二肽酶(EC 3.4.13)、二肽基肽酶和三肽基肽酶(EC 3.4.14)、肽基二肽酶(EC 3.4.15)、丝氨酸型羧肽酶(EC3.4.16)、金属羧肽酶(EC 3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(EC 3.4.18)、ω肽酶(EC 3.4.19)、丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(EC 3.4.23)、金属内肽酶(EC 3.4.24)、苏氨酸内肽酶(EC 3.4.25)、催化机理未知的内肽酶(EC3.4.99)。

市售的蛋白酶包括但不限于Lavergy^TMPro(BASF)；

Duralase^TM、Durazym^TM、

(Novozymes A/S)，以下述商标名出售的那些：

(Danisco/DuPont)、Axapem^TM(Gist-Brocases N.V.)、迟缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)碱性蛋白酶和获自Kao的KAP(Bacillus alkalophilus枯草杆菌蛋白酶)。

可以从丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)中选择至少一种蛋白酶。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶(EC 3.4.21)的特征在于在催化活性位点具有丝氨酸，其在催化反应过程中与底物形成共价加合物。丝氨酸蛋白酶可以选自糜蛋白酶(例如EC 3.4.21.1)、弹性蛋白酶(例如EC 3.4.21.36)、弹性蛋白酶(例如EC 3.4.21.37或EC 3.4.21.71)、粒酶(例如EC3.4.21.78或EC 3.4.21.79)，激肽释放酶(例如EC 3.4.21.34、EC 3.4.21.35、EC3.4.21.118或EC 3.4.21.119)、纤溶酶(例如EC 3.4.21.7)、胰蛋白酶(例如EC 3.4.21.4)、凝血酶(例如EC 3.4.21.5)和枯草杆菌蛋白酶(也称为枯草肽酶，例如EC 3.4.21.62)，后者在下文中也称为“枯草杆菌蛋白酶”。

Siezen等人(1991),Protein Eng.4:719-737和Siezen等人(1997),ProteinScience 6:501-523中提出了暂时指定为枯草杆菌酶(subtilase)的丝氨酸蛋白酶的亚组。它们是通过对丝氨酸蛋白酶(以前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶)的170多个氨基酸序列进行同源性分析而定义。枯草杆菌蛋白酶以前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，根据Siezen等人的报道，现在是枯草杆菌酶的一个亚组。已经鉴定出各种各样的枯草杆菌酶，并且已经确定了许多枯草杆菌酶的氨基酸序列。有关此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细说明，参见Siezen等人(1997),Protein Science 6:501-523。枯草杆菌酶可分为6个亚类，即枯草杆菌蛋白酶族、热酶族、蛋白酶K族、羊毛硫抗生素肽酶族、kexin族和极端嗜热古菌蛋白酶(pyrolysin)族。

枯草杆菌酶的一个亚组是枯草杆菌蛋白酶，它们是MEROPS数据库(http:// merops.sanger.ac.uk)所定义的S8家族的丝氨酸蛋白酶。肽酶家族S8包含丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶及其同源物。在S8A亚族中，活性位点残基经常出现在基序Asp-Thr/Ser-Gly(其与AA族天冬氨酸内肽酶家族的序列基序相似)、His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro。肽酶家族S8的大多数成员在中性至弱碱pH下均具有活性。该家族中的许多肽酶都是热稳定的。

S8家族的亚家族A的主要成员是：

枯草杆菌蛋白酶类型(EC 3.4.21.62)及其变体的亲本蛋白酶可以是细菌蛋白酶。所述细菌蛋白酶可以是革兰氏阳性细菌多肽，例如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)的蛋白酶，或者是革兰氏阴性细菌多肽，例如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、llyobacter、奈瑟球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或尿素支原体(Ureaplasma)的蛋白酶。例如，R.Siezen在R.Bott和C.Betzel编辑，纽约，1996的"Subtilisin enzymes"中的第75-95页"Subtilases:Subtilisin-like Proteases"中提供了该家族的综述。

至少一种蛋白酶可以选自以下：来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BPN'的枯草杆菌蛋白酶(由Vasantha等人(1984)在J.Bacteriol.Volume 159,p.811-819和JA Wells等人(1983)在Nucleic Acids Research,Volume 11,p.7911-7925中所述)；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的枯草杆菌蛋白酶(枯草溶菌素；在EL Smith等人(1968)在J.Biol Chem,Volume 243,pp.2184-2191和Jacobs等人(1985)在Nucl.Acids Res,Vol 13,p.8913-8926中公开)；枯草杆菌蛋白酶PB92(碱性蛋白酶PB92的原始序列在EP 283075A2中有描述)；如WO 89/06279中公开的枯草杆菌蛋白酶147和/或309(分别为

)，如WO 91/02792中公开的来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的枯草杆菌蛋白酶，例如WO 95/23221中所述来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483或迟缓芽孢杆菌DSM 5483的变体；如DE 10064983中公开的来自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)(DSM 11233)的枯草杆菌蛋白酶；如WO 2003/054184中公开的来自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)(DSM 14391)的枯草杆菌蛋白酶；如WO2003/056017公开的来自芽孢杆菌属物种(DSM 14390)的枯草杆菌蛋白酶；在WO 2003/055974中公开的来自芽孢杆菌属物种(DSM 14392)的枯草杆菌蛋白酶；在WO 2003/054184中公开的来自吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)(DSM 14393)的枯草杆菌蛋白酶；如WO2005/063974中描述的具有SEQ ID NO：4的枯草杆菌蛋白酶；如WO 2005/103244中描述的具有SEQ ID NO：4的枯草杆菌蛋白酶；如WO 2005/103244中描述的具有SEQ ID NO：7的枯草杆菌蛋白酶；和如在申请DE 102005028295.4中描述的具有SEQ ID NO：2的枯草杆菌蛋白酶。

至少一种枯草杆菌蛋白酶可以是如在WO 89/06279的表I中的序列a)所公开的枯草杆菌蛋白酶309(在本文中可以称为

)或与其至少80％相同并且具有蛋白水解活性的变体。

已知蛋白酶包含以下文献所述的变体：WO 92/19729、WO 95/23221、WO 96/34946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/11768、WO 01/44452、WO 02/088340、WO 03/006602、WO2004/03186、WO 2004/041979、WO 2007/006305、WO 2011/036263、WO 2011/036264和WO2011/072099。合适的实例尤其包括衍生自如EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22的枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶变体(具有一个或多个以下位置的氨基酸取代：3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274，且具有蛋白水解活性。此外，一种枯草杆菌蛋白酶不在位置Asp32、His64和Ser221处突变。

合适的蛋白酶包括具有蛋白水解活性的与如上所述的亲本酶的全长多肽序列相比时具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的蛋白酶变体。

至少一种枯草杆菌蛋白酶可以具有如EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22，或者是其变体，其与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同并且具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与EP 1921147中描述的SEQ ID NO：22至少80％相同，并且特征在于在位置101处(根据BPN’编号)具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)或天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)或丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)，且具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同，并且特征在于在位置101处(根据BPN’编号)具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，且具有蛋白水解活性。此类枯草杆菌蛋白酶变体可在位置101处(例如R101E或R101D)单独包含氨基酸取代，或与以下位置的一个或多个取代组合：3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和/或274(根据BPN’编号)，且具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，所述蛋白酶包含一个或多个其它取代：(a)在位置3的苏氨酸(3T)，(b)在位置4的异亮氨酸(4I)，(c)在位置63(63A、63T或63R)的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸，(d)在位置156(156D或156E)的天冬氨酸或谷氨酸，(e)在位置194的脯氨酸(194P)，(f)在位置199的甲硫氨酸(199M)，(g)在位置205的异亮氨酸(205I)，(h)在位置217(217D、217E或217G)的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸，(i)根据(a)至(h)的两个或更多个氨基酸的组合。

合适的枯草杆菌蛋白酶可以与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同，并且特征在于包含一个氨基酸(根据(a)-(h))或根据(i)的组合以及氨基酸101E、101D、101N、101Q、101A、101G或101S(根据BPN’编号)，且具有蛋白水解活性。

在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同，并且特征在于包含突变(根据BPN’编号)R101E，或S3T+V4I+V205I，或S3T+V4I+R101E+V205I，或S3T+V4I+V199M+V205I+L217D，并具有蛋白水解活性。

