CN104619837A - 利用co2使用于木质纤维素材料的生物化学转化的纤维素分解微生物失活 - Google Patents

利用co2使用于木质纤维素材料的生物化学转化的纤维素分解微生物失活 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种使能够生产酶混合物的纤维素分解微生物失活的方法，所述混合物在木质纤维素材料的生物化学转化过程中使用而没有分离纤维素分解微生物，所述方法包括至少一个使气体流与包含所述微生物的培养基接触的步骤，所述气体流包含大于25％重量的CO2并包含小于0.5mol％的O2。

Description

利用CO2使用于木质纤维素材料的生物化学转化的纤维素分解微生物失活
本发明涉及生产纤维素分解酶和半纤维素分解酶，尤其是在从纤维素或木质纤维素材料生产乙醇的情况。
现有技术
自二十世纪七十年代，在组分多糖被水解为可发酵糖之后，将木质纤维素材料转化为乙醇已经是大量研究的焦点。可被引用的实例为来自国家再生能源实验室的参考工作(Process Design andEconomics for Biochemical Conversion of Lignocellulosic Biomass toEthanol(木质纤维素生物质到乙醇的生物化学转化的工艺设计及经济学)，Humbird et al.，NREL1TP-5100-57764，2011年5月)。
木质纤维素材料为即包含大于90％重量纤维素的纤维素材料，和/或即由纤维素，半纤维素和木质素构成的木质纤维素材料，所述纤维素和半纤维素为基本上由戊糖、己糖和木质素构成的多糖，所述木质素为具有复杂结构和高分子量的大分子，由通过醚键键合的芳醇组成。
木材、稻草和玉米棒是最广泛使用的木质纤维素材料，但是可以使用其它来源、专用的森林栽培物、醇生成中的残渣、糖和谷类植物、造纸业的产物和残渣以及木质纤维素材料的转化产物。它们主要由约35％-50％的纤维素、20％-30％的半纤维素和15％-25％的木质素构成。
木质纤维素材料生物化学转化为乙醇的方法包括：物理化学预处理步骤，接着利用酶混合物(enzymatic cocktail)的酶水解步骤、释放的糖的乙醇发酵步骤和纯化乙醇的步骤。
乙醇发酵和酶水解，也称为糖化作用，可以同时进行(同时糖化和发酵，或SSF)，例如通过在水解步骤期间加入乙醇有机体。
所述酶混合物是纤维素分解酶(也称作纤维素酶)和/或半纤维素分解酶的混合物。纤维素分解酶具有三种主要的活性类型：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶，这些后者也被称作β-葡糖苷酶。半纤维素分解酶尤其具有木聚糖酶活性。
酶水解是高效的且在温和条件下进行。相比之下，酶的成本仍然高，占木质纤维素材料转化为乙醇的成本的20％-50％。因为这个原因，进行了大量关于降低成本的研究：通过选择超高生产力的微生物和通过改善生产所述酶的方法，然后降低水解中酶的量，通过优化预处理步骤，通过改善这些酶的比活，和通过优化酶水解步骤的执行，来从最初优化酶的生产。
生产酶混合物的步骤包括三个主要阶段：纤维素分解微生物生长阶段(a)；产生酶混合物阶段(b)以及分离和浓缩阶段(c)，阶段(c)期间酶混合物与纤维素分解微生物分离并被浓缩。酶混合物与纤维素分解微生物的分离通过液/固分离(例如通过离心法)来进行。通过过滤(例如通过超滤)浓缩所述酶混合物。
这些分离阶段是必需的，因为如果纤维素分解微生物被置于存在酶混合物和不存在含碳底物下，存在纤维素分解微生物将消耗包含于所述混合物中的酶以使其可以存活，从而导致生产损失的风险。
另外，不考虑分离期间的处理，一部分酶混合物将总是随包含微生物的级分而损失。取决于采用的分离技术，这些损失可相当于分离前存在的酶混合物的3％重量-50％重量。因此，使用没有分离的醪液(mash)以防止这些损失可为有利的。
SSF步骤的操作温度为约30℃-35℃。然而，这些温度与纤维素分解微生物的生长相容。因此，如果在SSF步骤中预期使用酶混合物而不分离纤维素分解微生物，则存在纤维素分解微生物与用于发酵的酵母之间的竞争导致所述SSF步骤的产率降低的风险。事实上，一部分通过水解释放的葡萄糖将会被纤维素分解微生物消耗。
