CN103283990A

CN103283990A - 桦褐孔菌多糖作为凡纳滨对虾饲料添加剂的应用

Info

Publication number: CN103283990A
Application number: CN2013101637879A
Authority: CN
Inventors: 徐向群
Original assignee: Institute of Animal Science of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-05-07
Also published as: CN103283990B

Abstract

本发明公开了一种桦褐孔菌多糖作为凡纳滨对虾饲料添加剂的应用，桦褐孔菌多糖在凡纳滨对虾基础饲料中的添加量为500-1500mg/kg凡纳滨对虾基础饲料。本发明将桦褐孔菌多糖作为添加剂应用到凡纳滨对虾饲料中能显著提高凡纳滨对虾的增重率和特定生长率，显著降低饲料系数，同时显著提高凡纳滨对虾血清溶菌酶、碱性磷酸酶和总抗氧化能力，提高血清一氧化氮合成酶、超氧化物歧化酶，降低血清丙二醛含量，其作用效果与β葡聚糖相当，是一种新型的免疫增强剂，在凡纳滨对虾养殖领域具有广阔的应用前景。

Description

桦褐孔菌多糖作为凡纳滨对虾饲料添加剂的应用

技术领域

本发明涉及水产养殖领域，特别涉及一种桦褐孔菌多糖作为凡纳滨对虾饲料添加剂的应用。

背景技术

凡纳滨对虾，俗称南美白对虾，是目前世界养殖虾类产量最高的三大虾种之一。因其生长速度快、营养要求低、虾肉含量大、肉质鲜美、营养丰富等特点深受消费者的青睐。近年来，随着凡纳滨对虾规模化和集约化养殖程度的迅速发展，养殖病害爆发越来越频繁，为控制疾病的发生，化学药物和抗生素等被大量使用，由此产生药物残留、耐药性及环境污染等问题严重影响消费者的健康。因此，寻求抗生素药物的替代品就显得尤为重要。

来源于药用真菌和酵母的β-1,3/1,6-葡聚糖（简称β-葡聚糖）是一种有效的免疫增强剂，人们已经知道了它们在免疫系统中的作用方式。此外，β-葡聚糖是无毒性的，且它们在所有动物（从无脊椎动物到人）的免疫系统中的作用机制是相同的。目前通过酵母发酵获得的β-葡聚糖已作为免疫增强剂应用于对虾的养殖中，β-葡聚糖不单可以通过注射和浸泡动物起作用，还可通过混入饲料投喂起作用。但是，经过几年的应用，对虾对β-葡聚糖产生免疫疲劳，导致β-葡聚糖免疫增强效果在减弱，市场急需更新替代产品。

桦褐孔菌，又名白桦茸，学名Inonotus obliquus，Fuscoporia oblique，欧洲人称之为“chaga”，是一种多孔菌科褐卧孔菌属食药用真菌。桦褐孔菌主要生长于白桦、银桦、榆树、赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上，形成不育的木腐菌，其菌核可以在砍伐后的枯干上生存达6年之久。它主要分布于俄罗斯北部、北欧、中国黑龙江、吉林长白山、日本北海道等北纬45-50°极寒地区。桦褐孔菌子实体一般呈瘤状，直径约25-40 cm，外表坚硬，有深的裂痕，较硬，干时脆，颜色呈黄褐色或更深。

从16世纪以来，桦褐孔菌在俄罗斯、北欧一些国家被广泛用于恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病、肝病和艾滋病等疾病的治疗。在俄罗斯，桦褐孔菌被广泛用作日常保健品。日本的研究人员则称桦褐孔菌为一种“万能药”。在日本，桦褐孔菌的粉末状冲剂经常作为保健茶来饮用。1955年莫斯科医科院(The Medical Academy of Science in Moscow)宣布将桦褐孔菌列为抗癌物质，政府批准桦褐孔菌可用于医药品开发。美国把桦褐孔菌列入“特殊的天然物质”。