在另一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶包含与EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同的氨基酸序列，并且特征还在于包含S3T+V4I+S9R+A15T+V68A+D99S+R101S+A103S+I104V+N218D(根据BPN’编号)，并具有蛋白水解活性。

枯草杆菌蛋白酶可以具有与EP 1921147中所述的SEQ ID NO：22至少80％相同的氨基酸序列，并且特征还在于包含R101E，以及一个或多个选自以下的取代：S156D、L262E、Q137H、S3T、R45E,D,Q、P55N、T58W,Y,L、Q59D,M,N,T、G61 D,R、S87E、G97S、A98D,E,R、S106A,W、N117E、H120V,D,K,N、S125M、P129D、E136Q、S144W、S161T、S163A,G、Y171 L、A172S、N185Q、V199M、Y209W、M222Q、N238H、V244T、N261T,D和L262N,Q,D(如WO 2016/096711所述，并根据BPN’编号)，并具有蛋白水解活性。

本发明的蛋白酶具有蛋白水解活性。确定蛋白水解活性的方法在文献中是公知的(参见例如Gupta等人(2002),Appl.Microbiol.Biotechnol.60:381-395)。可以通过使用琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(Suc-AAPF-pNA，短AAPF；参见例如DelMar等人(1979),Analytical Biochem 99,316-320)作为底物确定蛋白水解活性。将pNA通过蛋白水解裂解从底物分子上裂解下来，从而释放出黄色的游离pNA，可以通过测量OD405对其进行定量。

纤维素酶

“纤维素酶”或“纤维素分解酶”是与纤维素水解有关的酶。已知三种主要类型的纤维素酶，即内切-ss-1,4-葡聚糖酶(内切-1,4-P-D-葡聚糖4-葡糖基水解酶，E.C.3.2.1.4；水解纤维素中的β-1,4-葡糖苷键)、纤维二糖水解酶(1,4-P-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，EC3.2.1.91)和ss-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。

专利文献和公开的专利申请中已经描述了纤维素酶，包括但不限于：WO1997/025417、WO1998/024799、WO2003/068910、WO2005/003319和WO2009020459。

市售的纤维素酶是Celluzyme^TM、Endolase^TM、Carezyme^TM、Cellusoft^TM、Renozyme^TM、Celluclean^TM(来自Novozymes A/S)、Ecostone^TM、Biotouch^TM、Econase^TM、Ecopulp^TM(来自AB酶Finland)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM、Genencor洗涤剂纤维素酶L、IndiAge^TM Neutra(来自Genencor International Inc./DuPont)、Revitalenz^TM(2000来自DuPont)、Primafast^TM(DuPont)和KAC-500^TM(来自Kao公司)。

本发明的纤维素酶具有“纤维素分解活性”或“纤维素酶活性”。纤维素酶活性的测定方法包括：纤维素酶的活性可以通过以下事实来确定：纤维素酶将羧甲基纤维素水解为还原性碳水化合物，根据Hoffman,W.S.,J.Biol.Chem.120,51(1937)所述的比色法通过铁氰化物反应测定其还原能力。

甘露聚糖酶

甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)酶水解甘露糖聚合物中的内部β-1,4键。“甘露聚糖酶”可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。已知甘露聚糖酶是来源于芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、嗜盐芽孢杆菌(B.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)或H.insolens。合适的甘露聚糖酶在WO 99/064619中描述。

市售的甘露聚糖酶包括：

(Novozymes AIS)。

果胶酸裂合酶

果胶酸裂合酶(E.C.4.2.2.2)催化消除式裂解(1->4)-α-D-聚半乳糖醛酸，从而得到在其非还原端带有4-脱氧-α-D-半乳-4-enuronosyl的寡糖。

果胶酸裂合酶已经在专利和公开的专利申请中描述，包括但不限于：WO2004/090099。已知果胶酸裂合酶衍生自芽孢杆菌属，特别是地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)或琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)，或衍生自其任一种的变体，例如在US 6,124,127、WO99/027083、WO 99/027084、WO 2002/006442、WO 2002/092741、WO 2003/095638中描述的那些。

市售的果胶酸裂合酶包括：Xpect^TM、Pectawash^TM和Pectaway^TM(Novozymes A/S)；PrimaGreen^TM、EcoScour(DuPont)。

核酸酶

核酸酶(EC 3.1.21.1)也称为脱氧核糖核酸酶I或Dnase，其内切核酸裂解为5'-磷酸二核苷酸和5'-磷酸寡核苷酸终产物。

核酸酶已经在专利和公开的专利申请中进行了描述，包括但不限于：US3451935、GB1300596、DE10304331、WO2015155350、WO2015155351、WO2015166075、WO2015181287和WO2015181286。

在本发明的一方面，提供了至少一种本发明的脂肪酶变体与至少一种枯草杆菌蛋白酶的组合。在一个实施方案中，本发明的脂肪酶变体对蛋白水解降解是稳定的。在一个实施方案中，与相应的脂肪酶亲本相比，本发明的脂肪酶变体具有抵抗蛋白水解降解的增加的稳定性。在一个实施方案中，至少一种枯草杆菌蛋白酶选自如在WO 89/06279的表I中的序列a)所公开的枯草杆菌蛋白酶309或与其至少80％相同并且具有蛋白水解活性的变体。在一个实施方案中，当与根据SEQ ID NO：1的脂肪酶相比时，本发明的脂肪酶变体在枯草杆菌蛋白酶309或与其至少80％相同的变体的存在下对蛋白水解降解具有增加的稳定性。

蛋白酶本身可以通过蛋白酶稳定剂来稳定，或者蛋白酶可以是不稳定的。因此，在一个实施方案中，当与根据SEQ ID NO.1的脂肪酶相比时，本发明的脂肪酶变体对例如非固定的枯草杆菌蛋白酶309或与其至少80％相同的非固定的变体具有增强的抗蛋白水解降解的稳定性。在另一个实施方案中，当与根据SEQ ID NO:1的脂肪酶相比时，本发明的脂肪酶变体在固定的枯草杆菌蛋白酶309存在下或在与其至少80％相同的固定的变体存在下具有对蛋白水解降解的增加的稳定性。

蛋白酶稳定剂可以选自含硼化合物。含硼化合物选自硼酸或其衍生物，以及选自有机硼酸或其衍生物，例如芳基硼酸或其衍生物，选自其盐及其混合物。本文中的硼酸可以称为原硼酸。

在一个实施方案中，含硼化合物选自芳基硼酸及其衍生物。在一个实施方案中，含硼化合物选自也称为苯基硼酸(PBA)的苯硼酸(BBA)、其衍生物和其混合物。在一个实施方案中，苯基硼酸衍生物选自式(I)和式(II)的衍生物：

其中R1选自氢、羟基、未取代或取代的C₁-C₆烷基和未取代或取代的C₁-C₆链烯基；在优选的实施方案中，R选自羟基和未取代的C₁烷基。

其中R2选自氢、羟基、未取代或取代的C₁-C₆烷基和未取代或取代的C₁-C₆链烯基；在优选的实施方案中，R选自H、羟基和取代的C₁烷基。

在一个实施方案中，苯基硼酸衍生物选自4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)、4-羧基苯基硼酸(4-CPBA)、4-(羟基甲基)苯基硼酸(4-HMPBA)和对甲苯基硼酸(p-TBA)。

其它适合的衍生物包括：2-噻吩基硼酸、3-噻吩基硼酸、(2-乙酰胺基苯基)硼酸、2-苯并呋喃基硼酸、1-萘基硼酸、2-萘基硼酸、2-FPBA、3-FBPA、1-噻蒽基硼酸、4-二苯并呋喃硼酸、5-甲基-2-噻吩基硼酸、1-苯并噻吩-2硼酸、2-呋喃基硼酸、3-呋喃基硼酸、4,4联苯-二硼酸、6-羟基-2-萘硼酸、4-(甲硫基)苯基硼酸、4-(三甲基硅烷基)苯基硼酸、3-溴噻吩硼酸、4-甲基噻吩硼酸、2-萘基硼酸、5-溴噻吩硼酸、5-氯噻吩硼酸、二甲基噻吩硼酸、2-溴苯基硼酸、3-氯苯基硼酸、3-甲氧基-2-噻吩硼酸、对甲基-苯基乙基硼酸、2-噻蒽基硼酸、二-苯并噻吩硼酸、9-蒽硼酸、3,5二氯苯基硼酸、二苯基硼酸酐、邻氯苯基硼酸、对氯苯基硼酸、间溴苯基硼酸、对溴苯基硼酸、对氟苯基硼酸、辛基硼酸、1,3,5三甲基苯基硼酸、3-氯-4-氟苯基硼酸、3-氨基苯基硼酸、3,5-二-(三氟甲基)苯基硼酸、2,4二氯苯基硼酸、4-甲氧基苯基硼酸，及其混合物。