因此，考虑到在SSF步骤中存储和/或使用酶混合物和纤维素分解微生物，使纤维素分解微生物失活以使分离酶混合物和所述纤维素分解微生物的步骤不再必需是有利的。通过利用对于所述方法内在的手段，例如所述方法的一个步骤的产物，能够使此微生物失活也是有利的。
GB 1 489 145公开了从纤维素残渣培养纤维素分解微生物和酶，以及使用培养基/酶生产整体而没有分离用于酶水解的任何组分。他们声称使用未经处理(过滤、浓缩或其它)的“根据本发明”的培养基整体除了可调节pH，还能够改善纤维素水解的速率和产率。
该专利未提及酶水解条件下纤维素分解微生物里氏木霉(T.reesei)的生长的潜在问题，也未提及通过纤维素分解微生物的蛋白再消耗的潜在问题。事实上，相比于在30℃-35℃范围的温度下进行的SSF，酶水解通常在阻止纤维素分解微生物生长的温度(45℃和55℃之间)下进行。
Barta等人(“软木基乙醇植物对于不同碳源的原位纤维素酶生产的工艺设计及经济学(Process Design and Economics of On-SiteCellulase Production on Various Carbon Sources in a Softwood-BasedEthanol Plant)”，Enzyme Research，2010卷，doi：10.4061/20 I0/734182)公开了将含有纤维素分解微生物的全部培养基加入至SSF步骤。根据该作者，这没有引起问题，由于SSF在37℃下进行，而当温度超过35℃时纤维素分解微生物的生长被完全抑制。该假设是可疑的，因为已知木霉属(例如拟康氏木霉(T.pseudokoningii)，土孢木霉(T.saturnisporum))的某些种能够在高达40℃-41℃下发展。
然而，本申请人的研究已经导致这样的发现，即对于生物质到乙醇的生物化学转化方法是内在的某些流可用于使纤维素分解微生物失活。
本发明提出一种使纤维素分解微生物失活的方法，该方法克服了迄今出现的缺点。
发明概述和优点
在通过与包含少于0.5摩尔％的氧气的气体流接触使纤维素分解微生物失活中，无需将所述微生物与产生的酶混合物分离，所述气体流对于生物质到乙醇的生物化学转化方法中是内在的。
所用内在气体流的明智选择意味着可以避免对所述方法性能的任何负面影响，所述负面影响可由通过再循环效应而积累不需要的物类引起。
因此本发明方法的一个优点是产生的酶混合物的损失是受限的。另一个优点是设备的尺寸是受限的：通过限制损失，来限制补偿所述损失所需的过量生产。另一优点是在酶混合物/纤维素分解微生物分离期间通过使清洗阶段减至最少或甚至将其省去来限制排放。另一优点是通过限制或甚至省去酶混合物/纤维素分解微生物分离阶段来使污染风险最小化。
将在下文中以非穷举方式列出的本发明方法的优点意味着能够降低从木质纤维素材料生产乙醇的成本，改善本领域的竞争地位。
发明详述
本发明涉及一种使能够生产酶混合物(cocktail)的纤维素分解微生物失活的方法，所述混合物在木质纤维素材料的生物化学转化过程中使用而没有分离纤维素分解微生物，所述方法包括至少一个使气体流与包含所述微生物的培养基接触的步骤，所述气体流包含大于25％重量的CO2并包含小于0.5摩尔％的O2。
优选地，所述气体流源自SSF步骤。
优选地，在接触步骤前，所述气体流经过处理以将其乙醇和挥发性有机化合物含量降低至少25％。
优选地，所述处理是用水洗涤所述气体流。
优选地，所述接触步骤在SSF步骤中进行。
优选地，所述接触步骤在酶混合物生产步骤中在生产所述混合物阶段的结束时进行。
优选地，所述接触步骤在酶混合物生产步骤和SSF步骤之间进行。
优选地，所述纤维素分解微生物选自属于木霉属、曲霉属、青霉菌属或裂褶菌属的真菌菌株。
优选地，所述纤维素分解微生物属于里氏木霉种。
酶混合物生产步骤利用纤维素分解微生物，所述生产过程在浸没培养中进行。术语“浸没培养”是指在液体培养基中的培养。
用于生产酶混合物的方法中的纤维素分解微生物为属于木霉属、曲霉属、青霉菌属或裂褶菌属，优选属于里氏木霉种的真菌菌株。表现最好的工业菌株为属于里氏木霉种的菌株，该菌株通过突变选择过程被修饰以改善酶混合物，例如菌株IFP CL847(法国专利FR-B-2 555 803)。也可以使用通过基因重组技术改善的菌株。在与其生长及酶的产生相容的条件下，在搅拌通气反应器中培养这些菌株。