桦褐孔菌多糖是桦褐孔菌的重要药理活性成分之一，桦褐孔菌多糖是一种新型的真菌多糖，具有免疫调节、抗氧化作用、抗炎症及抗病毒等优点，成为当前免疫增强剂的研究热点。目前，桦褐孔菌多糖多应用于体外及小鼠的抗氧化、免疫功能的研究中，作用效果显著。但桦褐孔菌多糖对于对虾是否合适，是否可以成为继酵母β-葡聚糖后新型的对虾免疫增强剂，则是个未知数。如果桦褐孔菌多糖能够提高对虾的免疫力和抗氧化能力，那么它在水产饲料添加剂研究中具有广阔的应用前景。

CN101828644A的发明公开了一种凡纳滨对虾饲料。本发明凡纳滨对虾饲料的营养组分按照质量百分数计如下：蛋白质25～35，脂肪4～9，灰分7～12，碳水化合物40～55，水分3～11。虽然该对虾饲料能够满足凡纳滨对虾生长的营养需求，但无法提高其免疫能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桦褐孔菌多糖作为凡纳滨对虾饲料添加剂的应用，采用桦褐孔菌多糖替代酵母β-葡聚糖，能有效提高对虾的生长性能、免疫力和抗氧化能力，拓宽了桦褐孔菌多糖的应用范围，为凡纳滨对虾饲料的开发提供了新途径。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种桦褐孔菌多糖作为凡纳滨对虾饲料添加剂的应用，桦褐孔菌多糖在凡纳滨对虾基础饲料中的添加量为500-1500mg/kg凡纳滨对虾基础饲料。

本发明首次将桦褐孔菌多糖作为添加剂应用到凡纳滨对虾饲料中，发现能显著提高对虾的增重率、特定生长率和成活率，显著降低饲料系数，并且显著提高对虾血清溶菌酶、碱性磷酸酶和总抗氧化能力，降低血清丙二醛含量。拓宽了桦褐孔菌多糖的应用范围，为凡纳滨对虾饲料的开发提供了新途径。本发明中，桦褐孔菌多糖的添加量低于500mg/kg则无法明显起到提高对虾的生长性能、免疫力和抗氧化能力的效果；桦褐孔菌多糖的添加量高于1500mg/kg，则成本过高，且更进一步提高对虾的生长性能、免疫力和抗氧化能力的效果微弱，不利于应用。

本发明中的桦褐孔菌多糖可以是市售产品，优选本发明自己制备的桦褐孔菌多糖。

作为优选，桦褐孔菌多糖在凡纳滨对虾基础饲料中的添加量为800-1200mg/kg凡纳滨对虾基础饲料。控制桦褐孔菌多糖在凡纳滨对虾基础饲料中的添加量为800-1200mg/kg凡纳滨对虾基础饲料，这样应用的效果最佳。

作为优选，所述桦褐孔菌多糖由以下工艺制备获得：

（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种。

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基中，摇床培养至对数期得液体菌种。

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8-10，所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖30-32g/L，木质纤维素32-38g/L，蛋白胨 2-5g/L，KH₂PO₄ 1-2g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01-0.02g/L， K₂HPO₄ 0.3-0.5g/L，FeSO₄ ·7H₂O 0.03-0.07g/L，MgSO₄ ·7H₂O 0.3-0.6 g/L，CuSO₄ ·5H₂O 0.01-0.03 g/L，CoCl₂ 0.01 -0.02g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.06-0.09 g/L，pH值6.0-6.5。

液体深层发酵培养基优化的配方为：葡萄糖30-32g/L，木质纤维素32-38g/L，蛋白胨 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01g/L，K₂HPO₄ 0.4g/L，FeSO₄ ·7H₂O 0.05 g/L， MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g/L，CuSO₄ ·5H₂O 0.02 g/L，CoCl₂ 0.01 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.08 g/L，pH值6.0。

液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28℃，发酵罐空气流量0.5-1.0vvm，发酵罐内部压力0.1-0.25 kg/cm³，搅拌转速70-150转/分钟，发酵周期12-14天。

（4）桦褐孔菌多糖提取：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖。

作为优选，从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体步骤为：发酵产物过滤，得发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在0-4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后即得桦褐孔菌多糖。