在一个实施方案中，将至少一种含硼化合物与至少一种含有2至6个羟基基团的多元醇一起使用以稳定蛋白酶。合适的例子包括乙二醇、丙二醇、1,2-丙二醇、1,2-丁二醇、乙二醇、己二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓醇、葡萄糖、果糖、乳糖醇和赤藓醇。

本发明的变体多肽可以用于几种工业中，在这些工业中脂肪酶在加工应用中是有用的和/或脂肪酶在制剂中是有用的组分。

本发明的脂肪酶变体可以用于食品制剂中，例如该酶可以是用于烘烤的添加剂(参见WO 2017/142904)。在一个实施方案中，本发明的具有脂肪酶活性的多肽可用于制备面团的方法中，或用于由面团制备的烘焙产品中，其中该方法包括以下步骤：(a)将具有脂肪酶活性的多肽添加至面团中，和(b)烘烤它。

本发明的脂肪酶变体也可以用于油籽加工工业中，例如该酶用于加工植物油(大豆油、芥花油)(WO 2005/086900)。在一个实施方案中，本发明的具有脂肪酶活性的多肽可以用于加工脂肪、油或油籽的方法中；其中该方法包括(a)提供脂肪、油或油籽；(b)提供具有脂肪酶活性的多肽；和(c)使多肽与脂肪、油或油籽接触，其中多肽将脂肪水解为所需的产物。

本发明的脂肪酶变体可以用于饲料配方中(参见美国专利号：8,735,123)。在一个实施方案中，具有脂肪酶活性的本发明多肽可以用于喂养动物的方法中；其中该方法包括(a)提供饲料制剂或颗粒，(b)在饲料制剂或颗粒中提供脂肪酶，和(c)给动物喂食饲料制剂。

本发明的脂肪酶变体可用于淀粉加工工业中，例如在用淀粉酶将淀粉转化为乙醇或糖的过程(高果糖玉米糖浆)中加工副产物例如油(参见WO2004/029193)。在一个实施方案中，具有脂肪酶活性的本发明多肽可以用于制造乙醇的方法中，其中在该方法中包括：(a)提供来自乙醇生产的材料，其中该材料具有油，(b)提供脂肪酶，和(c)使所述材料与脂肪酶接触，其中所述脂肪酶有助于改善从所述材料中回收油。在另一个实施方案中，本发明的脂肪酶变体可以用于生物柴油生产(U.S.7,550,278)。

本发明的脂肪酶变体用于纸浆和纸张加工中，例如，所述酶(脂肪酶)可用于改善纸张强度(参见WO 2006/031699)和间距控制(参见U.S.2010/0269989)。在一个实施方案中，具有脂肪酶活性的本发明多肽可用于加工纸浆或纸的方法中，其中该方法包括(a)提供纸浆或纸，(b)提供脂肪酶，和(c)将纸浆或纸与脂肪酶接触，其中脂肪酶提高纸浆或纸的强度。

本发明的脂肪酶变体可以用于采矿和油井服务，例如，纤维素酶、淀粉酶和/或脂肪酶可用于在油井压裂过程中破坏瓜尔胶(US 5725771)。

本发明的脂肪酶变体可以用于洗涤剂制剂或清洁制剂中。在一个实施方案中，本发明的具有脂肪酶活性的多肽可以用于清洁方法，包括以下步骤：(a)提供要清除脂肪污渍的表面；(b)提供本发明的洗涤剂制剂；和(c)使(a)的要清除脂肪污渍的表面与(b)的洗涤剂接触；其中洗涤剂中所含的多肽去除了要清洁油脂污渍的表面上的油脂污渍。在一个实施方案中，本发明涉及一种清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具的方法，其中所述方法包括：(a)提供纺织品、硬表面或餐具，(b)提供脂肪酶，和(c)将纺织品、硬表面或餐具与脂肪酶接触，其中脂肪酶从纺织品、硬表面或餐具上除去脂肪污渍。该方法的步骤(b)中提供的洗涤剂制剂至少包含本发明的脂肪酶。该方法的步骤(b)中提供的洗涤剂制剂可包含至少一种与本发明的脂肪酶不同的其他酶，其选自脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、漆酶、果胶酶和核酸酶。

本发明涉及洗涤剂制剂或清洁制剂，其包含至少一种本发明的脂肪酶变体和至少一种洗涤剂组分。“洗涤剂制剂”或“清洁制剂”是指用于清洁脏污材料的组合物。清洁包括洗衣和硬表面清洁。根据本发明的脏污材料包括纺织品和/或硬表面。

术语“洗衣”涉及家庭洗衣和工业洗衣，是指用含有本发明洗涤剂制剂的溶液处理纺织品的方法。洗衣过程可以通过使用例如家用或工业洗衣机的技术设备来进行。或者，洗衣过程可以手工完成。

术语“纺织品”是指任何纺织材料，包括纱线(用于针织或机织的天然或合成纤维制成的线)、纱线中间体、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料以及由这些材料制成的织物(通过机织、针织或毡合纤维制成的织物)，例如服装(任何织物制成的衣物)、布料和其它物品。

术语“纤维”包括天然纤维、合成纤维及其混合物。天然纤维的实例是植物(例如亚麻、黄麻和棉花)或动物来源的，其包含例如胶原蛋白、角蛋白和丝蛋白的蛋白质(例如丝绸、绵羊毛、安哥拉呢、马海毛、羊绒)。合成来源的纤维的例子是聚氨酯纤维，例如

聚酯纤维、聚烯烃，例如elastofin，或聚酰胺纤维例如尼龙。纤维可以是单纤维或纺织品的一部分，例如针织品、织造物或非织造物。

术语“硬表面清洁”在本文中定义为硬表面的清洁，其中硬表面可以包括家庭中的任何硬表面，例如地板、家具、墙壁、卫生陶瓷、玻璃、金属表面，包括餐具或餐盘。

术语“餐具洗涤”是指所有形式的餐具洗涤，例如用手或自动洗碗机。餐具清洗包括但不限于清洗各种形式的陶器，例如盘子、杯子、玻璃杯、碗，各种形式的餐具，例如汤匙、刀、叉和进餐用具，以及陶瓷制品、塑料(例如三聚氰胺)、金属、瓷器、玻璃和丙烯酸酯类。

本发明的洗涤剂制剂包含一种或多种洗涤剂组分。选择的组分取决于所需的清洁应用和/或洗涤剂制剂的物理形式。

术语“洗涤剂组分”在本文中定义为指适用于洗涤剂制剂的任何类型的成分，例如表面活性剂、助剂、聚合物、漂白体系。本领域内已知的确认其已知特性的任何组分是根据本发明的合适的洗涤剂组分。在一个实施方案中，洗涤剂组分是指当以有效量存在时提供洗涤或清洁性能或有效地辅助加工(在加工、储存和使用过程中保持物理特性；例如流变改进剂、助水溶物、干燥剂)的组分。

通常情况下，洗涤剂制剂是具有两种以上洗涤剂成分的复合制剂。

洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中可以具有不止一种功能，因此，在本文特定功能的上下文中提及的任何洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中也可以具有另一种功能。特定洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中的功能通常取决于其在洗涤剂制剂中的量，即洗涤剂组分的有效量。

术语“有效量”包括提供有效去除污渍和有效清洁条件(例如，pH、起泡量)的各成分的量，有效提供光学益处(例如，荧光增白，抑制染料转移)的某些成分的量，以及有效地辅助加工(在加工、储存和使用过程中保持物理特性；例如流变改进剂、助水溶物、干燥剂)的某些成分的量。

在一个实施方案中，洗涤剂制剂是多于两种洗涤剂组分的制剂，其中至少一种组分可有效去除污渍，至少一种组分可有效提供最佳清洁条件，且至少一种组分可有效保持洗涤剂的物理特性。

在相关的清洁条件下评估清洁性能。术语“相关的清洁条件”在本文中是指在洗衣机、自动洗碗机或手动清洁过程中实际使用的条件，尤其是清洁温度、时间、清洁机制、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。