根据本发明，包含小于0.5摩尔％，优选小于0.25摩尔％氧气(O2)，以及更优选没有氧气的气体流然后与含有所述纤维素分解微生物的培养基接触。
乙醇发酵是其中有机体例如酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)将糖转化为乙醇和二氧化碳(CO2)的生物化学反应。
包含在乙醇发酵步骤和/或SSF步骤期间产生的CO2的气体流通过对发酵罐连续除气而被分离。包含溶解在发酵培养基中的CO2级分的气体流在乙醇纯化步骤期间产生。
用于本发明的气体流有利地由通过对发酵罐连续除气而分离的气体流和乙醇纯化步骤期间产生的流的混合物构成。
乙醇发酵步骤期间产生的气体流包含至少25％重量的CO2，优选至少50％重量的CO2，以及更优选至少75％重量。所述气体流还包含0-10％重量范围内的乙醇，优选0-5％重量范围内。所述气体流还包含水和挥发性有机化合物(VOC)，这些后者根据1999年3月11日Council Directive 1999/13/CE第二条限定。
在所述乙醇纯化步骤期间，通过技术人员已知的任何方式将溶解的CO2级分与包含乙醇的培养基分离，例如通过闪蒸，通过蒸馏，通过膜分离或通过这些方式的组合或技术人员已知的其它方式，所述闪蒸由降低培养基的压力以蒸发溶解的CO2组成。
优选地，如有必要，包含通过连续除气分离的CO2的气体流和/或包含在乙醇纯化步骤中分离的CO2的气体流在涤气步骤中被处理以降低其乙醇和VOC含量以及其氧气含量。所述涤气步骤可以利用技术人员已知的任何方法进行。优选地，所述涤气步骤是用水或膜分离洗涤。
所述涤气步骤旨在使气体流中的乙醇和VOC含量降低25％重量-100％重量，优选50％重量-100％重量以及更优选75％重量-100％重量。
在优选的设置中，气体流与含有纤维素分解微生物的培养基接触，没有所述涤气步骤中的在先处理。
在所述接触期间，可包含于所述气体流中的乙醇被吸收至含有纤维素分解微生物的所述培养基中。通过再循环，然后，乙醇发酵步骤结束时乙醇浓度增加。乙醇浓度的增加具有降低乙醇纯化步骤的能量消耗的作用。
在所述接触步骤期间，CO2将使培养基酸化。气体流与含有纤维素分解微生物的培养基的接触总是伴随检查和pH的可能调整进行。
气体流与含有纤维素分解微生物的培养基的接触可以通过技术人员已知的使气体与液体密切接触的任何方式进行，所述培养基与液体表现方式相似。这类方式被描述于例如Adsorption en traitementd′air，[空气处理中吸附]，Michel Roustan，Techniques dingenieur，G1750，但不是以穷举方式。
优选地，使气体流与包含纤维素分解微生物的培养基接触的步骤在SSF步骤中进行。为了获得此接触，在其中进行SSF步骤的设备提供有在液体培养基中分散气体的系统。另一方法由以下组成：提取包含在所述设备中的反应培养基级分，将所述级分与所述气体流密切混合，再将可能已与所述气体部分分离或可能没有分离的所述级分引入到所述设备。另一方法由将所述气体流注入所述所述设备的顶部气体组成。
优选地，使气体流与包含纤维素分解微生物的培养基接触的步骤在生产酶混合物的步骤期间，在生产所述混合物的阶段(b)结束时进行。由于生产酶混合物的设备是通风且搅拌的，如技术人员已知，且例如如专利EP 1 690944所述，空气注入在所述生产阶段(b)结束时被截断，且取而代之的是，注入所述气体流直至氧气的分压小于0.5摩尔％，优选小于0.25摩尔％，且更优选0％。加入CO2的另一优势是使pH降低，优选在3.5至3.7之间。这些低pH意味着相对于在4.8至4范围内的培养pH，污染的风险可以被限制。在这一步骤中应该小心使pH不低于3.3，低于3.3将会对混合物中的某些酶的活性有负面影响。
优选地，使气体流与包含纤维素分解微生物的培养基接触的步骤在生产酶混合物的步骤和SSF步骤之间进行。利用技术人员已知的传统气/液接触技术，可在专用设备中引起这种接触。
含有CO2的气体流也可用于生产微藻类，所述微藻类旨在从所述微藻类提取脂质后用于生产被称为“第三代”燃料的生物燃料，因此意味着可以生产具有高附加值的副产物，即直接用于进行水产业。
也可以使用包含少于0.5摩尔％氧气的其它气体流，例如来自用于水厌氧处理的装置的流出液、废物燃烧烟雾，或来自有机废物甲烷化装置的流出液。