作为优选，从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体步骤为：

a、发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在0-4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后得桦褐孔菌胞外多糖；

b、将菌丝体水洗后，菌丝体悬浮于蒸馏水（1g菌丝体20-30ml蒸馏水）中，超声破壁， 121±1℃加热1.5-2h，冷却后离心收集上清液，残渣悬浮于蒸馏水中（1g残渣20-30ml蒸馏水），121±1℃加热3-4h，冷却后离心收集上清液，合并上清液，浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的95%-98%的乙醇，搅拌均匀后在0-4℃下静置过夜沉淀，所得沉淀依次用95%-98%的乙醇和丙酮洗涤后，冷冻干燥得桦褐孔菌胞内多糖；

c、将a步的桦褐孔菌胞外多糖和b步的桦褐孔菌胞内多糖混合均匀后即为桦褐孔菌多糖。

本发明自己制备的桦褐孔菌多糖，可以是从发酵液中提取的桦褐孔菌胞外多糖作为桦褐孔菌多糖使用，更为优选是从发酵液中提取的桦褐孔菌胞外多糖和从菌丝体中提取的桦褐孔菌胞内多糖的混合物作为桦褐孔菌多糖使用。桦褐孔菌胞外多糖和桦褐孔菌胞内多糖的混合物组成的桦褐孔菌多糖，其中的杂多糖含量更丰富，活性物质更全面均衡，提高对虾的生长性能、免疫力和抗氧化能力的效果更显著。

作为优选，所述木质纤维素选自农作物秸秆、木屑、花生壳、甘蔗渣中的一种。

作为优选，所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6；斜面菌种培养基上培养的参数为：温度27-28℃，培养200-250小时。

作为优选，所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL；液体菌种培养的参数为：温度27-28℃，培养3.5-4.5d，摇床转速80-140转/分钟。

一种添加有桦褐孔菌多糖的凡纳滨对虾饲料，包括桦褐孔菌多糖和凡纳滨对虾基础饲料，桦褐孔菌多糖用量为每千克凡纳滨对虾基础饲料中添加500-1500mg。

作为优选，桦褐孔菌多糖用量为每千克凡纳滨对虾基础饲料中添加800-1200mg。

本发明的有益效果是：采用桦褐孔菌多糖替代酵母β-葡聚糖，能有效提高对虾的生长性能、免疫力和抗氧化能力，拓宽了桦褐孔菌多糖的应用范围，为凡纳滨对虾饲料的开发提供了新途径，促进了对虾养殖业的可持续发展。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

凡纳滨对虾基础饲料为现有技术，可以是市售，也可以是现有文献中公开的配方。

实施例1：

称取凡纳滨对虾基础饲料（市售，青岛长生中科水产饲料有限公司生产的海森特凡纳滨对虾配合饲料）100kg，加入50g桦褐孔菌多糖（市售，浙江方格药业有限公司），混合均匀后用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为1.0 mm的颗粒饲料，55 ℃下烘干即可。

实施例2：

称取凡纳滨对虾基础饲料（市售，青岛长生中科水产饲料有限公司生产的海森特凡纳滨对虾配合饲料）100kg，加入150g桦褐孔菌多糖（市售，浙江方格药业有限公司），混合均匀后用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为1.0 mm的颗粒饲料，55 ℃下烘干即可。

实施例3：

称取凡纳滨对虾基础饲料（市售，青岛长生中科水产饲料有限公司生产的海森特凡纳滨对虾配合饲料）100kg，加入80g桦褐孔菌多糖，混合均匀后用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为1.0 mm的颗粒饲料，55 ℃下烘干即可。

桦褐孔菌多糖的制备方法如下：

（1）菌种活化：以桦褐孔菌（市售，购自徐州师范大学）为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上27℃，培养250小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基27℃，摇床上培养4.5d至对数期得液体菌种，摇床转速80转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL。

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27℃，发酵罐空气流量0.5vvm，发酵罐内部压力0.1 kg/cm³，搅拌转速70转/分钟，发酵周期14天；所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖30g/L，玉米秸秆32g/L，蛋白胨 2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01g/L， K₂HPO₄ 0.3g/L，FeSO₄ ·7H₂O 0.03 g/L， MgSO₄ ·7H₂O 0.3 g/L，CuSO₄ ·5H₂O 0.01 g/L，CoCl₂ 0.01 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.06 g/L，pH值6.0；发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2%，镜检发现菌丝体开始衰老。