含脂肪酶的洗涤剂的清洁性能在本文中可以称为脱脂性能。脱脂性能可能与洗涤剂制剂除去沉积在纺织品上的脂肪污渍的能力有关。

根据融化温度，脂肪可分为脂肪、油脂或油。油在室温下通常是液体。油脂在室温下的粘度比油高，因此称为糊状。由于油和油脂的较低熔化温度，洗涤温度≥40℃有助于清除沉积在纺织品上的油和油脂污渍。包含熔融温度>30℃的脂肪化合物的脂肪沉积物是指在≤30℃的温度下保持固态的脂肪。

沉积在纺织品上的脂肪污渍在本文中可以称为脂肪沉积物。在一个实施方案中，脂肪沉积物包含熔点＞40℃的脂肪化合物，这意味着这些脂肪化合物在≤40℃的洗涤温度下保持固体。在一个实施方案中，脂肪沉积物包含熔点＞30℃的脂肪化合物，这意味着这些脂肪化合物在≤30℃的洗涤温度下保持固体。

一方面，本发明涉及用于洗涤温度≤40℃的固体或液体洗衣制剂，其包含本发明的至少一种脂肪酶变体，以及所述制剂在洗涤温度≤40℃时去除包含熔融温度>40℃的脂肪化合物的脂肪沉积物中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于洗涤温度≤30℃的固体或液体洗衣制剂，其包含至少一种本发明的脂肪酶变体，以及所述制剂在洗涤温度≤30℃时去除包含熔融温度>30℃的脂肪化合物的脂肪沉积物中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于洗涤温度≤30℃的固体或液体衣物制剂，其包含至少一种本发明的脂肪酶变体，以及所述制剂在洗涤温度≤30℃时去除包含熔融温度>40℃的脂肪化合物的脂肪沉积物中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于洗涤温度≤20℃的固体或液体洗衣制剂，其包含至少一种本发明的脂肪酶变体，以及所述制剂在洗涤温度≤20℃时去除包含熔融温度>20℃的脂肪化合物的脂肪沉积物中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于洗涤温度≤20℃的固体或液体洗衣制剂，其包含至少一种本发明的脂肪酶变体，以及所述制剂在洗涤温度≤20℃时去除包含熔融温度>30℃的脂肪化合物的脂肪沉积物中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于洗涤温度≤20℃的固体或液体洗衣制剂，其包含至少一种本发明的脂肪酶变体，以及所述制剂在洗涤温度≤20℃时去除包含熔融温度>40℃的脂肪化合物的脂肪沉积物中的用途。

当改善脂肪污渍的去除时，意味着改善脱脂性能。在此背景下的改进可意味着，与非本发明的脂肪酶和/或缺少本发明的脂肪酶的洗衣制剂和/或包含母体脂肪酶的洗衣制剂相比，本发明的脂肪酶和/或包含至少一种本发明的脂肪酶的洗涤剂制剂表现出更好的脱脂性能。脂肪污渍的去除可能由于沉积在纺织品上的脂肪化合物的酶促降解和/或增溶和/或分散和/或乳化而发生。

各个洗涤剂组分和在洗涤剂制剂中的用途是本领域技术人员已知的。合适的洗涤剂组分尤其包括表面活性剂、助剂、聚合物、碱、漂白体系、荧光增白剂、抑泡剂和稳定剂、助水溶物和腐蚀抑制剂。例如，进一步的示例描述在“complete Technology Book onDetergents with Formulations(Detergent Cake,Dishwashing Detergents,Liquid&Paste Detergents,Enzyme Detergents,Cleaning Powder&Spray Dried WashingPowder)”,Engineers India Research Institute(EIRI),第6版(2015)。本领域技术人员的另一本参考书可以是“Detergent Formulations Encyclopedia”，SolverchemPublications，2016。

在洗涤剂制剂中的洗涤剂组分的类型和/或含量会有所不同，取决于所需的应用，例如洗涤白色纺织品、有色纺织品和羊毛。所选择的组分还取决于洗涤剂制剂的物理形式(液体、固体、凝胶、以小袋形式或以片剂形式提供等)。选择的组分例如用于洗衣配方的还取决于地区惯例，这些惯例本身涉及以下方面：所用的洗涤温度、洗衣机的机械原理(垂直与水平轴洗衣机)、每个洗涤周期的耗水量等，以及地理特征，例如水的平均硬度。

例如：低洗涤剂浓度体系包括这样的洗涤制剂，其中洗涤水中存在的洗涤剂成分少于约800ppm；中等洗涤剂浓度包括这样的洗涤制剂，其中洗涤水中存在的洗涤剂成分在约800ppm至约2,000ppm。高洗涤剂浓度包括这样的洗涤制剂，其中洗涤水中存在约2,000ppm以上的洗涤剂成分。

对各个洗涤剂组分列举的数字范围提供了洗涤剂制剂中包含的量。这样的范围必须被理解为包括限定范围的数字，并且包括所限定范围内的每个整数。

如果没有另外描述，则“重量％”或“％w/w”是指与总洗涤剂制剂相比。在这种情况下，“重量％”或“％w/w”的计算方法如下：物质的浓度等于物质的重量除以组合物的总重量再乘以100。

本发明的洗涤剂制剂可以包含一种或多种表面活性剂。“表面活性剂”(在本文中与“表面活性剂”同义使用)是指一种有机化学品，当添加到液体中时，会改变该液体在界面处的性质。根据其离子电荷，表面活性剂称为非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。

表面活性剂的非限制性实例公开于McCutcheon's 2016 Detergents andEmulsifiers，以及McCutcheon's 2016 Functional Materials,北美版和国际版,MCPublishing Co,2016版本。在本领域技术人员已知的这些出版物的早期版本中公开了更多有用的示例。

非离子表面活性剂是指既不带正电也不带负电(即离子性)官能团的表面活性剂。与阴离子和阳离子表面活性剂相反，非离子表面活性剂不会在溶液中离子化。

下文提供的用于任何类型表面活性剂的实例应理解为非限制性的。

非离子表面活性剂可以是通式(IIIa)和(IIIb)的化合物：

通式(IIIa)和(IIIb)的变量如下所定义：

R¹选自C₁-C₂₃烷基和C₂-C₂₃链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的；例如正-C₇H₁₅、正-C₉H₁₉、正-C₁₁H₂₃、正-C₁₃H₂₇、正-C₁₅H₃₁、正-C₁₇H₃₅、异-C₉H₁₉、异-C₁₂H₂₅。

R²选自H、C₁-C₂₀烷基和C₂-C₂₀链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。

R³和R⁴各自独立地选自C₁-C₁₆烷基，其中烷基是直链或支链的；例如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，仲戊基，新戊基，1,2-二甲基丙基，异戊基，己基，异己基，仲己基，正庚基，正辛基，2-乙基己基，正壬基，正癸基，异癸基。

R⁵选自H和C₁-C₁₈烷基，其中烷基是直链或支链的.

通式(IIIa)和(IIIb)的整数定义如下：m在0至200的范围内，优选1-80，更优选3-20；n和o各自独立地在0至100的范围内；n优选为1至10，更优选为1至6；o优选为1至50，更优选为4至25。m、n和o的总和至少为1，优选地，m、n和o的总和在5至100的范围内，更优选地在9至50的范围内。

通式(IIIa)和(IIIb)的非离子表面活性剂可以具有任何结构，可以是嵌段结构或无规结构，并且不限于所显示的序列。

在一个实施方案中，洗涤剂制剂包含至少一种选自通式(IIIa)的非离子表面活性剂，其中m为3-11，优选不大于7；n和o是0，R¹是C₁₂-C₁₄，R⁵是H。所述洗涤剂制剂可包含至少两种选自通式(IIIa)的化合物的非离子表面活性剂，其中一种所述非离子表面活性剂的特征在于R¹是C₁₂，R⁵是H，m是7，n和o＝0，且另一种表面活性剂的特征在于R¹是C₁₄，R⁵是H，m是7，n和o＝0。

非离子表面活性剂还可以是通式(IV)的化合物，其可称为烷基-聚糖苷类(APG)：

通式(IV)的变量如下所定义：

R¹选自C₁-C₁₇烷基和C₂-C₁₇链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的；例如正-C₇H₁₅、正-C₉H₁₉、正-C₁₁H₂₃、正-C₁₃H₂₇、正-C₁₅H₃₁、正-C₁₇H₃₅、异-C₉H₁₉、异-C₁₂H₂₅。