以下实施例阐述本发明而非限制其范围。在下文，在表示为FPU的滤纸单元(Filter Paper Unit)中测量酶混合物的活性。此活性在50g/L的初始浓度下，在Whatman 1号纸上测量(IUPAC生物技术委员会推荐的程序)。确定待分析的酶溶液的样品，所述酶溶液在60分钟内释放2g/L当量的葡萄糖(比色测定)。
实施例1：存储的里氏木霉醪液比较
实施例1表示称作醪液的包含酶混合物和纤维素分解微生物里氏木霉的培养基在存储3周且经过3种不同处理后的所述酶混合物的活性变化。该实施例显示FPU活性在已被放置在CO2或N2气氛中的醪液中保持，而在保存于空气中的醪液中该活性大大降低。
利用里氏木霉CL847并通过例如描述于专利申请EP 1690944中的常规方案，在发酵罐中生产酶混合物。所得的酶混合物的浓度为39.9g/L，且活性为32FPU/mL。
将醪液分装入不同的预灭菌的烧瓶中，没有分离纤维素分解微生物和含有酶混合物的上清液。
在烧瓶A中，包含大于99摩尔％CO2并包含小于0.5摩尔％O2的气体流被鼓泡直至顶部气体含有少于0.5摩尔％CO2。通过采集来自在别处进行的乙醇发酵的除气产物来获得所述气体流。
在烧瓶B中，包含大于99摩尔％N2并包含小于0.5摩尔％O2的气体流被鼓泡直至顶部气体含有少于0.5摩尔％O2。
在烧瓶C中，醪液在具有0.2μm过滤器的灭菌烧瓶中于空气中储存。
利用采自顶部气体的样品通过气相色谱法(GPC)测量％O2。
然后烧瓶在33℃下储存3周。
3周后获得的活性显示于表1中。超过90％的活性在CO2气氛或氮气气氛中保持，而当真菌在空气存在时损失50％的活性。因此无空气存在时纤维素分解微生物确实失活。
表1：酶活性的变化
实施例2：两种SSF的比较
实施例2利用包含纤维素分解微生物和酶混合物两者的醪液在33℃下，加入或不加入CO2到顶部气体来进行两种SSF的比较。
每克干物质(DM)用30mg剂量的酶，在水解和发酵反应器中直接利用酶生产醪液(酶混合物+纤维素分解微生物)进行两种SSF。干物质的重量百分比是在105℃下干燥24小时后获得的样品的重量与样品的初始重量的比。干物质的重量是干物质的重量百分比与样品重量的乘积。
在2L反应器中在18％DM(小麦杆在酸性条件下蒸汽爆破，洗涤并干燥)下进行该实验。将温度调节至33℃并利用5N氢氧化钠(NaOH)将pH调至5。开始水解后1小时以每千克发酵培养基0.5克酵母的浓度加入酵母。用轻微鼓泡穿过包含99.8摩尔％CO2和0.2摩尔％O2的气体流进行第一SSF(SSF1)。第二SSF(SSF2)在无鼓泡CO2穿过下进行。
SSF1结束时的最终乙醇浓度为40.2g/L，而SSF2结束时的最终乙醇浓度仅为34.1g/I。SSF1产率比SSF2产率大17.9％。在SSF2的情况下，纤维素分解微生物消耗了一部分纤维素水解释放的糖，导致乙醇生产的最终产率降低。

Claims (9)

1.一种使能够生产酶混合物的纤维素分解微生物失活的方法，所述混合物在木质纤维素材料的生物化学转化过程中使用而没有分离纤维素分解微生物，所述方法包括：
至少一个使气体流与包含所述微生物的培养基接触的步骤，所述气体流包含大于25％重量的CO2并包含小于0.5摩尔％的O2。
2.根据权利要求1的方法，其中所述气体流源自SSF步骤。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中在接触步骤前，所述气体流经过处理以将其乙醇和挥发性有机化合物含量降低至少25％。
4.根据权利要求3的方法，其中所述处理是用水洗涤所述气体流。
5.根据权利要求1-4之一的方法，其中所述接触步骤在SSF步骤中进行。
6.根据权利要求1-5之一的方法，其中所述接触步骤在酶混合物生产步骤中在生产所述混合物阶段结束时进行。
7.根据权利要求1-6之一的方法，其中所述接触步骤在酶混合物生产步骤和SSF步骤之间进行。
8.根据权利要求1-7之一的方法，其中所述纤维素分解微生物选自属于木霉属、曲霉属、青霉菌属或裂褶菌属的真菌菌株。
9.根据权利要求8的方法，其中所述纤维素分解微生物属于里氏木霉种(Trichoderma reesei)。
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