（4）桦褐孔菌多糖提取：发酵产物过滤，得发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%，加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在0℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后即得桦褐孔菌多糖。

实施例4：

称取凡纳滨对虾基础饲料（配方见王文娟等，凡纳滨对虾对13种动物性饲料原料营养物质表观消化率的研究，动物营养学报，2012，24（12））100kg，加入120g桦褐孔菌多糖，混合均匀后用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为1.0 mm的颗粒饲料，55 ℃下烘干即可。

桦褐孔菌多糖的制备方法如下：

（1）菌种活化：以桦褐孔菌（市售，购自徐州师范大学）为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上28℃，培养200小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基28℃，摇床上培养3.5d至对数期得液体菌种，摇床转速140转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL。

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1: 10，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度28℃，发酵罐空气流量1.0vvm，发酵罐内部压力0.25 kg/cm³，搅拌转速150转/分钟，发酵周期12天；所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖32g/L，花生壳38g/L，蛋白胨 5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.02g/L， K₂HPO₄ 0.5g/L，FeSO₄ ·7H₂O 0.07 g/L， MgSO₄ ·7H₂O 0.6 g/L，CuSO₄ ·5H₂O 0.03 g/L，CoCl₂ 0.02 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.09 g/L，pH值6.5；发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2%，镜检发现菌丝体开始衰老。

（4）桦褐孔菌多糖提取：发酵产物过滤，得发酵液，发酵液浓缩至原体积的30%，加入6倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后即得桦褐孔菌多糖。

实施例5：

称取凡纳滨对虾基础饲料（配方见杨志强等，凡纳滨对虾对7种蛋白原料的蛋白质和氨基酸的消化率，《饲料工业》，2010年第31卷第2期）100kg，加入100g桦褐孔菌多糖，混合均匀后用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为1.0 mm的颗粒饲料，55 ℃下烘干即可。

桦褐孔菌多糖的制备方法如下：

（1）菌种活化：以桦褐孔菌（市售，购自徐州师范大学）为菌种，划线接种至斜面菌种培养基上28℃，培养220小时，获得活化菌种；斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6。

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基28℃，摇床上培养4d至对数期得液体菌种，摇床转速100转/分钟。液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL。

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入装有液体深层发酵培养基的发酵罐中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:9，液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度28℃，发酵罐空气流量0.8vvm，发酵罐内部压力0.2 kg/cm³，搅拌转速100转/分钟，发酵周期13天；所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖31g/L，甘蔗渣35g/L，蛋白胨 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01g/L， K₂HPO₄ 0.4g/L，FeSO₄ ·7H₂O 0.05 g/L， MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g/L，CuSO₄ ·5H₂O 0.02 g/L，CoCl₂ 0.01 g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.08 g/L，pH值6.0，发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2%，镜检发现菌丝体开始衰老。

（4）桦褐孔菌多糖提取：

a、发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液，发酵液浓缩至原体积的25%，加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后得桦褐孔菌胞外多糖；

b、将菌丝体水洗后，菌丝体悬浮于蒸馏水（1g菌丝体20ml蒸馏水）中，超声破壁（超声共5 min，超声5s，间隔3s）， 121±1℃加热1.5h，冷却后离心收集上清液，残渣悬浮于蒸馏水（1g残渣20ml蒸馏水）中，121±1℃加热3h，冷却后离心收集上清液，合并上清液，浓缩至原体积的20%，加入4倍体积的95%的乙醇，搅拌均匀后在4℃下静置过夜沉淀，所得沉淀依次用95%的乙醇和丙酮洗涤后，冷冻干燥得桦褐孔菌胞内多糖；