R²选自H、C₁-C₁₇烷基和C₂-C₁₇链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。

G¹选自具有4-6个碳原子的单糖残基，例如葡萄糖和木糖。

通式(IV)的整数w在1.1至4的范围，w是平均数。

非离子表面活性剂还可以是通式(V)的化合物：

通式(V)的变量如下所定义：

AO选自环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)、环氧丁烷(BO)，以及它们的混合物。

R⁶选自C₅-C₁₇烷基和C₅-C₁₇链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。

R⁷选自H、C₁-C₁₈-烷基，其中烷基是直链或支链的。

通式(V)的整数y是1至70，优选7至15的数字。

非离子表面活性剂还可选自脱水山梨糖醇酯和/或乙氧基化或丙氧基化脱水山梨糖醇酯。非限制性实例是以商标名称SPAN和TWEEN出售的产品。

非离子表面活性剂还可以选自烷氧基化的单或二烷基胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAMA)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、聚羟烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺、GA或脂肪酸葡糖酰胺、FAGA)及其组合。

根据本发明，两种或多种不同的非离子表面活性剂的混合物也可以存在于洗涤剂制剂中。

两性表面活性剂是取决于pH的那些，其可以是阳离子、两性离子或阴离子的。

表面活性剂可以是包含通式(VI)的两性结构的化合物，其可以被称为修饰的氨基酸(蛋白来源的和非蛋白来源的)：

通式(VI)的变量如下所定义：

R⁸选自H、C₁-C₄烷基、C₂-C₄链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。

R⁹选自C₁-C₂₂烷基、C₂-C₂₂链烯基、C₁₀-C₂₂烷基羰基和C₁₀-C₂₂链烯基羰基。

R¹⁰选自H、甲基、-(CH₂)₃NHC(NH)NH₂、-CH₂C(O)NH₂、-CH₂C(O)OH、-(CH₂)₂C(O)NH₂、-(CH₂)₂C(O)OH、(咪唑-4-基)-甲基、-CH(CH₃)C₂H₅、-CH₂CH(CH₃)₂、-(CH₂)₄NH₂、苄基、羟基甲基、-CH(OH)CH₃、(吲哚-3-基)-甲基、(4-羟基-苯基)-甲基、异丙基、-(CH₂)₂SCH₃和-CH₂SH。

R^x选自H和C₁-C₄烷基。

表面活性剂还可以是包含通式(VIIa)、(VIIb)或(VIIc)的两性结构的化合物，所述两性结构可被称为甜菜碱和/或磺基甜菜碱：

通式(VIIa)、(VIIb)和(VIIc)的变量如下所定义：

R¹¹选自直链或支链C₇-C₂₂烷基和直链或支链C₇-C₂₂链烯基。

R¹²各自独立地选自直链C₁-C₄烷基。

R¹³选自C₁-C₅烷基和羟基C₁-C₅烷基；例如2-羟基丙基。

A^-选自羧酸根和磺酸根。

通式(VIIa)、(VIIb)和(VIIc)的r为2至6的范围。

表面活性剂还可以是包含通式(VIII)的两性结构的化合物，所述两性结构可被称为烷基-两性羧酸盐：

通式(VIII)的变量如下所定义：

R¹¹选自C₇-C₂₂烷基和C₇-C₂₂链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的，优选直链的。

R¹⁴选自-CH₂C(O)O^-M⁺、-CH₂CH₂C(O)O^-M⁺和-CH₂CH(OH)CH₂SO₃ ^-M⁺。

R¹⁵选自H和-CH₂C(O)O^-。

通式(VIII)的r为2至6的范围。

其他合适的烷基两性羧酸盐的非限制性实例包括椰油酰两性基乙酸钠、月桂酰两性基乙酸钠、辛酰两性基乙酸钠、椰油酰两性基二乙酸二钠、月桂酰两性基二乙酸二钠、辛酰两性基二乙酸二钠、癸酰两性基二乙酸二钠、椰油酰两性基二丙酸二钠、月桂酰两性基二丙酸二钠、辛酰两性基二丙酸二钠和癸酰两性基二丙酸二钠。

表面活性剂还可以是包含通式(IX)的两性结构的化合物，所述两性结构可被称为氧化胺类(AO)：

通式(IX)的变量如下所定义：

R¹⁶选自C₈-C₁₈直链或支链烷基、羟基C₈-C₁₈烷基、酰胺基丙基和C₈-C₁₈烷基苯基基团；其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。

R¹⁷选自C₂-C₃亚烷基、羟基C₂-C₃亚烷基及其混合物。

R¹⁸:每个残基可以独立地选自C₁-C₃烷基和羟基C₁-C₃；R¹⁸基团可以互相连接，例如通过氧或氮原子，以形成环结构。

通式(IX)中的整数x是0-5的范围，优选0-3，最优选0。

其它合适的氧化胺类的非限定性实例包括C₁₀-C₁₈烷基二甲基氧化胺和C₈-C₁₈烷氧基乙基二羟基乙基氧化胺。这种材料的实例包括二甲基辛基氧化胺、二乙基癸基氧化胺、双-(2-羟基乙基)十二烷基氧化胺、二甲基十二烷基氧化胺、二丙基十四烷基氧化胺、甲基乙基十六烷基氧化胺、十二烷基酰胺基丙基二甲基氧化胺、十六烷基二甲基氧化胺、硬脂基二甲基氧化胺、牛脂基二甲基氧化胺和二甲基-2-羟基十八烷基氧化胺。

合适的氧化胺类的另一个实例是椰油酰胺基丙基二甲基氧化胺，有时也称为椰油酰胺基丙基氧化胺。

在本发明的洗涤剂制剂中可以存在两种或多种不同的两性表面活性剂的混合物。

阴离子表面活性剂是指具有带负电的离子基团的表面活性剂。阴离子表面活性剂包括但不限于含有疏水基团和至少一个水溶性阴离子基团的表面活性化合物，所述阴离子基团通常选自硫酸根、磺酸根和羧酸根，以形成水溶性化合物。

阴离子表面活性剂可以是通式(X)的化合物，当A^-是SO₃ ^-时，其可以称为(脂肪)醇/烷基(乙氧基/醚)硫酸盐[(F)A(E)S]，当A^-是–RCOO^-时，其可以称为(脂肪)醇/烷基(乙氧基/醚)羧酸盐[(F)A(E)C]:

通式(Xa和Xb)的变量如下所定义：

R¹选自C₁-C₂₃-烷基(例如1-、2-、3-、4-C₁-C₂₃-烷基)和C₂-C₂₃-链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的，并且其中2-、3-或4-烷基；例如正-C₇H₁₅、正-C₉H₁₉、正-C₁₁H₂₃、正-C₁₃H₂₇、正-C₁₅H₃₁、正-C₁₇H₃₅、异-C₉H₁₉、异-C₁₂H₂₅。

R²选自H、C₁-C₂₀-烷基和C₂-C₂₀-链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的.

R³和R⁴各自独立地选自C₁-C₁₆-烷基，其中烷基是直链或支链的；例如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，仲戊基，新戊基，1,2-二甲基丙基，异戊基，正己基，异己基，仲己基，正庚基，正辛基，2-乙基己基，正壬基，正癸基，异癸基。

A^-选自–RCOO^-、-SO₃ ^-和RSO₃ ^-，其中R选自直链或支链C₁-C₈-烷基，和C₁-C₄羟基烷基，其中烷基是。

M⁺选自H和成盐阳离子。成盐阳离子可以是一价或多价；因此M⁺等于1/v M^v+。实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵和乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的铵盐。

通式(Xa)和(VIIIXb)的整数定义如下：m在0-200的范围内，优选1-80，更优选3-20；n和o各自独立地在0至100的范围内；n优选为1-10，更优选为1-6；o优选为1-50，更优选为4-25。m、n和o的总和至少为1，优选地，m、n和o的总和在5-100的范围内，更优选在9-50的范围内。

通式(Xa)和(Xb)的阴离子表面活性剂可以是任何结构、嵌段共聚物或无规共聚物。

其他合适的阴离子表面活性剂包括C₁₂-C₁₈磺基脂肪酸烷基酯(例如C₁₂-C₁₈磺基脂肪酸甲基酯)、C₁₀-C₁₈-烷基芳基磺酸(例如正-C₁₀-C₁₈-烷基苯磺酸)和C₁₀-C₁₈烷基烷氧基羧酸酯的盐(M⁺)。