实施例6：

桦褐孔菌多糖的制备方法如下：

本实施例步骤（1）-（3）同实施例5，不同之处在于步骤（4）桦褐孔菌多糖提取：

b、将菌丝体水洗后，菌丝体悬浮于蒸馏水中（1g菌丝体30ml蒸馏水），超声破壁（超声共5 min，超声5s，间隔3s）， 121±1℃加热2h，冷却后离心收集上清液，残渣悬浮于蒸馏水中（1g残渣30ml蒸馏水），121±1℃加热4h，冷却后离心收集上清液，合并上清液，浓缩至原体积的30%，加入6倍体积的98%的乙醇，搅拌均匀后在0℃下静置过夜沉淀，所得沉淀依次用98%的乙醇和丙酮洗涤后，冷冻干燥得桦褐孔菌胞内多糖；

实验数据

以凡纳滨对虾基础饲料（配方见杨志强等，凡纳滨对虾对7种蛋白原料的蛋白质和氨基酸的消化率，《饲料工业》，2010年第31卷第2期）为空白对照饲料，在每千克凡纳滨对虾基础饲料中添加1000 mg 桦褐孔菌多糖作为处理组的饲料，在每千克凡纳滨对虾基础饲料中添加500 mg 纯度为90%的酵母β-葡聚糖（购自美国Sigma公司）作为阳性对照组的饲料。

选取初重为0.5g左右的凡纳滨对虾，随机分为3组，每组3个重复，每个重复30尾虾，分别投喂空白对照饲料、试验饲料和阳性对照饲料，记为G0、G4和 G5组。养殖周期为4周。结果见表1。

表1 桦褐孔菌多糖对凡纳滨对虾生长性能及饲料利用的影响

指标	增重率(%)	特定生长率（%/d）	饲料系数	成活率(%)
					G0	197.2±23.2^b	1.69±0.12^b	2.09±0.07^a	56.7±6.7^b
G4	328.3±23.5^a	2.26±0.09^a	1.66±0.02^b	78.9±12.6^a
					G5	287.2±28.6^a	2.10±0.12^a	1.69±0.06^b	63.3±6.7^b

注：同行上标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）

从表1可知，养殖28d后，G4和G5对虾的增重率、特定生长率和摄食量均显著高于G0（P ＜0.05），G4增重率比G0、G5分别升高66.5%和14.3%。G4和G5对虾的饲料系数显著低于G0（P ＜0.05），其中G4比G0降低20.6%。G4对虾成活率显著高于G0和G5（P ＜0.05），G4比G0升高39.2%。由此可知，添加桦褐孔菌多糖到凡纳滨对虾基础饲料中饲养一段时间后，可显著提高凡纳滨对虾生长性能。

饲养试验结束时，每个缸随机取10尾虾，用1ml无菌注射器从对虾头胸甲插入心脏抽取血淋巴，合并置于无菌的Eppendorf管中，4℃下静置3~4h，在4℃下以10000r/min离心10min，吸取上清液分装保存于-80℃冰箱中备用。指标检测方法及作用效果如下。

一、检测方法：

1、凡纳滨对虾血清溶菌酶（LZM）活性的测定

溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为 1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要成分。由于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对象是革兰氏阳性菌。

测定原理：溶菌酶能使革兰氏阳性菌细胞壁溶解，尤其是对腐生菌，如溶壁微球菌最为敏感，故常以溶解溶壁微球菌为指标，对溶菌酶的活性值进行测定。

以溶壁微球菌冻干粉为底物，用0.1mol/L PH值为6.4的磷酸钾盐缓冲溶液配成底物悬液（OD570=0.3）。取3ml该悬液于试管内，置冰浴中，再加入50ul血清混匀，于570nm处测其初始光密度值A0值，然后将试液移入37℃水浴中保温30min，取出后立刻置于冰浴中10min终止反应，测其A值。溶菌酶活力（LZM）按下式计算：U=(A0-A)/A。

2、凡纳滨对虾血清碱性磷酸酶（AKP）活性的测定

碱性磷酸酶是一种专一性较广的磷酸酯水解酶，可以催化所有的磷酸酶的水解反应和磷酸集团的转移反应，在生物体内具有非常重要的生理功能，它直接参与磷代谢，并与DNA，RNA蛋白质脂质等代谢有关。能催化磷酸单脂的水解和磷酸基团的转移反应，在生物体内具有重要的生理功能，且它是一种非特异性磷酸水解酶，能催化磷酸单脂的水解及磷酸基团的转移反应，对动物的生存具有重要的意义。