M⁺在任何情况下都选自成盐阳离子。成盐阳离子可以是一价或多价；因此M⁺等于1/v M^v+。实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵和乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的铵盐。

在一个实施方案中，洗涤剂制剂包含至少一种选自通式(Xa)化合物的阴离子表面活性剂，其中R¹是C₁₁-C₁₃，R₂是H，m是1-4，n和o＝0，A^-是SO₃ ^-，M⁺是Na⁺。该洗涤剂制剂可包含至少两种选自通式(Xa)化合物的阴离子表面活性剂，其中所述阴离子表面活性剂之一的特征在于R¹为C₁₁，R²为H，m为2，n和o＝0，A^-为SO₃ ^-，M⁺为Na⁺，另一种表面活性剂的特征为R¹为C₁₃，R²为H，m为2，n和o＝0，A^-为SO₃ ^-，M⁺为Na⁺。

其它合适的阴离子表面活性剂的非限制性实例包括支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷烃-2,3-二烷基双(硫酸盐)、羟基烷烃磺酸盐和二磺酸盐、仲烷烃磺酸盐(SAS)、石蜡磺酸盐(PS)、磺化的脂肪酸甘油酯、烷基或链烯基琥珀酸、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基琥珀酸的二酯和单酯。

在一个实施方案中，洗涤剂制剂包含至少一种选自通式(XI)的化合物的阴离子表面活性剂：

其中式(XI)中的R¹为C₁₀-C₁₃烷基。该洗涤剂制剂可以包含至少两种选自通式(XI)化合物的阴离子表面活性剂，其中所述阴离子表面活性剂之一的特征在于R¹为C₁₀，而另一种表面活性剂的特征在于R¹为C₁₃。

阴离子表面活性剂可以是通式(XII)的化合物，可以称为N-酰基氨基酸表面活性剂：

通式(XII)的变量如下所定义：

R¹⁹选自直链或支链C₆-C₂₂-烷基和直链或支链C₆-C₂₂-链烯基，例如油烯基。

R²⁰选自H和C₁-C₄-烷基。

R²¹选自H、甲基、-(CH₂)₃NHC(NH)NH₂、-CH₂C(O)NH₂、-CH₂C(O)OH、-(CH₂)₂C(O)NH₂、-(CH₂)₂C(O)OH、(咪唑-4-基)-甲基、-CH(CH₃)C₂H₅、-CH₂CH(CH₃)₂、-(CH₂)₄NH₂、苄基、羟基甲基、-CH(OH)CH₃、(吲哚-3-基)-甲基、(4-羟基-苯基)-甲基、异丙基、-(CH₂)₂SCH₃和-CH₂SH。

R²²选自–COOX和–CH₂SO₃X，其中X选自Li⁺、Na⁺和K⁺。

合适的N-酰基氨基酸表面活性剂的非限定性实例是N-酰化的谷氨酸的单和二羧酸盐(例如钠、钾、铵和乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的铵盐)，例如，椰油酰谷氨酸钠、月桂酰谷氨酸钠、肉豆蔻酰谷氨酸钠、棕榈酰谷氨酸钠、硬脂酰谷氨酸钠、椰油酰谷氨酸二钠、硬脂酰谷氨酸二钠、椰油酰谷氨酸钾、月桂酰谷氨酸钾和肉豆蔻酰谷氨酸钾；N-酰化丙氨酸的羧酸盐(例如钠、钾、铵和乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的铵盐)，例如椰油酰丙氨酸钠和月桂酰丙氨酸三乙醇胺；N-酰化的甘氨酸的羧酸盐(例如钠、钾、铵和乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的铵盐)，例如椰油酰基甘氨酸钠和椰油酰基甘氨酸钾；N-酰化的肌氨酸的羧酸盐(例如钠、钾、铵和乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的铵盐)，例如月桂酰肌氨酸钠、椰油酰肌氨酸钠、肉豆蔻酰肌氨酸钠、油酰肌氨酸钠和月桂酰肌氨酸铵。

阴离子表面活性剂可以进一步选自皂类。合适的是饱和的和不饱和的C₁₂-C₁₈脂肪酸的盐(M⁺)，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、油酸、(水合)芥酸的盐。M⁺选自成盐阳离子。成盐阳离子可以是一价或多价；因此M⁺等于1/v M^v+。实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵和乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的铵盐。

合适的皂类的其它非限定性实例包括衍生自天然脂肪酸的皂类混合物，例如牛脂、椰子油、棕榈仁油、月桂油、橄榄油或芥花油。这样的皂类混合物包括以不同量的月桂酸和/或肉豆蔻酸和/或棕榈酸和/或硬脂酸和/或油酸和/或亚油酸的皂类，取决于皂类所衍生的天然脂肪酸。

合适的阴离子表面活性剂的其它非限定性实例包括衍生自天然脂肪酸的硫酸盐、磺酸盐或羧酸盐的盐(M⁺)，例如牛脂、椰子油、棕榈仁油、月桂油、橄榄油或芥花油。此类阴离子表面活性剂包括以不同量的月桂酸和/或肉豆蔻酸和/或棕榈酸和/或硬脂酸和/或油酸和/或亚油酸的硫酸盐、磺酸盐或羧酸盐，取决于皂类所衍生的天然脂肪酸。

两种或更多种不同的阴离子表面活性剂的混合物也可以存在于本发明的洗涤剂制剂中。

非离子和/或两性和/或阴离子表面活性剂的混合物也可以存在于本发明的洗涤剂制剂中。

阳离子表面活性剂是指具有带正电的离子基团的表面活性剂。

通常，这些阳离子部分是含氮基团，例如季铵或质子化的氨基。阳离子型的质子化胺可以是伯、仲或叔胺。

阳离子表面活性剂可以是通式(XIII)的化合物，其可称为季铵盐化合物(季铵化合物)：

通式(XIII)的变量如下所定义：

R²³选自H、C₁-C₄烷基(例如甲基)和C₂-C₄链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。

R²⁴选自C₁-C₄烷基(例如甲基)、C₂-C₄链烯基和C₁-C₄羟基烷基(例如羟基乙基)，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。

R²⁵选自C₁-C₂₂烷基(例如甲基、C₁₈烷基)、C₂-C₄链烯基、C₁₂-C₂₂烷基羰基氧基甲基和C₁₂-C₂₂烷基羰基氧基乙基(例如C₁₆-C₁₈烷基羰基氧基乙基)，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。

R²⁶选自C₁₂-C₁₈烷基、C₂-C₄链烯基、C₁₂-C₂₂烷基羰基氧基甲基、C₁₂-C₂₂烷基羰基氧基乙基和3-(C₁₂-C₂₂烷基羰基氧基)-2(C₁₂-C₂₂烷基羰基氧基)-丙基。

X^-选自卤素，例如Cl^-或Br^-。

其他阳离子表面活性剂的非限制性实例包括胺类，例如具有C₁₈烷基或链烯基链的伯、仲、叔单胺，乙氧基化烷基胺，乙二胺的烷氧化物，咪唑类(例如1-(2-羟基乙基)-2-咪唑啉、2-烷基-1-(2-羟基乙基)-2-咪唑啉等)，季铵盐，例如烷基季铵氯化物表面活性剂，例如正烷基(C₁₂-C₁₈)二甲基苄基氯化铵、正十四基二甲基苄基氯化铵一水合物和萘基取代的季铵氯化物，例如二甲基-1-萘基甲基氯化铵。

特别合适的阳离子表面活性剂可以是：

-N,N-二甲基-N-(羟基-C₇-C₂₅-烷基)铵盐；

-被烷基化试剂季铵化的单和二(C₇-C₂₅-烷基)二甲基铵化合物；

-酯的季铵化合物，特别是被C₈-C₂₂-羧酸所酯化的单、二和三链烷醇胺的季铵；

-咪唑啉季铵化合物，特别是式XIV或XV的1-烷基咪唑啉鎓盐

通式(XIV)和(XV)的变量如下所定义：

R²⁷选自C₁-C₂₅-烷基和C₂-C₂₅-链烯基；

R²⁸选自C₁-C₄-烷基和羟基-C₁-C₄-烷基；

R²⁹选自C₁-C₄-烷基、羟基-C₁-C₄-烷基和R*-(CO)-R³⁰-(CH₂)j-基团，其中R*选自C₁-C₂₁-烷基和C₂-C₂₁-链烯基；R³⁰选自-O^-和-NH^-；j是2或3。