测定原理：AKP分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。

本试验所采用碱性磷酸酶（AKP）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所（名称：碱性磷酸酶（AKP）测试盒(50管/48样) 货号：A059），测定步骤按说明书进行。

3、凡纳滨对虾血清一氧化氮合成酶（NOS）的测定

一氧化氮合成酶是催化L-精氨酸与O₂产生NO的合成酶，广泛存在于生物体的神经组织中，催化产生的一氧化氮在生物内发挥了信息传递和病的重要作用，其活力大小可有NO合成量的多少来确定。

测定原理：NOS催化L-Arg和分子氧反应生成NO，NO与亲和性物质生成有色化合物，在530nm波长下测定吸光度，根据吸光度的大小可计算NOS活力。

本试验所采用一氧化氮合成酶（NOS）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所（名称：一氧化氮合成酶（NOS）测试盒(100管/48样) 货号：A014），测定步骤按说明书进行。

4、凡纳滨对虾血清总抗氧化能力（T-AOC）的测定

机体防御体系的总抗氧化能力(T-AOC) 的强弱与机体健康程度存在着密切联系，是对机体抗氧化能力评价的一个总体指标。该防御体系有酶促与非酶促两个体系，其防护氧化作用主要通过消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化；并分解过氧化物，阻断过氧化链；同时除去起催化作用的金属离子。

测定原理：机体中有许多抗氧化物质，能使Fe³⁺还原成Fe²⁺，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。

本试验所采用总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所（名称：总抗氧化能力（T-AOC）测试盒(100管/50样) 货号：A015），测定步骤按说明书进行。

5、凡纳滨对虾血清SOD活性的测定

超氧化物歧化酶（SOD）对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，其可以清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受伤害。

测定原理：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。

本试验所用超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所（名称：超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（酶标法）(96T) 货号：A001-3），测定步骤按说明书进行。

6、凡纳滨对虾血清MDA含量的测定

丙二醛（MDA）是脂质过氧化反应的主要产物，MDA的测定常常与超氧化物歧化酶(SOD)的测定相互配合，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。

测定原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。通过比色即可求出各样品中丙二醛的含量。

本试验所用丙二醛（MDA）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所（名称：丙二醛（MDA）测试盒(100管/96样) 货号：A003-1），按说明书进行测定。

二、作用效果

按照指标测定要求测定相关指标，结果见表2和表3。

表2 桦褐孔菌多糖对凡纳滨对虾幼虾血清非特异性免疫酶活性的影响

指标	溶菌酶(U/ml)	碱性磷酸酶(U/100ml)	一氧化氮合成酶(U/ml)
				G0	0.045±0.022^b	16.62±3.12^c	18.21±2.08^b
G4	0.138±0.013 ^a	34.39±2.55^a	22.58±4.14^ab
				G5	0.122±0.019^a	25.06±5.52^b	24.21±3.71^a

注：同行上标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

从表2可知，G4可显著提高凡纳滨对虾血清溶菌酶和碱性磷酸酶活性(P<0.05)，提高血清一氧化氮合成酶活性(P＞0.05)。

表3 桦褐孔菌多糖对凡纳滨对虾幼虾血清抗氧化能力的影响

指标	总抗氧化能力(U/ml)	超氧化物歧化酶(U/ml)	丙二醛(nmol/ml)
				G0	8.19±0.47^b	170.40±2.92^b	15.66±2.06^ab
G4	10.53±0.60^a	180.37±5.53^ab	10.00±3.76^b
				G5	11.58±1.33^a	182.64±5.66^a	18.47±2.71^a

注：同行上标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）

从表3可见，G4可显著提高凡纳滨对虾血清总抗氧化能力（P ＜0.05），提高血清超氧化物歧化酶活性和降低血清丙二醛含量（P ＞0.05）。

由上述结果可见，添加桦褐孔菌多糖到凡纳滨对虾基础饲料中饲养一段时间后，可显著提高凡纳滨对虾生长性能，并且可显著提高凡纳滨对虾血清溶菌酶、碱性磷酸酶和总抗氧化能力，提高血清一氧化氮合成酶、超氧化物歧化酶，降低血清丙二醛含量，能够起到较好的免疫保护作用。其作用效果与β葡聚糖相当，是一种新型的免疫增强剂，在凡纳滨对虾养殖领域具有广阔的应用前景。

本发明各个实施例的效果均可参考上述实验数据部分内容的结果，本发明在此不作一一赘述。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1.一种桦褐孔菌多糖作为凡纳滨对虾饲料添加剂的应用，其特征在于：桦褐孔菌多糖在凡纳滨对虾基础饲料中的添加量为500-1500mg/kg凡纳滨对虾基础饲料。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：桦褐孔菌多糖在凡纳滨对虾基础饲料中的添加量为800-1200mg/kg凡纳滨对虾基础饲料。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述桦褐孔菌多糖由以下工艺制备获得：

（1）菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；

（2）液体菌种培养：将活化菌种转入液体种子培养基中，摇床培养至对数期得液体菌种；

（3）液体深层发酵：将液体菌种接入液体深层发酵培养基中发酵培养，液体菌种与液体深层发酵培养基的体积比为1:8-10，所述液体深层发酵培养基的配方为：葡萄糖30-32g/L，木质纤维素32-38g/L，蛋白胨 2-5g/L，KH₂PO₄ 1-2g/L，ZnSO₄ ·2H₂O 0.01-0.02g/L， K₂HPO₄ 0.3-0.5g/L，FeSO₄ ·7H₂O 0.03-0.07g/L，MgSO₄ ·7H₂O 0.3-0.6 g/L，CuSO₄ ·5H₂O 0.01-0.03 g/L，CoCl₂ 0.01 -0.02g/L，MnSO₄ ·H₂O 0.06-0.09 g/L，pH值6.0-6.5；

液体深层发酵的工艺参数为：发酵温度27-28℃，发酵罐空气流量0.5-1.0vvm，发酵罐内部压力0.1-0.25 kg/cm³，搅拌转速70-150转/分钟，发酵周期12-14天；

（4）桦褐孔菌多糖提取：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体步骤为：发酵产物过滤，得发酵液，发酵液浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后在0-4℃下静置过夜，离心分离去上清液，沉淀冷冻干燥后即得桦褐孔菌多糖。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：从发酵产物中提取桦褐孔菌多糖的具体步骤为：

b、将菌丝体水洗后，菌丝体悬浮于蒸馏水中，超声破壁， 121±1℃加热1.5-2h，冷却后离心收集上清液，残渣悬浮于蒸馏水中，121±1℃加热3-4h，冷却后离心收集上清液，合并上清液，浓缩至原体积的20%-30%，加入4-6倍体积的95%-98%的乙醇，搅拌均匀后在0-4℃下静置过夜沉淀，所得沉淀依次用95%-98%的乙醇和丙酮洗涤后，冷冻干燥得桦褐孔菌胞内多糖；

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述木质纤维素选自农作物秸秆、木屑、花生壳、甘蔗渣中的一种。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，琼脂10 g/100mL，pH值为5.4-5.6；斜面菌种培养基上培养的参数为：温度27-28℃，培养200-250小时。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/100mL，KH₂PO₄ 0.1 g/100mL，MgSO₄ 0.15 g/100mL，CaCl₂ 0.01 g/100mL；液体菌种培养的参数为：温度27-28℃，培养3.5-4.5d，摇床转速80-140转/分钟。

9.一种添加有桦褐孔菌多糖的凡纳滨对虾饲料，其特征在于：包括桦褐孔菌多糖和凡纳滨对虾基础饲料，桦褐孔菌多糖用量为每千克凡纳滨对虾基础饲料中添加500-1500mg。

10.根据权利要求9所述的一种添加有桦褐孔菌多糖的凡纳滨对虾饲料，其特征在于：桦褐孔菌多糖用量为每千克凡纳滨对虾基础饲料中添加800-1200mg。