洗涤剂制剂可包含选自通式(IIIa)的化合物、通式(Xa)的化合物和通式(XI)的化合物的表面活性剂的混合物。

实施例1：变体脂肪酶

在实验室中使用合理设计的单点诱变和多点诱变创建了非天然存在的变体脂肪酶。所述变体脂肪酶包括在亲本酶(LIP062，其为SEQ ID NO：1的氨基酸序列，由SEQ ID NO：2的核酸序列编码)的18个不同氨基酸残基位置上的单点的氨基酸修饰、插入或缺失：23、33、82、83、84、85、160、199、254、255、256、258、263、264、265、268、308、311或其任意组合，其中所述变体脂肪酶具有脂肪酶活性。

还通过亲本酶(LIP062)的单点修饰的各种组合来产生变体脂肪酶，其中所述变体脂肪酶具有脂肪酶活性。例如，表1中列出了单点修饰以及单点修饰的各种组合。

该表显示了LIP110的变体脂肪酶，LIP110是具有LIP062的氨基酸序列和一个氨基酸取代D265S的变体多肽，其中该变体多肽具有脂肪酶活性。该表还显示了LIP160的变体脂肪酶，LIP160是具有LIP062的氨基酸序列以及S83H、I85L和D265T的氨基酸取代的组合的变体多肽，其中该变体多肽具有脂肪酶活性。该表还显示了LIP173的变体脂肪酶，LIP173是一种变体多肽，具有LIP062的氨基酸序列以及I255A和D265S的氨基酸取代的组合，其中该变体多肽具有脂肪酶活性。表1还显示了亲本脂肪酶的脂肪酶变体，其中所述变体包括插入氨基酸残基。氨基酸残基的插入显示为(‘)，例如(84’)。

表1

实施例2：脂肪酶的表达和纯化

表达

通过构建含有编码多核苷酸序列的表达质粒，将质粒转化入巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)并以以下方式培养所得的表达菌株，获得了变体脂肪酶。表达菌株的新鲜巴斯德毕赤酵母细胞是通过将序列已确认的菌株的甘油储备液铺到含有Zeocin的酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YPD)琼脂平板上而获得的。2天后，使用来自这些平板的细胞将生产菌株的起始种子培养物接种到100mL缓冲甘油复合培养基(BMGY)中，并在30℃和225-250rpm下生长20-24小时。通过将合适量转移到装有挡板的发酵罐中的2-4L BMMY培养基中来扩大种子培养的规模。发酵是在30℃和1100rpm的搅拌下进行的，该搅拌是通过平叶轮提供的，持续48-72小时。在发酵的初始分批阶段之后，每当培养物中的溶解氧水平降至30％以下时，就添加无菌过滤的甲醇作为养料。或者，每3小时以起始分批培养物的0.5％v/v添加养料。将最终的发酵液在4℃下以7000xg离心30分钟，以获得无细胞的上清液。

变体脂肪酶的表达水平显示于表2，其测定如下：通过SDS-PAGE或毛细管电泳并以PNP-辛酸酯为底物通过酶促活性测定上清液中目的蛋白的表达。结果在下表2中提供，并且数据显示为与母体(LIP062)表达相比的百分比。某些变体脂肪酶的表达水平未确定，为“n.d.”；但是，产生了足够的物质以将变体脂肪酶引入实施例3的脂肪酶活性测试中，并如上文实施例1的表1中所述用于氨基酸序列鉴定。

回收

在通过粗棉布过滤后，无细胞的上清液使用分子量为5kD截断值的实验室级正切流动过滤(TFF)系统进行超滤(SpectrumLabs)。首先将样品浓缩10-20X，然后将缓冲液交换5X到50mM HEPES pH 7.5中。将得到的渗余物以27000xg离心1小时，然后通过0.2μm过滤器进行无菌过滤，以除去任何生产生物体或颗粒物。使用Braford测定法测定最终样品的总蛋白质含量。将脂肪酶冻干以形成粉末。

实施例3：脂肪酶活性

使用在溶液中的天然底物测定变体脂肪酶的活性。通过超声处理，在0.25％的脱氧胆酸钠中以5mM的终浓度制备天然的脂质底物。将底物(15μL)与30uL荧光素(0.25μg/mL，在10mM CaCl2中)和10μL在5mM Hepes pH 7.5中预先稀释的回收的脂肪酶(约1-2μg/mL)混合。通过由pH变化引起的荧光下降(用于激发/发射的485nm/525nm)监测脂质水解的产物，在26℃下每30秒动态记录，持续10分钟。对数尺度的活性与每分钟的荧光变化成正比。结果显示在下表3中，数据表示为在相同蛋白质浓度下相对于亲本(LIP062)荧光变化的百分比。对于某些底物上的某些变体脂肪酶未确定变体活性，为“n.d.”；但是，如实施例2所述创建了足够的材料，并且提供给如上文实施例1中表1所述用于氨基酸序列鉴定。

实施例4：在多种pH值下的脂肪酶的比活性

将变体脂肪酶以适当的浓度在5mM Hepes pH 7.5中稀释，然后再稀释16倍到在pH6.5至pH 12.0的宽范围缓冲液中制备的0.4mM PNP-辛酸酯中。所述宽范围缓冲液包含：25mM磷酸，25mM柠檬酸，25mM硼酸，25mM CAPS和50mM NaCl。对于pH 8.0，在缓冲液中添加10mM Tris pH 8.0。在26℃下通过每40秒记录一次405nm处的吸光度，持续15分钟，来测量活性。通过对背景(无酶)和在相同条件下每种pH下PNP的吸光度来校正活性。结果列于表6，数据显示为微克PNP/min/mg酶。

实施例5：在耐洗牢度试验仪中评价脂肪酶

脂肪酶通过在2g/L液体洗涤剂(ES1或ES4)或2g/L粉末洗涤剂(ECE2)中在每次运行时使用两个多污渍监测物(MSB、NSL、MSL1和MSL2)测试。测试的洗涤温度为20℃和40℃。脂肪酶的用量为0和0.5ppm。

选定的污渍监测物在使用基础配方ES1或ES4或ECE 2的洗涤液中在耐洗牢度试验仪(LOM，LP2 Typ，SDL Atlas Inc.，USA)中与压舱棉织物和钢球一起在20℃或40℃洗涤，洗涤条件如下：

ES1液体洗涤剂配方:

组分	类型	浓度[％]
			Lutensit A-LBS	LAS	5,5
Edenor椰油基脂肪酸	C<sub>12</sub>-C<sub>18</sub>椰油基脂肪酸	2,4
			Lutensol AO7	AEO	5,5
Texapon N70	FAEO	5,5
				1,2丙二醇	6,0
	乙醇	2,0
				KOH	2,2

ECE2粉末洗涤剂配方组合物(ISO 105-C08:2010)，来自WFK:

ES4液体洗涤剂配方

组分	类型	浓度[％]
			Lutensit A-LBS	LAS	3,63
Edenor椰油基脂肪酸	C<sub>12</sub>-C<sub>18</sub>椰油基脂肪酸	2,67

Lutensol AO 7	AEO	7,62
			Texapon N70	FAEO	10,37
	1,2丙二醇	4,45
				乙醇	1,48
	KOH	2,45

实验条件

洗涤液	250ml
		钢球数*	20
洗涤时间/温度	在25℃或40℃下20min
		脂肪酶用量	0ppm或1.5ppm
洗涤剂用量	2g/L或5g/L
		洗涤循环	1
水的硬度	2.5mmol/L；
		压舱织物	15g棉织物283
压舱织物+污染织物的总和	20g
		污染织物	2x 2.5g C-S-61或C-S 62
织物/溶液的比例	1:12.5

洗涤后，将织物漂洗，旋转脱水并在空气中干燥。对单个污渍的洗涤性能是通过使用来自Fa.Datacolor(Elrepho 2000)的分光光度计在460nm测量污染的织物在洗涤后的消退值来确定的。通常，消退值越高，性能越好。对于多污渍监测物，通过使用MACH5多区域颜色测量来确定去污性能，该测量给出了LAB值和在未洗涤和已洗涤的污渍之间计算的ΔE(根据实施例7的计算)。结果也在下表4的试验5至8中概述。

所测试的污渍–污渍样品均购自CFT,Vlaardingen,NL：

编号	样品细节	特征
			污渍1	E-142/1	唇膏
污渍2	W-10D	皮脂
			污渍3	PCS-04	橄榄油
污渍4	CS-170	巧克力慕斯
			污渍5	CS-68	巧克力冰淇淋
污渍6	C-09	花生油
			污渍7	CS-61	牛脂
污渍8	KC-H010	可可粉
			污渍9	KC-H015	油煎脂肪
污渍10	KC-H134	汉堡油脂
			污渍11	KC-H131	乳脂

表5：ES1洗涤剂制剂中脂肪酶变体对脂肪污渍的洗涤性能；数据在无脂肪酶的洗涤剂基础上标准化，洗涤温度为20℃

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍1	污渍2	污渍3	污渍4	污渍5	污渍6
								-	-	100	100	100	100	100	100
Lip173	0.5ppm	114	110	116	108	109	122
								Lip120	0.5ppm	104	100	101	106	103	110

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍7	污渍8	污渍9	污渍10	污渍11
							-	-	100	100	100	100	100
Lip173	0.5ppm	101	109	104	108	107
							Lip120	0.5ppm	85	108	97	113	82

表6：ES1洗涤剂制剂中脂肪酶变体对脂肪污渍的洗涤性能；数据在无脂肪酶的洗涤剂基础上标准化，洗涤温度为40℃

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍1	污渍2	污渍3	污渍4	污渍5	污渍6
								-	-	100	100	100	100	100	100
Lip173	0.5ppm	114	110	120	105	107	128
								Lip120	0.5ppm	108	103	95	101	100	108

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍7	污渍8	污渍9	污渍10	污渍11
							-	-	100	100	100	100	100
Lip173	0.5ppm	120	100	113	103	102
							Lip120	0.5ppm	110	102	99	99	98

表7：ECE 2洗涤剂制剂中脂肪酶变体对脂肪污渍的洗涤性能；数据在无脂肪酶的洗涤剂基础上标准化，洗涤温度为20℃

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍1	污渍2	污渍3	污渍4	污渍5	污渍6
								-	-	100	100	100	100	100	100
Lip62	0.5ppm	115	109	119	108	110	107
								Lip173	0.5ppm	124	110	117	117	121	110
Lip160	0.5ppm	113	100	115	109	108	100

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍7	污渍8	污渍9	污渍10	污渍11
							-	-	100	100	100	100	100
Lip62	0.5ppm	116	99	97	123	98
							Lip173	0.5ppm	113	102	108	145	114
Lip160	0.5ppm	108	96	102	126	93

表8：ECE 2洗涤剂制剂中脂肪酶变体对脂肪污渍的洗涤性能；数据在无脂肪酶的洗涤剂基础上标准化，洗涤温度为40℃

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍1	污渍2	污渍3	污渍4	污渍5	污渍6
								-	-	100	100	100	100	100	100
Lip62	0.5ppm	98	104	87	104	111	110
								Lip173	0.5ppm	101	104	89	103	112	109
Lip160	0.5ppm	97	103	105	101	104	102

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍7	污渍8	污渍9	污渍10	污渍11
							-	-	100	100	100	100	100
Lip62	0.5ppm	107	105	102	101	96
							Lip173	0.5ppm	107	109	115	100	95
Lip160	0.5ppm	109	111	105	103	100

表9：ES 4洗涤剂制剂中脂肪酶变体对脂肪污渍的洗涤性能；数据在无脂肪酶的洗涤剂基础上标准化，洗涤温度为20℃

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍1	污渍2	污渍3	污渍4	污渍5	污渍6
								-	-	100	100	100	100	100	100
Lip62	0.5ppm	100	98	106	107	108	113
								Lip173	0.5ppm	121	103	112	107	108	113
Lip160	0.5ppm	110	99	109	106	109	115

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍7	污渍8	污渍9	污渍10	污渍11
							-	-	100	100	100	100	100
Lip62	0.5ppm	104	99	93	111	86
							Lip173	0.5ppm	128	105	109	113	117
Lip160	0.5ppm	121	103	98	110	107

表10：ES 4洗涤剂制剂中脂肪酶变体对脂肪污渍的洗涤性能；数据在无脂肪酶的洗涤剂基础上标准化，洗涤温度为40℃

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍1	污渍2	污渍3	污渍4	污渍5	污渍6
								-	-	100	100	100	100	100	100
Lip62	0.5ppm	114	96	109	100	102	110
								Lip173	0.5ppm	124	106	112	104	108	115
Lip160	0.5ppm	118	103	106	105	104	112

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍7	污渍8	污渍9	污渍10	污渍11
							-	-	100	100	100	100	100
Lip62	0.5ppm	102	98	108	106	99
							Lip173	0.5ppm	114	99	108	110	103
Lip160	0.5ppm	110	100	106	109	102

实施例6：脂肪酶在全规模洗衣中的评价–与基准脂肪酶的比较

所述脂肪酶在2g/L液体洗涤剂(Persil small&mighty non bio2016，购自UK)中测试，每次运行使用两个多污渍监测物(MSB、NSL、MSL1和MSL2)。测试的洗涤温度为20℃和40℃。脂肪酶用量为0.5ppm。

实验设置如实施例5。

所测试的污渍：所有污渍样品均购自CFT,Vlaardingen,NL：

表11：脂肪酶变体在Persil洗涤剂制剂中对脂肪污渍的洗涤性能；数据在Lipex(Novozymes)基础上标准化，洗涤温度20℃

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍1	污渍3	污渍4	污渍5	污渍6
							Lipex	0.5ppm	100	100	100	100	100
Lip110	0.5ppm	103	102	106	107	101

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍8	污渍9	污渍12
					Lipex	0.5ppm	100	100	100
Lip110	0.5ppm	111	107	115

表12：脂肪酶变体在Persil洗涤剂制剂中对脂肪污渍的洗涤性能；数据在Lipex(Novozymes)基础上标准化，洗涤温度40℃

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍2	污渍3	污渍4	污渍5	污渍6
							Lipex	0.5ppm	100	100	100	100	100
Lip110	0.5ppm	111	106	108	105	108

脂肪酶	脂肪酶浓度	污渍8	污渍12	污渍13
					Lipex	0.5ppm	100	100	100
Lip110	0.5ppm	129	101	102

Claims

1.洗涤剂制剂，其包含：至少一种根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，或至少一种具有脂肪酶活性的具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少80％同一性的多肽，以及至少一种洗涤剂组分。

2.根据权利要求1所述的洗涤剂制剂，其中所述多肽在下述氨基酸残基的位置编号处包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一个氨基酸残基的插入、缺失或取代：23、33、82、83、84、85、160、199、254、255、256、258、263、264、265、268、308、311或其任意组合，并且该多肽具有脂肪酶活性。

3.根据权利要求2所述的洗涤剂制剂，其中所述对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一个氨基酸取代选自：Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D；L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S；T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、Y311E，或其任意组合，并且该多肽具有脂肪酶活性。

4.根据权利要求2-3所述的洗涤剂制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一个单一氨基酸取代，并且所述对氨基酸序列SEQ ID NO:1的一个单一氨基酸取代选自：Y23A、K33N、S82T、S83D、S83H、S83I、S83N、S83R、S83T、S83Y、S84S、S84N、84’Y、84’L、84’S、I85A、I85C、I85F、I85H、I85L、I85M、I85P、I85S、I85T、I85V、I85Y、K160N、P199I、P199V、I254A、I254C、I254E、I254F、I254G、I254L、I254M、I254N、I254R、I254S、I2454V、I254W、I254Y、I255A、I255L、A256D、L258A、L258D；L258E、L258G、L258H、L258N、L258Q、L258R、L258S、L258T、L258V、D263G、D263K、D263P、D263R、D263S；T264A、T264D、T264G、T264I、T264L、T264N、T264S、D265A、D265G、D265K、D265L、D265N、D265S、D265T、T268A、T268G、T268K、T268L、T268N、T268S、D308A、Y311E，或其任意组合；其中该多肽具有脂肪酶活性。

6.一种清洁方法，包括以下步骤：

(a)提供要清除油脂污渍的表面；

(b)提供权利要求1-5所述的洗涤剂制剂；

11.根据权利要求1-10所述的洗涤剂制剂，其中所述至少一种洗涤剂组分选自：表面活性剂、助剂、聚合物、碱、漂白体系、荧光增白剂、抑泡剂和稳定剂、助水溶物、流变改进剂、防腐剂和腐蚀抑制剂，其量为对洗涤或清洁性能有效或对保持洗涤剂的物理特性有效的量。